Biologia Nro 08

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR 2010

I. INTRODUCCION:

La vida celular depende del continuo intercambio con el medio externo, ya que la Célula

debe tomar de este, los nutrientes y expulsar hacia él, los productos de su metabolismo.

El intercambio se establece a través de la Membrana celular, la cual se comporta como

una estructura semipermeable que permite el paso de determinadas sustancias e

impide el de otras.

La membrana está constituida por una bicapa de moléculas lipídicas, orientadas de

forma tal que sus grupos polares quedan expuestos hacia las interfases interna y

externa, mientras que los grupos apolares se disponen hacia el nterior, alejados del

agua. La bicapa lipídica se ve interrumpida en determinados puntos por la presencia de

moléculas proteicas.

De acuerdo con la estructura molecular de las sustancias que atraviesan la membrana,

el paso se efectúa a través de la parte lipídica o de la proteica.

Las sustancias apolares se solubilizan en los lípidos de membrana y la atraviesan

fácilmente; las sustancias polares pequeñas atraviesan los polos proteicos. En ambos

casos la Sustancia se mueve siguiendo su potencial químico y el mecanismo se conoce

como permeabilidad simple. Las sustancias polares cuyo diámetro molecular sobrepasa

el diámetro máximo de los poros, requieren de un mecanismo especial de paso a través

de la membrana, en el cual están involucradas las proteínas de membrana; este

mecanismo se conoce como transporte mediado o facilitado.

El transporte a través de los compartimientos del organismo generalmente va seguido de

transporte de Agua mediante el proceso conocido como Osmosis.

Cuando entre dos compartimientos separados por una membrana semipermeable existe

una diferencia de concentración de solutos, lo cual constituye un desequilibrio, el

sistema restablece el equilibrio moviendo el Soluto y/o el solvente.

II. OBJETIVOS:

Comprobar algunas propiedades de las membranas biológicas como la

permeabilidad selectiva.

PIENSA EN GRANDE Página 1

SOLUCIONES ISOTÓNICAS:

Concentración de solutos: igual dentro y fuera de la Célula.

Concentración de Agua: igual dentro y fuera de la Célula.

Flujo de Agua: de afuera hacia adentro y viceversa.

Fenómenos: ninguno

SOLUCIONES HIPERTÓNICAS:

Concentración de Solutos: mayor concentración fuera de la Célula.

Concentración de Agua: menor concentración fuera de la Célula.

Flujo de Agua: de adentro hacia fuera

Fenómenos: las células se encogen (deshidratación). En los glóbulos

rojos toma el nombre de Crenación. En células vegetales se denomina

Plasmólisis.


Comprobar el efecto que tienen algunos agentes químicos sobre las membranas

biológicas.

La importancia del entorno para mantener la integridad de la Membrana celular.

III. MARCO TEORICO:

MOVIMIENTOS MOLECULARES

1. Difusión: Paso de solutos de una zona de mayor concentración a otra de menor

concentración.

2. Ósmosis: Paso de solvente a través de una membrana semipermeable. También

se llama difusión de agua

En base a la variación de la concentración de las soluciones tanto en el interior

como en el exterior de la Célula, son tres tipos diferentes de soluciones biológicas:

PIENSA EN GRANDE Página 2SOLUCIONES HIPOTÓNICAS

Concentración de Solutos: menor fuera de la célula.

Concentración de agua: mayor concentración fuera de la Célula

Flujo de agua: de afuera hacia adentro


MECANISMOS DE TRANSPORTE DE SUSTANCIAS


SOLUCIONES HIPOTÓNICAS

Concentración de Solutos: menor fuera de la célula.

Concentración de agua: mayor concentración fuera de la Célula

Flujo de agua: de afuera hacia adentro


1. TRANSPORTE PASIVO.

El movimiento de sustancias por una membrana, que va hacia un gradiente de

concentración, presión o carga eléctrica.

No requiere de gasto de energía por la célula.

Los gradientes ofrecen la energía potencial para efectuar el movimiento y controlan la

dirección del mismo hacia adentro y fuera de la célula.

a) Difusión simple: difusión de agua, gases disueltos, o moléculas liposolubles o

través de una bicapa fosfolipídica de una membrana.

b) Difusión facilitada: Difusión de moléculas (generalmente solubles en agua) a

través de una membrana, con participación de la proteína de membrana. La mayor

parte de las moléculas solubles en agua, como los iones (K, Na, Ca), los aminoácidos

y los monosacáridos no pueden moverse por la bi capa de lípidos sino a través de las

proteínas

2. TRANSPORTE ACTIVO.

Movimiento de sustancias a través de una membrana, generalmente en contra de una

gradiente de concentración, utilizando la energía celular.

IV. MATERIALES:



Pipeta de 5ml

Soluciones 0.3M de Urea, tiourea, glicerol, Glucosa y Sacarosa

Sangre humana

Cronometro



V. MÉTODOS DE EXPERIMENTACION:


EXPERIMENTO 1: Hemólisis producida por interacción de agentes químicos con la membrana celular.

MATERIALES:

Solución saturada de jabón

Solución de Cloruro de Sodio

Cloroformo

Etanol

Sangre humana fresca

Pipeta de 10 ml

1 gotero

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 10 ml de cloruro de Sodio al 0.9% en 3 tubos de ensayo

2. Añadir 2 gotas de Sangre humana a cada tubo

3. Conserve uno de los tubos como control y a los otros tres añadir

respectivamente 2 gotas de solución saturada de jabón, cloroformo

(manipular con cuidado, agente irritante), y alcohol etílico.

4. Agite rápidamente y deje la solución en reposo durante 15 minutos

5. Observe los tubos y compárelos con el control.

EXPERIMENTO 2: Hemolisis producida por efecto de Permeabilidad


SUSTANCIA TIEMPO DE HEMOLISIS(MINUTOS)

UREA (TUBO1) 0.93 SEGUNDOS

GLUCOSA (TUBO 2) 0.02MINUTOS

GLICEROL (TUBO 3) 4 MINUTOS

ETER DIETILICO (TUBO 4) -------------------------------------------------------

SACAROSA (TUBO 5) 5 MINUTOS

VI. RESULTADOS


MATERIALES:

Pipeta de 5ml

1 gotero

Soluciones de 0.3M de Urea, tiourea,

glicerol, glucosa y Sacarosa

Sangre humana.

Cronometro.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 2 ml de solución 0.3 M a probar (úrea, glucosa, etc) en un tubo

de ensayo rotulado y adicione una gota de Sangre mezclando

inmediatamente.

2. Mida el tiempo de Hemolisis.

EXPERIMENTO 1: Hemólisis producida por interacción de agentes químicos con la membrana celular.


1. Colocar 10 ml de cloruro de Sodio al 0.9% en 3 tubos de ensayo

Debemos seleccionar 3 tubos de ensayo

que se encuentren completamente limpios,

posteriormente los marcamos con los

números romanos I, II y III. Después de la

marcación de los tubos procedemos a

colocar la muestra de Cloruro de Sodio en

cada tubo. El Cloruro de Sodio actúa como

un estabilizador del sistema, evitando que

se produzca la Hemólisis de los Glóbulos

rojos. En otras palabras esta solución equilibra la cantidad de Sodio y Agua, convirtiendo

a todo el sistema en una solución isotónica.

2. Añadir dos gotas de sangre humana a cada tubo

Tomamos la sangre que ha sido

proporcionada por el profesor, la

destapamos cuidadosamente y con la ayuda

de un gotero extraemos 2 gotas de sangre

para cada tubo de ensayo. Debemos tener

mucho cuidado para introducir la sangre

(evitar que choque con las paredes del

tubo). Para esto debemos actuar con

firmeza, sin hacer temblar la mano.



3. Conserve uno de los tubos como control y a los otros tres añadir

respectivamente 2 gotas de solución saturada de jabón, cloroformo (manipular

con cuidado, agente irritante), y alcohol etílico.

En una mesa adyacente preparamos una

solución saturada de jabón (jabón de

baño), después la introducimos 2 gotas de

esta solución a los tubos I y II. No se

introduce la solución al tubo III, ya que

este ha sido elegido como “tubo de

control”. Esto nos permitirá observar las

diferencias entre las muestras que

presentan y no presentan esta solución.

Posteriormente agregamos 2 gotas de alcohol etílico a los dos primeros tubos.

4. Agite repetidamente y deje la solución en reposo durante 15 minutos.

Después de haber adicionado las soluciones

ya anteriormente mencionadas, ahora

tenemos que agitar los tres tubos y esperar

un tiempo aproximado de 15 minutos para

que se comiencen a notar las diferencias

entre los tubos de de ensayo de prueba con

el tubo de ensayo de control. Para esto

hemos elegido a dos compañeros, quienes

serán los encargados de analizar y anotar

cuales han sido los principales cambios en las diferentes muestras de sangre.



5. Observe los tubos y compárelos con el control

A los 15 minutos aun no se puede asegurar a

ciencia cierta que se haya producido un

cambio, los tubos I, II y III tienen casi la

misma opalescencia. Es por eso que se ha

dejado que pase un poco más de tiempo

para poder observar los cambios.

Teóricamente el tubo III debería presentar

una mejor transparencia que los demás

tubos, pero raramente el tubo II es el que presenta una mayor transparencia. Esto se

puede deber a muchos factores que pasare a explicar en la discusión de las

experiencias realizadas. El tubo I presenta casi la misma naturaleza que el tubo II.

La deducción exacta sería la siguiente:


+ SOLUCIONES DESESTABILIZADORAS, ENTONCES MAYOR PROBABILIDAD DE HEMOLISIS.

-SOLUCIONES DESESTABILIZADORAS, ENTONCES MENOR PROBABILIDAD DE HEMOLISIS.

EXPERIMENTO 2: Hemolisis producida por efecto de Permeabilidad

SEGÚN LA TEORIA LOS TUBOS QUE HAN DESARROLLADO

HEMOLISIS DEBERIAN PRESENTAR MAS TRANSPARENCIA QUE

LOS DEMAS TUBOS(color rojo brillante translucido)


1. Colocar 2 ml de solución 0.3 M a probar (úrea, glucosa, etc) en un tubo de

ensayo rotulado y adicione una gota de Sangre mezclando inmediatamente.

Tomamos cinco tubos de ensayo y los

codificamos con los números 1, 2, 3, 4, 5;

posteriormente agregamos las sustancias

indicada: tubo1 (úrea), tubo2 (glucosa),

tubo 3(glicerol), tubo 4(éter dietílico) y al

tubo 5(sacarosa). Al finalizar este

procedimiento agregamos una gota de

sangre a casa tubo.

2. Mida el tiempo de hemolisis:

La primera hemolisis ocurrió en el tubo

número 2, que contenía Glucosa,

reaccionó de una manera rápida (0.02

minutos). La muestra del tubo número 1

reacciono a los 0.93 minutos. El tubo

número 4 no reaccionó (no hubo

hemolisis, ni coloración roja),

simplemente sedimento al fondo por ser

de naturaleza inmiscible. En el tubo numero 5 hubo hemolisis más un pequeño

precipitado. El tubo numero 3 también hemolisó y presento un color rojo brillante

translucido.

VII. DISCUSION

EXPERIENCIA NUMERO 1:

La experiencia número 1 no fue tan satisfactoria de acuerdo a lo que dice la teoría.




Según la teoría: El fenómeno de hemólisis. Los tubos 1 y 2 son

soluciones de eritrocitos no hemolisados, el tubo 3 contiene una

solución de eritrocitos hemolisados. Todos los tubos poseen una

coloración roja, característica de la hemoglobina. Sin embargo,

en el tubo 3 se observa que la solución es más brillante. El

experimento debería notarse así al final:

Los factores negativos en la experiencia fueron:

Ausencia de soluciones Las soluciones no tenían una concentración exacta La falta de instrumentos de Laboratorio Dilación del alumnado Otras causas

El experimento no salió como esperábamos, obteniendo el sgte resultado:


EXPERIENCIA NÚMERO 2:

VIII. CUESTIONARIO

1. Investigue en base a qué mecanismos cada una de las soluciones saturadas de jabón,

cloroformo y alcohol etílico causan lisis celular de los eritrocitos.

Jabón: Los jabones rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e

interrumpiendo la interacción lípido-lípido, lípido-proteína y proteína-proteína. Los

jabones, al igual que los lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies

hidrofóbicas. Se componen de una cabeza polar hidrofílica y una cola no polar

hidrofóbica.


No todas las muestras sufrieron Hemólisis, el que solo sedimento

pero no hemolizó fue la muestra de tubo2. Con esto podemos

concluir que la miscibilidad de los compuestos es muy importante

para determinar si se producirá o no la lisis celular.

La experiencia numero 2 se realizo sin ningún problema; el único

inconveniente fue al momento de introducir la Sangre al tubo de

Ensayo (chocaba con las paredes del tubo).


No hay un protocolo estándar disponible. El detergente dependerá de la aplicación que

se le quiera dar. Muchos estudios en los que se usa electroforesis usan típicamente

SDS para desnaturalizar las proteínas por completo. La elección del detergente para la

lisis celular dependerá también del tipo de célula. Es importante tomar en cuenta

además los buffer usados, el pH, la concentración de sal y la temperatura para la

elección del detergente correcto.

Cloroformo: el cloroformo es usualmente estable y miscible con la mayoría de los

compuestos orgánicos lipídicos y saponificables, es comúnmente utilizado como

solvente. El cloroformo al ser un compuesto orgánico produce lisis celular enj un tiempo

muy pequeño.

Alcohol: el alcohol tiene una naturaleza polar, es por eso que causa la deformación de

la membrana y la posterior muerte celular. También puede causar Crenación

dependiendo del medio extra e intracelular.

2. En el experimento numero 2 explique si los datos obtenidos concuerdan o no con los

datos esperados teóricamente, puede tomar los siguientes datos como referencia.


SUSTANCIA DIÁMETRO PERMEABILIDAD RELATIVA

AGUA 0.300 1

UREA 0.360 6 X 104

ION CLORURO HIDRATADO

0.386 1 X 10-8

ION POTASIO HIDRATADO

0.396 6 X 10-11

SODIO 0.512 2 X 10-11

GLICEROL 0.620 6 X 10-4

GLUCOSA 0.860 9 X 10-6

http://es.wikipedia.org/wiki/Solvente

http://es.wikipedia.org/wiki/Miscible


Debemos conocer una propiedad muy importante al momento de hablar de la

membrana celular de cualquier célula animal.

La Permeabilidad depende de:

la porosidad del material;

la densidad del fluido considerado, afectada por su temperatura;

la presión a que está sometido el fluido

El experimento fue realizado y según la teoría se cumplió correctamente con las

exigencias.

El tiempo de Hemolisis vario en los compuestos.

IX. CONCLUSIONES:

Para obtener resultados óptimos debemos contar con todos los materiales en

buenas condiciones, las soluciones deben presenta la concentración que indica la

práctica, los volúmenes de las soluciones también deben ser exactos para poder

cubrir todos los experimentos a realizar.

Las propiedades de la lisis celular pueden ser explicadas de una manera eficaz en

los Eritrocitos, siempre y cuando se cuente con todo el material de Laboratorio

La solubilización de los lípidos de la membrana celular, o la disminución de la

Tensión superficial, pueden producir hemólisis. Si no hay hemólisis la solución

será de color rosado pero opaco. No será posible por ejemplo, leer un texto a

través del tubo de ensayo. Si hay hemólisis, la solución se irá aclarando

progresivamente hasta hacerse completamente clara y transparente, momento en

que se podrá leer un texto a través del tubo de ensayo.


El tiempo que tarde en producirse la lisis será inversamente proporcional a la permeabilidad de la membrana para el

soluto en cuestión.


Si una membrana es permeable al soluto, provocará la lisis celular. La razón de

ello es que el soluto penetra por difusión al interior de la célula, provocando la

entrada de agua y ruptura final de la membrana. El tiempo que tarde en

producirse la lisis será inversamente proporcional a la permeabilidad de la

membrana para el soluto en cuestión. Para tener un criterio bien definido de lo

que es hemólisis se recomienda esperar hasta que sea posible empezar a leer las

letras de un texto a través del tubo. El llamado tiempo de hemólisis (medido en

min y s) será el que transcurra entre la adición de la gota de sangre y el momento

en que se empieza a leer el texto.

Todas las células de nuestro cuerpo se encuentran en un determinado estado, en

donde también se encuentran otros agentes extracelulares que actúan sobre las

células (iones, sustancias polares, etc.)

El intercambio de sustancias a través de la Membrana se hace de manera

selectiva, para evitar que ingresen macromoléculas que afecten el equilibrio

interno de la Célula, en este caso el Eritrocito.

X. BIBLIOGRAFIA:

Angulo Ugalde, Y. Bioquímica Manual de Laboratorio. Universidad de Costa

Rica. 1999

Nelson D.L y Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry. W. H.

Freeman and Company, NY. Quinta edición, 2008.


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