Bioprospección de Microorganismos Nativos Amilolíticos

RESUMEN

En Colombia se han realizado pocos estudios de prospección, a pesar deposeer una elevada diversidad biológica. En el presente trabajo se realizó elestudio de cepas microbianas aisladas de diferentes nichos ecológicos,productoras de las enzimas amilolíticas, así: procesado de maíz, de papa yde yuca. Los criterios utilizados para el aislamiento de las cepas amilolíticas,fueron los inherentes al crecimiento sobre los medios modificados conalmidón y la positividad frente al Test de Lugol. Los medios empleadosfueron CZAPEK, PCA y MRS modificados. Las cepas obtenidas fueron debi-damente purificadas, crío conservadas e identificadas bioquímicamente,obteniendo un total de 103 cepas nativas. De éste total de cepas, seseleccionaron debido a la similitud entre microorganismos aislados, 13cepas. Estas últimas fueron identificadas bioquímicamente. Los géneroshallados fueron Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp. Las enzimasamilolíticas obtenidas a partir de las cepas nativas presentaron pesosmoleculares que oscilan entre 30 y 150 kDa aproximadamente.

ABSTRACT

In Colombia few studies of prospection have been made, in spite ofhaving a high biological diversity. In the present work the study of isolated

BIOPROSPECCIÓN DEMICROORGANISMOS NATIVOS AMILOLÍTICOS

ORGANISMS WILDS AMILOLITICS BIOPROSPECTING

CLAUDIA P. SÁNCHEZ1, CARLOS E. MEJÍA2, CARLOS FIGUEROA M.3,MABEL ESQUIVIA4, LINA MARIA AGUDELO5, NORELA ZAPATAQ.6

____________

Recibido para evaluación: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicación: 27 de febrero de 2004.

1 Todos los autores son miembros del Grupo de Biotecnología, Universidad de Antioquia.M. Sc. Ingeniera Química.

2 M.Sc. Biotecnología. Ingeniero Químico, Microbiologo.3 Ph.D. Microbiologo.4 Microbiologa.5 Ingeniera Química.6 Química, Politécnico Colombiano Jaime Isaza Cadavid (PCJIC).

Correspondencia: Claudia P. Sánchez, e_mail: [email protected]

PALABRAS CLAVE:

Amiloglucosidasa, α−amilasa, almi-dón de yuca, enzimas amilolíticas,bacillus sp.

KEYWORDS:

Amiloglucosidase, α−amilase,cassava starch, enzymes amylo-litics, bacillus sp.

9Facultad de Ciencias AgropecuariasVol 2 No.1 Marzo 2004

microbial stocks of different ecological niches, producing of amilolíticas enzymes were made, thus: cassava,potatoes and corn starch processing. The criteria used for the isolation of the amylolitics stocks, wereinherent to the growth on means modified with starch and the true of the Test of Lugol. The culture employeeswere modified CZAPEK, PCA and MRS. The obtained stocks properly were purified, child conserved and identifiedbiochemically, obtaining a total of 103 native stocks. Of this one total of stocks, they were selected due to thesimilarity between isolated microorganisms, 13 stocks. These last ones were identified biochemically. Thefound sorts were Bacillus sp, Clostridium sp and Kurthia sp. The obtained amylolitics enzymes from the nativestocks displayed molecular weights that oscillate approximately between 30 and 150 KDa.

Las perspectivas futuras con respecto a la hidrólisisdel almidón es acor tar las etapas del proceso, a unasola etapa ya sea con dos cepas microbianas juntascon sus respectivas enzimas, con una sola cepa conlas dos enzimas amilolíticas, o con una enzima quetenga capacidad de romper todo tipo de enlace delas moléculas de a lmidón como lo hace laGlucoamilasa.

La amiloglucosidasa (Glucoamilasa o alfa-1,4 gluco-hidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima "GRAS", extra-celular producida por los hongos de los génerosAspergillus, Rhizopus, principalmente, y de Mucor,Candida, Saccharomyces, Schwanniomyces, y de losgéneros bacterianos Clostridium, Arthrobacter y unaenzima tipo "Glucoamilasa" de Flavobacterium (4). Enotro trabajo se presenta un alineamiento de 14amiloglucosidasas por anál is is de clustershidrofóbicos (5).

La enzima es una glucoproteína que contiene manosa,glucosa, galactosa y ácido urónico, con un pesomolecular de 60-100.000 Da., con un pH óptimo de4.3-4.5, e hidroliza fácilmente enlaces glicosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6 con menor afinidad (5). La rata dehidrólisis enzimática es afectada por el tamaño delsubstrato, por la estructura y los enlaces en la secuen-cia de la cadena. Algunos investigadores usando unapreparación altamente purificada de A. niger, demostra-ron que la amiloglucosidasa es capaz de hidrolizarmaltosa 100 veces más rápido que isomaltosa, mien-tras que la panosa se hidroliza en un 45 % de la rata demaltosa, entonces, esto indica que los enlaces alfa-1,6cerca a los enlaces alfa-1,4 fueron atacados más rápi-damente que los mismos enlaces solos. Con enlacesalfa-1,6, un incremento en la longitud de la cadena cau-sa un incremento en la rata de hidrólisis. La glucoamilasatiene gran afinidad por cadenas largas, así la rata máxi-ma incrementa con la longitud mientras que la constan-te de Michaelis disminuye (4).

INTRODUCCIÓN

La producción de jarabes se basa en la degradación delalmidón, y ha sido empleada industrialmente desde ladécada del 70. Desde entonces, se han venido desa-rrollando procesos enzimáticos que permiten transfor-mar el almidón en los llamados jarabes con alto conte-nido de fructosa, dando origen a nuevos productos conmayor poder edulcorante y menor costo en relación conel azúcar de caña. La producción de jarabes se da endos etapas, en la primera se utiliza una enzima -amilasay en la segunda una amiloglucosidasa. En el mundoactualmente se buscan enzimas amilasas y amilo-glucosidasas con características diferentes a las ya co-mercializadas.

Los jarabes glucosados son soluciones de glucosa enalta concentración que se utilizan en diversas aplicacio-nes de la industria alimenticia y biotecnológica (1). Losjarabes de glucosa se obtienen por hidrólisis enzimáticadel almidón (2). Este proceso requiere dos etapas, laprimera etapa, denominada de licuefacción, es unahidrólisis de las largas cadenas de almidón para obte-ner maltodextrinas (cadenas mas cortas de almidón),esta es llevada a cabo por la enzima -amilasa que cortalos enlaces glicosídicos -1,4 internos en forma aleatoriadel almidón. En la segunda etapa, denominadasacarificación se hidrolizan los enlaces -1,4 y/o -1-6del terminal no reductor de la cadena de dextrina, por laenzima amiloglucosidasa, liberando glucosa (3).

Hasta el momento el proceso de hidrólisis enzimática delalmidón hasta glucosa, se ha llevado a cabo en dos eta-pas, licuefacción y sacarificación, por lo que ha sido ne-cesario cultivar y manipular dos microorganismos pro-ductores de enzimas amilolíticas separadamente, conlle-vando a un alto consumo de energía y de equipos para elproceso además de las diferencias existentes entre el pHy la temperatura que necesitan las dos enzimas, es difícilque ambos actúen simultáneamente con el almidón.

Facultad de Ciencias AgropecuariasVol 2 No.1 Marzo 200410

La amiloglucosidasa se utiliza a gran escala en la indus-tria del procesado del almidón en tanques discontinuosa 55-60ºC y pH de 4.5 y con períodos de incubación de48-92 h. para transformar las dextrinas formadas por lahidrólisis de alfa-amilasa en glucosa. El calcio laestabiliza frente a la desnaturalización por el calor o elálcalis (6).

En las industrias de alimentos y bebidas, las enzimas hansido aplicadas satisfactoriamente desde hace muchosaños y la necesidad de controlar los costos es dominan-te. Por ejemplo, en la producción de edul-corantes sehan venido reemplazando la sacarosa de caña por otrosprovenientes de una materia prima más barata y accesi-ble; como es el almidón de maíz que se puede transfor-mar en glucosa y de ella producir jarabes ricos en fructosacon mayor poder endulzante y a menor costo, además,de las ventajas que tiene por ser producidos por víaenzimática y no por vía química. (6).

En el mundo actualmente se buscan enzimas amilasasy amiloglucosidasas con características diferentes a lasya comercializadas. Esto se hace mediante estudios debioprospección microbiana, que tratan de identificar laspotencialidades de la flora microbiana presente en losdiversos nichos ecológicos del mundo, que posibilitenla formación de industrias productoras de enzimas y lasindustrias derivadas de su aplicación (4). En Colombiase han realizado pocos estudios de este tipo, pese a queposee una elevada diversidad biológica (7).

Por tal razón, el objetivo del presente trabajo fue realizarel estudio de cepas microbianas aisladas de diferentesnichos ecológicos, productoras de enzimas amilolíticas.Los resultados obtenidos incluyen el aislamiento de 103cepas amilolíticas. De estas, debido a la similitud entremicroorganismos aislados, se seleccionaron 13 ce-pas, las cuales fueron identificadas bioquímicamente.

De las 13 cepas estudiadas se seleccionó una de lasque resultó positiva en la prueba de lugol y que presen-tó mayor halo, al igual que su expresión en la proteínafue siempre mejor, para establecer si presentaba activi-dad amilolítica; se estudió cualittivamente el efecto quepresentan diferentes fuentes de carbono en la expre-sión de la proteína. La cepa utilizada en la fermentacióncorrespondió a un Bacillus sp, para el cual no se obtu-vieron resultados satisfactorios de actividad amilolíticatanto para alfa amilasa como para amiloglucosidasa,bajo las condiciones de fermentación establecida.

MATERIALES Y METODOS

MICROORGANISMOS:

Se aislaron cepas microbianas de las fuentes de almi-dón (maíz, papa y yuca) procedentes de sus respecti-vas procesadoras. Se identificaron por medio decoloraciones y crecimiento en cultivos selectivos (MRS,CZAPEK y PCA), para que crecieran, según sean mo-hos, levaduras o bacterias.

RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS DEALMIDÓN

Recolección de las muestras de almidón de maíz.

Las muestras fueron colectadas de los tanques de pro-cesamiento final y de lavado, de la empresa "Industriasdel Maíz "en 2 frascos estériles de 1L, los cuales sellenaron completamente con la muestra liquida prove-niente de los compartimientos descritos, obteniéndose1L de muestra por cada tanque mencionado; luego de 2h de ser recolectadas las muestras se prosiguió a proce-sarlas.

Recolección de las muestras de almidón de papa.

La muestra fue colectada del tanque de agua de lavadode la empresa Mekato, cuya materia prima es la papa, enun frasco estéril de 1L., el cual se llenó completamente,obteniéndose 1L de muestra; luego de 2 h de ser colec-tada, la muestra fue procesada.

Recolección de la muestra de almidón de yuca.

La muestra fue colectada de la empresa "Almidones LaMaría", en tres frascos estériles de 1L, los cuales fueronllenados completamente con almidón sólido pertene-ciente a tres puntos diferentes del tanque de fermenta-ción, esta muestra fue enviada por la empresa a la uni-versidad y procesada de inmediato.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS.

Procesamiento de las muestras de almidón de maíz

Por cada muestra de almidón de maíz (una pertenecien-te al tanque de procesado final y otra proveniente deltanque del agua de lavado), se tomaron 50 de los 1000


mL recogidos inicialmente, luego se resuspendieron en450 mL de agua peptonada estéril y se homogenizarondurante 10 min.; seguidamente se realizaron dilucionesseriadas hasta 10-9 en tubos que contenían 9mL deagua peptonada.

Se continuó con la siembra, por triplicado, de 100 L decada dilución en cajas de petri con los medios: MRS,CZAPECK y PCA, modificados con almidón. Posterior-mente se dejaron incubando a 30 C durante 72horas,tiempo al que se hizo el conteo de colonias, se descar-taron las cajas de petri que presentaban un contenidomucho mayor de 300 colonias.

Procesamiento de la muestra de almidón de papa

La muestra obtenida, fue procesada siguiendo los mis-mos parámetros utilizados para la muestra de almidónde maíz.

Procesamiento de la muestra de almidón de yuca

Se tomaron 100 g. de almidón de yuca, a partir de lamezcla de las tres muestras colectadas y seresuspendieron en 900 mL de solución salina, luego sehomogenizaron durante 20 min.; seguidamente se rea-lizaron diluciones seriadas hasta 10-9 en tubos quecontenían 9 mL de agua peptonada.

Se continuó con la siembra por triplicado; de 100 L decada dilución en cajas de petri con los medios: MRS,CZAPECK y PCA, modificados. Posteriormente se deja-ron Encubando a 30 C durante 72horas, tiempo al quese hizo el conteo de colonias, se descartaron las cajasde petri que presentaron un contenido mucho mayor de300 colonias.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE CEPASMICROBIANAS CON ACTIVIDAD AMILOLÍTICA

AISLAMIENTO DE LAS CEPAS AMILOLÍTICAS.

Con base en el crecimiento sobre los medios mo-dificados con almidón, la positividad frente al Testde Lugol, y los aspectos mor fológicos de losmicroorganismos, se hizo el aislamiento de las ce-pas amilolíticas.

Estas cepas se sembraron por agotamiento en el

medio sólido en el que anteriormente habían creci-do y se dejaron incubando a 30 C por 24 h.

Luego se describió su mor fología gruesa, tenien-do en cuenta tamaño, tipo de borde, coloración ytextura; seguidamente se les practicó la prueba delugol, notificando como positivas aquellas quepresentaron la formación de un halo transparentealrededor de la colonia luego de añadirle lugol enla superficie del agar. Las cepas positivas fueronsembradas en 5ml de respectivo medio líquido eincubadas a 30 C por 24 horas. Finalmente estasúltimas cepas se crioconservaron en glicerol al 30%a -20 C.

PURIFICACIÓN DE LAS CEPASAMILOLÍTICAS AISLADAS.

Las cepas aisladas fueron purificadas, sembrándolasen 5mL del respectivo medio de cultivo e incubándolasa 30 C durante 72 h.; seguidamente se les aplicó colo-ración de Gram, notificándose los resultados obteni-dos. Luego se sembraron en medio sólido por agota-miento y se incubaron a 30 C durante 48 h., después seles aplicó la prueba de filancia (KOH), agregándolesdirectamente a las colonias este reactivo; se notificaroncomo positivas aquellas que formaban un filamento,luego de agitarlas con un asa de ojo.

Posteriormente se sembraron estas cepas, (tomándoseuna sola colonia con asa de ojo) en 5mL del medio en elque habían reportado crecimiento y se incubaron a 30C durante 48 h. Por último, se crioconservaron en gli-cerol al 30% y se dejaron en nevera a -20ºC.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE LASCEPAS AMILOLÍTICAS AISLADAS

Para la identificación de las cepas obtenidas, setuvieron en cuenta los aspectos mor fológicosmacro y microscópicos y se realizaron las prue-bas bioquímicas de oxidasa, catalasa, citrato, SIM(sulfuro- indol - movilidad) y TSI (triple- azúcar -hierro). Los parámetros utilizados para el análisisde resultados y la clasificación de los microor-ganismos manejados son los descritos por el Ma-nual de Bergey (10).


CONDICIONES DE CULTIVO

Se utilizaron frascos tapa rosca de 500 mL conteniendomedio de cultivo PCA en volumen de 150 mL por dupli-cado, incluyendo el almidón como substrato de degra-dación para las enzimas amilolíticas y como fuente decarbono para los microorganismos. Estos cultivos secolocaron en agitadores orbitales (BOEKEL cerant ORS200) a una agitación de 130rpm, T de 30ºC, durante72h.

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DELAS ENZIMAS PRODUCIDAS POR LASCEPAS AMILOLÍTICAS AISLADAS.

Las cepas positivas al lugol, fueron crecidas en mediolíquido, PCA modificado con almidón, se centrifugarona 8000g y 4ºC. El sobrenadante se recupera y sometea electroforesis de proteínas en SDS-PAGE, según elmétodo descrito por Sambrook et al (8), en geles al 8%de poliacrylamida usando un marcador de pesomolecular conocido (Sigma B2787), para determinarasí la presencia de enzimas extracelulares y sus respec-tivos pesos moleculares.

NOTA:

Se estimaron como cepas amilolíticas aquellas que pre-sentaron la prueba de lugol positiva. El principio de estaprueba se basa en la incapacidad que presenta el lugolpara pigmentar las zonas en las que el almidón ha sidohidrolizado por acción enzimática. Por esta razón seutilizó la prueba de lugol para la determinación demicroorganismos que producen enzimas amilolíticasexocelulares, ya que este test permite el reconocimientode las mismas por la formación de un halo no pigmen-tado y de diámetro variable alrededor de aquellas colo-nias que sintetizan este tipo de enzimas.

Este fenómeno se observa cuando se expone el cultivoa la acción del lugol durante un periodo aproximado de1 a 3 min.

DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEDIFERENTES FUENTES DE CARBONO PARALA CEPA 24.

La fermentación se realizó en erlenmeyers de 250 mL,

se sometió a un baño agitado (BOEKEL cerant ORS200) a 130 rpm y a 30º C. 50 mL del medio PCA modi-ficado con 5g/L de cada una de las tres diferentes fuen-tes de carbono utilizadas (Almidón, Dextrinas y Gluco-sa) fueron inoculados con la cepa seleccionada (Bacillussp). Se realizaron toma de muestras en cámara de flujolaminar para evitar la contaminación del cultivo. Poste-riormente se realizó electroforesis a las muestras (6).

FERMENTACIÓN

El inóculo para la fermentación, se preparó con la cepaincubada en cajas petri. Tomando la muestra con asade ojo y adicionándola a 20 mL de medio líquido PCA,hasta obtener una concentración adecuada, verificadacon la lectura de la densidad óptica de la muestra en unespectrofotómetro, a una longitud de onda de 600 nm.Posteriormente fue adicionada al medio líquido para serfermentada en un baño agitado a 130 rpm y 30º C du-rante un período de 24 a 96 horas.

Determinación de la Actividad enzimática

Se tomaron 10 mL de muestra de la fermentación a las24, 48, 72 y 96 horas, en cámara de flujo laminar paraevitar contaminación. Posteriormente la muestra fuecentrifugada a 4000 rpm durante cinco minutos a tem-peratura ambiente. Se tomó el líquido decantado y sepracticó la determinación de actividad enzimática de laAMG, utilizando la técnica desarrollada por IndustriasNOVO, en la que 1 AGU es la cantidad de enzima que acondiciones estándar hidroliza una micromol de maltosapor minuto a 25º C y pH 4.3 (Método analítico Referen-cia: AF 22/ 4-GR. 1976, http:// www. Enzymes. Novo.dk,2003)(9).

Se realizó también la determinación de la actividadenzimática de la Alfa Amilasa siguiendo el protocolo des-crito en el método analítico Novozyme. EB-SM- 0009 02/01. Método basado en la degradación de almidón por laenzima alfa amilasa, en el que 1 KNU (kilo Novo Unit) esla cantidad de enzima la cual degrada 5 mg de almidónsoluble por hora bajo condiciones estándar (9).

Adicionalmente, se realizó la concentración de las mues-tras y se les practicó las pruebas de medición de laactividad tanto amiloglucosidasa como alfa amilasa, si-guiendo los protocolos establecidos. Para la concen-tración se tomaron 5 mL de muestra se le adicionaron


15 mL de sulfato de amonio concentrado (solución sa-turada), se guardó en nevera a 4º C por 60 min., luegose centrifugó a 10000 rpm por 10 min. a 4º C, se elimi-nó el decantado y se resuspendió el precipitado en 200?L de solución buffer fosfato (6).

RESULTADOS Y DISCUSION

Proceso de aislamiento y selección

Se aislaron 103 cepas, teniendo en cuenta losparámetros morfológicos, el crecimiento en los mediosmodificados con almidón y la positividad frente al Testde Lugol. Dentro de las cepas obtenidas figuranmicroorganismos de tipo bacilos y cocos Gram Positi-vos y Gram. negativos. Debido a la marcada similitudexistente entre algunos de las cepas aisladas y con baseen las diferencias de tipo morfológico, se selecciona-ron 13 de ellas para su respectiva identificación las cua-les se presentan en la Tabla 1.

Identificación bioquímica

Las cepas amilolíticas seleccionadas fueron identi-ficadas bioquímicamente, mostraron per tenecer alos géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurtia sp.,siendo el primero el más predominante dentro delas cepas seleccionadas. En la Tabla 2. aparecenconsignados los resultados obtenidos a par tir delanálisis bioquímico de las cepas seleccionadas y laclasificación según género de las mismas. Losparámetros utilizados para la clasificación y análisisde resultados de los microorganismos manejadosson los descritos por Bergeys. (10).

DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR DELAS DE ENZIMAS PRODUCIDAS POR LASCEPAS AMILOLÍTICAS AISLADAS.

A las cepas seleccionadas se les realizó la prueba de

TABLA 1. Selección de algunas cepas amilolíticas aisladas de diferentes fuentes de almidón.

* M.O: microorganismo, las muestras seleccionadas fueron del muestreo de almidón de maíz, estas presentaron unamayor formación de halo.

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*


electroforesis para determinar el peso molecular pro-medio de las proteínas presentes en las fermentacio-nes. Los resultados se presentan en la Tabla 3, dondese observa como varía el peso molecular de las proteí-nas de acuerdo con la especie; el peso molecularoscila entre 38-175 KDa (11), 1997; (3), 1998). Comose puede observar de los resultados, es posible quelas cepas estén expresando proteínas de AMG, ya queestán en rango de pesos moleculares esperados, se-guiría la prueba de actividad enzimática para corrobo-rar si son AMG (amilogucosidasas) o alfa amilasas.

Las enzimas amilolíticas varían su peso molecular de-pendiendo del microorganismo que las produce pre-sentando pesos entre 38 y 175 KDa. Cabe anotar que,las -amilasas microbianas oscilan entre 23-96KDa,mientras que las amiloglucosidasas están entre 82-114KDa En nuestro caso, las enzimas amilolíticas pro-ducidas por los microorganismos nativos selecciona-dos, presentaron pesos moleculares que oscilaron en-tre 30 y 150 KDa aproximadamente. Por esta razón, noes clara la determinación si las enzimas producidas son-amilasas o amiloglucosidasas, dada la diversidad detamaños moleculares presentes en ellas. Se recomien-

da una purificación de las proteínas con membranas dediálisis para medir la actividad específica de cada unade estas enzimas.

DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEDIFERENTES FUENTES DE CARBONO PARALA COLONIA 24

Las modificaciones de la fuente de Carbono del medioestándar seleccionado utilizando Almidón, Glucosa yDextrina en una cantidad de 1g/L permitieron establecerque el comportamiento de las cepas seleccionadascuando se utiliza un medio de cultivo con almidón odextrina como fuente de carbono es similar; es decir, alrealizar la electroforesis de las respectivas muestras delas fermentaciones realizadas, se observó que las pro-teínas presentes en el medio de cultivo modificado conalmidón son exactamente las mismas expresadas en elmedio de cultivo modificado con dextrina. Las proteí-nas expresadas por la cepa en el medio de cultivo modi-ficado con glucosa, y observadas en la electroforesisno presentaron un comportamiento diferente. Estosresultados se pueden apreciar en las Figuras 1 y 2.

* Las colonias 72 y 89 no pudieron ser identificadas por la ambigüedad que presentan suscomportamientos bioquímicos, razón por la cual su clasificación según género requiere larealización de otras pruebas confirmatorias.

TABLA 2. Clasificación de las cepas amiliolíticas seleccionadas según género.

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N° DECOLONIA

Pruebas bioquímicas Practicadas

Oxidasa catalasa citrato SIM TSI

GENERO

**


En la Figura 1 se pueden apreciar las enzimas patronesutilizadas y el marcador molecular con los diferentespesos moleculares. La primera banda observada co-rresponde a la enzima patrón Termamy 120L (T), lasegunda banda corresponde a la enzima patrónAmiloglucosidasa: AMG 300L (A). El marcador (M) pre-senta 7 bandas que corresponden de manera descen-dente a los siguientes pesos moleculares: 116, 97, 58.1,39.8, 29, 20.1 y 14.3 K Da.

Los perfiles electroforéticos de los diferentes aisladospresentaron bandas claramente definidas a 30 y 58 kDaacordes con los tamaños definidos para -amilasas,como lo muestra la cepa 24 (Figura 2).

A partir de lo observado en la electroforesis realizadaa las muestras tomadas de las fermentaciones, seaprecia que la cepa 24 presenta trazas de diferentesproteínas. Se seleccionó por lo tanto ésta cepa pararealizar la determinación de actividad amilolítica y pararealizar el seguimiento de la cinética de fermentación.Se eligió, además, el almidón como fuente de carbo-no, ya que como se observa éste no inhibe la expre-sión de diferentes proteínas del microorganismo, yel interés es obtener una enzima que degrade estesustrato.

Existen muchos factores como la temperatura, la des-hidratación, la purificación, la congelación etc., quepueden desnaturalizar las proteínas y enzimas. La acti-vidad de las enzimas depende de la concentración deéstas en el medio fermentado. La electroforesis es unmedio bastante sensible, que no requiere de grandescantidades de proteína para arrojar resultados positi-

vos. Sin embargo, los protocolos utilizados para ladeterminación de las actividades, tanto, deamiloglucosidasa como alfa-amilasa requieren de unaconcentración mínima de enzimas para llevar a cabocon éxito la cuantificación. Las fermentaciones realiza-das con el medio, y el volumen establecidos en la me-todología, no presentaron una concentración de enzi-ma que fuera detectable por los métodos establecidos.Se plantea la necesidad de desarrollar un nuevo diseñoexperimental que permita trabajar con un volumen ma-yor de muestra que garantice la concentración mínimade enzima requerida para la determinación de la activi-dad enzimática.

CONCLUSIONES

Bajo las condiciones de referencia se logró obtener uncepario de 103 cepas amilolíticas, de las cuales 13presentaron cualitativamente mayor actividad amilolíticae identificadas bioquímicamente pertenecen a los gé-neros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp,estas fue-ron presentadas en el Almidón de maíz.

Se plantea la necesidad de realizar futuras investigacio-nes, orientadas a la experimentación con otros mediosde cultivo diferentes al PCA, que proporcionen losnutrientes necesarios para el mantenimiento del micro-organismo, y que estimulen la expresión de la enzimaamilolítica AMG. A su vez, se puede recomendar unametodología diferente, donde se realice un seguimientodurante un mayor tiempo, con el objetivo de verificar elcomportamiento del microorganismo y la producciónde proteínas a períodos más largos de fermentación.

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TABLA 3. Peso molecular de las proteínas obtenidas a partir de las cepas amilolíticas nativas seleccionadas.

Tiempo de fermentación 48h


REFERENCIAS

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39.8 KD

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Figura 1. Perfiles electroforéticos (SDS-PAGE) obtenidos usando el marcador de peso molecular de Sigma B2787,y las enzimas comerciales, a-amilasa bacteriana (Tarmamylâ 120L) y la amiloglucosidasa fúngica (AMGâ 300L).

Figura 2. Influencia de la fuente de carbono en la expresión de enzimas amilolíticas en la cepa 24 a las 72h defermentación. T: enzima Tarmamylâ 120L, A: AMG 300L, 24-A: medio con almidón, 24-D: medio con dextrina, 24-G: medio con glucosa, M: marcador de peso molecular (Sigma B2787).


grado para optar al título de Ingeniera Química,Universidad de Antioquia, Colombia, Medellín.

(7) Madigan M. T., Martinko J. M., and Parker J.,Brock. 2000. Biología de los Microorganismos,pp 535-537. Prentice Hall, España.

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(10) Bergeys Manual of Systematic Bacteriology - J.Holt, Ed. 1994. Novena edición. William andWilkins, Co. Baltimore, USA

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Bioprospección de Microorganismos Nativos Amilolíticos

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