Bioquímica estructural.

Propiedades del agua

Introducción

Nombre común que se aplica al estado líquido del compuesto de hidrógeno y oxígeno H2O. Los antiguos filósofos consideraban el agua como un elemento básico que representaba a todas las sustancias líquidas. Los científicos no descartaron esta idea hasta la última mitad del siglo XVIII. En 1781 el químico británico Henry Cavendish sintetizó agua detonando una mezcla de hidrógeno y aire. Sin embargo, los resultados de este experimento no fueron interpretados claramente hasta dos años más tarde, cuando el químico francés Antoine Laurent de Lavoisier propuso que el agua no era un elemento sino un compuesto de oxígeno e hidrógeno. En un documento científico presentado en 1804, el químico francés Joseph Louis Gay-Lussac y el naturalista alemán Alexander von Humboldt demostraron conjuntamente que el agua consistía en dos volúmenes de hidrógeno y uno de oxígeno, tal como se expresa en la fórmula actual H2O.

2. Propiedades Físicas Del Agua

1) Estado físico: sólida, liquida y gaseosa2) Color: incolora3) Sabor: insípida4) Olor: inodoro5) Densidad: 1 g./c.c. a 4°C6) Punto de congelación: 0°C7) Punto de ebullición: 100°C8) Presión critica: 217,5 atm.9) Temperatura critica: 374°C

El agua químicamente pura es un liquido inodoro e insípido; incoloro y transparente en capas de poco espesor, toma color azul cuando se mira a través de espesores de seis y ocho metros, porque absorbe las radiaciones rojas. Sus constantes físicas sirvieron para marcar los puntos de referencia de la escala termométrica Centígrada. A la presión atmosférica de 760 milímetros el agua hierve a temperatura de 100°C y el punto de ebullición se eleva a 374°, que es la temperatura critica a que corresponde la presión de 217,5 atmósferas; en todo caso el calor de vaporización del agua asciende a 539 calorías/gramo a 100°.

Mientras que el hielo funde en cuanto se calienta por encima de su punto de fusión, el agua liquida se mantiene sin solidificarse algunos grados por debajo de la temperatura de cristalización (agua subenfriada) y puede conservarse liquida a –20° en tubos capilares o en condiciones extraordinarias de reposo. La solidificación del agua va acompañada de desprendimiento de 79,4 calorías por cada gramo de agua que se solidifica. Cristaliza en el sistema hexagonal y adopta formas diferentes, según las condiciones de cristalización.

A consecuencia de su elevado calor especifico y de la gran cantidad de calor que pone en juego cuando cambia su estado, el agua obra de excelente regulador de temperatura en la superficie de la Tierra y más en las regiones marinas.

El agua se comporta anormalmente; su presión de vapor crece con rapidez a medida que la temperatura se eleva y su volumen ofrece la particularidad de ser mínimo a la de 4°. A dicha temperatura la densidad del agua es máxima, y se ha tomado por unidad. A partir de 4° no sólo se dilata cuando la temperatura se eleva,. sino también cuando se enfría hasta 0°: a esta temperatura su densidad es 0,99980 y al congelarse desciende bruscamente hacia 0,9168, que es la densidad del hielo a 0°, lo que significa que en la cristalización su volumen aumenta en un 9 por 100.

Las propiedades físicas del agua se atribuyen principalmente a los enlaces por puente de hidrógeno, los cuales se presentan en mayor número en el agua sólida, en la red cristalina cada átomo de la molécula de agua está rodeado tetraédricamente por cuatro átomos de hidrógeno de otras tantas moléculas de agua y así sucesivamente es como se conforma su estructura. Cuando el agua sólida (hielo) se funde la estructura tetraédrica se destruye y la densidad del agua líquida es mayor que la del agua sólida debido a que sus moléculas quedan más cerca entre sí, pero sigue habiendo enlaces por puente de hidrógeno entre las moléculas del agua líquida. Cuando se calienta agua sólida, que se encuentra por debajo de la temperatura de fusión, a medida que se incrementa la temperatura por encima de la temperatura de fusión se debilita el enlace por puente de hidrógeno y la densidad aumenta más hasta llegar a un valor máximo a la temperatura de 3.98ºC y una presión de una atmósfera. A temperaturas mayores de 3.98 ºC la densidad del agua líquida disminuye con el aumento de la temperatura de la misma manera que ocurre con los otros líquidos.

3. Propiedades Químicas del Agua

1)Reacciona con los óxidos ácidos2)Reacciona con los óxidos básicos3)Reacciona con los metales 4)Reacciona con los no metales5)Se une en las sales formando hidratos1)Los anhídridos u óxidos ácidos reaccionan con el agua y forman ácidos oxácidos.

2) Los óxidos de los metales u óxidos básicos reaccionan con el agua para formar hidróxidos. Muchos óxidos no se disuelven en el agua, pero los óxidos de los metales activos se combinan con gran facilidad.3) Algunos metales descomponen el agua en frío y otros lo hacían a temperatura elevada.4)El agua reacciona con los no metales, sobre todo con los halógenos, por ej: Haciendo pasar carbón al rojo sobre el agua se descompone y se forma una mezcla de monóxido de carbono e hidrógeno (gas de agua).5)El agua forma combinaciones complejas con algunas sales, denominándose hidratos.En algunos casos los hidratos pierden agua de cristalización cambiando de aspecto, y se dice que son eflorescentes, como le sucede al sulfato cúprico, que cuando está hidratado es de color azul, pero por pérdida de agua se transforma en sulfato cúprico anhidro de color blanco.

Por otra parte, hay sustancias que tienden a tomar el vapor de agua de la atmósfera y se llaman hidrófilas y también higroscópicas; la sal se dice entonces que delicuesce, tal es el caso del cloruro cálcico.

El agua como compuesto quimico:

Habitualmente se piensa que el agua natural que conocemos es un compuesto químico de fórmula H2O, pero no es así, debido a su gran capacidad disolvente toda el agua que se encuentra en la naturaleza contiene diferentes cantidades de diversas sustancias en solución y hasta en suspensión, lo que corresponde a una mezcla.

El agua químicamente pura es un compuesto de fórmula molecular H2O. Como el átomo de oxígeno tiene sólo 2 electrones no apareados, para explicar la formación de la molécula H 2O se considera que de la hibridación de los orbitales atómicos 2s y 2p resulta la formación de 2 orbitales híbridos sp3. El traslape de cada uno de los 2 orbitales atómicos híbridos con el orbital 1s1 de un átomo de hidrógeno se forman dos enlaces covalentes que generan la formación de la molécula H2O, y se orientan los 2 orbitales sp3 hacia los vértices de un tetraedro triangular regular y los otros vértices son ocupados por los pares de electrones no compartidos del oxígeno. Esto cumple con el principio de exclusión de Pauli y con la tendencia de los electrones no apareados a separarse lo más posible.

Experimentalmente se encontró que el ángulo que forman los 2 enlaces covalentes oxígeno-hidrógeno es de 105º y la longitud de enlace oxígeno-hidrógeno es de 0.96 angstroms y se requiere de 118 kcal/mol para romper uno de éstos enlaces covalentes de la molécula H2O. Además, el que el ángulo experimental de enlace sea menor que el esperado teóricamente (109º) se explica como resultado del efecto de los 2 pares de electrones no compartidos del oxígeno que son muy voluminosos y comprimen el ángulo de enlace hasta los 105º. Las fuerzas de repulsión se deben a que los electrones tienden a mantenerse separados al máximo (porque tienen la misma carga) y cuando no están apareados también se repelen (principio de exclusión de Pauli). Además núcleos atómicos de igual carga se repelen mutuamente. Las fuerzas de atracción se deben a que los electrones y los núcleos se atraen mutuamente porque tienen carga opuesta, el espín opuesto permite que 2 electrones ocupen la misma región pero manteniéndose alejados lo más posible del resto de los electrones. La estructura de una molécula es el resultado neto de la interacción de las fuerzas de atracción y de repulsión (fuerzas intermoleculares), las que se relacionan con las cargas eléctricas y con el espín de los electrones. De acuerdo con la definición de ácido y álcali de Brönsted-Lowry, los 2 pares de electrones no compartidos del oxígeno en la molécula H2O le proporciona características alcalinas. Los 2 enlaces covalentes de la molécula H2O son polares porque el átomo de oxígeno es más electronegativo que el de hidrógeno, por lo que esta molécula tiene un momento dipolar electrostático igual a 6.13x10-30 (coulombs)(angstrom), lo que también indica que la molécula H2O no es lineal, H-O-H. El agua es un compuesto tan versátil principalmente debido a que el tamaño de su molécula es muy pequeño, a que su molécula es buena donadora de pares de electrones, a que forma puentes de hidrógeno entre sí y con otros compuestos que tengan enlaces como: N-H, O-H y F-H, a que tiene una constante dieléctrica muy grande y a su capacidad para reaccionar con compuestos que forman otros compuestos solubles. El agua es, quizá el compuesto químico más importante en las actividades del hombre y también más versátil, ya que como reactivo químico funciona como ácido, álcali, ligando, agente oxidante y agente reductor.

Estructura del agua

La molécula de agua está formada por dos átomos de H unidos a un átomo de O por medio de dos enlaces covalentes. La disposición tetraédrica de los orbitales sp3 del oxígeno determina un ángulo entre los enlaces

H-O-H

aproximadamente de 104'5:, además el oxígeno es más electronegativo que el hidrógeno y atrae con más fuerza a los electrones de cada enlace.

Fig.1

Fig.2

Fig.3

El resultado es que la molécula de agua aunque tiene una carga total neutra (igual número de protones que de electrones ), presenta una distribución asimétrica de sus electrones, lo que la convierte en una molécula polar, alrededor del oxígeno se concentra una densidad de carga negativa , mientras que los núcleos de hidrógeno quedan desnudos, desprovistos parcialmente de sus electrones y manifiestan, por tanto, una densidad de carga positiva.

Por eso en la práctica la molécula de agua se comporta como un dipolo

Fig.4Fig.5

Así se establecen interacciones dipolo-dipolo entre las propias moléculas de agua, formándose enlaces o puentes de hidrógeno, la carga parcial negativa del oxígeno de una molécula ejerce atracción electrostática sobre las cargas parciales positivas de los átomos de hidrógeno de otras moléculas adyacentes.

Aunque son uniones débiles, el hecho de que alrededor de cada molécula de agua se dispongan otras cuatro molécula unidas por puentes de hidrógeno permite que se forme en el agua (líquida o sólida) una estructura de tipo reticular, responsable en gran parte de su comportamiento anómalo y de la peculiaridad de sus propiedades físicoquímicas.

Propiedades del agua

1. Acción disolvente El agua es el líquido que más sustancias disuelve, por eso decimos que es el disolvente universal. Esta propiedad, tal vez la más importante para la vida, se debe a su capacidad para formar puentes de hidrógeno con otras sustancias que pueden presentar grupos polares o con carga iónica ( alcoholes, azúcares con grupos R-OH , aminoácidos y proteínas con grupos que presentan cargas + y - , lo que da lugar a disoluciones moleculares Fig.7. También las moléculas de agua pueden disolver a sustancias salinas que se disocian formando disoluciones iónicas.(Fig.6)

Fig.6 Fig.7

En el caso de las disoluciones iónicas (fig.6) los iones de las sales son atraídos por los dipolos del agua, quedando "atrapados" y recubiertos de moléculas de agua en forma de iones hidratados o solvatados.

La capacidad disolvente es la responsable de dos funciones : 1. Medio donde ocurren las reacciones del metabolismo 2. Sistemas de transporte

Este efecto puede verse en esta animacisn, donde vemos a las moliculas de agua separando los iones, e impidiendo que istos vuelvan a unirse.

2. Elevada fuerza de cohesión Los puentes de hidrógeno mantienen las moléculas de agua fuertemente unidas, formando una estructura compacta que la convierte en un líquido casi incomprensible. Al no poder comprimirse puede funcionar en algunos animales como un esqueleto hidrostático, como ocurre en algunos gusanos perforadores capaces de agujerear la roca mediante la presión generada por sus líquidos internos.

3. Elevada fuerza de adhesión

Fig.8

Esta fuerza está también en relación con los puentes de hidrógeno que se establecen entre las moléculas de agua y otras moléculas polares y es responsable, junto con la cohesión del llamado fenómeno de la capilaridad. Cuando se introduce un capilar (Fig.8) en un recipiente con agua, ésta asciende por el capilar como si trepase agarrándose por las paredes, hasta alcanzar un nivel superior al del recipiente,

donde la presión que ejerce la columna de agua , se equilibra con la presión capilar. A este fenómeno se debe en parte la ascensión de la savia bruta desde las raíces hasta las hojas, a través de los vasos leñosos. 3. Gran calor específico

También esta propiedad está en relación con los puentes de hidrógeno que se forman entre las moléculas de agua. El agua puede absorber grandes cantidades de "calor" que utiliza para romper los p.de h. por lo que la temperatura se eleva muy lentamente. Esto permite que el citoplasma acuoso sirva de protección ante los cambios de temperatura. Así se mantiene la temperatura constante .

4. Elevado calor de vaporización Sirve el mismo razonamiento, también los p.de h. son los responsables de esta propiedad. Para evaporar el agua , primero hay que romper los puentes y posteriormente dotar a las moléculas de agua de la suficiente energía cinética para

pasar de la fase líquida a la gaseosa. Para evaporar un gramo de agua se precisan 540 calorías, a una temperatura de 20: C.

Funciones del agua

Las funciones del agua se relacionan íntimamente con las propiedades anteriormente descritas. Se podrían resumir en los siguientes puntos

1. Soporte o medio donde ocurren las reacciones metabólicas 2. Amortiguador térmico 3. Transporte de sustancias 4. Lubricante , amortiguadora del roce entre órganos 5. Favorece la circulación y turgencia 6. Da flexibilidad y elasticidad a los tejidos 7. Puede intervenir como reactivo en reacciones del metabolismo, aportando

hidrogeniones o hidroxilos al medio.

PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS

Desde el punto de vista bioquímico, las propiedades de las proteínas son:

precipitación selectiva capacidad amortiguadora

propiedades osmóticas

El agua es el disolvente biológico por excelencia. En disolución acuosa, los residuos hidrofóbicos de las proteínas se acumulan en el interior de la estructura, mientras que en la superficie aparecen diversos grupos con carga eléctrica, en función del pH del medio (Figura de la izquierda). En torno a los grupos cargados, los dipolos del agua se orientan conforme a la carga eléctrica de cada grupo, de tal manera que la proteína presenta una capa de solvatación formada por el agua de hidratación, que es el agua retenida por las cargas eléctricas de la superficie de las proteínas (En color rojo en la Figura superior derecha). Los AA polares sin carga también se disponen en la superficie, donde interaccionan con el agua mediante puentes de hidrógeno.

Cualquier factor que modifique la interacción de la proteína con el disolvente disminuirá su estabilidad en disolución y provocará la precipitación. Así, la desaparición total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralización de las cargas eléctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrógeno facilitará la agregación intermolecular y provocará la precipitación. La precipitación suele ser consecuencia del fenómeno llamado desnaturalización.

Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija

Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio en su interacción con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Cualquier alteración de la estructura nativa que modifique su interacción con el disolvente y que provoque su precipitación dará lugar a una estructura desnaturalizada. En una proteína cualquiera, la estructura nativa y la desnaturalizada tan sólo tienen en común la estructura primaria, es decir, la secuencia de AA que la componen. Los demás niveles de organización estructural desaparecen en la estructura desnaturalizada.

La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

1. cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión

2. una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie

3. pérdida de las propiedades biológicas

Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama renaturalización. estructura primaria la que contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración. Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. En algunos casos, la desnaturalización

conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

(1) la polaridad del disolvente

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación. La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos.

(2) la fuerza iónica

Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición de sulfato amónico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) también provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitación provocada por el aumento de la fuerza iónica es reversible. Mediante una simple diálisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la función original. A veces es una disminución en la fuerza iónica la que provoca la precipitación. Así, las proteínas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza iónica original.

(3) el pH

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación. La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados.

(4) la temperatura

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asímismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.

CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE LAS PROTEÍNAS

Esta propiedad se debe a la existencia de:

Grupos ionizables de las cadenas laterales de los aminoácidos Asp, Glu, Lys, Arg, His, Tyr, Cys.

Grupos COOH y NH2 terminales (Tabla de la derecha).

Por este motivo, las proteínas poseen un considerable poder amortiguador en una amplia zona de pH. Aunque cada AA tiene unos grupos ionizables con unas constantes de ionización (pKa) características, el valor de dichas constantes puede verse ligeramente modificado por el entorno proteico. El grupo imidazol del AA histidina es el principal responsable del poder amortiguador de las proteínas a pH fisiológico, ya que su pKa está próximo a 7.

Cuando el pH es bajo, los grupos ionizables están protonados, y la carga neta de la proteína es de signo positivo. Cuando el pH es alto, los grupos ionizables están desprotonados, y la carga neta es de signo negativo. Entre ambas zonas, habrá un pH en el cual la carga neta de la proteína es nula. Es el pH isoeléctrico o punto isoeléctrico, y es característico de cada proteína (Tabla de la izquierda).

A valores de pH por debajo del pH isoeléctrico la carga neta de la proteína es positiva, y a valores de pH por encima del pH isoeléctrico, la carga neta de la proteína es negativa. La mayoría de las proteínas intracelulares tienen carga negativa, ya que su pH isoeléctrico es menor que el pH fisiológico (que está proximo a 7). Se llaman proteínas ácidas a aquellas que tienen un punto isoeléctrico bajo (como la pepsina), y proteínas básicas a las que tienen un punto isoeléctrico alto (como las histonas).

PROPIEDADES OSMÓTICAS DE LAS PROTEÍNAS

Como todo soluto molecular o iónico, las proteínas ejercen un efecto osmótico cuando existen barreras que limitan su libre difusión, como puede ser una membrana semipermeable (Figura de la izquierda), que permite el paso del agua, pero no de los solutos. Si tenemos dos compartimentos acuosos separados por una membrana semipermeable y uno de ellos contiene proteínas, éstas tienden a captar agua del compartimento vecino (Figura de la derecha). Este efecto osmótico es proporcional al número de partículas dispersas. El valor de la presión osmótica se puede calcular mediante la fórmula de Van't Hoff: p = cRT, donde p es la presión osmótica, c es la concentración, R es la constante de los gases y T es la temperatura absoluta.

En el caso de las proteínas, el efecto osmótico se ve amplificado por otros dos factores.

Por un lado, el agua de hidratación que forma la envoltura acuosa de las proteínas también contribuye a la presión osmótica

Por otro lado, las proteínas se comportan como polianiones, cuyas cargas están neutralizadas por iones Na+ o K+ (Figura inferior izquierda). Las membranas biológicas son permeables a estos iones y a sus contraiones, con lo cual su concentración a ambos lados de la membrana se equilibra. Sin embargo, la existencia de proteínas en sólo uno de los compartimentos provoca

la retención permanente de iones difusibles en ese lado de la membrana (efecto Donnan), lo que incrementa el efecto osmótico (Figura inferior derecha).

Se denomina presión coloidosmótica o presión oncótica al efecto osmótico conjunto de las proteínas, que es el resultado de:

(1) la presión osmótica (que sólo depende del número de partículas) (2) la presión provocada por el agua de hidratación (3) la presión provocada por el exceso de iones debido al efecto Donnan

La mayor parte del agua en el sistema circulatorio está retenida por el efecto osmótico de las proteínas del plasma. Cuando por cualquier circunstancia patológica disminuye la concentración de proteínas en el plasma, el agua puede fluir libremente hacia los tejidos, provocando un edema

ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

Módelo de la Doble Hélica Difracción de Rayos X: ADN-B J. Watson y F. Crick

Composición de los Ácidos nucleicos. Proporciones de las Bases Nitrogenadas: Reglas de Chargaff (1950).

El Modelo de la Doble Hélice: Watson y Crick (1953).

Alternativas al Modelo de la Doble Hélice.

Propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos.

Densidad de los Ácidos Nucleicos.

Desnaturalización: Temperatura de Fusión.

Absorbancia a 260 nm.

Cinética de la Renaturalización: Curvas Cot.

Hibridación de los ácidos nucleicos.

Secuenciación del ADN: Método Didesoxi y Método Automático.

COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Miescher en 1871 aisló del núcleo de las células de pus una sustancia ácida rica en fósforo que llamó "nucleína". Un año más tarde, en 1872, aisló de la cabeza de los espermas del salmón un compuesto que denominó "protamina" y que resultó ser una sustancia ácida y otra básica. El nombre de ácido nucleico procede del de "nucleína" propuesto por Miescher.

Cuando se realiza la hidrólisis completa de los ácidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales:

Azúcar, en concreto una pentosa. Bases nitrogenadas: púricas y pirimidínicas. Ácido fosfórico.

El azúcar, en el caso de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa y en el caso de los ácidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.

Pentosas Ácido fosfórico

Las bases nitrogenadas que forman parte de los ácidos nucleicos son de dos tipos, púricas y pirimidínicas. Las bases púricas derivadas de la purina (fusión de un anillo pirimidínico y uno de imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Las bases pirimidínicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o también llamada 5-metiluracilo), Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6-dihidroxipirimidina). Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es específica del ADN y el Uracilo es específico del ARN.

Bases Púricas Bases Pirimidínicas

Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina. Entre las bases pirimidínicas podríamos citar la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos T-pares.

En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traducción de proteínas se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I).

La unión de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nucleósido y se realiza a través del carbono 1’ de la pentosa y los nitrógenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosídico. La unión del nucleósido con el ácido fosfórico se realiza a través de un enlace de tipo éster entre el grupo OH del carbono 5’ de la pentosa y el ácido fosfórico, originando un nucleótido. Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de polinucleótidos.

Nucleósido = Pentosa + Base nitrogenada. Nucleótido = Pentosa + Base nitrogenada + Ácido fosfórico. Polinucleóotido = Nucleótido + Nucleótido + Nucleótido + ....

Nucleótido

Tanto los nucleótidos como los nucleósidos pueden contener como azúcar la D-ribosa (ribonucleótidos y ribonucleósidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucleótidos y desoxirribonucleósidos).

Además, los nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato unidos al carbono 5’ de la pentosa, existiendo por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato, nucleótidos 5’ difosfato y nucleótidos 5’ trifosfato. En algunos casos el ácido fosfórico se une a la pentosa por el carbono 3’, existiendo nucleótidos 3’ monofosfato, difosfato o trifosfato según el número de grupos fosfato que posea.

La terminología empleada para referirse a los nucleósidos y nucleótidos es la siguiente:

Base Nitrogenada Nucleósido Nucleótido

Adenina Adenosina Ácido Adenílico

Guanina Guanidina Ácido Guanílico

Citosina Citidina Ácido Citidílico

Timina Timidina Ácido Timidílico

Uracilo Uridina Ácido Uridílico

Los nucleótidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinuclóetidos, esta unión entre monómeros nucleótidos se realiza mediante enlaces fosfodiéster entre los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido con la 5’ del siguiente.

Polinucleótido

PROPORCIONES DE LAS BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

Al principio se pensaba que los ácidos nucleicos eran la repetición monótona de un tetranucleótido, de forma que no tenían variabilidad suficiente para ser la molécula biológica que almacenara la información. Sin embargo, Chargaff (1950) demostró que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguían algunas reglas. Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hélice y son las siguientes:

REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HÉLICE

Edwin Chargaff

La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1).

La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1).

La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1.

Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) era característica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas.

En la siguiente tabla se observan las proporciones de las bases nitrogenadas en algunos organismos.

Procedencia del ADN A G C T 5-Me-C

Timo de Bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 1,3

Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 1,3

Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 6,0

Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 -

Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 -

Mycobacterium tuberculosis 15,1 34,9 35,4 14,6 -

ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 -

T3 23,7 26,2 27,7 23,5 -

T5 30,3 19,5 19,5 30,8 -

T7 32,4 18,3 32,4 17,0 HMC

Virus ARN A G C U

Mosaico del tabaco (TMV) 29,8 25,4 18,5 26,3

Mosaico amarillo nabo 22,6 17,2 38,0 22,2

Poliomielitis 28,6 24,0 22,0 25,4

Encéfalo miocarditis del 27,3 23,5 23,2 25,9

ratón

Reovirus Tipo 3 28,0 22,3 22,0 27,9

Tumor de las heridas 31,1 18,6 19,1 31,3

De la observación de la tabla anterior pueden extraerse las siguientes conclusiones:

Todos los ADN estudiados cumplen la relación A=T y G=C, excepto el ADN del bacteriofago ØX174. El ADN de este virus es de una sola hélice.

En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus del Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hélice. En estos virus se cumple que A=U y G=C, además se cumple que A+G/U+C=1.

El fago T2 y los otros fagos T-pares (T4 y T6) en vez de citosina tienen hidroximetil-citosina (HMC).

Algunos organismos tiene en su ADN una pequeña proporción de 5-metil-citosina (5-Me-C) que sustituye a la citosina.

Igualmente, en la siguiente tabla puede observarse como la proporción A+T/G+C varia de un organismo a otro.

Organismo TejidoA+T/G+C

Escherichia coli - 1,00

Diplococcus pneumoniae - 1,59

Mycobacterium tuberculosis - 0,42

Levadura - 1,79

Paracentrolus lividus (erizo mar) Esperma 1,85

Arenque Esperma 1,23

Rata Médula ósea 1,33

Hombre Timo 1,52

Hombre Hígado 1,53

Hombre Esperma 1,52

Por tanto, la proporción A+T/G+C es específica de cada organismo y como veremos más adelante cuando hablemos de las propiedades físico- químicas de los ácidos nucleicos, dicha proporción está relacionada con la densidad y la temperatura de fusión.

EL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE: WATSON Y CRICK (1953)

Una vez demostrado que los ácidos nucleicos eran los portadores de la información genética, se realizaron muchos esfuerzos encaminados a determinar su estructura con exactitud. Watson y Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los ácidos nucleicos y su labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, Premio Nobel que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedió por sus descubrimientos en relación con la estructura molecular de los ácidos nucleícos y su

significación para la transmisión de la información en la materia viva.. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya existentes.

Francis H. C. Circk James D. Watson Maurice H. F. Wilkins Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios años antes por Chargaff (1950),

relativos a la composición de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos. El otro tipo de datos eran los procedentes de estudios de difracción de rayos X sobre

fibras de ADN. Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las moléculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la difracción de los rayos sobre una película fotográfica. La película se impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse manchas. El ángulo de difracción presentado por cada una de las manchas en la película suministra información sobre la posición en la molécula de ADN de cada átomo o grupo de átomos.

Mediante esta técnica de difracción de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:

Las bases púricas y pirimidínicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucleótido a una distancia de 3,4 Å. Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury, 1947).

El diámetro del polinucleótido es de 20 Å y está enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 Å se produce una vuelta completa de la hélice.

Existe más de una cadena polinucleotídica enrollada helicoidalmente (Wilkins et el. 1953, Frankling y Gosling, 1953).

Difracción de Rayos X: ADN-B Rosalin Franklin

Basándose en estos dos tipos de datos Watson y Crick propusieron su Modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de Modelo de la Doble Hélice. Las características del

Modelo de la Doble Hélice son las siguientes:

El ADN es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido dextrorso). Algo parecido a dos muelles entrelazados.

Enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas como si fuera un sacacorchos.

Módelo de la Doble hélice: ADN-B J. Watson y F. Crick Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un

grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del siguiente).

Las dos hélices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las bases nitrogenadas de cada hélice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hélice aparea con la Timina de la hélice complementaria mediante dos puentes de hidrógeno. Igualmente, la Guanina de una hélice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de hidrógeno.

Par A-T Par G-C Pares A-T y G-C Las dos hélices porrazones de complementaridad de las bases nitrogenadas

son antiparalelas,teniendo secuencias de átomos inversas. Una hélice lleva la secuencia 5’P → 3’OH , mientras que la hélice complementaria sigue la secuencia de átomos 3’OH→5’P.

El diámetro de la doble hélice es de 20 Å. Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hélice

y están apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 Å. Cada 10 bases, cada 34 Å se produce una vuelta completa de la doble hélice (360º).

Las bases se encuentran en sus configuraciones cetónicas, cumpliendo así las reglas de

apareamiento A-T y G-C. La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna

restricción.

Además, la estructura en doble hélice propuesta por Watson y Crick (1953) sugería varías propiedades importantes del material hereditario:

Las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren un forma sencilla de replicación del material hereditario. Esta forma sencilla de replicación se denomina método Semiconservativo. Cuando el ADN se replica sus dos hélices se separan y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hélice siguiendo las reglas de apareamiento de las bases nitrogenadas.

La mutación a nivel molecular consistiría en un cambio en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN.

Al no existir ninguna restricción en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN poseía la suficiente variabilidad como para ser el material hereditario.

Además, esta estructura sugería la existencia de algún código que permitiera pasar de la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminoácidos en las proteínas.

ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HÉLICE

El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado en estudios del ADN en disolución (hidratado). La denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor interés biológico ya que es la que presenta el ADN en interacción con las proteínas nucleares. Además de la forma B, existen otras estructuras posibles que puede presentar el ADN. Algunas de estas alternativas son las siguientes:

ADN-B: ADN en disolución, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza iónica se corresponde con el modelo de la Doble Hélice.

ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 23 Å de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN.

ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases por giro completo y 19 Å de diámetro.

ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro completo, 18 Å de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina son más accesibles.

ADN-A ADN-B ADN-Z ADN-A ADN-Z ADN-B ADN con enrollamiento paranémico: Las dos hélices se pueden separar por traslación,

cada hélice tiene segmentos alternantes dextrorsos y sinistrorsos de unas cinco bases. Uno de los principales problemas del modelo de la doble hélice (ADN-B) es el enrollamiento plectonémico, para separar las dos hélices es necesario girarlas como un sacacorchos, siendo necesario un gran aporte energético.

ADN triple hélice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. Este oligonucleótido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrógeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucleótido y los pares A-T y G-C de la doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.

Triple hélice: pirimidinas Triple hélice: purinas Triple Hélice ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo)

unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucarióticos (telómeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática. Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G): 5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH

Cuartetos de Guanina

Además, de las alternativas anteriormente citadas es necesario tener en cuenta que no todos los organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hélice, algunos virus tienen ADN de hélice sencilla, ARN de una y de doble hélice.

Palíndromos: plegamiento o apareamiento de una hélice consigo misma. El palíndromo también es una figura gramatical que se lee igual en los dos sentidos, por ejemplo: DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. Existe ADN palindrómico de hélice sencilla y de hélice doble. En el palíndromo de doble cadena la secuencia de bases se lee igual en dirección 5’ P→ 3’OH en ambas cadenas.

Secuencias palindrómicas Palíndromos en ADN de una y doble hélice Existen algunos virus cuyos ácidos nucleicos son de una sola hélice: el ADN de los

fagos ØX174 y M13 es circular de hélice sencilla, sin embargo, se ha comprobado que una pequeña parte resiste la acción de enzimas que digieren específicamente ADN de hélice sencilla. Por tanto, estas regiones resistentes de ADN presentan complementaridad interna o autoapareamiento, formando ADN duplex o doble hélice, teniendo secuencias palíndrómicas. Una situación semejante se ha observado en el ARN de hélice sencilla del bacteriofago MS2 (3569 ribonucleotidos y tres genes). En este caso, el gen de la proteína de la cubierta del virus presenta segmentos que tienen complementaridad interna (autoapareamiento) que se pliegan sobre si mismos formando horquillas (regiones de ARN de doble hélice).

ARN Fago MS2: proteína de la cápside El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminoácidos y el ARN ribosómico

(ARN-r) que intervienen en el proceso de traducción, son ácidos ribonucleicos de una sola hélice y también presentan autoapareamiento.

Esquema ARN-transferente Esquema ARN-ribosómico de Tetrahymena

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Las principales propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos que vamos a considerar son las siguientes:

Densidad de los ácidos nucleicos. Desnaturalización de los ácidos nucleicos: Temperatura de fusión (Tm). Absorbancia a 260 nm. Cinética de Renaturalización: Curvas Cot. Hibridación de los ácidos nucleicos.

DENSIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Densidad: existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

Cuanto mayor es el contenido en (G+C) mayor es la densidad.

Meselson y col. (1957) desarrollaron una técnica de centrifugación en gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solución densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusión del soluto y la fuerza de sedimentación, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la dirección de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si añadimos al centrifugar una molécula de ADN, está migrará hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotación). Posteriormente, es posible aislar las moléculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. También es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posición de la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo.

Centrifugación en gradiente de CsCl

Basándose en múltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su

composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación (ρ) con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C).

DESNATURALIZACIÓN: TEMPERATURA DE FUSIÓN

Desnaturalización: la proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molécula, mayor cantidad de pares G-C presentará, como consecuencia tendrá una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, será necesario suministrar una mayor cantidad de energía a esa doble hélice para separar sus dos hebras (desnaturalización o fusión del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusión (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice ® ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).

Relación entre el contenido en (G+C) y Tm Curvas de desnaturalización de diferentes ADNs

ABSORBANCIA A 260 nm

Absorbancia a 2.600 Å: El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

Esquema efecto hipercrómico

Por tanto, la absorbancia a 2.600 Å se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN. Las curvas de fusión tienen forma de S observándose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusión.

CINÉTICA DE RENATURALIZACIÓN: CURVAS CoT

Velocidad de renaturalización: la velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayoría sólo tiene secuencias que están una sola vez en el genoma (secuencias únicas). Sin embargo, los organismo más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias únicas (SU), secuencias de bajo número de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias).

Tipo de Secuencia Nº de repeticiones Nº de nucleótidos

A (SU) 1 5.700

B (SU) 1 7.530

C (SBNC) 4 3.720

D (SBNC) 6 4.350

E (SR) 200 500

F (SAR) 10.000 300

G (SAR) 1.000.000 200

Complejidad 22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla anterior, su complejidad sería la suma del número de nucleótidos de cada tipo de secuencia (22.300) sin tener en cuenta el número de veces que está repetida cada una de ellas.

No es difícil imaginar que la velocidad de renaturalización del ADN (paso de dos hélices sencillas a una doble hélice) este relacionada con el número de veces que esta repetida una determinada secuencia.

Supongamos que tenemos dos organismos hipotéticos distintos, ambos con la misma cantidad de ADN (1.000.000 de pares de nucleótidos). El organismo A posee 1.000 secuencias únicas diferentes, cada una con una longitud media de 1.000 nucleótidos. El organismo B tiene una secuencia de 100 nucleótidos de longitud que está repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamaño uniforme de los fragmentos de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones iónicas, etc), es evidente que el ADN del organismo B renaturalizará mucho antes, más rápidamente, que el del organismo A, ya que es mucho más probable que la secuencia que está repetida 10.000 veces encuentre otra complementaria en el medio de reacción para formar la doble hélice.

Las curvas de renaturalización o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un sólo punto de inflexión o punto medio de la reacción. Todas las secuencias son únicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble hélice.

Curvas Cot de virus y bacterias Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexión. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (únicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas).

Como en el caso de las curvas de fusión, también se utiliza como medida el punto medio de la reacción de renaturalización, es decir, el Cot ½ o tiempo al que se ha reasociado la mitad del

ADN. El Cot ½ es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de Cot ½ bajos (10-4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot ½ comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las secuencias únicas o de bajo número de copias dan lugar a valores de Cot ½ altos (mayores de 103) .

HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Las técnicas de desnaturalización y posterior renaturalización se utilizan para conseguir la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hélice, es posible volver a formar una doble hélice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridación de ADN con ADN) o volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridación de ADN con ARN).

Endonucleasas de restricción

Las técnicas de hibridación (desnaturalización y posterior renaturalización) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se aísla un mensajero determinado en una célula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la célula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restricción.

Las endonucleasas de restricción de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrómico y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico).

Eco RI Hae III

Dichas endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificación-restricción) de las bacterias frente a la entrada de ADN exógeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palíndrómico. En la siguiente tabla se indican algunas de las endonucleasas más frecuentes:

Endonucleasa de restricción

Bacteria de la que procede Secuencia que reconoce (5'→ 3') y lugar de corte (¯)

Eco RI Escherichia coli 5' G¯AATTC 3' (asimétrico)

Eco RII Escherichia coli 5' ¯CCTGG 3' (asimétrico)

Hae III Haemophilus aegyptus 5' GG¯CC 3' (simétrico)

Hin dII Haemophilus influenzae 5' GTPi¯Pu AC 3' (simétrico)

Hin dIII Haemophilus influenzae 5' A¯AGCTT 3' (asimétrico)

Hpa I Haemophilus parainfluenzae 5' GTT¯AAC 3' (simétrico)

Hpa II Haemophilus parainfluenzae 5' C¯CGG 3' (asimétrico)

Ava I Anabaena variabilis 5' CGPu¯PiCG 3' (simétrico)

La utilización de diferentes endonucleasas y la separación por tamaños de los fragmentos producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restricción.

Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restricción, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se separan por tamaños mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por tamaños se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posición. Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridará solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria. La técnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Técnica Southern (hibridación ADN-ADN), cuando la hibridación se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Northern (hibridación ADN-ARN).

El empleo combinado de endonucleasas de restricción y de diferentes sondas de ADN de secuencia única marcadas permite obtener Polimorfismos para Longitudes de Fragmentos de Restricción (RFLPs), muy utilizados en la construcción de mapas de ligamiento.

Hibridación "in situ"

Las técnicas de hibridación "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por ejemplo un gen) en una posición determinada de un cromosoma eucariótico. Es posible obtener preparaciones citológicas de cromosomas en metafase mitótica o en otras fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparación citológica y

posteriormente hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo fluorescente, denominándose dicha técnica Hibridación "in situ" mediante fluorescencia (abreviadamente FISH). También, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de cromosomas completo y realizar una Hibridación "in situ" Genómica (abreviadamente GISH) que permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio están presentes. Otra aplicación, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosómicas concretas utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosómica.

FISH trigo (Triticum intermedium)

GISH: Híbrido (Liliaceae)

Pintura cromosómica (ratón)

Pintura cromosómica (humanos)

SECUENCIACIÓN DEL ADN: MÉTODO DIDESOXI Y MÉTODO AUTOMÁTICO

El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes métodos para obtener la secuencia de nucleótidos del ADN, sin embargo, actualmente los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger también conocido por el método didesoxi.

Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger

Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el método enzimático de terminación de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.

Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador o "primer".

Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy

cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente.

Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.

Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN.

Breve descripción del método enzimático de terminación de cadena

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.

Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucleótido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel.

Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciación Autorradiografía Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5' → 3', si

comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5' → 3'.

Breve descripción del método automático de secuenciación

La principal diferencia entre método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con nucleótido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción.

La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

El siguiente esquema representa de forma abreviada el método automático de secuenciación.

Esquema del método automático de secuenciación

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.

Secuencia obtenida por métodos automáticosPropiedades de los lípidos

Con el nombre de lípidos (del griego lypos, grasa) denominamos a un grupo de compuestos orgánicos formados por C, H, y O mayoritariamente y ocasionalmente N, P y S.Con características químicas diversas, pero propiedades físicas comunes: poco o nada solubles en agua, siéndolo en los disolventes orgánicos (éter, benceno, cloroformo, acetona, alcohol).

Dada la diversidad de características químicas, su clasificación también lo es: puede hacerse atendiendo a criterios de saponificación, por simples o complejos o resaltando su importancia biológica, que será lo suficientemente destacada a lo largo de este tema.

Estructura y características de los ácidos grasos

Son ácidos carboxílicos de cadena larga, suelen tener nº par de carbonos (14 a 22), los más abundantes tienen 16 y 18 carbonos.

Los ácidos grasos son saturados cuando no poseen enlaces dobles, son flexibles y sólidos a temperatura ambiente.

Los Insaturados o poliinsaturados si en la cadena hay dobles o triples enlaces, rígidos a nivel del doble enlace siendo líquidos aceitosos.

Propiedades físicas.

A)Solubilidad. Son moléculas bipolares o anfipáticas (del griego amphi, doble). La cabeza de la molécula es polar o iónica y, por tanto, hidrófila (-COOH). La cadena es apolar o hidrófoba (grupos -CH2- y -CH3 terminal).

B) Punto de fusión. En los saturados, el punto de fusión aumenta debido al nº de carbonos, mostrando tendencia a establecer enlaces de Van der Waals entre las cadenas carbonadas.

Los Insaturados tienen menos interacciones de este tipo debido al codo de su cadena.

Propiedades químicas.

A) Esterificación. El ácido graso se une a un alcohol por enlace covalente formando un ester y liberando una molécula de agua.

B)Saponificación. Reaccionan los álcalis o bases dando lugar a una sal de ácido graso que se denomina jabón. El aporte de jabones favorece la solubilidad y la formación de micelas de ácidos grasos.

Gracias a este comportamiento anfipático los jabones se disuelven en agua dando lugar a micelas monocapas, o bicapas si poseen agua en su interior.

También tienen un efecto espumante cuando la monocapa atrapa aire y detergente o emulsionante si contienen pequeñas gotas de lípido.

PROPIEDADES FÍSICAS DE LAS GRASAS Y FUNCIÓN BIOLÓGICA Las propiedades físicas de estas sustancias son de gran importancia pues en cierto modo determinan su función biológica. Estas propiedades se deben, en gran medida, a la longitud y al grado de insaturación de la cadena hidrocarbonada de los ácidos grasos que las forman. Solubilidad: Los ácidos grasos son sustancias anfipáticas ya que la cadena hidrocarbonada es apolar mientras que el grupo carboxilo es polar. Esta propiedad será más ampliamente tratada más adelante. Los triglicéridos son sustancias apolares, prácticamente insolubles en agua. Los monoacilglicéridos y los diacilglicéridos, al tener la glicerina radicales OH- libres, tienen cierta polaridad. Punto de fusión: Los ácidos grasos saturados, al poderse disponer la cadena hidrocarbonada totalmente extendida, pueden empaquetarse estrechamente lo que permite que se unan mediante fuerzas de Van der Waals con átomos de cadenas vecinas (el número de enlaces, además, está en relación directa con la longitud de la cadena). Por el contrario, los ácidos grasos insaturados, al tener la cadena doblada por los dobles enlaces no pueden empaquetarse tan fuertemente. Es por esto que los ácidos grasos saturados tienen puntos de fusión mas altos que los insaturados y son sólidos (sebos) a temperaturas a las que los insaturados son líquidos (aceites). En los animales poiquilotermos y en los vegetales hay aceites y en los animales homeotermos hay sebos. Los sebos y los aceites están formados por mezclas más o menos complejas de acilglicéridos. Las grasas tienen sobre todo funciones energéticas. En los vegetales se almacenan en las vacuolas de las células vegetales (las semillas y frutos oleaginosos) y en el tejido graso o adiposo de los animales. Contienen en proporción mucha más energía que otras sustancias orgánicas, como por ejemplo el glucógeno, pues pueden almacenarse en grandes cantidades y en forma deshidratada, con lo que ocupan un menor volumen. En el intestino, las lipasas hidrolizan los acilglicéridos liberando glicerina y ácidos grasos. En algunos animales las grasas acumuladas bajo la piel sirven como aislante térmico o para regular la flotabilidad, pues son malas conductoras del calor y menos densas que el agua.

Acilglicéridos, grasa simples o neutras

Son lípidos simples formados por glicerol esterificado por uno, dos, o tres ácidos grasos, en cuyo caso: monoacilglicérido, diacilglicérido o triacilglicérido respectivamente.

Clasificación. Atendiendo a la temperatura de fusión se clasifican en:A) Aceites. Si los ácidos grasos son Insaturados o de cadena corta o ambas cosas a la vez, la molécula resultante es líquida a temperatura ambiente y se denomina aceite.Se encuentra en las plantas oleaginosas: el fruto del olivo es rico en ácido oleico (monoinsaturado), las semillas del girasol, maíz, soja etc. son ricos en poliinsaturados como el linoleico, algunas plantas que viven en aguas frías contienen linolénico y eicosapentanoico,

que también se acumulan en las grasas de los pescados azules que se alimentan de ellas como el salmón.

B) Mantecas. Son grasas semisólidas a temperatura ambiente. La fluidez de esta depende de su contenido en ácidos Insaturados y esto último relacionado a la alimentación.Los animales que son alimentados con grasas insaturadas, generan grasas más fluidas y de mayor aprecio en alimentación. (Seria el caso de un cerdo alimentado con bellotas)

C)Sebos. Son grasas sólidas a temperatura ambiente, como las de cabra o buey. Están formadas por ácidos grasos saturados y cadena larga.

Lípidos complejos o de Membrana

En su composición intervienen ácidos grasos y otros componentes como alcoholes, glúcidos, ácido fosfórico, derivados aminados etc.Son moléculas anfipáticas con una zona hidrófoba, en la que los ácidos grasos están unidos mediante enlaces ester a un alcohol (glicerina o esfingosina), y una zona hidrófila, originada por los restantes componentes no lipídicos que también están unidos al alcohol.

Encontramos los siguientes tipos:

- Glicerolípidosa) Gliceroglucolípidos

b) Glicerofosfolípidos (fosfolípidos)

- Esfingolípidosa) Esfingoglucolípidos

b) Esfingofosfólípidos

1.- Glicerolípidos.

Poseen dos moléculas de ácidos grasos mediante enlaces ester a dos grupos alcohol de la glicerina (posiciones y ). Según sea el sustituyente unido al tercer grupo alcohol de la glicerina se forman los:

a) Gliceroglucolípidos. Si se une un glúcido. Lípidos que se encuentran en membranas de bacterias y células vegetales.

b) Fosfolípidos. Se une el ácido fosfórico y constituye el ácido fosfatídico.

La estructura de los distintos Fosfolípidos se pueden considerar derivados del ácido fosfatídico, y por ello se nombran con el prefijo fosfatidil seguido del nombre del derivado aminado o polialcohol con el que se une. Así se obtienen los derivados fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilserina, fosfatidilglicerol y fosfatidilinositol.

Los Fosfolípidos tienen un gran interés biológico por ser componentes estructurales de las membranas celulares.

2.- Esfingolípidos. Todos ellos poseen una estructura derivada de la ceramida (formada por un ácido graso unido por enlace amida a la esfingosina)

Pueden ser de dos clases:

a)Esfingoglucolípidos. Resultan de la unión de la ceramida y un conjunto de monosacáridos como la glucosa y galactosa entre otros.Los más simples se denominan cerebrósidos y sólo tienen un monosacárido (glucosa o galactosa) unida a la ceramida. Los más complejos son los gangliósidos, que poseen un oligosacárido unido a la ceramida.Estas moléculas forman parte de las membranas celulares y especialmente de la plasmática, donde se intercalan con los fosfolípidos.

b) Esfingofosfolípidos. El grupo alcohol de la ceramida se une a una molécula de ácido ortofosfórico que a su vez lo hace con otra de etanolamina o de colina. Así se originan las esfingomielinas muy abundantes en el tejido nervioso, donde forman parte de las vainas de mielina.

Céridos o ceras

Son ésteres de un ácido graso de cadena larga. Sólidos a temperatura ambiente, poseen sus dos extremos hidrófobos, lo que determina su función impermeabilizar y proteger.

Entre las más conocidas se encuentran la de abeja (ésteres del ácido palmítico con alcoholes de cadena larga), la lanolina (grasa de lana de oveja), el aceite de espermaceti (producido por el cachalote) y la cera de cornauba (extraído de una palmera de Brasil).En general en los animales se encuentran en la piel, recubriendo el pelo, plumas y exoesqueleto de insectos. En los vegetales forman películas que recubren hojas, flores y frutos.

Esteroides

Son lípidos que derivan del ciclopentano perhidrofenantreno, denominado gonano (antiguamente esterano). Su estructura la forman cuatro anillos de carbono (A, B, C y D). Los esteroides se diferencian entre sí por el nº y localización de sustituyentes.

Los esteroides más característicos son:

a)Esteroles. De todos ellos, el colesterol es el de mayor interés biológico. Forma parte de las membranas biológicas a las que confiere resistencia, por otra parte es el precursor de casi todos los demás esteroides.

Otros esteroles constituyen el grupo de la vitamina D o calciferol, imprescindible en la absorción intestinal del calcio y su metabolización.

b) Ácidos biliares. Derivan de los ácidos cólico, desoxicólico y quenodesoxicólico, cuyas sales emulsionan las grasas por lo que favorecen su digestión y absorción intestinal.

c) Hormonas esteroideas. Incluyen las de la corteza suprarrenal, que estimulan la síntesis del glucógeno y la degradación de grasas y proteínas (cortisol) y las que regulan la excreción de agua y sales minerales por las nefronas del riñón (aldosterona). También son de la misma naturaleza las hormonas sexuales masculinas y femeninas (andrógenos como la testosterona, estrógenos y progesterona) que controla la maduración sexual, comportamiento y capacidad reproductora.

Terpenos o Isoprenoides

Están formados por polimerización del isopreno.

Son moléculas muy abundantes en los vegetales y su clasificación se determina por el nº de isoprenos que contienen.

a) Monoterpenos: (dos isoprenos)Se encuentran aquí los aceites esenciales de muchas plantas, a las que dan su olor sabor característicos: mentol, geraniol, limoneno, pineno, alcanfor etc.

b) Diterpenos: (cuatro isoprenos) Es de destacar el fitol que forma parte de la clorofila y ser precursor de la vitamina A. Las vitaminas A, E y K también son diterpenos.

c) Tetraterpenos: (ocho isoprenos) En este grupo son abundantes las xantofilas y carotenos, pigmentos vegetales amarillo y anaranjado respectivamente. Dan color a los frutos, raíces (zanahoria) flores etc.En la fotosíntesis desempeñan un papel clave absorbiendo energía luminosa de longitudes de onda distinta a las que capta la clorofila. El caroteno es precursor de la vitamina A.

d) Politerpenos: (muchos isoprenos) Es de destacar el caucho, obtenido del Hevea Brasiliensis, que contiene varios miles de isoprenos. Se usa en la fabricación de objetos de goma.

Funciones de los lípidos1. Reserva. Constituyen la principal reserva energética del organismo. Sabido es que un

gramo de grasa produce 9,4 Kc. En las reacciones metabólicas de oxidación, mientras que los prótidos y glúcidos solo producen 4,1 Kc./gr. La oxidación de los ácidos grasos en las mitocondrias produce una gran cantidad de energía.Los ácidos grasos y grasas (Acilglicéridos) constituyen la función de reserva principal.

2. Estructural. Forman las bicapas lipídicas de las membranas citoplasmáticas y de los orgánulos celulares. Fosfolípidos, colesterol, Glucolípidos etc. son encargados de

cumplir esta función.En los órganos recubren estructuras y les dan consistencia, como la cera del cabello. Otros tienen función térmica, como los acilglicéridos, que se almacenan en tejidos adiposos de animales de clima frío.También protegen mecánicamente, como ocurre en los tejidos adiposos de la planta del pie y en la palma de la mano del hombre.Resumiendo: la función estructural está encargada a Glucolípidos, Céridos, Esteroles, Acilglicéridos y Fosfolípidos.

3. Transportadora. El transporte de lípidos, desde el intestino hasta el lugar de utilización o al tejido adiposo (almacenaje), se realiza mediante la emulsión de los lípidos por los

ácidos biliares y los proteolípidos, asociaciones de proteínas específicas con triacilglicéridos, colesterol, fosfolípidos, etc., que permiten su transporte por sangre y linfa.

Las enzimas

La Enzima Como Unidad Fundamental De Vida

Cada célula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que comporta continuos cambios en su estado bioquímico, en la base de la cual están las enzimas, que tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintéticos y analíticos. Los propios genes son reguladores de la producción de las enzimas; por tanto, genes y enzimas pueden considerados como las unidades fundamentales de la vida.

Este concepto poco difundido casi hasta el siglo XX, se ha desarrollado y concretado cada vez mas, y constituye un componente esencial de diversas disciplinas: la microbiología, la fisiología, la bioquímica, la inmunología y la taxonomía, formando además parte del campo aplicado, en gran variedad de industrias. El rasgo particular de las enzimas es que pueden catalizar procesos químicos a baja temperatura, compatible con la propia vida, sin el empleo de sustancias lesivas para los tejidos. La vida es, en síntesis, una cadena de procesos enzimáticos, desde aquellos que tienen por sustratos los materiales mas simples, como el agua (H2O) y el anhídrido carbónico (CO2), presentes en los vegetales para la formación de hidratos de carbono, hasta los mas complicados que utilizan sustratos muy complejos.

La formación de los prótidos, los glúcidos y los lípidos es un ejemplo típico: Son a la vez degradados y reconstruidos por otras reacciones enzimáticas, produciendo energía a una velocidad adecuada para el organismo, sin el gasto energético que exigen los métodos químicos de laboratorio.

Características de las enzimas

Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas de carbono (C), Hidrógeno (H), oxigeno (O), Nitrógeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero siempre con peso molecular bastante elevado y común propiedades catálicas especificas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden sistemático de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema funcional son alterados de algún modo, cada organismo sufre mas o menos gravemente y el trastorno puede ser motivado tanto por la falta de acción como por un exceso de actividad de enzima.

Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiologicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las deficiencias en la funcion enzimatica causan patologias.

Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales. La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la división celular, la reproducción, etc. Están regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, etc.; prácticamente constante.

A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción o solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcadas que en general actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminoácidos que tienen su carbono a , asimétrico, con estructura L-, no muestran la menor actividad sobre formas idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D-.

En los sistemas biológicos se llevan a cabo diversas reacciones a partir de la misma sustancia; por ejemplo algunos microorganismos convierten la glucosa en alcohol y bióxido de carbono, al paso que otros gérmenes la convierten en ácido láctico o ácido pirúvico o acetaldehido. Esto quiere decir que la glucosa puede descomponerse en distintos productos y aunque todas las posibilidades son teóricas y prácticamente posibles la presencia de ciertas enzimas favorece uno de los caminos que llevan a la acumulación de determinados compuestos.

Las enzimas, por lo tanto, se consideran como catalizadores altamente específicos que:

Modifican la velocidad de los cambios promovidos por ellas. Determinan que sustancias particulares, de preferencia a otras distintas son las que

van a sufrir los cambios. Impulsan dentro de los distintos cambios posibles que pueda seguir una sustancia, cual

de ellos en especial, será el utilizado.

Las enzimas representan las sustancias encargadas de graduar la velocidad de una reacción determinada en el interior de las células; como en las diversas células se realizan infinidad de reacciones, ya que en una de ellas se encuentran varios miles de sustancias, se deduce, también, la presencia de varios miles de enzimas. Es posible, por lo tanto, que la mayor parte de esta estructura proteínica celular esté formada por enzimas, encargadas de las diversas funciones de síntesis, degradación, oxidación, etc. características de la actividad vital de los distintos organismos.

La estructura enzimática

Por su estructura y composición química puede afirmarse que el origen de las enzimas esta vinculando al origen de las sustancias proteicas. Al hablar del origen de la vida se ha citado el éxito de los experimentos realizados en el laboratorio para la producción de aminoácidos; estos aminoácidos son los que precisamente constituyen la base del edificio proteico. También en el laboratorio se ha intentado la síntesis de proteínas a partir de aminoácidos.

La sede de las enzimas es el citoplasma. Los cloroplastos vegetales contienen una amplia gama enzimas encargadas de la función clorofílica, proceso que a través de reacciones químicas complejas y encadenadas transforman compuestos inorgánicos, como el agua, y el anhídrido carbónico, en sustancias complejas adecuadas para ser entre otras cosas el alimento fundamental de los animales.

En las mitocondrias existe un sistema de transporte de electrones que determinan importantes fenómenos de oxidorreducción, durante los cuales se forman notables cantidades de ATP, que es un compuesto altamente energético del que depende la mayor parte de metabolismo, y coma, por tanto el trabajo de las células; en las mitocondrias se produce el metabolismo enzimático de los ácidos grasos, los cuales son en parte elaborados también en el citoplasma.

En los ribosomas tiene lugar concretamente todas la s síntesis de las sustancias proteicas, mientras que en los lisosomas se producen enzimas hidrolíticos cuya misión escindir, con la intervención del agua, moléculas grandes en otras menores, que pueden a su vez ser utilizadas por las células; en cambio, las enzimas glucolíticos están difundidos en el citoplasma.

La localización de las sedes de las distintas operaciones enzimáticas antes mencionadas ha sido posible a través del sistema de ruptura de las células y de la separación de los distintos componentes mediante centrifugación diferencial del homogeneizado de estas la ruptura celular y la subdivisión de los componentes subcelulares se realizan actualmente utilizando los tejidos, por ejemplo con saltos bruscos desde temperaturas inferiores a 0° C hasta temperaturas mas elevadas con cambios de presión osmótica o mediante ultrasonidos.

Naturaleza química de las enzimas

Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son proteinas. Las más importantes son las siguientes:

a. El análisis de las enzimas obtenidas en forma más pura, criatalizada, demuestra que son proteínas.

b. Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en general, la cinética de la desnaturalización térmica de las enzimas da resultados muy parecidos a los de la desnaturalización térmica de las proteínas; por ejemplo el Q10 de la mayoría de las reacciones químicas es de 2 a 3, y, en el caso de las enzimas, a temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 ° C, la actividad neta aumeta varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalización térmica de las proteínas.

c. Las enzimas son activadas en unas zona muy restringida de pH, y presenta un punto óptimo de ph donde su actividad es mayor. Las proteínas en su punto isoeléctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista de viscosidad, solubilidad, difución, etc., que resulta del todo similares a las propiedades de este tipo que muestran las enzimas.

d. Todos los agentes que desnaturalizan a las proteínas también destruyen o inactivan a las enzimas, ya sea el calor, los ácidos fuertes, o los metales pesados que pueden combinarse con ellas.

e. Los problemas de solubilidad y de precipitación son comunes a las proteínas y las enzimas; en general, son solubles en agua o soluciones salinas, insolubles en alcohol, precipitan con determinadas concentraciones de sales neutras, etc.

Composición química de las enzimas

Los conocimientos sobre la composición química de las enzimas constituyeron materia de numerosas controversias hasta 1926, cuando J.B Sumner (1887-1955) consiguió cristalizar la ureasa, enzima que transforma la urea en anhídrido carbonico y amoniaco, y demostrar que era una sustancia proteica.

A, partir de entonces fueron aisladas otras enzimas en forma pura, cristalina, y el análisis demostraba siempre la presencia de una proteina, simple o conjugada. Cuando los analisi químicos demuestran que la enzima es una proteína conjugada, pueden distinguirse en el dos partes bien diferenciadas:

El grupo prosteico (Coenzima) La proteina (Apoenzima)

En algunas enzimas oxidantes fue observada la presencia de la promoporteinas, en las cuales el grupo prospético esta representado por un compuesto que contiene Fe y otro elemento, el cual desmpeña un papel importante en la combinación de la proteina con el sustrato; otras veces este grupo prostético es derivada de vitaminas (como la vitamina B); 4en muchos casos resulta facil de separar de la molécula proteica. No obstante una vez separadas, las dos unidades no muestran actividad enzimático; por tanto el grupo proteico (coenzima) y el grupo proteico (apoenzima) han de estar íntimamente ligados entre si para ser operativos. Por consiguiente, de las enzimas pueden distinguirse los formados por:

Solo proteínas, que difieren entre si por la secuencia con que los aminoácidos están combinados, como la ureasa y las enzimas digestivas (la pepsina y la tripsina)

Los conjugados, separados en dos entidades químicas bien definidas: la coenzima y la apoenzima.

Después del descubrimiento de Sumner, el numero de la enzimas y el estudio de sus actividades químicas proporcionaron un notable impulso en la enzimología, y la gran cantidad de las enzimas que rápidamente se acumulaban determinaron la necesidad de utilizar una clasificación o nomenclatura para evitar errores y facilitar la comprensión de futuros investigadores.

Nomenclatura y clasificacion de las enzimas

Cien años atrás solo se conocian enzimas, muchas de estas, catalizaban la hidrólisis de enlaces covalentes. Algunas enzimas, de manera especial las que fueron descubiertas en un principio, recibieron nombres ligados mas bien a su sitio de procedencia anatómica que no siguen ninguna regla ni sistema; tal es el caso de la ptialina de la saliva, que ataca al almidón de la pepsina del estómago y de la tripsina del páncreas, que atacan proteínas; de la renina, que cuagula la leche; de la papaina, enzima proteolítica que se encuentra en la papaya y de las catepsinas, también proteasas, que se encuentran en las células. Las enzimas relacionadas con la cuagulación de la sangre, como son la trombina, la plasmina, el plasminógeno, etc. reciben también nombres sistematizados.

Al descrubir nuevas enzimas y proceder a su caracterización estricta se aplicaron reglas de nomenclatura basadas en el nombre del sustrato atacado, o en el tipo general de sustrato, o en la reacción catalizada y se ha añadido convencionalmente, la terminación -asa. Por ejemplo:

las lipasas (hidrolizan lipidos o grasas), las amilasas (hidrolizan almidon), las proteasas (hidrolizan proteinas), las esterasas (basado en la unión general de tipo éster presentes en muchas sustancias), colesterol estrerasa (si la esterasa es específica de los esteres de colesterol) y acetilcolina esterasa (si la estersa de la acetilcolina). Otros ejemplos: Las fosfatasas son enzimas que atacan las uniones éster, pero en este caso, toman su nombre del grupo vecino a la unión que van a atacar, de manera que se denominan fosfatasas (cuando quitan una molécula de monofosfato), pirofosfatasas (cuando quitan el ácido fosfórico como esteres dobles (pirofosfatos), o triples, etc.) De la misma manera, las carbohidrasas se denominan así genericamente, pero pueden comprender enzimas con nombres proveniente del sustrato particular sobre el que actuan como la amilasa que ataca al almidón y la celulasa que actúa sobre la celulosa y, en otras ocaciones, se denominan de acuerdo con la unión atacada, como la b -glucosidasa que actúa sobre las uniones b -glucosídicas. Los ejemplos se pueden extender a todos los terrenos de la actividad enzimática, como en las enzimas proteolíticas, las fosforilasas, las nucleasas, etc.

Esta manera de llamarlas, se demostro que era inadecuada porque al descubrirse varias enzimas, notaron que varias enzimas catalizaban reacciones diferentes del mismo sustrato, por ejemplo, oxidacion o reduccion de la funcion alcohol de un azucar.

Aunque el sufijo –asa continua en uso; actualmente, al nombrar a las enzimas, se enfatiza el tipo de reaccion catalizada. Por ejemplo: las hidrogenasas catalizan la eliminacion de hidrogeno y las transferasas, reacciones de transferencia de grupo. Con el descubrimiento de mas y mas enzimas, surgieron ambiguedades y con frecuencia no estaba claro cual era la enzima que un investigador deseaba estudiar. Para remediar esta deficiencia, la Comisión para el estudio de las enzimas, que constituye con respecto a los sistemas anteriores un punto de vista más uniforme, preciso y descriptivo; esta formada por la Union Internacional de Bioquimica (IUB) adopto, en 1964, un sistema complejo pero inequivoco de la nomenglatura enzimatica basado en el mecanismo de reaccion.

El sistema se basa en la reacción química catalizada que es la propiedad específica que caracteriza a cada enzima las cuales se agrupan en clases, porque catalizan procesos semejantes, y en subclases que especifican con mayor exactitud la reacción particular considerada. En general, las enzimas reciben un nombre de acuerdo con el sustrato o los sustratos que participan en la reacción seguido por el tipo de reacción catalizada y, por fin, la terminación -asa. A menudo los nombres así obtenidos resultan largos y complejos, por lo que es muy dificil que en la práctica se pueda excluir el uso de los nombres triviales, consagrados por la costumbre. Sin embargo, con fines de sistematización, se reconoce la necesidad de aceptar el nuevo sistema.

Aunque su claridad y carencia de ambigüedad recomiendan al sistema de nomenglatura IUB para trabajos de investigacion, nombres mas ambiguos, pero basante mas cortos persisten en libros de texto y en el laboratorio clinico. Por esta razon, a continuacion solo se presenta principios generales del sistema IUB:

1. Las reacciones y las enzimas que las catalizan se dividen en 6 clases principales, cada una con 4 a 13 subclases.

2. El nombre de la enzima tiene 2 partes: la primera es el nombre del o los sustratos; la segunda, con terminacion –asa, indica el tipo de reaccion catalizada.

3. Informacion adicional, si es necesario aclarar la reaccion, puede seguir el parentesis. Por ejemplo: la enzima que cataliza L-malato + NAD= = piruvato + CO2 NADH + H= , se denomina como 1.1.1.37 L-malato:NAD+ oxidorreductasa (descarboxilante).

4. Cada enzima tiene un numero clave (E.C.) que caracteriza al tipo de reaccion según la clase (primer digito), subclase (segundo digito) y subclase (tercer digito). El cuarto

digito es para la enzima especifica. Asi, E.C. 2.7.1.1 denota la clase 2 (una transferasa), subclase 7 (transferencia de fosfato), sub-clase 1 (una funcion alcohol como aceptor de fosfato). El ultimo digito denota a la enzima hexocinasa o ATP: D-hexosa-6-fosforotransferasa, enzima que cataliza la transferencia de fosfato desde el ATP al grupo hidroxilo de carbono 6 de la glucosa.

Al final de sus y trabajos, clasifico las enzimas en seis grupos principales, correspondientes por sus términos a las raciones que cada enzima ejerce sobre el sustrato. Estos grupos se subdividen en otro, según el tipo de sustrato y los átomos concretos que son sensibles a sus acciones. Estos seis grupos son los siguientes:

1. Oxidoreductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Isomerasa 5. Liasas

1.Oxido-reductasas: Son las enzimas relacionadas con las oxidaciones y las reducciones biológicas que intervienen de modo fundamental en los procesos de respiración y fermentación. Las oxidoreductasas son importantes a nivel de algunas cadenas metabólicas, como la escisión enzimática de la glucosa, fabricando también el ATP, verdadero almacén de energía. Extrayendo dos átomos de hidrógeno, catalizan las oxidaciones de muchas moléculas orgánicas presentes en el protoplasma; los átomos de hidrógeno tomados del sustrato son cedidos a algún captor.

En esta clase se encuentran las siguientes subclases principales: Deshidrogenasas y oxidasas. Son más de un centenar de enzimas en cuyos sistemas actúan como donadores, alcoholes, oxácidos aldehidos, cetonas, aminoácidos, DPNH2, TPNH2, y muchos otros compuestos y, como receptores, las propias coenzimas DPN y TPN, citocromos, O2, etc.

2.Las Transferasas: Estas enzimas catalizan la transferencia de una parte de la molécula (dadora) a otra (aceptora). Su clasificación se basa en la naturaleza química del sustrato atacado y en la del aceptor. También este grupo de enzimas actúan sobre los sustratos mas diversos, transfiriendo grupos metilo, aldehído, glucosilo, amina, sulfató, sulfúrico, etc.

3.Las Hidrolasas: Esta clase de enzimas actúan normalmente sobre las grandes moléculas del protoplasma, como son la de glicógeno, las grasas y las proteínas. La acción catalítica se expresa en la escisión de los enlaces entre átomos de carbono y nitrógeno (C-Ni) o carbono oxigeno (C-O); Simultáneamente se obtiene la hidrólisis (reacción de un compuesto con el agua)de una molécula de agua. El hidrógeno y el oxidrilo resultantes de la hidrólisis se unen respectivamente a las dos moléculas obtenidas por la ruptura de los mencionados enlaces. La clasificación de estas enzimas se realiza en función del tipo de enlace químico sobre el que actúan.

A este grupo pertenecen proteínas muy conocidas: la pepsina, presente en el jugo gástrico, y la tripsina y la quimiotripsina, segregada por el páncreas. Desempeñan un papel esencial en los procesos digestivos, puesto que hidrolizan enlaces pépticos, estéricos y glucosídicos.

4.Las isomerasas:Transforman ciertas sustancias en otras isómeras, es decir, de idéntica formula empírica pero con distinto desarrollo. Son las enzimas que catalizan diversos tipos de isomerización, sea óptica, geométrica, funcional, de posición, etc. Se dividen en varias subclases.

Las racemasas y las epimerasas actúan en la racemización de los aminoácidos y en la epimerización de los azúcares. Las primeras son en realidad pares de enzimas específicas para los dos isómeros y que producen un solo producto común. Las isomerasas cis – trans modifican la configuración geométrica a nivel de un doble ligadura. Las óxido – reductasas intramoleculares cetalizan la interconversión de aldosas y cetosas, oxidando un grupo CHOH y reduciendo al mismo tiempo al C = O vecino, como en el caso de la triosa fosfato isomerasa, presente en el proceso de la glucólisis ; en otros casos cambian de lugar dobles ligaduras, como en la (tabla) isopentenil fosfato isomerasa, indispensable en el cambio biosinético del escualeno y el colesterol. Por fin las transferasas intramoleculares (o mutasas) pueden facilitar el traspaso de grupos acilo, o fosforilo de una parte a otra de la molécula, como la lisolecitina acil mutasa que transforma la 2 – lisolecitina en 3 – lisolecitina, etc. Algunas isomerasa actúan realizando inversiones muy complejas, como transformar compuestos aldehídos en compuestos cetona, o viceversa. Estas ultimas desarrollan una oxidorreducción dentro de la propia molécula (oxido rreductasa intramoleculares)sobre la que actúan, quitando hidrógeno, a algunos grupos y reduciendo otros; actúan ampliamente sobre los aminoácidos, los hidroxácidos, hidratos de carbono y sus derivados.

5.Las Liasas: Estas enzimas escinden (raramente construyen) enlaces entre átomos de carbono, o bien entre carbono y oxigeno, carbono y nitrógeno, y carbono y azufre. Los grupos separados de las moléculas que de sustrato son casi el agua, el anhídrido carbónico, y el amoniaco. Algunas liasa actúan sobre compuestos orgánicos fosforados muy tóxicos, escindiéndolos; otros separan el carbono de numerosos sustratos.

6.Las Ligasas: Es un grupo de enzimas que permite la unión de dos moléculas, lo cual sucede simultáneamente a la degradación del ATP, que, en rigor, libera la energía necesaria para llevar a cabo la unión de las primeras. Se trata de un grupo de enzimas muy importantes y recién conocidas, pues antes se pensaba que este efecto se llevaba a cabo por la acción conjunta de dos enzimas, una fosfocinasa, para fosforilar a una sustancia A (A + ATP A - ℗ + ADP) y una transferasa que pasaría y uniría esa sustancia A, con otra, B (A -℗ + B A – B + Pi ). A este grupo pertenecen enzimas de gran relevancia reciente, como las aminoácido –ARNt ligasas conocidas habitualmente con el nombre de sintetasas de aminoácidos –ARNt o enzimas activadoras de aminoácidos que representan el primer paso en el proceso biosintético de las proteínas, y que forman uniones C-O; las ácido-tiol ligasas, un ejemplo típico de las cuales es la acetil coenzima. A sintetasa, que forma acetil coenzima. A partir de ácido acético y coenzima A ; las ligasas ácido – amoniaco (glutamina sintetasa), y las ligasas ácido-aminoácido o sintetasas de péptidos, algunos de cuyos ejemplos más conocidos son la glutación sintetasa, la carnosina sintetasa, etc.

La acción de estas enzimas se manifiesta con la formación de enlaces entre átomos de carbono y oxigeno de diversas moléculas, o bien entre carbono y azufre, carbono y nitrógeno y carbono y carbono. Las ligasas utilizan siempre, para el proceso de reacción, la energía proporcionada por el ATP o compuestos homólogos que son degradados, Por consiguiente las enzimas de esta clase son los únicos que intervienen en reacción no espontánea desde un punto de vista termodinámico; Actúan sobre los sustratos más diversos y revisten particular importancia en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

Estas reacciones enzimáticas se desarrollan en dos tiempos: en el primero se forma un complejo intermedio con potencia energética muy alta-, en el segundo utilizan la energía obtenida para realizar la reacción de síntesis.

Grupo Accion ejemplos

1. Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción. Tras la acción catálica quedan modificados en su grado de oxidación por lo que debe ser transformados antes de volver a actuar de nuevo.

Dehidrogenasas

Aminooxidasa

Deaminasas

Catalasas

2. Transferasas Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas)a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversiones de azucares, de aminoácidos, etc

Transaldolasas

Transcetolasas

Transaminasas

3. Hidrolasas Verifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Suele ser de tipo digestivo, por lo que normalmente actúan en primer lugar

Glucosidasas

Lipasas

Peptidasas

Esterasas

Fosfatasas

4. Isomerasas Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros de función o de posición. Suelen actuar en procesos de interconversion

Isomerasas de azúcar

Epimerasas

Mutasas

5. Liasas Realizan la degradación o síntesis (entonces se llaman sintetasas) de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energético.

Aldolasas

Decarboxilasas

6. Ligasas Realizan la degradación o síntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energía como los nucleosidos del ATP

Carboxilasas

Peptidosintetasas

Partes del sistema enzimatico

Los sistemas enzimáticos en general, están formados por la enzima propiamente dicha (apoenzima), el sustrato o los sustratos un grupo proteico ( o coenzimas) y sustancias activadoras. La estructura formada por la apoenzima y la coenzima se denomina boloenzima; con cierta frecuencia se reconocen sistemas enzimaticos que no tienen grupo prostético o activadores reconocidos.

Apoenzima: concepto del centro activo

La apoenzima es la enzima propiamente dicha, de naturaleza proteica formada por cadenas de polipéptidos, con peso moléculas elevado, no dializable y termolábil.

Las estudiadas analíticamente hasta ahora, han sido, por razones técnicas de peso molecular bajo, 12 a 24 000, tienen una sola cadena polipeptídica (ribonucleasa, papaina, tripsina, pepcina, etc.) excepto uno o dos casos (a - quimotripsina y aldolasa) que tienen dos.

El análisis de los aminoácidos que componen a diversas enzimas demuestran que tienen una estructura similar a la de cualquier proteína; existen, de hecho unos cuantos casos en los que se ha determinado su secuencia completa, es decir, el orden en el que están dispuestos todos ellos en la cadena. El análisis de la estructura secundaria de la proteína, osea el modo como la cadena peptídoica se dispone a lo largo de su eje mayor y el de la estructura terciaria, osea la forma en que la cadena se pliega y se acomoda para formar una estructura tridimensional se conocen muy mal para todas las enzimas. Solo en el caso de la lisozima (enzima presente en las lágrimas donde funciona como un antiséptico suave y que tiene la capacidad de atacar a los polisacáridos que forman la pared de diversas bactérias) se ha determinado la estructura tridimensional de una enzima; para este fin se aplican las técnicas de cristalografía de rayos x, con una solución de dos Å, lo que demostró que la lisosima es una proteína con su cadena de 129 aminoácidos ampliamente plegada y en la que se reconoce una hendidura representante del centro activo donde se acomodan muy bien los inhibidores – ciertos compuestos del tipo de carbohidratos – que nulifican su actividad enzimática. Se ha demostrado, en este caso, que es cierta regla general de que el modo como se ordenan y disponen los aminoácidos de termoina el arreglo espacial que permite a las otras partes del sistema enzimático – sustratos, cofactores, iones, etc. – adaptarse, en el espacio, en forma adecuada, para que se lleve a cabo la acción catalítica. Por lo tanto, las estructuras indispensables que permiten la combinación con el sustrato y que confieren propiedades enzimáticas a la molécula se denomina "centro activo". Se acepta que el centro activo no es una parte muy grande de la enzima completa y, en ciertos sistemas estudiados por medio de bloqueos químicos no parece constituir una zona de más de 20 Å de diámetro. Es muy posible que el centro activo esté formado por la contribución de grupos funcionales de aminoácidos situados en distintas cadenas o en diferentes repliegues de una cadena, asiendo aparecer a dichos grupos muy distantes entre ellos si se considera el orden que guardan a lo largo de la cadena polipeptídica.

Un caso muy ilustrativo sobre lo que significa la estructura del centro activo desde el punto de vista de la composición de los aminoácidos es el de la triptofano pirrolasa, enzima ampliamente estudiada en bacterias desde el punto de vista de la bioquímica genética. En ella, la modificación de algunos aminoácidos produce perdida e la actividad enzimática, que se recupera si vuelve a incluirse los aminoácidos en el orden original; sin embargo, se pueden reemplazar dos de ellos por otros completamente distintos, y la enzima vuelve a ser totalmente activa. Es posible que con estos nuevos aminoácidos se consigan también las condiciones de distribución espacial de grupos funcionales y estructuras necesarias para la actividad enzimática.

El concepto de arreglo tridimensional adecuado de los aminoácidos que forman la cadena polipeptídica de la enzima para lograr la actividad funcional correcta permite entender numerosos denómenos: la necesidad de que la molécula proteica íntegra esté preservada en su forma; el hecho de que la desnaturalización de la enzima al permitir la separación de los pliegues, conduce a la perdida de la actividad enzimática; que al calentar una enzima con su sustrato (por ejemplo, la invertasa con sacaroza, la transaminasa con ácido a -cetoglutárico), se impide una desnaturalización que sin ellos se produciría, pues es posible que el propio sustrato contribuya a sostener y reforzar la aproximación de los pliegues de la cadena, etc.

También se entiende por que al atacar la ribonucleasa con pepsina y romper una sola unión peptídica que separa un tetrapéptido del extremo con grupo carboxilo libre se pierde la actividad, mientras que si solo se quita los tres últimos disminuye su acción sugiriendo así la importancia del residuo de ácido aspártico para sostener el centro activo en condiciones de eficiencia, o lo que es más probable, para formar parte del propio centro activo. Si se parte la ribonucleasa entre los aminoácidos 20 y 21, y se separan los dos fragmentos, ninguno es activo, pero basta mezclarlos para que se unan en tal forma que se restablece la actividad, aunque un poco menor que la originalmente observada.

El estudio detallado de la estructura del centro activo se hace por medio de inhibidores o de reactivos que se combinan de modo específico, con algunos de los aminoácidos del centro activo tales como el diisopropilfluorofosfato (DFP), que se combina con el OH del aminoácido serina, en diversas esterasas, peptidasas, etc. , e inactiva el centro activo del que forman parte dicho aminoácido; este inhibidor, aún a concentraciones de 10 -10 M, inhibe a la acetilcolinesterasa; mucho de los derivados del DFP se utilizan como gases de guerra o como insecticidas (parathion), y su utilidad se debe, en rigor a su capacidad para destruir funcionalmente ciertas enzimas.

La unión del DFP al aminoácido cedina es muy estrecha y a permitido el análisis de los aminoácidos vecinos a él, haciendo un estudio de su ordenamiento en el centro activo. La secuencia de los centros activos de diversas enzimas hidrolíticas sensibles al DFP, se demuestran que la mayoría tienen cerina y a demás un aminoácido dicarboxílico (aspártico o glutámico) y en el otro un aminoácido neutro (alanina o glicina). También se ha demostrado que la histidina, cuando menos para el caso de la quimotripsina, forma parte del centro activo aún cuando el análisis de la secuencia no demuestra que exista cerca de la cerina ninguna histidina; se trata, por lo tanto, de otro ejemplo de una aminoácido, alejado e otro, y en distinto pliegue de la cadena, que integra el centro activo.

Teniendo en cuenta estos hechos, se deduce, por lo tanto, que la actividad de la enzima depende en parte de la disposición o arreglos de los aminoácidos y grupos prostéticos en determinada región de la proteína. Los aminoácidos que componen a las proteínas pueden tener moderadas actividades catalíticas, aunque de ninguna manera comparable en su magnitud, cuando se les considera en forma aislada, a las que muestran la gran molécula proteica. De hecho para muchos sistemas enzimáticos se han ideado modelos análogos, osea sustancias químicas sencillas que suelen reproducir los efectos ocasionados por la enzima, tal es el caso de los análogos, a base de piridoxsal que representan la parte activa de enzimas descarboxilantes y transaminantes. Esto no significa que necesariamente, en el estado natural, la enzima funcione como lo hace el análogo pues muchos sistemas pudieran tener otro mecanismo de operación; la hidrólisis del almidón lo mismo se logra con la adición del ácido que con la enzima específica amilasa, aún cuando en el primer caso se atacan indiscriminadamente numerosas uniones glucosídicas, y con la enzima, en cambio solo se desprenden, uno tras otro fragmentos de dos unidades de glucosa de los extremos de las ramificaciones.

Conformación de la enzima y propiedades del centro activo. La propiedad catalítica de las enzimas parece depender de la facilidad con la que ayudan a que se pongan en contacto las sustancias reaccionantes para dar el producto o los productos de la reacción. Esto implica que el sistema enzimático tenga una conformación especial osea, una disposición adecuada de os grupos funcionales – aminoácidos de la apoenzima y grupos prostéticos, cuando existen estos – y de las moléculas mismas de los sustratos que se unirán a aquellos y permitirán que se lleve a cabo la reacción química. Este acercamiento de las sustancias reaccionantes de los grupos prostéticos y los grupos funcionales fue las razón del modelo de Ehrlich, conocido clásicamente como de la "llave y la cerradura". Así

la enzima sería un molde tridimensional en negativo, de la estructura también tridimensional, en positivo de los reaccionantes que se adaptarían perfectamente a ala disposición de la enzima. Sin embargo ha sido necesario reconsiderar esta situación y sugerir – de acuerdo con Koshland – la teoría de un "acomodo inducido".

Así las enzimas pueden sufrir un cambio en su estructura desde el momento en que entran en contacto con los reaccionantes, sustratos y cofactores, y es posible que todos ellos modifiquen el arreglo tridimensional de la enzima; la enzima los recibe en un orden determinado y cada uno de ellos al unirse a la enzima modifica su estructura. La nueva analogía es la del "guante y la mano"; aquel no representa una estructura de negativo tridimensional mientras no se halla la mano en el, ya que antes pueden tener diversas formas y disposiciones, una vez que ha entrado la mano - que a su vez también puede adoptar distintas posiciones – se ponen en contacto todas las partes correspondientes, es decir, en el caso de la enzima, las partes reactivas del sistema enzimático, con las partes reaccionantes, osea los sustratos. Se ha preservado con esta nueva idea, el aspecto de la armonía estructural entre el sustrato y la enzima pero se introduce el nuevo concepto de que es necesario provocar un cambio en la estructura proteica que favorezca la colocación adecuada de todos los elementos que interviene en la reacción enzimática. Los cambios de la estructura protéica se denominan "conformacionales". El cambio en la disposición tridimensional puede hacerse a distancia y en muchas ocasiones la unión del sustrato a una parte de la enzima modifica otras zonas de ella y aún su estructura completa, debido a plegamientos que acercan o alejan diversos grupos colocados a lo largo del péptido que forma la enzima. Esta alteración múltiple y de tipo flexible, permite entender mejor el proceso de entrada ordenada de los sustratos, y los cofactores y la reacción en la que se participan. También permiten comprender porque un sustrato entra a una enzima y es atacado y uno que no lo es aún muy parecido a él, puede quedar excluido del centro activo.

Se ejemplifican estas ideas en A se encuentra la enzima en una forma desplegada con ciertos grupos reactivos (+) y (-), colocados en una zona de la superficie de la enzima. La entrada de un cofactor F1, modifica una parte del sistema (B); se introduce en el sistema un nuevo arreglo a base de la reactividad de tipo electrónico entre la zona (+) y una parte del cofactor F 1, recién introducido; por fin la entrada de un nuevo reaccionate F2 modifica la parte terminal de la enzima de manera que permite la entrada del otro reaccionante (sustrato) que se acomoda en un lugar preparado previamente por los reaccionantes F1 y F2, y permite de esta manera echar a andar la reacción catalítica. Los cambios conformacionales, se pueden demostrar con diversos métodos algunos de tipo físico, como son las modificaciones en la rotación óptica o en el patrón de sedimentación en el campo gravitacional de la ultracentrífuga, o químicos como el aumento o la disminución de la actividad enzimática bajo la influencia de cambios térmicos o la adición de agentes desnaturalizantes. Basten unos cuantos ejemplos: la transaminasa a -cetoglutárica se pude calentar a 65° C. en presencia de su sustrato sin que se afecte, al paso que la enzima sola es rápidamente degradada, cambia de configuración y se precipita; la miosina, proteína muscular contráctil, en presencia de ATP hace más notable su forma de espiral y permite el reconocimiento de aminoácidos previamente ocultos en sus pliegues; la D-amino oxidasa, al unirse a su cofactor, el FAD, pasa de la forma espiral en a -hélice, a una disposición irregular distribuida al azar.

Bioquímica celular

Catabolismo

Catabolismo, concepto energético celular

Es un conjunto de reacciones en que se rompen moléculas de alimento en otras más pequeñas y se libera energía. En la mayoría de los casos el catabolismo tiene lugar en las mitocondrias, que contienen enzimas y facilitan esta ruptura. Esta ruptura tiene lugar de manera escalonada. Si fuera de golpe dañaría las células. La degradación de la glucosa requiere 30 pasos sucesivos. En cada paso actúan enzimas específicas.

Sustancia alimenticia + O2 ! CO2 + H2O + Energía (ATP)

Respiración celular

Son reacciones de oxidación. La energía química de los alimentos se va a transformar en energía para la célula. Esta oxidación de las moléculas orgánicas es como principalmente obtienen energía las células. Ésta puede ser de 2 tipos:

Aerobia: la degradación de las moléculas es completa. La molécula orgánica se degrada hasta formar moléculas inorgánicas. La respiración se realiza con intervención de oxígeno. La liberación de energía es mayor aquí que en la anaerobia.

Anaerobia: se obtiene energía sin intervención de oxígeno. La degradación no es total, se forman compuestos intermedios. Podemos distinguir dos subtipos: anaerobia propiamente dicha y fermentación. La anaerobia se da en todos los organismos, incluido el hombre.

Respiración aerobia ! Glucosa ! CO2, H2O, Energía

Respiración

celular Fermentación ! Glucosa ! CO2, Alcohol etílico, Energía

Respiración anaerobia ! Glucosa ! CO2, Ácido láctico, Energía

La mayor parte de energía la proporcionan los glúcidos. Es en el interior de las mitocondrias donde los glúcidos se degradan enzimáticamente y se va a liberar energía que sintetizará ATP. El catabolismo de la glucosa es fundamental para los vertebrados. El balance final del catabolismo es:

C6H12O6 + 6O2 ! 6CO2 + 6H2O + ENERGÍA

Se obtienen 686 Kcal por mol de glucosa. La glucosa al oxidarse va a perder átomos de H, y éstos los va a ganar el oxígeno, con lo que se va a liberar agua, y mucha energía para sintetizar ATP. Distinguimos 3 etapas:

Glucólisis

Ciclo de Krebs

Fosforilación oxidativa

En la glucólisis y en el ciclo de Krebs se van a ir liberando átomos de C que se van a unir al O para formar CO2. En la fosforilación oxidativa el H se va a unir con el oxígeno para formar agua, al tiempo que se sintetiza el ATP (ADP+P).

La glucólisis ocurre en el citoplasma, la respiración es dentro de la mitocondria.

Vías glucolíticas

Los alimentos: fuente de energía

Todas las unidades biológicas se alimentan, con la finalidad de proveerse tanto de energía como de materia prima para su crecimiento y desarrollo.

Los alimentos pueden agruparse en tres grandes grupos: Carbohidratos, Proteínas y Grasas.

Estos tres tipos de alimentos al final pueden metabolizarse como energía para el organismo.

Grupo alimenticio Unidad metabolizada Transformación convergente

Carbohidratos Glucosa ENERGÍA en ATP

Grasas (Lípidos) Acidos grasos

Proteínas Aminoácidos

El ATP: la "moneda universal de E°" en los sistemas biológicos

Concepto:

El ATP pertenece al grupo de los nucleótidos, por lo tanto esta compuesto por una base nitrogenada (adenina), una pentosa (ribosa) y un grupo fosfato (tres radicales fosfato con enlaces de alta energía).

ATP significa Adenosina Tri Fosfato, o Trifosfato de Adenosina. Tómese en cuenta que fósforo se abrevia con la letra P.

Recuerde que la palabra fosfato significa que el fósforo está participando con carga de -5 (si fuera carga -3 sería fosfito). Vea el siguiente esquema del ATP:

El ATP es una molécula que almacena bastante energía, la misma se almacena en los enlaces fosfato que son dos para cada molécula de ATP (vea la figura). Cada uno de ellos equivale a 8000 kcal/mol, por lo tanto si tomamos en cuenta que son dos enlaces, tendríamos un potencial de 16000 kcal/mol de energía para cada molécula de ATP. Sirva de comparación que una molécula de glucosa tiene apenas 2260 kcal/mol de energía, pequeña cantidad comparada con el ATP.

Otro aspecto importante es que estos enlaces fosfato se rompen fácilmente, por lo cual su energía almacenada es bastante disponible para los proceso bioquímicos.

Vea el siguiente gráfico de los radicales fosfato y sus enlaces:

Liberación de energía del ATP:

La energía almacenada en los enlaces de fosfato se libera a través de un proceso catabólico.

Recuerde que catabolismo es un tipo de metabolismo que consiste en la transformación de una molécula compleja en otras más sencillas con liberación de energía.

Pues este es el caso del ATP, el cual tiende a liberar su grupo fosfato para transformarse en Adenosina Di Fosfato o ADP. Vea el siguiente gráfico:

De esta forma es que el ATP, libera energía transformándose en ADP + P + E°.

Esta reacción es reversible, o sea el ATP del organismo se reconstituye a partir de ADP para almacenar la energía presente en los alimentos que consumimos.

Usualmente el ATP se transforma en ADP para liberar energía, y el ADP en ATP para almacenar energía.

Sin embargo bajo ciertas condiciones el ADP se transforma en AMP (Adenosina Mono Fosfato), liberando así un excedente de energía al romper el segundo enlace fosfato, pero esta condición no es muy usual.

Atp, moneda universal de energía en los sistemas biológicos.

Es importante recalcar que esta "transacción" energética (almacenamiento y liberación) utilizando ATP es común en todos los sistemas biológicos, desde los procariotes hasta los organismos mas complejos del grupo pluricelular.

Debido a esto es que se conceptúa al ATP como la "moneda universal" de las transacciones energéticas en todos los sistemas biológicos.

Usos comunes del ATP

El ATP a parte que sirve para el almacenamiento "a cortísimo plazo" de la energía, es utilizado por el organismo para los siguientes procesos (todos ellos trabajos, recuerde que trabajo es toda utilización de energía):

Transporte activo en las membranas celulares, para el movimiento de solutos en contra del gradiente de concentración. De toda la utilización de ATP por las células, se le atribuye a este proceso un 30% de participación.

Síntesis de compuestos químicos (anabolismo), recuerde que muchos de los procesos bioquímicos requieren energía para ejecutarse o sea son procesos endergónicos. El ATP provee la energía para la ejecución de dichas reacciones. Se atribuye a estos proceso un 70% de participación en el uso global de ATP a niveles celulares.

Trabajo mecánico, específicamente movimiento muscular, de cilios - flagelos y movimientos ameboides.

Metabolismo energético: Síntesis de ATP

Lugar de síntesis

El lugar donde se sintetiza el ATP radica en las crestas mitocondriales. En los procariotes, este trabajo se realiza en la membrana celular.

En el citoplasma también se produce ATP, pero en proporciones considerablemente menores o muy poco significativas.

La energía de los alimentos y su transformación en ATP

Todos los grupos alimenticios (carbohidratos, lípidos y proteínas) pueden transformarse en ATP. Sin embargo los procesos que atraviesan son diferentes. Vea el siguiente esquema que acontece en el citoplasma celular:

En un primer paso, todos los grupos alimenticios se simplifican al dividirse en sus compuestos más sencillos, tal es el caso de los diversos carbohidratos que acaban simplificándose en glucosa, o las proteínas en aminoácidos.

Posteriormente estas "unidades menores" o simplificadas sufren transformaciones para convertirse en piruvato (o ácido pirúvico) para el caso de los carbohidratos y en acetoacetato para el caso de los lípidos y las proteínas.

Al final de este proceso que ocurre en el citoplasma celular, tanto el piruvato como el acetoacetato se transforman en acetil CoA, compuesto que ingresa a las mitocondrias para participar en la síntesis de ATP.

En un segundo paso, que ocurre en las mitocondrias, el acetil CoA es utilizado en un proceso denominado "Ciclo de Krebs" (en honor a Hans Krebs su descubridor), del cual resultan principalmente dos tipos de compuestos denominados NADH y FADH, los cuales son "vehículos biológicos de transferencia de electrones". Es pues durante este ciclo de Krebs que se libera bastante energía en procesos de oxido-reducción, de la cual concluyen estos "transportadores de electrones". Posteriormente el NADH y FADH ingresan a un proceso denominado "cadena respiratoria" del cual ya resulta la síntesis de ATP.

Metabolismo energético: Glucólisis.

ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES: ISOMERIZACIÓN Y REDOX

Primeramente, repasemos que es un isómero. Un isómero es un compuesto químico que tiene al misma composición de elementos y la misma cantidad de los mismos que otro compuesto químico. La única diferencia entre estos dos elementos radica en la distribución espacial de los átomos de los elementos.

Por ejemplo, el caso de la glucosa que es isómero de la fructosa. Ambos tienen la misma composición química de C, H y O y en iguales cantidades. O sea que la fórmula C6H12O6 es

común para ambos compuestos la diferencia radica en la distribución espacial de estos. Vea la figura:

Por lo tanto "isomerización", vendría a ser la transformación de un compuesto químico en su isómero, para el ejemplo anterior, la transformación de glucosa en fructosa o viceversa.

Ahora, repasemos un poco los conceptos de reducción y oxidación.

Se dice que un compuesto se oxida cuando libera electrones y que se reduce cuando los captura. Vea el siguiente esquema.

Algo importante para mencionar en el tema redox es que los electrones no se liberan solos, sino mas bien acompañados por un protón. Por lo tanto recordemos que la conformación de un electrón mas un protón forma el átomo de hidrógeno, el cual está representado en el anterior esquema. Debido a esto es que a las oxidaciones también se las denomina "deshidrogenaciones".

Dentro de los sistemas biológicos, toda reacción de oxidación está acompañada por otra reacción de reducción, o sea que una no ocurre sin la otra.

GLUCOLISIS, EL METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS.

La palabra glucólisis etimológicamente proviene de gluco que significa "dulce" y de lisis que significa "solución".

Conceptualmente podemos definirla como "la conversión metabólica de los azúcares en compuestos más sencillos", para este caso en ácido pirúvico o piruvato.

Recuerde que todos los carbohidratos que se consumen se transforman en glucosa, la cual es almacenada en los animales en forma de glucógeno.

Es importante recalcar que este proceso se aplica exclusivamente a los carbohidratos, no a las proteínas y lípidos.

LA GLUCÓLISIS SE PUEDE DIVIDIR EN TRES FASES.

El proceso de transformación de la molécula de glucosa (6C) a dos moléculas de piruvato (3C) se puede dividir en las siguientes tres fases:

Activación e isomerización. Fraccionamiento. Recuperación de energía.

PRIMERA FASE: ACTIVACIÓN E ISOMERIZACIÓN.

La glucosa es una molécula cuya carga energética alcanza a las 2260 kcal/mol. También es una molécula bastante estable, por lo cual lo primero que busca el proceso es desestabilizarla a través de un proceso de activación durante el cual se incrementa la energía contenida en la glucosa mediante un enlace fosfato transformándola en Fosfato-glucosa. Posteriormente esta fosfato-glucosa es transformada en un isómero de Fosfato-fructosa, el cual otra vez es activado al incrementar nuevamente su energía con otro enlace fosfato, formando así la DiFosfato-Fructosa, producto final de esta primera etapa.

Para aclarar sus dudas vea el siguiente esquema:

Obsérvese en la gráfica la participación de diversas enzimas en el proceso como ser la Hexocinasa, la Fosfoglucoisomerasa y la Fosfofructocinasa.

SEGUNDA FASE: FRACCIONAMIENTO.

La DiFosfato-Fructosa es un compuesto mas inestable que la glucosa y se encuentra cargado de energía (a raíz de los enlaces fosfato), por lo cual se encuentra listo para fraccionarse.

La DiFosfato-Fructosa se fracciona por acción de la enzima aldolasa quedando como producto de esta ruptura dos compuestos de 3 carbonos y un fósforo cada uno: el FosfatoGlicerAldehido o PGAL y la FosfatoDiHidroxiAcetona o PDHA.

De estos dos compuestos de 3 carbonos, el único que puede pasar a la siguiente etapa es el PGAL, sin embargo por acción de la enzima isomerasa de triosa, el PDHA se transforma en PGAL. En resumen durante este proceso de fraccionamiento de una DiFosfato-Fructosa se producen dos PGAL que ingresan a la siguiente fase.

Vea el esquema:

TERCERA FASE: RECUPERACIÓN DE ENERGÍA.

Hasta este momento, el proceso de glucólisis ha sido un "gasto" de energía proveniente del ATP para el organismo. Sin embargo a partir de ahora se recuperará "con intereses" la energía invertida en el proceso.

Los PGAL resultantes del fraccionamiento ingresan a un nuevo ciclo en el cual son oxidados (o sea liberan electrones) a través de una reducción de NAD en NADH, absorben Fósforo y reaccionan a través de la enzima SH. De esta forma se transforman en Difosfoglicerato

(recuerde que el PGAL tenía ya un átomo de P) cuya molécula tiene un enlace fosfato energizado y otro enlace con P sin energía.

El Difosfoglicerato "cargado" de energía en su enlace fosfato, libera un P transformando una molécula de ADP en ATP, transformándose en Fosfoglicerato, molécula con un solo átomo de P pero que carece de un enlace fosfato energizado.

Entonces este Fosfoglicerato sufre un proceso de oxidación produciendo agua, gracias a esta oxidación su enlace de fósforo se transforma en enlace fosfato cargándose de energía, transformándose en Fosfopiruvato.

Este Fosfopiruvato libera su P energizado, para convertir una molécula de ADP en ATP a través de la enzima piruvatocinasa.

El producto final de esta reacción es el Piruvato o ácido pirúvico.

Para entender mejor vea la siguiente gráfica.

BREVE RESUMEN, RECAPITULEMOS UN POCO

Ya hemos revisado el proceso de glucólisis desde el momento en que la glucosa (6 carbonos) ingresa hasta su transformación en dos moléculas de piruvato (3 carbonos), note como existe equilibrio en las reacciones bioquímicas, ya que el número de carbonos (seis) se mantiene desde el inicio hasta el final.

Durante la primera fase "activación e isomerización", la glucosa se transforma en DiFosfato-Fructosa. Durante la segunda fase "fraccionamiento", este compuesto se divide para formar dos FosfatoGlicerAldehidos (PGAL), los cuales ingresan a la tercera etapa.

Ya en la "recuperación de energía", cada uno de los PGAL se acaba transformando en Piruvato, por lo cual se concluye que de una glucosa se forman dos piruvatos.

Es importante hacer notar que el piruvato es el producto más importante de este proceso, los cuatro ATP´s que se forman son realmente un bajo aporte al global de la síntesis de ATP del organismo a través del metabolismo energético.

En resumen podemos expresar el conjunto de entradas y salidas al proceso de la siguiente forma:

Resumen de compuestos que ingresan y productos que salen del proceso

Entradas: Glucosa + 2 ATP + 4 ADP + 2 Pi + 2 NAD

Salidas: 2 piruvatos + 2 ADP + 4 ATP + 2 NADH + H2O

Para comprobarlo, solo tiene que revisar los tres esquemas anteriores.

ANTES DE CONTINUAR ALGUNOS CONCEPTOS IMPORTANTES.

Antes de continuar con el tema es preciso tener en claro que son el NAD y el FAD.

Bueno, inicialmente podemos definirlos como "vehículos biológicos para la transferencia de electrones". O sea estos dos compuestos sirven para equilibrar las reacciones de oxidación y reducción al absorber o aportar electrones.

Presentación oxidada Presentación reducida

NAD NADH

FAD FADH

Como ejemplo cuando el PGAL se oxida para transformarse en Difosfoglicerato la reacción se ve acompañada por una reducción del NAD que se transforma en NADH al recibir los electrones que se liberan durante la oxidación anterior. Por eso se dice que la presentación reducida es NADH.

GLUCÓLISIS: VIA AEROBIA.

El proceso de la glucólisis no termina en el piruvato, sino que continua bajo dos modalidades, una vía aerobia (o sea con presencia de oxigeno) y una vía anaerobia (en ausencia de oxigeno). Dependiendo de esta condicional, se obtendrá un producto específico.

Para el caso de la formación de ATP como producto final de la serie de proceso de la cual la glucólisis forma parte, nos interesa la "vía aerobia".

El oxigeno cumple la función de "reductor final" de los procesos bioquímicos, principalmente reduciendo el NADH y el FADH que se forman, para habilitarlos nuevamente en su presentación oxidada de NAD y FAD.

Durante la vía aerobia, el piruvato que contiene un grupo carboxilo (-COOH) libera carbono y oxigeno para formar CO2. De esta forma el piruvato se transforma en acetaldehido, el cual sufre un proceso de oxidación al liberar electrones y se junta con el grupo HS-CoA (Coenzima A) para formar la Acetil CoA.

Vea el siguiente esquema:

Y este Acetil CoA es el que ingresa a las crestas mitocondriales para iniciar el Ciclo de Krebs.

Nótese la importancia que tiene el oxigeno como aceptor de electrones para formar agua y volver a habilitar al NAD para continuar los procesos.

GLUCÓLISIS: VÍAS ANAEROBIAS.

Cuando existe escasez de oxigeno, el NADH deja de oxidarse y por lo tanto se acumula, para comenzar una serie de reacciones distintas a la vía aerobia.

Contamos con dos casos para exponer: la fermentación alcohólica producida por levaduras y la fermentación acidoláctica que ocurre en los músculos.

Para el primer caso, la fermentación alcohólica, esta es producida por levaduras las cuales transforman el piruvato en acetaldehido (al igual que en la vía aerobia) y posteriormente este se reduce para formar etanol. Recuerde que esto ocurre por el exceso de NADH presente en el organismo.

Vea el gráfico:

Normalmente esta fermentación ocurre hasta que los niveles de etanol llegan de 12 a 17% de concentración, momento en el cual se inhiben los procesos de fermentación alcohólica.

Durante el segundo caso de fermentación acidoláctica, esta ocurre en los tejidos musculares y es producto del trabajo excesivo, por lo cual la demanda de oxigeno para reducir el NADH a NAD es superior al abastecimiento de oxigeno de la respiración. Ante esta circunstancia el NADH se oxida a NAD reduciendo el piruvato a ácido láctico.

Vea el gráfico:

Este ácido láctico se acumula en los tejidos musculares produciendo fatiga o cansancio y dolor.

Y es debido a esta demanda insatisfecha de oxigeno que se da el fenómeno del "jadeo", ya que el organismo busca incrementar la velocidad de la respiración para así compensar la falta de oxigeno.

c) Ciclo de los acidos tricarboxilicos

El ciclo de Krebs (también llamado ciclo del ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxílicos) es una serie de reacciones químicas que forman parte de la respiración celular en todas las células aerobias, es decir que utilizan oxígeno. En organismos aeróbicos, el ciclo de Krebs es parte de la vía catabólica que realiza la oxidación de hidratos de carbono, ácidos grasos y aminoácidos hasta producir CO2, liberando energía en forma utilizable (poder reductor y GTP).

El metabolismo oxidativo de glúcidos, grasas y proteínas frecuentemente se divide en tres etapas, de las cuales el ciclo de Krebs supone la segunda. En la primera etapa los carbonos de estas macromoléculas dan lugar a moléculas de acetil-CoA de dos carbonos, e incluye las vías catabólicas de aminoácidos (p. ej. desaminación oxidativa), la beta oxidación de ácidos grasos y la glucolisis. La tercera etapa es la fosforilación oxidativa, en la cual el poder reductor (NADH y FADH2) generado se emplea para la síntesis de ATP según la teoría del acomplamiento quimiosmótico.

El ciclo de Krebs también proporciona precursores para muchas biomoléculas, como ciertos aminoácidos. Por ello se considera una vía anfibólica, es decir, catabólica y anabólica al mismo tiempo.

El ciclo Krebs recibe su nombre en honor a su descubridor Sir Hans Krebs, quien propuso los elementos clave de esta vía en 1937. Krebs estaba estudiando el consumo de oxígeno en músculo pectoral de paloma, un tejido con alta tasa de respiración, y realizó varias observaciones de gran relevancia. En primer lugar, el citrato, el isocitrato y el cis-aconitato estimulaban la oxidación de piruvato y el consumo de O2, en cantidad desproporcionada respecto a las cantidades añadidas. En segundo lugar, empleando malonato (inhibidor de la succinato deshidrogenasa), lograba bloquear la oxidación del piruvato, lo que indicaba su participación en la vía. Además, observó que las células tratadas con malonato acumulaban citrato, succinato y α-cetoglutarato, lo cual sugería que citrato y α-cetoglutarato eran precursores del succinato. En tercer lugar, la administración al tejido de piruvato y oxaloacetato provocaba la acumulación de citrato en el músculo, lo que indicaba que son precursores del citrato. Con base en estas observaciones experimentales Hans Krebs propuso una ruta cíclica y su secuencia de reacciones. Este esquema inicial, con ciertas modificaciones, dio lugar al ciclo de Krebs tal y como hoy lo conocemos.

Reacciones del ciclo de Krebs

El ciclo de Krebs tiene lugar en la matriz mitocondrial en eucariotas y en el citoplasma de procariotas.

Reacciones del ciclo de Krebs

Leyenda de colores: enzimas, coenzimas, nombres de sustratos, iones metálicos, moléculas inorgánicas, inhibición, estimulación .

Ciclo de Krebs: balance de entradas y salidas

Entradas Acetil CoA + 3 NAD + FAD + ADP + Pi + H2O

Salidas HS-CoA + 2 CO2 + 3 NADH + FADH + ATP

El acetil-CoA es el principal precursor del ciclo. El ácido cítrico (6 carbonos) o citrato se regenera en cada ciclo por condensación de un acetil-CoA (2 carbonos) con una molécula de oxaloacetato (4 carbonos). El citrato produce en cada ciclo una molécula de oxaloacetato y dos CO2, por lo que el balance neto del ciclo es:

Acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 3 H2O → CoA-SH + 3 (NADH + H+) + FADH2 + GTP + 2 CO2

+ 3 H+

Los dos carbonos del Acetil-CoA son oxidados a CO2, y la energía que estaba acumulada es liberada en forma de energía química: GTP y poder reductor (electrones de alto potencial): NADH and FADH2. NADH and FADH2 son coenzimas (moléculas capaces de unirse a enzimas) capaces de acumular la energía en forma de poder reductor para su conversión en energía química en la fosforilación oxidativa.

Las reacciones son:

Molécula Enzima Tipo de reacción Reactivos/Coenzimas

Productos/Coenzima

I. Citrato 1. Aconitasa Deshidratación H2O

II. cis-Aconitato 2. Aconitasa Hidratación H2O

III. Isocitrato 3. Isocitrato deshidrogenasa

Oxidación NAD+ NADH + H +

IV. Oxalosuccinato

4. Isocitrato deshidrogenasa

Descarboxilación

V. α-cetoglutarato

5. α-cetoglutaratodeshidrogenasa

Descarboxilación oxidativa

NAD+ +CoA-SH

NADH + H+

+ CO2

VI. Succinil-CoA 6. Succinil-CoA sintetasa Hidrólisis GDP+ Pi

GTP +CoA-SH

VII. Succinato 7. Succinato deshidrogenasa

Oxidación FAD FADH2

VIII. Fumarato 8. Fumarato Hidratasa Adición (H2O) H2O

IX. L-Malato 9. Malato deshidrogenasa Oxidación NAD+ NADH + H+

X. Oxaloacetato 10. Citrato sintasa Condensación

Visión simplificada del proceso

El proceso comienza con la oxidación del piruvato, produciendo un acetil-CoA y un CO2.

El acetil-CoA reacciona con una molécula de oxaloacetato (4 carbonos) para formar citrato (6 carbonos), mediante una reacción de condensación.

A través de una serie de reacciones el citrato se convierte de nuevo en oxaloacetato. El ciclo consume netamente 1 acetil-CoA y produce 2 CO2. También consume 2 NAD+ y 1 FAD, produciendo 3 NADH y 3 H+ y 1 FADH+.

El resultado de un ciclo es (por cada molécula de piruvato): 1 GTP, 3 NADH, 1 FADH 2, 2CO2

Cada molécula de glucosa produce (vía glucólisis) dos moléculas de piruvato, que a su vez producen dos acetil-CoA, por lo que por cada molécula de glucosa en el ciclo de Krebs se produce: 2 GTP, 6 NADH, 2 FADH2, 4CO2.

Regulación

Muchas de las enzimas del ciclo de Krebs son reguladas por retroalimentación negativa, por unión alostérica del ATP, que es un producto de la vía y un indicador del nivel energético de la célula. Entre estas enzimas se incluye el complejo de la piruvato deshidrogenasa que sintetiza el acetil-CoA necesario para la primera reacción del ciclo a partir de piruvato, procedente de la glucólisis o del catabolismo de aminoácidos. También las enzimas citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa, que catalizan las tres primeras reacciones del ciclo de Krebs, son inhibidas por altas concentraciones de ATP. Esta regulación frena este ciclo degradativo cuando el nivel energético de la célula es bueno.

Algunas enzimas son también reguladas negativamente cuando el nivel de poder reductor de la célula es elevado. El mecanismo de esta inhibición es una inhibición competitiva por producto (por NADH) de las enzimas que emplean NAD+ como sustrato. Así se regulan, entre otros, los complejos piruvato deshidrogenasa y citrato sintasa.

Principales vías que convergen en el ciclo de Krebs

La mayoría de las vías catabólicas convergen en el ciclo de Krebs, como muestra el diagrama. Las reacciones que forman intermediarios del ciclo se conocen como reacciones anapleróticas.

El ciclo de Krebs contituye la segunda etapa del catabolismo de carbohidratos. La glucolisis rompe la glucosa (6 carbonos) generando dos moléculas de piruvato (3 carbonos). En eucariotas el piruvato se desplaza al interior de la mitocondria (gracias a un transportador específico de membrana interna). En la matriz mitocondrial produce acetil-CoA que entra en el ciclo de Krebs.

En el catabolismo de proteínas, los enlaces peptídicos de las proteínas son degradados por acción de enzimas proteasas en el tubo digestivo liberando sus constituyentes aminoacídicos. Estos aminoácidos penetran en las células, donde pueden ser empleados para la síntesis de proteínas o ser degradados para producir energía en el ciclo de Krebs. Para su entrada al ciclo deben eliminarse sus grupos amino (terminales y laterales) por acción de enzimas aminotransferasas y desaminasas, principalmente.

En el catabolismo de lípidos, los triglicéridos son hidrolizados liberando ácidos grasos y glicerol. En el hígado el glicerol puede ser convertido en glucosa vía dihidroxiacetona fosfato y gliceraldehído-3-fosfato, por la gluconeogénesis (ruta anabólica). En muy diversos tejidos, especialmente en músculo cardíaco, los ácidos grasos son degradados en la matriz mitocondrial mediante sucesivos ciclos de beta oxidación que liberan unidades de acetil-CoA, que pueden incorporarse al ciclo de Krebs. En ocasiones, el ciclo de Krebs puede rendir propionil-CoA (3 carbonos), que puede emplearse para la síntesis de glucosa en la gluconeogénesis hepática.

El ciclo de Krebs siempre es seguido por la fosforilación oxidativa. Este proceso extrae la energía en forma de electrones de alto potencial de las moléculas de NADH y FADH2, regenerando NAD+ and FAD, gracias a lo cual el ciclo de Krebs puede continuar. Los electrones son transferidos a moléculas de O2, rindiendo H2O. Pero esta transferencia se realiza a través de una cadena transportadora de electrones capaz de aprovechar la energía potencial de los electrones para bombear protones al espacio intermembrana de la mitocondria. Esto genera un gradiente electroquímico de H+, que es utilizado para la síntesis de ATP mediante la enzima

ATP sintetasa. De este modo el ciclo de Krebs no utiliza directamente O2, pero lo requiere al estar acoplado a la fosforilación oxidativa.

Por cada molécula de glucosa la energía obtenida mediante el metabolismo oxidativo, es decir, glucolisis seguida del ciclo de Krebs, equivale a 30/32 moléculas de ATP dependiendo del tipo de lanzadera para introducir el poder reductor dentro de la mitocondria, si es la lanzadera de malato-aspartato son 32 y si es la de glicerol 3 fosfato, son 30.

Fosforilación oxidativa

Cadena transportadora de electrones

La fosforilación oxidativa es la transferencia de electrones de los equivalentes reducidos NADH, NADPH, FADH, obtenidos en la glucólisis y en el ciclo de Krebs hasta el oxígeno molecular, acoplado con la síntesis de ATP. Este proceso metabólico está formado por un conjunto de enzimas complejas, ubicadas en la membrana interna de las mitocondrias, que catalizan varias reacciones de óxido-reducción, donde el oxígeno es el aceptor final de electrones y donde se forma finalmente agua.

La fosforilación oxidativa es un proceso bioquímico que ocurre en las células. Es el proceso metabólico final (catabolismo) de la respiración celular, tras la glicólisis y el ciclo del ácido cítrico. De una molécula de glucosa se obtienen 36 moléculas de ATP mediante la fosforilación oxidativa.

Dentro de las células, la fosforilación oxidativa se produce en las membranas biológicas. En procariotas es la membrana plasmática y en eucariotas es la membrana interna de las dos de que consta la mitocondrial. El NADH y FADH2, moléculas donadores de electrones que "fueron cargadas" durante el ciclo del ácido cítrico, se utilizan en un mecanismo intrincado (que implica a numerosas enzimas como la NADH-Q reductasa, la citocromo c oxidasa y la citocromo reductasa), gracias a la bomba H+ que moviliza los protones contra un gradiante de membrana.

Un gran complejo proteico llamado ATP-sintasa situado en la membrana, permite a los protones pasar a través en ambas direcciones; genera el ATP cuando el protón se mueve a favor de gradiente. Debido a que los protones se han bombeado al espacio intermembranoso de la mitocondria en contra de gradiente, ahora pueden fluir nuevamente dentro de la matriz mitocondrial y mediante la vía ATP-sintasa, se genera ATP en el proceso. La reacción es:

ADP3- + H+ + Pi ↔ ATP4- + H2O

Cada molécula de NADH contribuye suficientemente a generar la fuerza motriz de un protón que produzca 2,5 moléculas de ATP. Cada molécula de FADH2 produce 1,5 moléculas de ATP. Todas juntas, las 10 moléculas de NADH y las 2 FADH2 provenientes de la oxidación de la glucosa (glucólisis, descarboxilación oxidativa de piruvato en acetil-CoA y ciclo de Krebs) a formar 28 de las 36 moléculas totales de ATP transportadoras de energía. Hay que decir que estos valores de moléculas de ATP son máximos. En realidad cada molécula de NADH contribuye a formar entre 2 y 3 moléculas de ATP, mientras que cada FADH2 contribuye a un máximo de 2 moléculas de ATP.

Beta oxidación es el proceso mediante el cual los ácidos grasos, en la forma de moléculas Acil-CoA , son rotas en la mitocondria para generar Acetil-CoA, la molécula de inicio para el ciclo de Krebs. Una vez dentro de la mitocondria, la β-oxidación de ácidos grasos ocurre vía cuatro pasos recurentes:

1. Oxidación por FAD 2. Hidratación 3. Oxidación por NAD + 4. Tiolisis

Pero para entrar en la mitocondria debe ser previamente activado. Para ello se hidroliza una molécula de ATP y se obtiene energía necesaria para aportársela al ácido graso y este se una a

una CoA, formando Acil-CoA. Este proceso viene favorecido por el sistema enzimático Acil-CoA sintetasa o Ácido graso tioquinasa.

Sin embargo el transporte activo de la mitocondria resultaría un problema. Para ello el ácido graso se une a una estructura llamada Carnitina de la que se libera una vez dentro de la mitocondria.

Oxidación por FAD

El primer paso es la oxidación de ácidos grasos por FAD. La siguiente reacción es catalizada por la acil CoA deshidrogenasa:

La enzima que cataliza la formación de un doble enlace entre C-2 y C-3. el producto final es Acil-CoA-betainsaturado ya que el carbono beta del ácido graso se une con un doble enlace al perder un hidrógeno .

Hidratación

El Siguiente paso es la Reacción de hidratación del enlace entre C-2 y C-3. esta reacción es catalizada por enoyl CoA hidratasa. esta reacción es Estereospecifica, Formando solo el isomeroL.

El Producto Final es Betahidroxiacil-CoA.

Oxidación por NAD+

El Tercer Paso es la Oxidación de L-3-hydroxiacyl CoA por el NAD, catalizado por L-3-hidroxiacil CoA dehidrogenasa. esto convierte el grupo hidroxilo en un grupo cetonico

El Producto final es Cetoacil-CoA con lo que el carbono beta ya ha sido oxidado y está preparado para la escisión. g ilian

Tiolisis

El paso final para la hendidura del Cetoacil-CoA por el grupo tiol de otra molécula de CoA. Esta reacción es catalizada por Β-cetotiolasa. que es insertada entre C-2 y C-3, mientras la molécula de acetil CoA y un acil CoA molécula, que es 2 C más pequeña. Este proceso continúa hasta que la molécula completa esta unida a las unidades del Acetil CoA . Por cada ciclo, una molécula de FADH 2, NADH Y acetil CoA es formada.

Esto supone una visión de un ciclo en espiral ya que repite los mismos pasos pero con diferentes sustancias procedentes del ciclo anterior. Por ello se le llama hélice de Lynen.

Productos de la β-Oxidación de los Ácidos grasos(AG)

Es la separación secuencial de los fragmentos de dos carbonos desde el extremo carboxilo. Durante este proceso se rompe el enlace alfa-beta y se forma acetil-CoA. Y se le conoce como beta-oxidación porque se oxida el carbono beta de los acidos grasos, que es el que se encuentra separado dos carbonos del grupo carboxilo.

La beta-oxidación se produce dentro de la mitocondria y también se llega a producir dentro de los peroxisomas y en el reticulo endoplasmatico(RE). Antes de que comienze, cada acidos graso se activa en una reacción con ATP y CoASH. La enzima que cataliza esta reacción es la acil-CoA sintetasa, que se encuentra en la membrana mitocondrial externa. Aquí se usa un transportador de las moléculas de acil-CoA, ya que éstas son impermeables a la membrana mitoncondrial interna y ése es la carnitina.

La carnitina, también reconocida como vitamina B11, este aminoácido participa en el circuito vascular reduciendo niveles de triglicéridos y colesterol en sangre. Se produce naturalmente en el hígado a partir de la L-Metionina y la L-Lisina.

La carnitina se encarga de llevar los grupos acilo al interior de la matriz mitoncondrial por medio del siguiente mecanismo:

1. Cada molécula de acil- Co A se convierte en una derivado de acilcarnitina. Esta reacción es catalizada por la aciltrasnsferasa I.

2. Después una proteína transportadora, llamada translocasa, dentro de la membrana mitocondrial interna transfiere la acilcarnitina a la matriz mitoncondrial.

3. La acil-CoA se regenera por la carnitina aciltrasnferasa II. 4. La carnitina se devuelve al espacio intermembrana por la proteína transportadora y

reacción con otra acil-CoA.

Beta- Oxidación de los acidos grasos saturados:

1. Comienza con una reacción de oxido-reducción, catalizada por la acil-CoA deshidrogenasa(una flavoproteína de la membrana mitocondrial interna), en la que se separa un átomo de hidrógeno de cada uno de los cabonos alfa y beta y se transfiere un FAD unido a la enzima.El FADH2 producido en esta reacción cede 2 electrones a la CTE. El producto de esta reacción es la Trans-alfa, beta-enoil-CoA.

2. La segunda reacción es catalizada por la enoil-CoA hidratasa. Es una hidratación del doble enlace entre los dos carbonos alfa y beta. El carbono beta se encuntra ahora hidroxilado.

3. En la reacción siguiente se oxida este grupo hidroxilo. La producción de un beta-cetoacil-CoA la cataliza la Beta- hidroxiacil CoA deshidrogenasa. Los electrones que se transfieren al NAD, posteriormente se ceden al complejo I de la CTE.

4. Finalmente la tiolasa(beta-cetoacil-CoA tiolasa) cataliza la rutura del los carbonos alfa y beta. Esta reacción suele denominarse rotura tiolitica, ya que se libera una molécula de acetil-CoA. El otro producto, una acil-Coa, contiene ahora dos átomos de carbono menos.

Los 4 pasos anteriores constituyen un ciclo de la beta-oxidación. Durante cada ciclo posterior se separa un fragmento de 2 carbonos, a este proceso se le denomina en ocasiones espiral de beta-oxidación y continua hasta que un su ultimo ciclo se rompe una acil-CoA de 4 carbonos para formar dos moléculas de acetil-CoA. De ahí las moléculas de acetil-CoA se van al ciclo del acido citrico o en la síntesis de isoprenoides.

Figura: el experimento de Knoop.

Figura: activación de un ácido graso, el palmitato

Figura: estructura de la carnitina y acil carnitina

Figura: sistema de carnitina palmitoiltransferasa

El glucógeno

1. Resumen: 2. Introducción: 3. Importancia Biomédica del Glucógeno: 4. Catabolismo del Glucógeno (glucogenólisis): 5. Cascada amplificadora de la degradación del glucógeno, estimulada por adrenalina: 6. Funciones de las reservas de glucógeno en el músculo y el hígado: 7. Fisiopatologías del metabolismo del glucógeno: 8. Bibliografia

Resumen:

El glucógeno representa la principal forma de almacenamiento de carbohidratos tanto en animales como en las plantas. Cuando existe una disminución significativa de glucosa en sangre, el glucógeno es degradado por medio de una serie de enzimas para cubrir las necesidades energéticas de nuestro organismo. Las glucogenosis son enfermedades en donde existen deficiencias congénitas de la mayoría de las enzimas relacionadas con el metabolismo del glucógeno, en donde los órganos más afectados son: el hígado y el músculo esquelético.

Los signos y síntomas clínicos más característicos son: hepatomegalia, hipoglucemia, osteoporosis, entre otros y en ocasiones son débiles y poco aparentes. Existen diversas pruebas de laboratorio para realizar un diagnóstico específico.

Palabras clave:

Glucógeno, glucostato, enzimas, cascada amplificadora de degradación de glucógeno, glucogenosis.

Introducción:

El glucógeno es la forma principal de almacenaje de carbohidratos en los animales, se encuentra en proporción mayor en el hígado (hasta 6%) y en el músculo, donde rara vez excede de 1%. Sin embargo, debido a su masa mayor, el músculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucógeno que tiene el hígado como reserva. Al igual que el almidón, es un polímero ramificado de alfa-glucosa .(9)

En las células hepáticas, el glucógeno aparece en forma de grandes gránulos, constituidos por agrupaciones de simples moléculas, muy ramificadas, por lo que tiene un peso molecular muy elevado. A semejanza de la amilopectina, el glucógeno es un polisacárido de la D-glucosa con enlaces alfa 1-4, sin embargo, está más ramificado, y su molécula es más reducida que la amilopectina; las ramificaciones aparecen cada 8 a 12 residuos de glucosa.

El glucógeno puede aislarse de los tejidos animales digiriéndolos con disoluciones calientes de KOH en las que los enlaces no reductores alfa 1-4 y alfa 1-6 son estables. (5)

Importancia Biomédica del Glucógeno:

La función del glucógeno muscular es actuar como una fuente de fácil disponibilidad de unidades de hexosa para la glucólisis dentro del propio músculo. El glucógeno hepático sirve en gran parte para exportar unidades de hexosa para la conservación de la glucosa sanguínea, en particular entre comidas.

Después de 12 a 18 horas de ayuno, el hígado casi agota su reserva de glucógeno. El glucógeno muscular sólo disminuye de manera significativa después de ejercicio vigoroso prolongado. Puede inducirse un almacenaje mayor de glucógeno muscular con dietas ricas en carbohidratos después de la depleción por el ejercicio. Las "enfermedades por

almacenamiento de glucógeno" son un grupo de trastornos hereditarios que se caracterizan por movilización deficiente del glucógeno y depósito de formas anormales del mismo, conduciendo a debilidad muscular e inclusive muerte. (9).

Molécula de Glucógeno:

(9) Murray, Robert K., Granner, Daryl K., Mayes, Peter, A. ,Rodwell, Víctor W.F. "Bioquímica de Harper". 1992. 14a. edición. Editorial: El Manual Moderno. Página 132

1. Metabolismo Bioquímico del Glucógeno

1.1. Digestión de Almidón y Glucógeno:

En los animales, la digestión del almidón y del glucógeno empieza en la boca, con la acción de la alfa-amilasa que se secreta en la saliva. Esta enzima rompe con los enlaces internos alfa 1-4 de ambos polímeros. En el intestino, la digestión continúa, facilitada por la alfa- amilasa secretada por el páncreas. Esta enzima degrada la amilosa a maltosa y un poco de glucosa. Sin embargo, solo degrada parcialmente la amilopectina y el glucógeno, porque no es capaz de romper los enlaces alfa 1,6 que se encuentran en los puntos de ramificación. El producto de la digestión completa de la amilopectina o del glucógeno por la alfa-amilasa se denomina dextrina límite, para continuar su degradación es necesaria la acción de una "enzima desramificante", la alfa 1-6 glucosidasa (también llamada isomaltasa). Esta acción expone un nuevo grupo de ramificaciones con enlaces alfa 1-4, que pueden ser atacadas por la alfa-amilasa, hasta alcanzar una nueva serie de ramificaciones con enlaces alfa 1-6.

El resultado final de la acción secuencial de estas dos enzimas es la degradación completa del almidón o glucógeno a maltosa y algo de glucosa. La maltosa se rompe hidrolíticamente por la maltasa, dando 2 moléculas de glucosa, que se absorbe a continuación al torrente circulatorio y se transporta a los diversos tejidos para su utilización. (7)

(7) Mathews, Christopher K. , Van Holde, K.E. "Bioquímica". 1998. 1a. edición. Editorial: Mc Graw Hill –Interamericana. Madrid, España. Página 522.

Movilización del Glucógeno:

Las principales reservas de glucógeno de los vertebrados se encuentran en el músculo esquelético y en el hígado. La degradación de estas reservas en energía utilizable, o movilización del glucógeno, requiere las rupturas fosforolíticas secuenciales de los enlaces alfa 1-4, catalizadas por la glucógeno fosforilasa. En las plantas, el almidón se moviliza de manera similar por la acción de la fosforilasa del almidón. Ambas reacciones liberan glucosa 1- fosfato a partir de los extremos no reductores del polímero de glucosa. La reacción de ruptura está ligeramente desfavorecida en condiciones estándar pero las concentraciones intracelulares relativamente elevadas de fosfato inorgánico hacen que esta reacción opere in vivo casi exclusivamente en la dirección de degradación, en vez de en la dirección de síntesis.

Al igual que la alfa-amilasa, las fosforilasas no son capaces de romper más allá de los puntos de ramificación alfa 1-6, de hecho, la ruptura se detiene a los cuatro residuos de glucosa de un punto de ramificación. El proceso desramificador requiere la acción de una segunda enzima llamada "desramificante" (alfa1-4 glucantransferasa), la cual cataliza dos reacciones. En primer lugar, está la actividad transferasa, en la que la enzima elimina tres de los residuos de glucosa restantes y transfiere este trisacárido intacto al extremo de alguna ramificación externa.

A continuación, el residuo de glucosa que queda unido aún a la cadena por un enlace alfa 1-6 se rompe por la actividad alfa 1-6-glucosidasa, que posee la misma enzima desramificadora. Ello da lugar a una molécula de glucosa libre y una ramificación de tres residuos de glucosa con enlaces alfa 1-4, esta ramificación que ha quedado ahora expuesta puede ser atacada por la fosforilasa. El resultado final de la acción de estas dos enzimas es la degradación completa del glucógeno a glucosa 1- fosfato (el producto final de la glucosa).

La importancia de almacenar energía de los hidratos de carbono en forma de un polímero altamente ramificado puede radicar en la necesidad del animal de generar energía de manera muy rápida, tras los estímulos apropiados. La glucógeno fosforilasa ataca los enlaces exoglucosídicos, es decir, rompe de manera secuencial a partir de los extremos no reductores. Cuantos más extremos de este tipo existen en un polímero con mayor rapidez puede movilizarse.

Para metabolizarse mediante la glucólisis, la glucosa 1- fosfato producida por la acción de la fosforilasa debe convertirse en glucosa 6-fosfato. Esta isomerización la lleva a cabo la fosfoglucomutasa. Desde el punto de vista de su mecanismo, esta reacción es similar a la de la fosfoglicerato mutasa, excepto que en la fosfoglucomutasa hay una fosfoserina en vez de una fosfohistidina en la enzima que reacciona con el sustrato.

La serina que lleva el grupo fosfato es excepcionalmente reactiva, como indica el hecho de que la fosfoglucomutasa, como la quimotripsina y otras proteasas de serina, se inhibe de forma irreversible por el diisopropilfluorofosfato.

Ambos procesos dan lugar a formas fosforiladas de glucosa,que no pueden salir de las células hepáticas. La conversión de glucosa libre se realiza mediante la acción de la glucosa –6-fosfatasa, que hidroliza la glucosa-6.fosfato a glucosa y ortofosfato. Esta enzima está presente también en el riñón y en el intestino. En cambio, el glucógeno muscular se utiliza principalmente como fuente de glucosa-6-fosfato para el catabolismo en las células musculares.

En consecuencia, en el músculo no hay glucosa-6-fosfatasa, como tampoco la hay en el cerebro, que depende casi exclusivamente de la glucosa de la sangre como principal fuente de energía. Ello garantiza que la glucosa-6-fosfato formada a partir del glucógeno no difunda hacia el exterior de estas células, puesto que, como se ha indicado antes, los azúcares fosfato no atraviesan con facilidad las membranas celulares.(7)

1.3 Síntesis del Glucógeno Hepático:

(6) Lynch,M.J., Rápale, S.S., Mellor, L.D., Spare, P.D., Inwood, M.J.H. "Métodos de Laboratorio" 1991. Tercera edición. Editorial: Interamericana, México,D.F. Página 554

La síntesis de glucógeno tiene lugar durante la fase posprandial de absorción, cuando la concentración de glucosa en la vena porta es superior a 150 mg/100ml, y en general cerca de 180mg/100ml durante la absorción activa. Se cree que no hay barrera para la entrada libre de glucosa a los hepatocitos; durante dicha fase de absorción, entran pues a las células del hígado grandes cantidades de glucosa. Este fenómeno inicia la síntesis de la enzima hepática específica de la fosforilación de glucosa llamada glucocinasa. Lo mismo hace la insulina, en tanto que el ayuno o la falta de insulina detienen la síntesis de glucocinasa. Sin embargo, la insulina desencadena un fenómeno de competición por parte de los músculos estriados, pues acelera la entrada de glucosa a las células de éstos, donde interviene en la fabricación de glucógeno. Es probable que, mientras se sintetiza glucocinasa, la hexocinasa inespecífica fosforila la glucosa en el hígado.

Pero el papel en conjunto desempeñado por la hexocinasa es mucho menor que el de la glucocinasa. Ambas enzimas transfieren fosfato del ATP al carbono 6 de la glucosa, pero el producto final (glucosa 6-fosfato) inhibe la hexocinasa. Mientras dura la absorción, la elevada cantidad de glucosa significa un alto nivel de glucocinasa, que forma bastante glucosa 6-fosfato para invertir el equilibrio habitual entre glucosa-1-fosfato y glucosa-6-fosfato, normalmente de 19 a 1, que corresponde a la enzima fosfoglucomutasa. Cuando se ha formado suficiente glucosa 6-fosfato para invertir este ingrediente, se inicia la glucogénesis, apareciendo glucosa 1-fosfato.

Luego la enzima transferasa de uridilo une el trifosfato de uridina a la glucosa-1-fosfato, formando difosfato de uridina y glucosa (UDPG). La unidad glucosilo del UDPG pasa enseguida al glucógeno, al que se une por un enlace alfa-1-4 por acción de la enzima sintetasa de glucógeno (llamada también transglucosilasa UDPG-glucógeno).

En particular, la sintetasa de glucógeno se activa por desfosforilación, mientras que ocurre lo contrario en el caso de la fosforilasa. Tal vez existan relaciones mutuas entre la fosforilación y desfosforilación de estas dos enzimas, de manera que al activarse una, se inactiva otra, y viceversa. La activación de sintetasa de glucógeno aumenta por efecto de la insulina.

La sintetasa de glucógeno fija unidades de glucosilo a las ramas externas del glucógeno, mediante enlaces 1,4 únicamente. Después de añadir de esta manera de 7 a 21 unidades de glucosilo, otra enzima, llamada "de ramificación" (transglucosidasa de amilo 1, 4, 1,6) transfiere algunas de estas unidades y las dispone como ramificaciones, mediante enlaces 1,6 sobre la misma cadena o sobre otra. De esta manera, se obtiene una molécula compacta ramificada; de no ser así, se obtendría una forma alargada, desparramada, parecida a la de un sauce llorón.

Sin embargo, Hers (1964) señala que en el organismo intacto las concentraciones relativas de fosfato inorgánico y de glucosa-1-fosfato de glucosa son tales que la fosforilasa sólo desdobla el glucógeno, y su función de síntesis se traduce mas bien por remodelado de la molécula.

Catabolismo del Glucógeno (glucogenólisis):

La glucogenólisis aumenta en el músculo varios cientos de veces inmediatamente después del comienzo de la contracción. Esto comprende la activación rápida de la fosforilasa causada por la activación rápida de la fosforilasa cinasa por el calcio, la misma señal que inicia la contracción. La fosforilasa cinasa muscular tiene cuatro tipos de subunidades: alfa, beta gamma y delta, en una estructura representada como (alfa-beta gamma-delta).

Las subunidades alfa y beta contienen residuos de serina que son fosforilados por la proteincinasa dependiente de AMPc. La subunidad beta fija 4 iones calcio y es idéntica a la proteína fijadora de calcio, calmodulina. La fijación del calcio activa el sitio catalítico de la subunidad gamma en tanto que la molécula permanece en la configuración b desfosforilada. Sin embargo, la forma a fosforilada sólo es activada en forma total en presencia de calcio. En

un hecho significativo que la calmodulina sea análoga en estructura a la TpC, la proteína fijadora de calcio en el músculo. Una segunda molécula de calmodulina o de TpC puede interactuar con la fosforilasa cinasa, aumentando la activación. Por lo tanto la activación de la contracción muscular y de la glucogenólisis son realizadas por la misma proteína fijadora de calcio, que asegura su sincronización (9).

Las enzimas que participan en la glucogenólisis son:

2.1 a) Fosforilasa: Es la enzima más importante para el desdoblamiento del glucógeno. Rompe el enlace 1,4 de la unidad de glucosilo del extremo de una rama o cadena de glucógeno, y cataliza simultáneamente la transferencia del glucosilo liberado a un fosfato inorgánico. De esta manera, la fosforilasa puede desdoblar casi la tercera parte de la molécula de glucógeno en glucosa 1-fosfato. Lo que queda de la molécula de glucógeno después de que la fosforilasa ha ejercido su efecto máximo se llama "dextrina límite".

La fosforilasa hepática se activa por transfosforilación (del ATP), debida a la enzima cinasa de desfosfofosforilasa, en presencia de magnesio. Esta activación es acelerada varias veces por el monofosfato cíclico de adenosina (AMP, o fosfato de 3,5-ribosa-adenina cíclica). El AMP se forma a partir del ATP por efecto de la enzima ciclasa de adenilo, que se encuentra en las membranas celulares. El glucágon y la adrenalina triplican la formación de AMP, por lo tanto, activan así la fosforilasa hepática, lo que explica su potente efecto glucogenolítico.

2.2. b) Fosforilasa del Músculo: Esta enzima difiere de la fosforilasa hepática por varias razones, principalmente porque existe en dos formas, las variedades a y b. La fosforilasa a del músculo (P.M. 495 000) es un dímero de b, y contiene cuatro unidades de fosfato de piridoxal por molécula, en tanto que la variedad b sólo contiene dos.

Las dos variedades presentan transformaciones mutuas. En el músculo en reposo predomina ampliamente la fosforilasa b; se activa y convierte en fosforilasa a por efecto de la cinasa de fosforilasa b, activada a su vez por el AMP cíclico. Puesto que la adrenalina (pero no el glucágon) aumenta considerablemente la formación de la AMP cíclico en el músculo, esta hormona aumenta la actividad de las fosforilasas del músculo e hígado, mientras que la acción del glucágon sólo se ejerce sobre el hígado.

En reposo, el AMP cíclico del músculo no basta para activar la fosforilasa, pero el ejercicio muscular y la anaerobiosis probablemente aumentan localmente la concentración del adenilato cíclico.

2.3 Enzima de desramificación (glucosidasa de 1,6 –amilo):

Puesto que la fosforilasa sólo ataca los enlaces 1,4 glucosídicos, deja de actuar cuando llega a un punto de ramificación. Cori y Larner (1951) dedujeron que la fosforólisis de las principales cadenas externas se detiene a varias unidades glucosílicas de distancia de un punto de ramificación; pero en el caso de las ramas laterales, prosigue hasta que sólo queda la unidad de glucosilo fijada por el enlace 1,6. La molécula de glucógeno "deshojada" o podada por la fosforilasa se llama "dextrina límite".

En este punto, la enzima de desramificación ataca el enlace 1,6 en cuestión, liberando unas moléculas de glucosa por cada punto de ramificación, lo que permite que vuelva a actuar la fosforilasa. En teoría cuando menos, estas intervenciones sucesivas de fosforilasa y enzima de desramificación pueden llevar el glucógeno al estado de cadena basal solamente, lo que se podría llamar el tronco; se puede producir así de 92 a 93% de glucosa 1-.fosfato y de 7 a 8% de glucosa libre.

2.4 Glucotranferasa de oligo 1,4 --------1,4:

Walker y Whelan ya sospechaban la presencia de esta enzima como contaminante en los preparados de glucosidasa de 1-6 amilo. En diversos análisis efectuados se obtuvieron resultados que hasta la fecha sugieren que la acción de la fosforilasa sobre las cadenas terminales se detiene a cuatro unidades de glucosilo de distancia de un punto de ramificación. En esta etapa (dextrina límite), la mayor parte de las cadenas externas "desprendidas" de la molécula parecen formadas por cuatro unidades alfa- 1,4-glucosilo, a partir de un punto de ramificación. Se cree que la glucotransferasa de oligo- 1,4 ---------1,4, pasa tres de estas unidades al extremo de otra cadena; por consiguiente, la fosforilasa puede volver a actuar sobre la cadena, ya más larga, y la enzima de desramificación puede atacar el enlace 1,6 en el punto de ramificación.

2.5 Alfa amilasas:

Olivarría y Torres (1962) demostraron que la alfa-amilasa del hígado podía atacar el glucógeno mediante: 1) Producción de oligosacáridos de cadena recta, como maltotriosa y maltotetrosa, a partir de las ramas externas del glucógeno, y 2) Liberación de sacáridos ramificados y de maltosa, desde el interior de la molécula. Existen varias maltasas (glucosidasas alfa 1,4) para transformar estos productos en glucosa. Sin embargo, todavía se ignora la importancia de la vía alfa-amilasa-oligosacárido maltasa en el catabolismo del glucógeno.

2.6 Glucógeno de lisosomas:

Los lisosomas poseen un conjunto de enzimas capaces de hidrolizar prácticamente cualquier componente del citoplasma que contienen entre otras, fosfatasa ácida, RNAasa, DNAasa, catepsina, beta-glucoronidasa, sulfatasa de arilo, beta-N-acetilglucosaminidasa, beta-galactosidasa y alfa-1,4(glucosidasa).

La función de esta última enzima en el metabolismo celular normal no se conoce todavía, pero la falta de maltasa ácida de lisosomas en la enfermedad de Pompe tiene como consecuencia el almacenamiento de glucógeno en acúmulos limitados por membranas (lisosomas). (6)

3. Cascada amplificadora de la degradación del glucógeno, estimulada por adrenalina:

Este proceso se inicia cuando la adrenalina estimula la degradación del glucógeno en el hígado para convertirse a glucosa, originando una serie de reacciones de amplificación (cascada amplificadora), con lo cual se eleva la concentración de glucosa sanguínea. El mecanismo se lleva a cabo como sigue:

La adrenalina que llega a la superficie de la célula hepática en una concentración de 10-8 a 10-10

M, se une a los centros receptores específicos de la adrenalina de la superficie exterior de la membrana de las células hepáticas. Se cree que esta unión provoca un cambio de conformación local en la membrana que origina la activación de la adenilato-ciclasa localizada sobre la superficie interior de la membrana celular. La forma activa de la adenilato-ciclasa convierte al ATP en AMP cíclico, que puede llegar hasta una concentración cumbre de 10 -6 M en el interior celular.

El AMP cíclico así formado se une entonces a la subunidad reguladora de la proteína-quinasa, liberando a su subunidad catalítica en una forma activa. La subunidad cataliza a continuación, la fosforilación de la forma inactiva de la fosforilasa-quinasa a expensas del ATP, para producir la fosforilasa-quinasa activa. Esta enzima, que requiere de calcio para su actividad, cataliza entonces la fosforilación de la fosforilasa b inactiva a expensas del ATP, rindiendo fosforilasa a activa, la cual, a su vez, provoca la degradación catalítica del glucógeno a glucosa-1-fosfato a partir de la cual, se forma glucosa 6-fosfato y después, la glucosa libre de la sangre. Cada una de las etapas de esta cascada es catalítica, y su conjunto acaba en una gran amplificación de la señal que ingresa, esto es, en la unión a la superficie del hepatocito de un número relativamente pequeño de moléculas de adrenalina. A pesar de que la cascada consta de muchas etapas de unas enzimas actuando sobre otros, puede alcanzar su máxima actividad en cuestión de segundos. La adrenalina no sólo estimula la degradación de glucógeno, sino que también inhibe la síntesis del mismo en el hígado, digiriendo así todos los restos de glucosa disponibles y sus precursores hacia la producción de glucosa libre.

La fijación de la adrenalina a la célula hepática y la subsiguiente formación de AMP cíclico promueve la fosforilación por la proteína-quinasa de la forma activa, o de desfosfo, de la glucógeno-sintasa, transformándola en la forma inactiva fosforilada. Seis restos de serina de la molécula de glucógeno-sintasa se fosforilan a expensas del ATP. Así, la inhibición de la glucógeno-sintasa se verifica por una cadena de fenómenos "disparados" o desencadenados por el mismo estímulo que provoca la aceleración de la degradación de glucógeno a glucosa sanguínea. Mientras se secreta adrenalina a la sangre por parte de la médula suprarrenal, el sistema hepático de la adenilato-ciclasa permanece activado, manteniendo el AMP cíclico a gran concentración. Sin embargo, en cuanto la secreción de adrenalina, ésta de detiene la adrenalina unida a la membrana de la célula se desliga. Entonces ya no se forma AMP cíclico, y el restante es destruido por la fosfodiesterasa. Inmediatamente las subunidades de la proteína-quinasa se reasocian formando un complejo que no tiene actividad catalítica. La forma fosforilada de la fosforilasa-quinasa experimenta desfosforilación, lo mismo que la propia fosforilasa a, por la acción de la fosforilasa-fosfatasa. De esta suerte el sistema glucogenolítico es devuelto a su estado normal de reposo; simultáneamente, la glucógeno-sintasa es reactivada por desfosforilación. Aparte de su actividad en el hígado, la adrenalina provoca la degradación de glucógeno en el músculo esquelético, con formación de lactato, gracias a la estimulación de la glucógeno-fosforilasa vía AMP cíclico.

La adrenalina también estimula una lipasa de las células adiposas que degrada escindiendo los triglicéridos, liberando ácidos grasos ligados a la seroalbúmina. Este efecto se verifica por estimulación de la adenilato-ciclasa y por formación de la proteína-quinasa activa, la cual, fosforila al parecer a un precursor inactiva de la lipasa activa de los triglicéridos. Por otra parte, los característicos efectos de la adrenalina sobre el ritmo y el rendimiento cardiacos son mediados por receptores catecolamínicos específicos, así como por la formación de AMP cíclico. Sin embargo, el glucógeno del corazón no se convierte en glucosa sanguínea, sino lactato. El músculo cardiaco y el esquelético carecen de glucosa-6-fosfatasa.

Funciones de las reservas de glucógeno en el músculo y el hígado:

El glucógeno constituye la principal fuente de energía para la contracción del músculo esquelético. Dado que el hígado obtiene la mayor parte de su energía metabólica de la oxidación de los ácidos grasos, el glucógeno hepático tiene una función muy distinta, como fuente de glucosa sanguínea que se transporta a otros tejidos para su catabolismo.

El hígado actúa fundamentalmente como un "glucostato", sensor de las concentraciones de glucosa sanguínea que ajusta en función de ello la síntesis y degradación de glucógeno; gran parte de esta regulación comporta el control de la glucógeno sintasa y la fosforilasa. Para cumplir esta función, el hígado contiene unas reservas de glucógeno relativamente elevadas, desde un 2 a un 8% del peso del órgano. En el hígado, la velocidad máxima de síntesis y degradación de glucógeno son aproximadamente iguales, mientras que en el músculo la velocidad máxima de glucogenólisis supera a la síntesis de glucógeno en unas 300 veces. Aunque la enzimología de la síntesis y degradación del glucógeno es semejante en el hígado y el músculo, el control endocrino del hígado es bastante diferente. Las enzimas difieren también estructuralmente.

Degradación de los aminoácidos y ciclo de la urea

Introducción  

 El nitrógeno molecular, N2, existe en gran abundancia en la atmósfera y es un macronutriente vital para todos los tipos de vida. Casi todos los compuestos biológicamente activos con N lo contienen en forma reducida, y por lo tanto, antes de que se pueda utilizar por los organismos, se tiene que fijar, es decir, reducir desde N 2 o NO3 - hasta NH3 (NH4+), por los microorganismos, plantas y descargas eléctricas en los relámpagos. El NH3 se incorpora a 

El ión amonio es una base débil y la forma sin protonar una base fuerte los aminoácidos y proteínas y entran en la cadena alimenticia. Los seres humanos solo pueden sintetizar 11 de los 20 aminoácidos que se necesitan para la síntesis de las proteínas. Aquéllos que no se pueden sintetizar de novo se denominan aminoácidos esenciales, ya que se deben de obtener de la dieta. Además de ser las unidades monoméricas de las proteínas, los aminoácidos son metabolitos energéticos y son precursores de muchos compuestos conteniendo nitrógeno, como el grupo hemo, las aminas, el glutatión, los nucleótidos y las coenzimas nucleotídicos. El exceso de aminoácidos no se almacenan ni se excretan, se convierten en precursores de otros metabolitos, como el Pyr, OAA y el CG. Por lo tanto los aminoácidos son también precursores de los ácidos grasos, glucosa y cuerpos cetónicos, es decir, fuel metabólico.

 

 Un organismo adulto tomando una dieta completa y variada está normalmente en balance nitrogenado, un estado en el que el nitrógeno que se toma en la dieta está equilibrado con el que se excreta, y por lo tanto no existe un cambio neto en el nitrógeno del organismo. El nitrógeno que se excreta procede del recambio proteico, es decir, síntesis y degradación, y por digestión del exceso de proteínas. En determinadas condiciones, el organismo está en balance positivo o negativo. En el balance negativo, más se excreta que se toma, lo que ocurre en el ayuno o en ciertas enfermedades. Durante el ayuno las cadenas de los aminoácidos se necesitan para formar intermediarios para la gluconeogénesis y el nitrógeno se excreta en forma de urea y no reincorporado en proteína. Una dieta deficiente en un aminoácido esencial también da lugar a un balance negativo ya que las proteínas del organismo se degradan para proveer dicho aminoácido esencial. Los otros 19 aminoácidos se metabolizan en consecuencia. También se puede dar en la senescencia. El balance positivo se da en los niños, que incoporan los aminoácidos de la dieta en proteínas. La Cys y la Arg no son esenciales en los adultos pero sí en los niños ya que se sintetizan a partir de la Met y de la Orn. También puede darse en el embarazo y en la alimentación después del ayuno.

 Asimilación y fijación del nitrógeno  

 Las dos rutas para la adquisición del N en la biosfera son la asimilación del nitrato y la fijación del nitrógeno. Ambas rutas dan lugar a la formación de amonio, el cual es incorporado en los compuestos orgánicos.

La asimilación del nitrato ocurre en dos pasos. Reducción del nitrato en nitrito por 2 e -, catalizado por la nitrato reductasa, que cataliza la reacción NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O . La secuencia es la siguiente: NADH [-SH FAD cyt b557 MoCo] NO3 - . El MoCo es un centro especial que contiene molibdeno. Las nitrato reductasas son típicamente homodímeros 2 de 210-270 kD. Reducción de nitrito en amonio por 6 e-, catalizado por la nitrito reductasa, NO2 - + 8H+ + 6e- NH4 + + 2H2O. La secuencia es la siguiente: Luz 6 Fdred [(4Fe-4S) sirohemo] NO2 - . Las nitrito reductasas son proteínas monoméricas de unos 63 kD con un sirohemo y un grupo (4Fe-4S). En las plantas superiores la nitrito reductasa se encuentra en los cloroplastos, donde está cerca de la ferredoxina que le proporciona los electrones. La nitrato reductasa se encuentra en el citosol. Las nitrito reductasas bacterianas son más complejas que las de las plantas superiores, pareciéndose a las nitrato reductasas. La asimilación del nitrato es la forma predominante por la cual los microorganismos, algas y plantas verdes adquieren el nitrógeno (99%).

La fijación del nitrógeno es la reducción del nitrógeno atmosférico mediante un sistema enzimático que es procariótico ( N2 + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2 ), o bien libre o bien en forma de simbiontes. El corazón de este sistema es la nitrogenasa. Menos del 1% del N asimilado en la biosfera pasa por esta vía. De manera particular es interesante el sistema formado por el grupo Rhizobia. Son bacterias que fijan el nitrógeno atmosférico en simbiosis con plantas leguminosas, teniendo una gran importancia económica. Infectan las raíces, proliferan y forman nódulos que son los lugares de la fijación del nitrógeno. La planta contiene una proteína, la leghemoglobina que se une al O2 y mantiene la [O2] muy baja o nula. El nitrógeno fijado pasa a la planta, mientras que esta da a las bacterias compuestos de carbono. El total de N2 fijado por lo microrganismos diazotrópicos es del orden de 1011 kg por año, un

60% del nitrógeno fijado de nuevo en la Tierra. La luz y la radiación UV fijan un 15% y los procesos industriales fijan el 25% restante. Todos los sistemas de fijación son iguales, por lo que parece ser que surgió una sola vez en la evolución biológica. Todos estos sistemas requieren:

1. La nitrogenasa, la enzima que cataliza la reducción del N2 en amonio

2. Un reductor fuerte, i.e., ferredoxina

3. ATP

4. Condiciones anaeróbias

5. Controles regulatorios

En una primera aproximación, dos son los controles más importantes: ADP, que inhibe a la enzima, por lo tanto la relación ATP/ADP regula la actividad de la enzima, y el NH4 +, que reprime la expresión de los genes nif (se conocen más de 20), los genes que codifican las proteínas del sistema fijador.

El complejo de la nitrogenasa está constituido por dos enzimas, la nitrógeno reductasa y la nitrogenasa propiamente dicha. La nitrógeno reductasa es un homodímero de 60 kD con un solo centro [4Fe-4S]. Es muy sensible al O2. Se requieren 4ATP por cada par de electrones transferidos. Como se necesitan 4 pares de electrones, se consumen 16 ATP por N2

reducido. La necesidad de ATP es paradójica, ya que la reducción del N2 a NH4 + es favorable termodinámicamente. La solución está en la fuerza de la unión NN (225 kcal/mol) y por tanto se necesita energía para romperlo. La nitrogenasa es un heterotetrámero de 220 kD _2_2. Contiene 2 Mo, 32 Fe, y unos 30 S lábiles. Todos estos átomos están formando 4 [4Fe-4S] y dos cofactores hierro-molibdeno (FeMoCo). Es muy sensible al O2. La enzima es muy lenta: 12 pares de electrones por segundo y por enzima, o tres N2 por segundo. Ya que la actividad es tan baja, las células que fijan nitrógeno tienen una gran cantidad de enzima, aproximadamente el 5% de la proteína total de la célula. Tener en cuenta la fijación industrial del N2 , utilizando un catalizador de hierro, 500ºC y una presión de 300 atm (1910, Fritz Haber): N2 + 3H2 2NH3

 

 Incorporación del nitrógeno en los aminoácidos  

 El amonio (NH3 NH4+) entra en los compuestos orgánicos mediante tres vías principales

catalizadas por las enzimas carbamoilfosfato sintetasa I, la glutamato deshidrogenasa y la glutamina sintetasa. Una vez incorporado en los aminoácidos, el grupo N se puede transferir mediante las aminotransferasas. La mayor parte de los aminoácidos utilizados por el organismo para la síntesis de proteínas u otros precursores se obtienen de la dieta o por recambio proteico. Cuando es necesario, loa aminoácidos no esenciales se sintetizan a partir de -ceto-ácidos mediante la transferencia de grupos amino preexistentes de otro aminoácido mediante las aminotransferasas o transaminas. La transferencia de los grupos amino también tiene lugar en la degradación de los aminoácidos. La transaminación de los aminoácidos no esenciales es bidireccional () mientras que la de los aminoácidos esenciales es normalmente unidireccional (), ya que el organismo no puede sintetizar los correspondientes -cetoácidos.

La transaminación es la reacción más común en la que participan los aminoácidos, y solo la Thr y la Lys no participan en este tipo de reacciones. Un par obligado en estas reacciones es el CG y el Glu (en menor medida el Asp y el OAA). Por lo tanto, si existe una transferencia entre Ala y Asp, un intermediario sería el Glu. [Ala + CG Pyr + Glu] + [Glu + OAA Asp + CG] Ala + OAA Pyr + Asp. La constante de equilibrio en estas reacciones es muy próxima a 1, por lo que estas reacciones están próximas al equilibrio. Cuando existe hiperamonemia, por ejemplo, cuando el hígado no funciona, se pueden reemplazar los aminoácidos por sus correspondientes a-ceto-ácidos (con excepción de Thr y

Lys) para su transaminación y conversión en aminoácidos. La distribución de las aminotransferasas en diferentes tejidos se utiliza en el diagnóstico, midiendo la liberación de enzimas específicos. Por ejemplo, la glutamato oxalacetato aminotransferasa en plasma significa daño en el hígado. La enzima glutamatoaspartato aminotransferasa interconvierte el Glu y el Asp formados en las reacciones de las aminotransferasas (Glu + OAA CG + Asp).

El piridoxal fosfato, la forma funcional de la vitamina B6, es el cofactor en las aminotransferasas, y está unido covelentemente (-CH=N-, aldimina, base de Schiff) a un grupo -amino de un resto de Lys.

El complejo está estabilizado además por interacciones iónicas e hidrofóbicas. Cuando un aminoácido se aproxima al enzima y al cofactor, su grupo amino desplaza al grupo _-amino de la Lys y ya el piridoxal fosfato no está unido covelentemente al enzima. Como existe un equilibrio tautomérico entre la aldimina (-CH=N-CHR2) y una cetimina (-CH2-N=CR2), la hidrólisis de la cetimina libera un -ceto-ácido, el grupo amino queda como parte de una piridoxamina (-CH2-NH3 +). En este momento puede ocurrir lo contrario, pero en este caso con otro -ceto-ácido. Este grupo también participa en descarboxilaciones.

En el hígado el amonio se puede incorporar como un grupo amino mediante la reacción catalizada por la glutamato deshidrogenasa (GDH). También cataliza la reacción inversa, la liberación del grupo amonio (que va al ciclo de la urea). Esta enzima es un multímero (6). En algunos casos existen dos isoenzimas diferentes, una en el citosol (formación de Glu) y otra en la mitocondria (formación de CG), funcionando cada una de manera preferente en una dirección.

 

El glutamato se utiliza en las aminotransferasas y por lo tanto es una vía para la incorporación del nitrógeno en los aminoácidos. En la reacción de formación del Glu se utiliza NADPH mientras que en el otro sentido, liberación de amonio, se utiliza NAD+. Es la única enzima que puede aceptar NADH o NADPH. Es reversible in vitro la reacción, pero in vivo funciona probablemente en la formación de amonio, ya que la [amonio] requerida para la formación de Glu es tóxica y normalmente no se alcanza en el organismo (excepto en la zona perivenosa del hígado). Una fuente importante de amonio en los organismos se produce gracias al metabolismo bacteriano en el intestino, y este se absorbe y se transporta al hígado, donde la glutamato deshidrogenasa incorpora el amonio en Glu. La enzima está regulada de forma alostérica por los nucleótidos de purina, ATP y GTP en la síntesis de Glu, y ADP y GDP, en la degradación de Glu (formación de CG).

El amonio libre es tóxico y se transporta en la sangre en forma de grupos amino o amida. Un 50% se transporta en forma de glutamina, el transportador de amonio. El grupo amida de la Gln es importante como donador de nitrógeno para la formación de diferentes tipos de moléculas, como las bases púricas, y el grupo amino de la citosina. El Glu y el amonio son sustratos para la glutamina sintetasa (GS), donde el ATP se necesita para la activación del grupo -carboxilo. La reacción de formación de Glu a partir de Gln se realiza por la glutaminasa. Existen isoenzimas específicos de diferentes tejidos. Las formas mitocondriales de hígado y riñón requieren fosfato para su actividad. El hígado contiene glutamina sintetasa y glutaminasa, pero no es un productor ni consumidor neto de Gln. Las dos enzimas están confinadas en las células del parénquima de diferentes segmentos del hígado. La región periportal, zona que rodea a los vasos sanguíneos de la vena porta o sangre entrante, contiene glutaminasa (y las enzimas del ciclo de la urea), mientras que las células de la región perivenosa, zona que rodea a los vasos sanquíneos que van a dar a la vena cava o sangre saliente, tienen glutamina sintetasa. Este ciclo intercelular de Gln se puede pensar que es una forma de retomar el amonio que no ha sido incorporado en urea.

El grupo amida de la Asn proviene de la Gln y no del amonio libre como en la Gln. Se necesita ATP y se forma AMP y PPi.

En organismos que habitan ambientes con mucho amonio, las reacciones de la GDH y GS actúan en secuencia, proporcionando la fuente más importante para la incorporación del amonio, con gasto de 1ATP y 1 NADPH.

 Sin embargo, la GDH tiene un alto Km para el amonio, mayor que el de la GS. De esta manera, en organismos con limitación de acceso al amonio, la GDH no es muy efectiva y la reacción de asimilación es básicamente la reacción de la GS. Tal situación crea una necesidad de llenar un nicho y este está ocupado por la glutamato sintasa (GOGAT), de glutamato:oxo-glutarato aminotransferasa. La GOGAT forma 2 Glu a partir de la aminación reductiva del CG, siendo el Gln el donador.

 

Reductor + CG + Gln 2 Glu + Reductor oxidado

 

Estos Glu formados pueden ser ahora aceptores de amonio y convertirse en Gln. Algunos organismos usan NADH (levaduras), otros NADPH (bacterias) y ferredoxinas reducidas (plantas). Son proteínas grandes y complejas. En E.coli, la GOGAT tiene 800 kD, es una flavoproteina, que contiene FMN y FAD, además de centros [4Fe-4S]. En este caso, la actuación conjunta de la GS y GOGAT constituyen otra ruta de asimilación del nitrógeno, siendo la función de la GS de asimilación y de la GOGAT de regeneración del Glu.

 En bacterias como la E.coli , la GS está regulada a tres niveles:

1. Su actividad está regulada alostéricamente por retroinhibición. Nueve inhibidores diferentes actúan sobre la GS: Gly, Ala, Ser, His, Trp, CTP, AMP, carbamoilfosfato y glucosamina-6-fosfato. La Gly, Ala y Ser son indicadores del metabolismo de los aminoácidos, mientras que los otros representan los productos finales mde rutas biosintéticas que comienzan con la Gln. Cada uno de ellos representa una pauta acumulativa de inhibición. Es decir, cada uno de ellos inhibe al enzima aproximadamente un 11% de su actividad. Tal inhibición implica un punto de unión diferente para cada uno de los inhibidores. Por lo tanto, cada polipéptido de la GS debe de proveer un punto de unió n para cada efector alostérico, los tres substratos (NH4 +, ATP y Glu) y un par de cationes divalentes.

2. La GS se interconvierte en formas activa e inactiva por modificación covalente. Cada subunidad de la GS se puede adenilar en un resto de Tyr (Tyr397) en una reacción dependiente de ATP. La adenilación inactiva al enzima. Si definimos n el número de grupos adenilo unidos a la GS, la actividad es inversamente proporcional a n. Este número varía

entre 0 y 12. La adenilación se realiza por una enzima, la adenilil-transferasa. La adenilación y desadenilación está regulada por un sistema de cascada bicíclico, compuesto de dos enzimas, la adenilil-transferasa (AT, 110 kD) y la uridiltransferasa (UT, 95 kD). Otra proteína, la PII, está también presente. La AT no solo cataliza la adenilación sino también la desadenilación. La dirección de la operación de la AT depende de la PII.

La PII es un tetrámero (4x11 kD) y cada uno de estos monómeros está sujeto a modificación covalente (uridilación) por la UT. Esta reacción está inhibida por la Gln y activada por el CG. La UT también cataliza la desuridilación de la PII. La reación hidrolítica de la UTT está activada por la Gln. De esta manera la uridilación/desuridilación esta últimamente ligada a la relación [Gln]/[CG]. Alta [Gln] indica suficiente nitrógeno, la GS se adenila y se inactiva. Alta [CG] indica limitación de nitrógeno, la GS se desadenila y se activa.

El estado de la PII controla la dirección de actuación de la AT. Si PII no está uridilada, forma PIIA, el complejo AT:PIIA adenila la GS. Cuando la PII está uridilada, forma PIID, el complejo AT:PIID ncataliza la desadenilación de la GS. Los centros activos de las formas AT:P IIA y AT:PIID son diferentes. Además estas formas están reguladas alostéricamente por el CG (inhibe la AT:PIIA y activa la AT:P IID) y la Gln (activa la AT:P IIA e inactiva la AT:P IID).

3. Las cantidades celulares de GS se controlan a nivel de la expresión de genes y síntesis de proteínas.El gen que codifica la GS en E.coli se denomina GlnA. Este gen se transcribe para dar GS-mRNA solamente si existe un activador transcripcional, NRI, en su forma fosforilada, NRI-P. A su vez NRI se fosforila por una proteína quinasa, la NRII, dependiente de ATP. Si la NRII está complejada con PIIA, no actúa como una quinasa, sino como una fosfatasa, y la forma NRI-P se convierte en su forma NRI, parándose la transcripción del gen GlnA. Una relación alta [Gln]/[CG] favorece la forma PIIA en vez de la PIID, y en estas condiciones la expresión de la GS no es necesaria.

Las formas eucarióticas de la GS no presentan estas formas de regulación. En E.coli la GS es un dodecámero de 600 kD (12). Los centros activos están localizados en las intefases de las subunidades y por tanto los monómeros son inactivos.

Los grupos -amino de la Ser y de la Thr se pueden desaminar directamente (Ser Pyr+NH4+ yThr CG + NH4+)por tener un grupo OH adyacente, mediante la serina deshidratasa y la treonina deshidratasa, que también tienen PLP como grupo prostético. Se las denomina deshidratasas porque la salida de agua (deshidratación) precede a la del grupo amonio.

 

Regulación de la degradación de proteínas endógenas y recambio de proteínas  

Las células mueren de manera regular y planeada y sus componentes moleculares se metabolizan. Esta muerte programada se denomina apoptosis. Las proteínas normales también se recambian en condiciones normales, aunque la comprensión de su regulación todavía no está del todo esclarecida. Las proteínas están sujetas a cambios, ya sea por oxidación, proteolisis, desnaturalización u otras modificaciones irreversibles. Al mismo tiempo, las proteínas se adaptan a las condiciones celulares. En algunos casos, la vida media de las proteínas puede ser de horas o minutos, como en el caso de la orinitina descarboxilasa, fosfoquinasa C o insulina, varios meses, como la hemoglobina e histonas, o toda la vida del individuo, como las cristalinas de la lente. La mayoría se recambia al cabo de unos días. Las enzimas que actúan en rutas metabólicas dependen muchas veces de

circunstancias externas, como por ejemplo las enzimas del ciclo de la urea, que cambian en respuesta a la dieta.

La selección de una proteína particular para su degradación no se comprende muy bien, pero, en muchos casos, se realiza mediante su marcaje, su unión covalente a un oligopéptido, la ubicuitina. La ubicuitina tiene 76 aminoácidos y se une mediante su Gly C-terminal al grupo amino terminal o a los residuos de Lys de la proteína para ser marcada para su degradación. Es un proceso no lisosómico, es dependiente del ATP y requiere un complejo de tres enzimas conocido como la ubicuitina proteína ligasa.

La ubicuitinación y degradación protéica regulan el ciclo celular mediante la influencia de la cantidad de proteínas (las ciclinas) disponibles en las fases S y G1 del ciclo celular. Parece ser que la ubicuitina también se une a histonas, pero no está relacionado con el recambio protéico. La degradación dependiente de ATP de proteínas marcadas por la ubicuitina tiene lugar en unos complejos denominados proteasomas de 26 kD, de unos 25 polipéptidos.

 

Paso 1a (E1, enzima E1)

 

UB-COOH + ATP + E1 [UB-CO-AMP.E1] + PPi

Paso 1b

[UB-CO-AMP.E1] UB-CO-S-E1

 

Paso 2 (E2, enzima E2)

UB-CO-S-E1 + E2-SH UB-CO-S-E2 + E1

 

Paso 3 (E3, grupo de enzimas E3)

UB-CO-S-E2 + E3-Proteína (UB-CO-)n-Proteína

 

Paso 4

(UB-CO-)n-Proteína + ATP UB-COOH + AMP + Péptidos

 

Otras degradaciones de proteína tienen lugar en los lisosomas, pero no es el mecanismo más importante de degradación de las proteínas celulares. Las proteasas dependientes de calcio,

denominadas calpainas, están presentes en todas las células y parece ser que están implicadas en el recambio de las proteínas.

La mayor parte de las proteínas se encuentran en el músculo y por lo tanto los aminoácidos.

Cuando se necesita energía, las proteínas del músculo se degradan y los grupos amino de los aminoácidos se transfieren a la Gln y Ala y se transportan al hígado o al riñón. Los esqueletos carbonados se utilizan para proporcionar energía o se transportan al hígado para la gluconeogénesis. En estos órganos, el amonio se libera por la alanina aminotransferasa, la glutaminasa o la glutamato deshidrogenasa. La glutamato deshidrogenasa no solo libera NH3, sino también NADH y CG, un intermediario glucogénico. Muchos tumores producen la caquesia o gasto de las proteínas del músculo. Esto se produce, no a nivel de regulación en la degradación de las proteínas del músculo, pero sí por un aumento en la velocidad de a la que el hígado quita los aminoácidos del plasma. Cuando la cantidad de glucagón circulante es alta, señal de que se necesita intermediarios para la gluconeogénesis), aumenta el metabolismo de los aminoácidos estimulando la toma de los aminoácidos por el hígado. 

Ciclo de la urea  

El ciclo de la urea y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos fueron descubiertos por Hans Krebs y colaboradores. En los animales mamíferos terrestres el ciclo de la urea es el mecanismo utilizado para la excreción del nitrógeno (ureotélicos), mientras que el ácido úrico se excreta por los reptiles terrestres y los pájaros (uricotélicos) y los animales acuáticos excretan el amonio como tal (amonotélicos). Las plantas reciclan virtualmente

todos los grupos amino y la excreción del N es muy rara. Los dos N de la molécula de urea se derivan de amonio libre y de Asp. El ciclo comienza y acaba con la ornitina (Orn). A diferencia del TCA, donde los átomos de C son diferentes al principio y al final, en el ciclo de la urea son los mismos en la Orn. La urea se sintetiza en el hígado, segregada en la sangre y secuestrada por el riñón.

El ciclo de la urea es también un mecanismo de excreción del exceso de HCO3 -, en la cual una ácido debil, el NH4 +, protona la base conjugada de un ácido más fuerte, el HCO3-.

 La reacción neta es

 

NH3 + HCO3 - + Asp + 3ATPUrea + Fumarato + 2ADP + 2Pi + AMP + PPi

Mirando la excreción de tenemos

 

HCO3- + 2NH4+ UREA + 2H2O + H+

 

HCO3- + H+ H2O + CO2

El amonio, el primer N de la urea, entra en el ciclo al condensarse con el bicarbonato para dar carbamoil-fosfato, que reacciona con la Orn para dar citrulina. El Asp, el donador del segundo N de la urea) reacciona con la citrulina para dar argininosuccinato, que se rompe para dar Arg y fumarato. La Arg se hidroliza en urea y Orn, regenerándose la Orn en este paso. La urea se transporta al riñón y excretada en la orina. El ciclo requiere 4 ATP para excretar los dos N de la urea. Es mucho más eficiente incorporar el N en los aminoácidos que excretarlo. El paso regulador más importante es la síntesis inicial del carbamoilfosfato y el ciclo se regula también por la inducción de la síntesis de los enzimas implicados.

La carbamoilfosfato sintetasa I no forma parte del ciclo de la urea pero es esencial para él.

Amonio libre y bicarbonato se condensan mediante el gasto de 2 ATP para formar carbamoilfosfato. Esta enzima está localizada en la mitocondria, utiliza amonio como donador de N y es absolutamente dependiente de N-acetilglutamato para ser activa. El N acetilglutamato se sintetiza por la Nacetilglutamato sintetasa (activada por la Arg) a partir de acetil-CoA y Glu e hidrolizado por una hidrolasa específica. El acetil-CoA, el Glu y la Arg son intermediarios necesarios para el ciclo de la urea, y la presencia de N-acetil-glutamato indica que estos están presentes. La velocidad de las demás enzimas del ciclo de la urea se regulan por la presencia o no de sus substratos. Otra enzima, la carbamoilfosfato sintetasa II se localiza en el citosol, utiliza el grupo amida de la Gln, no se ve afectada por el Nacetilglutamato, y participa en la biosíntesis de las pirimidinas.

 

HCO3- + ATP + E HOOC-P.E + ADP

 

HOOC-P-E + NH3 + ATP H2N-CO-P + E + ADP + Pi

 

La formación de la citrulina a partir de Orn y carbamoilfosfato se cataliza por la ornitina transcarbamoilasa en la matriz mitocondrial. La citrulina se transporta al citosol desde la mitocondria ya que las otras reacciones transcurren en el citosol. El argininosuccinato se forma por la argininosuccinato sintetasa, mediante la condensación de citrulina y Asp, con gasto de ATP y formación de AMP y PPi (equivalente a 2 ATP). La rotura del argininosuccinato se realiza por la argininosuccinato liasa para dar Arg y fumarato. La Arg se rompe en urea y Orn por la arginasa. La Orn entra en la mitocondria y comienza el ciclo de nuevo. La membrana interna mitocondrial contiene un intercambiador de citrulina/ornitina. La inducción de los enzimas del ciclo (10-20 veces) tiene lugar cuando los aminoácidos o el amonio en hígado aumenta. También, una dieta alta en proteínas (exceso de aminoácidos) o el ayuno (producción de energía) dan lugar a la inducción de las enzimas del ciclo de la urea.

Ya que la Arg se produce a partir de los carbonos y nitrógenos de la Orn, amonio y Asp, es un aminoácido no esencial. Sin embargo, en niños, la síntesis de Arg no es suficiente y este aminoácido es esencial.

Los carbonos del Asp se liberan en forma de fumarato, y pueden entrar en la mitocondria donde se metabolizan a OAA por el TCA. Este se puede transaminar, al menos teóricamente, y entrar de nuevo en el ciclo. En principio el ciclo de la urea convierte dos grupos amino, uno del amonio y otro del Asp, junto con un carbono del bicarbonato, en un producto de excreción relativamente no tóxico, la urea, con un coste de 4 enlaces de alta energía (3ATP hidrolizados en 2ADP, 2Pi, AMP y PPi, este último hidrolizado rápidamente en 2Pi). El fumarato puede formar de nuevo Asp (el donador de N, proveniente de otro aminoácido por transferencia), y en este proceso se forma un NADH. El NH3 puede proceder del Glu por la glutamato deshidrogenasa, a su vez de otro aminoácido, y también forma un NAD(P)H. Por lo tanto el gasto de ATP en el proceso se ve compensado por la formación de NADH.

La urea se transporta el riñón para su filtrado y excreción. La urea que entra en el tracto intestinal se rompe por la ureasa bacteriana, y el amonio resultante se absorbe y utiliza por el hígado. El ciclo de la urea es el mecanismo más importante para la eliminación del amonio, una substancia muy tóxica. Los desórdens metabólicos que surgen por una disfunción en los enzimas del ciclo de la urea son potencialmente fatales y causan el coma cuando la [NH4 +] es muy alta. Además, una gran [NH4 +] secuestra el CG para formar Glu y de resultas el ciclo de los ácidos tricarboxílicos no funciona. La síntesis de fumarato es importante además porque liga el ciclo de la urea con el TCA. El fumarato puede hidratarse a malato y este oxidarse a OAA. El OAA puede transaminarse hasta Asp, puede convertirse en glucosa por la gluconeogénesis, puede formar citrato y puede convertirse en Pyr.

Los rumiantes excretan parte de la urea al rumen, donde los microorganismos la utilizan para sintetizar aminoácidos, siendo estos absorbidos posteriormente por el animal. El reciclado de la urea les permite reducir las necesidades de ingestión de proteína y producción de orina, además de que les permite mejor alimentarse con forraje con poca proteína y en un ambiente relativamente seco. Esto tiene también lugar en el camello, por lo que reduce también la necesidad de disponer de agua para su excreción.

Vía de las pentosa fosfato y gluconeogénesis

Gluconeogénesis

La gluconeogénesis es la ruta por la cual los precursores no azúcares (lactato, piruvato, propionato, glicerol y aminoácidos) se convierten en glucosa. No debemos de confundirlo con la glucogenolisis, ya que se forma glucosa pero a partir del glucógeno o (glucosa)n y no es una síntesis de novo. Como sabemos, la glucosa ocupa un papel central en el metabolismo, tanto como fuel como precursor de otros carbohidratos y biomoléculas. El cerebro (una persona normal consume unos 160±20 g de glucosa por día, un 75% por el cerebro) y los eritrocitos por ejemplo dependen de la glucosa como fuente energética (otros son la lente, la córnea, los testículos, la médula del riñón). Sin embargo el hígado solamente puede almacenar glucosa en forma de glucógeno para proporcionar al cerebro glucosa durante solo medio día en condiciones de ayuno (entre 180 y 200 g de glucógeno se almacenan en un individuo normal y los fluidos corporales tienen unos 20 g de glucosa libre). Por lo tanto, durante condiciones de ayuno o metabólicamente parecidas la mayor parte de la glucosa se debe de formar por la gluconeogénesis (nueva síntesis de glucosa) a partir de precursores que no son carbohidratos. Mediante estudios de marcaje, la fuente de la glucosa en condiciones de ayuno por la gluconeogénesis es de cerca del 64% del total de la glucosa presente en sangre (durante las primeras 22 h) y prácticamente toda la glucosa a las 48 h. Por lo tanto, incluso durante unas horas sin alimentarse, la gluconeogénesis es la ruta por la cual la mayor parte de la glucosa se forma en los animales. Tiene lugar principalmente en el hígado (90%) y menos en el riñón (10%).

Los precursores que se pueden convertir en glucosa son: lactato y piruvato, producidos en la glicolisis, intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y los esqueletos carbonados de la mayoría de los aminoácidos (glucogénicos, dan lugar a la síntesis neta de Pyr o OAA). En primer lugar todos estos precursores tienen que convertirse en OAA, que es la molécula que comienza la gluconeogénesis. Los únicos aminoácidos que no se pueden convertir en OAA son la Leu y la Lys (cetogénicos) ya que producen acetil-CoA y acetoacetato y los animales no tienen ninguna ruta que les permita convertir el acetil-CoA en OAA (solo en plantas). Por la misma razón los ácidos grasos no pueden utilizare para la síntesis de glucosa en los animales ya que se degradan acetil-CoA. El glicerol, formado en la rotura de los triacilgliceroles, forma G3P con gasto de ATP (glicerol quinasa) y después DHAP (G3P deshidrogenasa).

Los ácidos grasos con número impar n de átomos de carbono o ramificados (derivados de laclorofila, por ejemplo) dan lugar a propionato,

(acido graso)n ® (n-3)/2 acetil-CoA + propionil-CoA

El propionil-CoA se convierte en S-metilmalonil-CoA por la propionil-CoA carboxilasa (utiliza ATP), este en R-metilmalonil-CoA por una racemasa y este en succinil-CoA por una mutasa (con vitamina B12), que da lugar a OAA.

La fructosa puede dar lugar a glucosa. La F se fosforila a F1P en el hígado y esta se rompe por una aldolasa específica en DHAP y gliceraldehido. El gliceraldehido se reduce a glicerol, este forma G3P con gasto de ATP (glicerol quinasa) y después DHAP (G3P deshidrogenasa). Las dos moléculas de DHAP formadas pueden ser utilizadas en la formación de glucosa o bien en la glicolisis.

En la glicolisis,la glucosa se convierte en piruvato; en la gluconeogénesis, el piruvato se convierte en glucosa. Pero una no es el inverso de la otra. La gluconeogénesis utiliza enzimas glicolíticas. Sin embargo, varias de las enzimas de la glicolisis tienen una _G bastante negativa (hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa) y por lo tanto estas reacciones se deben de reemplazar para que la biosíntesis de la glucosa sea favorable termodinámicamente. Esto es así (las rutas de degradación y biosíntesis deben de diferenciarse al menos en un enzima) para que

en condiciones fisiológicas las rutas sean favorables termodinámicamente y al mismo tiempo puedan ser reguladas de manera independiente y coordinada, y si una ruta funciona la otra no.

Formación de PEP a partir de Pyr 

La formación de PEP a partir de Pyr necesita energía y esto se consigue convirtiendo el Pyr primero en OAA y después este en PEP. Este proceso requiere dos enzimas, la piruvato carboxilasa, que forma OAA a partir de Pyr, HCO3 - y ATP, y la PEP carboxiquinasa, que convierte el OAA en PEP utilizando GTP. La piruvato carboxilasa es una proteína tetramérica (4 x 120 kD), con 4 grupos prostéticos de biotina y localizada solamente en la mitocondria. La biotina funciona como un transportador de grupos CO2. La biotina está unida covalentemente al enzima por una unión amida entre su cadena lateral de valerato y un grupo e-amino de un resto de Lys, formando la biocitina o biotinillisina. La biotina está por tanto unida a la proteína por una cadena flexible de unos 14A, de manera parecida al grupo lipoil-lisilo del complejo de la piruvato deshidrogenasa. La biotina es un factor esencial en la dieta humana, pero su carencia es rara ya que es abundante en los alimentos y es sintetizado por la flora intestinal. Unicamente se produce en personas que se alimentan de muchos huevos crudos, ya que tienen una proteína, la avidina, que une a la biotina muy fuertemente (no ocurre en los cocinados por que la avidina está desnaturalizada). Parece ser que la avidina funciona como bactericida para inhibir el crecimiento de los microorganismos en el huevo.

La reacción de la piruvato carboxilasa transcurre en dos partes. En la primera, la biotina se carboxila por el bicarbonato, con gasto de ATP, y en la cual se forma un intermediario carboxifosfato. Este intermediario tiene suficiente energía para carboxilar la biotina sin necesidad de más aporte de energía. A continuación, el carboxilo activado se transfiere al Pyr en una reacción de tres pasos para formar el OAA. Estos dos pasos ocurren en sitios diferentes del enzima; el brazo de la biocitina sirve para transferir el anillo de biotina entre ambos sitios. La síntesis del OAA es una reacción anaplerótica que aumenta la actividad del TCA. La acumulación del acetil-CoA señala la necesidad de más OAA para que el ciclo de los ácidos tricarboxílicos pueda funcionar; el acetil-CoA es un activador alostérico de la piruvato carboxilasa muy importante. El enzima está completamente inactivo si no tiene acetil-CoA unido. Si el ciclo de los ácidos tricarboxílicos está inhibido, por ejemplo por el ATP y el NADH, el OAA va hacia la gluconeogénesis.

La PEP carboxiquinasa, una enzima monomérica de 74 kD, cataliza la descarboxilación del OAA (utilizando GTP) para formar PEP (y GDP). Nótese que el CO2 utilizado para carboxilar al Pyr se elimina ahora al formar PEP. El OAA se podría pensar como un Pyr activado con CO2.

La generación del OAA a partir del Pyr o de los intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos ocurre en la mitocondria, mientras que los enzimas que convierten el PEP en glucosa son citosólicos. La PEP carboxiquinasa está en la mitocondria del hígado de paloma y conejo, en el citosol del hígado de ratón y rata, y en cobayas y humanos tanto en la mitocondria como en el citosol. Para que la gluconeogénesis continue o bien el OAA o bien el PEP deben de salir de la mitocondria. El PEP tiene transportadores específicos situados en la membrana mitocondrial, pero no así para el OAA. Se debe de convertir o bien en Asp o bien en malato para poder salir a través de transportadores específicos. La diferencia entre ambos tipos de transporte radica en la utilización de los equivalentes de reducción. La ruta de la malato deshidrogenasa da lugar al transporte de equivalentes de reducción del NADH desde la mitocondria hacia el citosol, mientras que la ruta de la aspartato aminotransferasa no. Como se necesita NADH para la gluconeogénesis en el citosol, la ruta del malato es más necesaria. En el caso de que el precursor de la glucosa fuera el lactato, como su oxidación para generar Pyr proporciona NADH, se puede utilizar cualquier ruta. Obviamente, ambas rutas se pueden

utilizar en sentido inverso para transportar equivalentes de reducción en forma de NADH dentro de la mitocondria (lanzadera del malatoaspartato).

Las rutas opuestas de la glicolisis y de la gluconeogénesis utilizan algunos enzimas de ambas rutas para ellas. Aparte de lo que ya hemos visto (reacción de la piruvato quinasa), en la glicolisis existen otros dos pasos desfavorables en la dirección gluconeogénica: la fosfofructoquinasa y la hexoquinasa. En estos pasos, en lugar de generar ATP simplemente cambiando el sentido de la reacción, la F1,6BP y la G6P son hidrolizadas, dando lugar a Pi, mediante las reacciones catalizadas por la fructosa-1,6- bisfosfatasa y la glucosa-6-fosfatasa. La glucosa-6-fosfatasa existe solamente en hígado y en riñón, lo que les permite proporcionar glucosa a otros tejidos. La glucosa-6-fosfatasa es una enzima de membrana y está localizado su centro activo dentro del retículo endoplásmico (RE). La G6P se transporta hacia el interior del RE por una proteína T1, allí es hidrolizada a G más Pi por la G6Pasa, y entonces el Pi y la G pasan de nuevo al citosol por las proteínas T2 y T3. La G6Pasa está estabilizada por una proteína asociada unida a Ca2+.

Gracias a la existencia de estos pasos irreversibles, tanto la glicolisis y la gluconeogénesis son favorables termodinámicamente. Esto es así gracias a la energía libre liberada en la hidrólisis de una molécula de ATP y otra de GTP por molécula de glucosa además de la que se utilizaría si la gluconeogénesis fuese lo mismo que la glicolisis pero al revés. Los cuatro enlaces extra que se necesitan en la gluconeogénesis comparada con la glicolisis son necesarios para que su DGº´ sea negativa.

GLICOLISIS

glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi ® 2 Pyr + 2 NADH + 4 H+ + 2 ATP + 2 H2O

DGº´= -20 kcal/mol

INVERSO DE LA GLICOLISIS

2 Pyr + 2 NADH + 4 H+ + 2 ATP + 2 H2O ® glucosa + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi

DGº´= +20 kcal/mol

GLUCONEOGENESIS

2 Pyr + 2 NADH + 4 H+ + 4 ATP + 2 GTP + 6 H2O ® glucosa + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi

DGº´= -20 kcal/mol

Gluconeogénesis – Glicolisis

2 ATP + 2 GTP + 4 H2O ® 2 ADP + 2 GDP + 4 Pi

Estas pérdidas en energía son imprescindibles y el precio a pagar para controlar y regular de manera independiente ambos tipos de procesos. Si recordamos que aproximadamente un ATP modifica la constante de equilibrio unas 108 veces, 4 ATPs, el consumo extra en la gluconeogénesis, modificaría la constante de equilibrio unas 1032 veces, favoreciendo por tanto la formación de glucosa a partir del piruvato

La gluconeogénesis es costosa en términos de ATP (6 ATP se requieren para la síntesis de una molécula de glucosa a partir de 2 moléculas de lactato). El ATP necesario se obtiene en gran parte de la oxidación de los ácidos grasos. Por regla general, las condiciones que hacen que el hígado sintetice glucosa también hacen que la cantidad de ácidos grasos en la sangre aumente. En el hígado estos ácidos grasos se oxidan a cuerpos cetónicos.

Regulación de la gluconeogénesis  

Como es obvio, si tanto la glicolisis como la gluconeogénesis procedieran de una manera descontrolada, tendríamos un ciclo fútil donde se gastaría ATP y GTP. Esto no ocurre sino que ambas rutas están reguladas de manera recíproca de acuerdo a las necesidades del organismo. Cuando el organismo está alimentado, y la[glucosa] en sangre es alta, el hígado funciona para la conservación de energía, se sintetiza glucógeno y la glicolisis está activada, así como la piruvato deshidrogenasa para formar acetil-CoA, con la consiguiente formación de ácidos grasos y lípidos. Cuando el organismo está en ayuno, el hígado intenta mantener la [glucosa] en sangre estimulando la rotura del glucógeno y cambiando la ruta de la glicolisis por la de la gluconeogénesis, utilizando principalmente productos de degradación de proteínas mediante el ciclo de la glucosa-alanina.

Como hemos comentado anteriormente, la velocidad y la dirección de la glicolisis y gluconeogénesis son controladas en los puntos de estas rutas donde la direcciones se pueden regular: reacciones de la hexoquinasa (HK)/glucosa-6-fosfatasa, fosfofructoquinasa (PFK)/fructosa-1,6- bisfosfatasa (FBPasa) y piruvato quinasa (PK) / piruvato caboxilasa-PEP carboxiquinasa (PEPCK).

Los mecanismos dominantes son las interacciones alostéricas y las modificaciones covalentes dependientes de AMPc (fosforilación/desfosforilación). Esta modificación covalente hace que el sistema sea sensible al control por el glucagón y otras hormonas que afectan los niveles de AMPc. El más importante de los efectores alostéricos es el F2,6-BP que activa la PFK e inhibe la FBPasa. El nivel de F2,6-BP está controlado por las velocidades de su síntesis y de rotura por la PFK-2 y la FBPasa-2 respectivamente. Aunque estas enzimas catalicen reacciones que no pertenecen estrictamente a las rutas de la glicolisis o de la gluconeogénesis, su control es muy importante. Las actividades de la PFK-2 y de la FBPasa-2 ocurren en dominios separados de la misma enzima (enzima bifuncional o enzima tándem), están sujetas a regulación alostérica y modificación covalente. La activación de la gluconeogénesis en el hígado implica también la inhibición de la glicolisis a nivel de la piruvato quinasa. La piruvato quinasa del hígado está inhibida por la Ala y por fosforilación. En contraste, la degradación del glucógeno está estimulada por fosforilación. Ambas rutas confluyen en la G6P, que se convierte en glucosa para ser exportada al cerebro y al músculo.

La piruvato quinasa del músculo no está regulada; esto sería contraproducente en el músculo ya que este tejido no posee la habilidad de sintetizar glucosa por la gluconeogénesis.

El glucagón aumenta el nivel de los ácidos grasos en la sangre promoviendo la lipolisis en el tejido adiposo, una acción opuesta por la insulina. La mayor cantidad de ácidos grasos que puede disponer el hígado hace que este los oxide a cuerpos cetónicos, promoviendo la síntesis de glucosa (proporciona el ATP necesario). También el glucagón y la insulina regulan la gluconeogénesis influyendo en la fosforilación de las enzimas susceptibles. El glucagón activa la adenilato ciclasa produciendo AMPc, el cual activa la proteína quinasa A, la cual a su vez inactiva fosforilando la piruvato quinasa. La inactivación de esta enzima glicolítica estimula el paso opuesto en la gluconeogénesis, bloqueando la conversión fútil de PEP en Pyr. El glucagón también estimula la gluconeogénesis disminuyendo la concentración de F-2,6-BP en el hígado (activador alostérico de la 6-fosfofructo-1-quinasa e inhibidor alostérico de la fructosa-1,6-bisfosfatasa). El glucagón, mediante el AMPc, baja el nivel de F-2,6-BP estimulando la fosforilación del enzima bifuncional 6-fosfofructo-2-quinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa. La fosforilación de este enzima inactiva la actividad quinasa que forman F-2,6-BP a partir de F6P pero activa la actividad fosfatasa que hidroliza el F-2,6-BP en F6P. Esta disminución de F-2,6-BP disminuye la actividad de la 6-fosfofructo-1-quinasa y aumenta la actividad fructosa-1,6-bisfosfatasa. En su conjunto, aumenta la gluconeogénesis. El aumento en F6P puede favorecer la gluconeogénesis por la inhibición de la glucoquinasa gracias a una proteína inhibidora. La insulina tiene efectos contrarios al glucagón, pero me3diante un mecanismo no del todo establecido.

El glucagón y la insulina tienen también efectos más duraderos en la glicolisis y en la gluconeogénesis del hígado mediante la inducción y la represión de la síntesis de enzimas de ambas rutas. Una relación glucagón/insulina alta en la sangre aumenta la capacidad gluconeogénica y disminuye la glicolítica. Una relación glucagón/insulina baja tiene efectos contrarios. El glucagón señala e induce una serie de enzimas: PEP carboxiquinasa, fructosa-1,6-bisfosfatasa, glucosa-6-fosfatasa y algunas aminotransferasas. Un modelo de cómo ocurre puede ser el siguiente: El glucagón se une a su receptor en la membrana plasmática, activa la adenilato ciclasa, aumenta el AMPc, y activa la proteína quinasa A. La proteína quinasa A fosforila un aproteína denominada proteína de unión activada por AMPc (CREB), que en su forma fosforilada se une a una proteína de respuesta al AMPc (CRE), proteína que promueve la transcripción de una serie de proteínas. Por un mecanismo similar, el glucagón reprime la transcripción de genes disminuyendo la síntesis de la glucoquinasa, 6-fosfofructo-1-quinasa y piruvato quinasa. La insulina actúa de manera contraria al glucagón. Cuando la glicolisis no se necesita, los enzimas clave no se sintetizan, mientras que los de la gluconeogénesis sí, y viceversa.

El etanol inhibe la gluconeogénesis por el hígado. El etanol se oxida principalmente en el hígado, produciendo gran cantidad de equivalentes de reducción, que se transportan a la mitocondria por la lanzadera del malato-aspartato. Este exceso de NADH crea problemas a la gluconeogénesis porque fuerza el equilibrio entre las reacciones catalizadas por la lactato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa en las direcciones de formación del lactato y del malato.

CH3CH2OH + NAD+ ® CH3CHO + NADH + H+

Pyr + NADH + H+ ® lactato + NAD+

CH3CH2OH + NAD+ ® CH3CHO + NADH + H+

OAA + NADH + H+ ® malato + NAD+

Forzando estas reacciones se inhibe la síntesis de glucosa porque limita las cantidades de Pyr y OAA presentes para las reacciones catalizadas por la piruvato carboxilasa y la PEP carboxiquinasa respectivamente.

Ciclo de Cori y ciclo de la alanina  

La contracción del músculo está sostenida por el consumo de ATP, que se regenera por la fosforilación oxidativa en las mitocondrias en las fibras musculares rojas y por la glicolisis, que da lugar a lactato, en las fibras musculares blancas. Las rojas también producen lactato cuando la demanda excede la capacidad de producción de ATP por la fosforilación oxidativa. El lactato se transfiere a través de la sangre, al hígado, donde se convierte en piruvato por la lactato deshidrogenasa y después en glucosa por la gluconeogénesis. Gracias al torrente sanguíneo, el hígado y el músculo participan de un ciclo metabólico conocido como el ciclo de Cori. Esto sería el ciclo fútil glicolisis/gluconeogénesis pero ahora no ocurren en el mismo lugar (célula) sino en diferentes (tejidos). El ATP del hígado se utiliza para resintetizar glucosa a partir del lactato producido en el músculo, y la glucosa resintetizada vuelve de nuevo al músculo para ser utilizada o almacenada en forma de glucógeno. Este ciclo también tiene lugar de manera importante en los eritrocitos. La formación de lactato ahorra tiempo y desvía parte de la carga metabólica desde el músculo hasta el hígado.

6 ATP hígado + 2 (ADP + Pi) eritrocito ® 6 (ADP + Pi)hígado + 2 ATPeritrocito

El ciclo de la alanina resulta del transporte de la alanina por la sangre relacionando el músculo y el hígado. En el músculo se forma alanina a partir del piruvato producido en la glicolisis. La Ala al llegar al hígado da lugar a piruvato y amonio. Este último por la ureogénesis da lugar a urea que se segrega en la sangre para ir al riñón, mientras que el Pyr da lugar a glucosa a través de la gluconeogénesis. En este caso el NADH generado en la formación de Pyr no se utilizan para formar lactato, sino que se pueden utilizar para la producción de ATP, en contraste con el ciclo de Cori, donde el NADH se gasta en formar lactato a partir de Pyr. El ciclo de la alanina es más eficiente que el ciclo de Cori, aunque hay que tener en cuenta que la formación de urea es bastante costosa energéticamente hablando.

10 ATPhígado + 6-8 (ADP + Pi)músculo + O2 músculo ® 10 (ADP + Pi)hígado + 6-8 ATPmúsculo

Estos ciclos son funcionales solo entre el hígado y tejidos que no oxiden la glucosa completamente a CO2 y H2O.

Existe una relación muy importante entre la gluconeogénesis y la ureogénesis, ya que la degradación de los aminoácidos no solo da lugar a intermediarios de la gluconeogénesis sino también a amonio.

La ruta del glioxilato  

Dado que los átomos de C de las molecúlas de acetato que entran en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos aparecen ochos pasos más tarde en el OAA parecería que el ciclo de los ácidos tricarboxílicos es capaz de generar OAA a partir de acetato y por tanto capaz de formar PEP para la síntesis de glucosa. Sin embargo, un examen de la estequiometría revela que no hay conversión neta de acetato en OAA ya que por cada dos C que entran en forma de acetato dos salen en forma de CO2. En las plantas, en algunos invertebrados y en algunos microorganismos, como en E. coli, el acetato puede servir de combustible rico en energía y al mismo tiempo de proporcionar PEP para la síntesis de glucosa. La ruta del glioxilato es una ruta por la cual estos organismos convierten el acetil-CoA en glucosa gracias a la síntesis de OAA a partir del acetil-CoA. Esta ruta comparte enzimas de la mitocondria y del glioxisoma, y podría ser anterior

evolutivamente hablando al TCA. El OAA de la mitocondria se condensa con acetil-CoA para formar citrato y este isomerizado a isocitrato como en el TCA. La isocitrato liasa del glioxisoma rompe el isocitrato en succinato y en glioxilato. El succinato se transporta a la mitocondria donde entra en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos para convertirse de nuevo en OAA. La ruta del glioxilato da lugar entonces a la conversión neta de glioxilato a partir de una molécula de acetil- CoA y no de dos moléculas de CO2, como en el TCA. El glioxilato se convierte en OAA gracias a dos enzimas: la malato sintasa, enzima del glioxisoma, que condensa glioxilato y otra molécula de acetil-CoA para formar malato, y la malato deshidrogenasa, del citosol, que oxida el malato en OAA gracias al NAD+. La reacción conjunta es la formación de una molécula de OAA a partir de dos acetil CoA.

2 acetil-CoA + 2 NAD+ + FAD ® OAA + 2 CoA + 2 NADH + FADH2 + 2H+

Estas dos enzimas, la isocitrato liasa y la malato sintasa, enzimas del ciclo del glioxilato existentes solamente en plantas, permiten a las semillas convertir los triacilgliceroles en glucosa a través del acetil- CoA. Los enzimas que son comunes a ambos ciclos están presentes como isoenzimas, tanto en la mitocondria como en el glioxisoma (el glioxisoma no tiene la succinato deshidrogenasa, la fumarasa y la malato deshidrogenasa). Los glioxisomas no se encuentran en todos los tejidos de las plantas y en todo momento. Se desarrollan sobre todo en semillas en germinación, antes de que las plantas adquieran la capacidad de sintetizar glucosa a través de la fotosíntesis.

En las semillas en germinación, las transformaciones enzimáticas de los ácidos dicarboxílicos y tricarboxílicos se producen en tres compartimentos celulares: mitocondria, glioxisoma y citosol, exisitiendo un intercambio continuo de intermedios entre todos ellos. El Asp transporta el esqueleto carbonado del OAA desde el ciclo de los ácidos tricarboxílicos hasta el glioxisoma, donde se condensa con el acetil-CoA procedente de los ácidos grasos. El citrato producido se convierte en isocitrato que a continuación se excinde para dar glioxilato y succinato. El succinato vuelve a la mitocondria, donde se incorpora al ciclo de los ácidos tricarboxílicos y es transformado en OAA entrando de nuevo en el ciclo al transformarse en Asp. El glioxilato formado se combina con otra molécula de acetil-CoA dando malato, que entra en el citosol y se oxida a OAA, precursor de la glucosa en la gluconeogénesis. En estas conversiones participan cuatro rutas: degradación de ácidos grasos a acetil-CoA, ciclo del glioxilato, ciclo del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la gluconeogénesis. El hecho de compartir intermedios comunes implica una coordinación conjunta entre todas estas rutas. El isocitrato es un intermedio crucial y la isocitrato deshidrogenasa se encuentra regulada por modificación covalente mediante una proteína quinasa específica, que la fosforila, inactivándola. Esta inactivación desvía el isocitrato al ciclo del glioxilato, donde inicia su ruta hacía la síntesis de glucosa. Una fosfatasa reactiva al enzima haciendo que el isocitrato entre en el TCA. Las actividades reguladoras proteína quinasa y proteína fosfatasa están separadas pero residen en el mismo enzima.

Algunas bacterias poseen todos los enzimas en el citosol. Por lo tanto, estas bacterias (E.coli) pueden crecer con acetato como única fuente de energía y de carbono. Los mismos intremedios que activan la isocitrato deshidrogenasa son inhibidores alostéricos de la isocitrato liasa.

Biosíntesis de oligosacáridos y glicoproteínas  

Los oligosacáridos consisten en unidades de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos (enlaces entre el carbono anomérico C1 de un monosacárido y el grupo OH de otro monosacárido). Se conocen cerca de 80 tipos de enlaces glicosídicos, la mayor parte de ellos entre unidades de manosa, Nacetilglucosamina, N-acetilmurámico, glucosa, fucosa o 6-desoxigalactosa, galactosa, Nacetilneuramínico o ácido siálico y N-acetilgalactosamina. Los enlaces glicosídicos también tienen lugar en lípidos (esfingomielinas) y proteínas (glicoproteínas). La formación de un enlace glicosídico requiere energía y esta es normalmente proporcionada uniendo al monosacárido con un nucleótido. Estos son el UDP, GDP o CMP.

Algunos disacáridos se sintetizan para su uso futuro como molécula de reserva energética como la lactosa o b-galactosil-(1®4)-glucosa, que se sintetiza en la glándula mamaria por la lactosa sintetasa. El donante es el UDP-galactosa, formado por epimerización de la UDP-glucosa, siendo el aceptor la glucosa. La lactosa sintetasa consiste en dos unidades, la galactosil transferasa, la subunidad catalítica, que está presente también en numerosos tejidos donde cataliza la reacción entre la UDP-galactosa y la Nacetilglucosamina para dar N-acetillactosamina, presente en numerosos oligosacáridos, y la a- lactalbúmina, una proteína presente en la glándula mamaria, sin actividad catalítica, que cambia la especificidad de la transferasa para que utilice glucosa como aceptor en vez de N-acetilglucosamina.

Las proteínas destinadas para la secreción, incorporación en membranas o localización dentro de orgánulos específicos, contienen carbohidratos y se clasifican como glicoproteínas. La glicosilación y el procesado de los oligosacáridos juegan un papel de suma importancia en la distribución de estas proteínas a sus destinos determinados. Las proteínas se sintetizan en los ribosomas y los oligosacáridos se les unen posteriormente. Estos se pueden clasificar en tres grupos:

1. Oligosacáridos unidos a N, unidos a la cadena polipeptídica por un enlace b-N-glicosídico a un Asn dentro de la secuencia Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, siendo X cualquier aminoácido menos Pro. Se forman en el retículo endoplásmico y se añaden a la cadena naciente y se añaden más unidades de monosacáridos en el aparato de Golgi. Para transportar los oligosacáridos se utiliza el dolicol.

2. Oligosacáridos unidos a O, unidos a la cadena polipeptídica por un enlace a-N-glicosídico a un resto de Ser o Thr o en colágeno 5-hidroxi-Lys. Las unidades de oligosacáridos se añaden a las proteínas en el aparato de Golgi.

3. Anclajes de membrana del tipo glicosil-fosfatidilinositol (GPI), unidos a la cadena polipeptídica por un enlace amida entre una manosa-6-fosfoetanolamina y el carboxilo C-terminal. Los grupos GPI se añaden a las proteína en el lumen del retículo endoplásmico.

La ruta de las pentosas fosfato  

El ATP es la moneda energética de la célula, su hidrólisis está acoplada a muchas reacciones endoergónicas. Pero las células tienen una segunda moneda, el poder reductor. Muchor procesos requieren NADPH además del ATP, como por ejemplo, la fotosíntesis, la biosíntesis de los ácidos grasos y del colesterol, etc. Aunque sean muy parecidos, el NADH y el NADPH no son intercambiables (difieren solo por el grupo fosfato unido en el grupo 2´-OH de la adenosina). Mientras que el NADH participa en la síntesis del ATP en la fosforilación oxidativa, el NADPH utiliza la energía disponible en la oxidación para biosíntesis endoergónicas de tipo reductor. Esta diferenciación es posible porque las deshidrogenasas que participan en la oxidación y en la reducción exhiben un alto grado de especificidad hacia sus coenzimas. En las células, la relación [NAD+]/[NADH] es de ~1000-800, lo que favorece la oxidación de metabolitos, mientras que la relación [NADP+]/[NADPH] es de ~0.015, lo que favorece la reducción de metabolitos.

La ruta de las pentosas fosfato (ruta del fosfogluconato) es una ruta alternativa para la degradación de la glucosa, cuya función principal es la de producir NADPH, la fuente de equivalentes de reducción para las biosíntesis, y la ribosa-5-fosfato (R5P), el precursor de los ácidos nucléicos, a partir de G6P. Los tejidos que sintetizan ácidos grasos y colesterol activamente (hígado, glándula mamaria, tejido adiposo, testículos y corteza adrenal) tienen una gran cantidad de enzimas que participan en la ruta de las pentosas fosfato, así como en el eritrocito, para poder generar glutatión reducido, esencial para su estructura y viabilidad. Aproximadamente un 20-30% de la oxidación de la glucosa en hígado tiene lugar a través de esta vía. Otros tejidos no lo utilizan prácticamente como el músculo esquelético. Los enzimas de la ruta se encuentran en el citosol, lugar donde se encuentran también los enzimas implicados en la síntesis de los ácidos grasos. También se podría pensar de esta vía como una forma de cortar azúcares de 6C un C cada vez.

El proceso general se puede representar por

3 G6P + 6 NADP+ + 3 H2O ® 6 NADPH + 6 H+ + 3CO2 + 2 F6P + G3P

Aunque el proceso se puede dividir en tres etapas:

1. Reacciones oxidativas que proporcionan NADPH y Ru5P (ribulosa-5-fosfato)

3 G6P + 6 NADP+ + 3 H2O ® 6 NADPH + 6 H+ + 3 CO2 + 3 Ru5P

2. Isomerización y epimerización, que transforman la Ru5P en R5P (ribosa-5-fosfato) o en Xu5P (xilulosa-5-fosfato)

3 Ru5P « R5P + 2 Xu5P

3. Una serie de reacciones que convierten dos Xu5P y un R5P en dos moléculas de F6P y una de G3P (gliceraldehido-3-fosfato)

R5P + 2 Xu5P « 2 F6P + G3P

Estas dos últimas son reversibles y por lo tanto los productos varían según las necesidades de la célula. Por ejemplo, cuando R5P se necesita para la síntesis de nucleótidos, se forman menos F6P y G3P. Si en cambio se forma más de R5P del necesario para lo que se necesita en la síntesis de nucleótidos, este se transforma en F6P y G3P, intermediarios de la glicolisis.

REACCIONES INDIVIDUALES

1. La glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) cataliza la transferencia neta de un ión hidruro al NADP+ del C1 de la G6P formando 6-fosfoglucono-d-lactona. La reacción es irreversible, la enzima es específica para el NADP+ y es inhibida por el NADPH y también por ácidos grasos y CoA.

2. En el siguiente paso la 6-fosfogluconolactonasa aumenta el grado de hidrólisis de la 6-fosfoglucono-d-lactona a 6-fosfogluconato, aunque la hidrólisis no enzimática se realiza a una velocidad grande.

3. La 6-fosfogluconato deshidrogenasa cataliza la descarboxilación oxidativa del 6-fosfogluconato, un b-hidroxiácido a Ru5P y CO2. La reacción es similar a la reacción de la isocitrato deshidrogenasa del TCA.

4. El Ru5P se convierte en R5P por la ribulosa-5-fosfato isomerasa y en Xu5P por la ribulosa-5-fosfato epimerasa.

5. La conversión de tres monosacáridos de 5C en dos de 6C y uno de 3C es realizada por una secuencia de reacciones muy interesante, en el cual participan dos enzimas, la transaldolasa y la transquetolasa. La transquetolasa, que tiene TPP y Mg2+, cataliza la transferencia de una unidad de 2C de la Xu5P a la R5P, dando lugar a G3P y a sedoheptulosa-7-fosfato (S7P).

6. La transaldolasa cataliza la transferencia de una unidad de 3C de la S7P a la G3P dando eritrosa-4-fosfato (E4P) y F6P.

7. En otra reacción, la transquetolasa transfiere una unidad de 2C de una segunda Xu5P a la E4P formando G3P y otra molécula de F6P.

Los productos principales son el R5P y el NADPH. Las reacciones de la transaldolasa y la transquetolasa sirven para convertir el exceso de R5P en intermediarios glicolíticos cuando la necesidad de NADPH excede la de R5P o reciclados incluso por la gluconeogénesis para formar otra vez G6P.

Por lo tanto, el G6P se puede utilizar como sustrato tanto en la glicolisis como en la ruta de las pentosas fosfato. La célula realzia la elección de acuerdo a sus necesidades biosintéticas y energéticas. Si la G6P se transfiere hacia la glicolisis se forma gran cantidad de ATP. Si lo que se necesita es NADPH y R5P, entonces se transfiere hacia la ruta de las pentosas fosfato. Esta decisión depende básicamente de la fosfoglucoisomerasa que transforma la G6P en F6P, que a su vez la fosfofructoquinasa, fuertemente regulada, la convierte en F1,6BP, o bien de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, también fuertemente regulada, que convierte el G6P en gluconolactona. Por lo tanto, la G6P dependerá de las actividades relativas de estas dos enzimas. Dependiendo de las necesidades relativas de la célula, la glicolisis y la ruta de las pentosas fosfato s epueden combinar de varias maneras diferentes:

1. Tanto NADPH como R5P se necesitan en la célula. En este caso predominan las cuatro reacciones primeras de la ruta de las pentosas fosfato.

G6P + 2 NADP+ + H2O ® R5P + CO2 + 2 NADPH + 2 H+

2. Se necesita más R5P que NADPH. Se puede sintetizar R5P sin producir NADPH si las reacciones primeras de la ruta de las pentosas fosfato no se producen. En este caso, es el F6P y la G3P, pero no el G6P, los que se utilizan (provenientes de la glicolisis), y mediante las enzimas transquetolasa y transaldolasa convertidos en R5P.

5 G6P + ATP ® 6 R5P + ADP + H+

3. Se necesita más NADPH que R5P. Esto se puede realizar si la G6P entra en la ruta de las pentosas fosfato para producir NADPH y el R5P producido se recicla a F6P y G3P que puede formar G6P mediante la gluconeogénesis.

6 G6P + 12 NADP+ + 6 H2O ® 5 G6P + 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + Pi

(Notar que se han formado 6 de CO2 a partir de un G6P neto)

4. Se necesita ATP y NADPH pero no R5P. Esto se puede realizar si la G6P entra en la ruta de las pentosas fosfato para producir NADPH y el R5P producido se recicla a F6P y G3P que van a la glicolisis para generar ATP formando Pyr, que a su vez podría generar más ATP posteriormente mediante el TCA.

3 G6P + 5 NAD+ + 6 NADP+ + 8 ADP + 5 Pi ®5 Pyr + 3 CO2 + 5 NADH + 6 NADPH + 8ATP + 2 H2O + 8 H+

La ruta de la pentosa fosfato es una ruta metabólica, en la cual se sintetizan pentosas (monosacáridos de 5 carbonos) y se genera poder reductor en forma de NADPH. La ruta puede dividirse en dos fases, la fase oxidativa, en que se genera NADPH, y la fase no oxidativa en que se sintetizan pentosas-fosfato (y otros monosacáridos-fosfato). Esta ruta es una de las tres principales vías en que se crea poder reductor (aproximadamente un 10% en humanos).

Fase oxidativa

En esta fase, dos moléculas de NADP+ son reducidas a NADPH utilizando la energía de la conversión de glucosa-6-fosfato en ribulosa-5-fosfato, según la reacción:

El NADPH que es usado en la síntesis de ácidos grasos y colesterol, reacciones de hidroxilación de neurotransmisores, detoxificación de peróxidos de hidrógeno, así como en el mantenimiento del glutation en su forma reducida.

Fase no oxidativa

A partir de la ribulosa-5-fosfato se sintetiza xilulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato monosacárido imprescindible para la síntesis de nucleósidos, nucleótidos y por ende de ácidos nucléicos. El resto de monosacáridos pueden tener diferentes usos, tanto biosintéticos como energéticos (glucólisis).

Fase no oxidativa de la ruta de la pentosa fosfato