Universidad Icesi

BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FENILCETONURIA

Lina Merchancano

16 de Mayo del 2011

BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FENILCETONURIA 2

Introducción

La fenilcetonuria es un trastorno caracterizado por la conversión defectuosa de fenilalanina en

tirosina, debido a la carencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa, por lo que la fenilalanina no

puede ser convertida en tirosina, que es un aminoácido fundamental para el metabolismo del

organismo. 1Cuando la hidroxilasa es deficiente, se usan vías alternativas para metabolizar la

fenilalanina, esta es convertida por transmutación en acido fenilpiruvio, que es reducido a acido

fenilactico, o en forma, por descarboxilacion, acido fenilacteico que, por conjugación, origina la

fenilcetilglutamina. Finalmente, la fenilalanina y estos productos metabólicos se acumulan en

líquidos del organismo. Estos compuestos no son metabólicos anormales, sino metabólicos

normales, aunque en cantidades anormales 2 Como resultado, este aminoácido puede acumularse

a niveles tóxicos en la sangre y otros tejidos, dado que las células nerviosas en el cerebro son

especialmente sensibles a los niveles de fenilalanina, cantidades excesivas de esta sustancia

puede causar daño cerebral, por lo que es una enfermedad progresiva severa que puede producir

retraso mental si no se trata con una dieta libre de alimentos que contengan este aminoácido a

tiempo.

La incidencia de la enfermedad es de 1:10000 a 20000 personas. Se manifiesta por igual en

ambos sexos. Los estudios de la genética de la población revelan claramente una herencia

autonómica recesiva. La salud de los portadores no sufre efecto alguno por la presencia de este

gen.3

Identificación y Características del gen implicado

Como se menciono anteriormente, todos los defectos se heredan con carácter autosómico

recesivo. Hasta el momento se ha encontrado un gen asociado a este trastorno, conocido como el

gen PAH. Este gen se encuentra en el brazo largo del cromosoma 12, entre las posiciones 22 y

24.2, abarca 90 kb y contiene 13 exones. Actualmente se han descrito más de 500 mutaciones en

su cDNA, que en diferentes combinaciones, pueden dar cuenta de la gran variedad clínica y

bioquímica que presentan los pacientes con deficiencia en PAH. El cromosoma 12 contiene

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103.232.103 pares de bases a 103.311.380 y el gen se encuentra de los pb 103.232.103 a

103.311.380.4

En cuanto a la identificación de este gen en 1984 Lidsky et al., demostraron que el gen PAH se

encuentra en el cromosoma 12 y presumiblemente en la parte distal de 12q, por medio del uso de

una sonda de DNAc de PAH humano para analizar el ratón hibrido de células humanas por

hibridación de Southern, la hipótesis planteada se confirmo porque en los híbridos que contienen

el cromosoma translocado 12, estaban separados con PEPB (12q21) y no con TPI

(12p13). 5También en 1984 Woo et al. Asigna el gen en el cromosoma 12q21 HAP-qter mediante

análisis de restricción de ADN de hámster híbridos de células somáticas humanas. Por

hibridación in situ, la asignación del gen PAH se redujo a 12q22-q24.1 cromosoma6. Por ultimo

en 1985 O´Conell et al. de RFLP, confirmó la asignación del gen PAH a 12q terminal.7

También es importante mencionar que mediante el análisis de Nothern blot, Lichter-Konecki et

al en 1999 detecto más alta expresión de un kb HAP de transcripción-2.5 en el hígado humano,

seguido de riñón, páncreas y cerebro. Una transcripción de 4,6 kb se detectó también en el

hígado, los riñones y el páncreas, los ensayos de RNasa confirmó HAP la expresión en el hígado

y el riñón.  El ARN de hibridación in situ reveló expresión de PAH en los túbulos proximales de

los adultos y la corteza renal fetal y en la corteza cerebral del cerebro del feto. El análisis

inmunohistoquímico confirmó expresión de la proteína PAH en túbulos renales proximales

complicado.8

Un poco de Historia

En cuanto a la historia de la fenilcetonuria, fue en 1934 cuando Fölling realizo la descripción de

una enfermedad que causaba un grave daño cerebral, en la que estaba implicada una sustancia

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originaria de las proteínas denominada fenilalanina; la denominó “imbecillitas phenylpyuruvica”

oligofrenia fenilpirúvica, también conocida como enfermedad de Fölling9. Tres años más tarde,

Penrose y Quastel sugieren que se denomine a esta enfermedad fenilcetonuria nombre con el que

se conoce hoy en día. En 1947 Jervis observó que cuando se daba fenilalanina a individuos

sanos, en éstos se producía un aumento de otra sustancia llamada Tirosina. Pero cuando

suministraba fenilalanina a individuos fenilcetonúricos no presentaban tal elevación. Tras varios

años de investigación Jervis concluyó finalmente que en la enfermedad conocida como

fenilcetonuria se produce un fallo en la transformación de la fenilalanina en tirosina y que dicha

transformación en los individuos sanos tiene lugar en el hígado. 10Los avances en el tratamiento

de la enfermedad no se iniciaron hasta 1953 cuando Bickel publica sus primeros trabajos en los

que demuestra la efectividad de una dieta especial restringida en fenilalanina para el tratamiento

de la fenilcetonuria, especulo que podría haber una relación causal entre el exceso de fenilalanina

en los líquidos biológicos y una niña de daño cerebral y por lo cual planteo que sería posible

mejorar su condición mediante la reducción de la ingesta de fenilalanina. El uso de un

hidrolizado de caseína restringida en fenilalanina como la principal fuente de proteínas de la

dieta se consideró.11

Mutaciones y estructura de la proteína

La proteína fenilalanina hidroxilasa tiene C-terminal del monómero PheOH que se caracteriza

por el dominio catalítico, y es también responsable de tetramerización. El sitio activo PheOH se

encuentra en un bolsillo profundo de las paredes helicoidal en el C-terminal. El N-terminal es el

dominio de reglamentación y se extiende a través del sitio activo del dominio catalítico y es

estructuralmente similar a la del dominio regulador de fosfoglicerato deshidrogenasa, una enzima

implicada en la biosíntesis de serina, y PCD / DCOH, involucrados en la regeneración de BH4 y

la activación de NHF1 que a su vez activa la transcripción de PAH. La siguiente figura es un

monómero de PheOH, el rojo indica que el término dominio catalítico-C, el verde indica que el

núcleo del ámbito regulatorio, y el azul la terminal de autorregulación de dominio-N. 

BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FENILCETONURIA 5

Las mutaciones en  el gen PAH y sus consiguientes cambios estructurales en la enzima, dan lugar

a la función PheOH reducida y la fenilcetonuria. Muchas mutaciones en el sitio activo PheOH

tienen evidentes implicaciones estructurales. Sin embargo, las mutaciones en el dominio

catalítico y la región N-terminal también se han identificado. Kobe et al. En anteriores

postulados dicen que el N-terminal y la función reguladora de la bisagra puede ayudar a explicar

la disminución de la actividad de los mutantes de PAH en las zonas que no sea el sitio activo.

La base de la fenilcetonuria son las mutaciones producidas en el gen PAH, hasta la actualidad se

han identificado 564 mutaciones en el gen PAH, según la base de datos internacional de este

gen12. Algunos estudios han establecido relaciones entre el genotipo y el fenotipo metabólico,

permitiendo determinar el grado de severidad de acuerdo con la actividad de la enzima mutada, y

de esta forma indirectamente también se puede afectar el desarrollo cognitivo.13 Los tipos de

mutaciones vinculados a la PKU son la sustitución de un aminoácido por otro, deleciones,

inserciones, mutaciones que alteran el procesamiento del RNA heteronuclear y las mutaciones

sin sentido (etc.) En la siguiente imagen se muestra la estadística de las mutaciones más comunes

del gen, estos datos fueron obtenidos de la base de datos internacional del gen PAH.14

BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FENILCETONURIA 6

De las diferentes estructuras de este gen la más afectada por las mutaciones es el exón 7 como se

puede observar en la siguiente imagen donde se muestra la incidencia de las diferentes

mutaciones del gen según la región apareciendo como la región más afectada el exón 7, luego el

11,10 (etc.) Lo cual se explica porque la región codificante contiene 22 sitios CPG (ricos en

pares citosina-guanina), 5 de los cuales están ubicados en el exón numero siete de este gen. En el

exón 7, se encuentran la mayoría de las manifestaciones que están relacionadas con

hiperfenilalninemia. La hipótesis más aceptada es que esta región altamente conservada, confiere

funciones esenciales para la hidroxilacion de la PAH, cualquier variación en el dominio

codificado por este exón, altera la función de la enzima produciéndose la elevación de la

fenilalanina. Diversas son las mutaciones que se han relaciona con la deficiencia de PAH, donde

la sustitución de un aminoácido por otro es de la mas frecuéntenme encontradas.

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Se han clasificado 28 mutaciones como graves, como es el caso de una de las más frecuentes, la

mutaciones IVS10nt-11, que en homocigosis confiere un fenotipo grave. Otro grupo de 16

mutaciones se relacionan con una actividad PAH residual con un fenotipo suave, entre las que se

incluyen la 165T la V388M.

Además se han caracterizado 13 mutaciones causantes de hiperfenilalninemia benigna, como la

A403V, muy frecuente en nuestra población. Se ha establecido un sistema de búsqueda

sistemática de mutaciones en el gen PAH, mediante la técnica de DGGE, que permite la

identificación del genotipo de los casos de PKU diagnosticados cada año en el programa de

detección precoz de metabolopatias. El conocimiento del genotipo aporta al clínico una

información esencial en la predicción de la evolución fenotípica de cada recién nacido PKU

permite la aplicación de la aplicación de la dieta optima individualizada para cada paciente15

Algunos estudios han establecido relaciones entre el genotipo y el fenotipo metabólico,

permitiendo determinar el grado de severidad de acuerdo con la actividad de la enzima mutada, y

de esta forma indirectamente también se puede afectar el desarrollo cognitivo.16

A continuación se muestra una imagen con las mutaciones más frecuentes del gen, y después una

descripción de las más importantes.

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ARG408TRP

Este defecto es causado por una transición CGG/TGG en el exón 12, en la secuencia 1222.000

dando lugar a una sustitución de aminoácidos (arg-a-trp) en el residuo 408 (R408W) de PAH, se

considera una mutación de tipo sin sentido que se produce en el dominio catalítico de la HAP.

Por medio del uso de hibridación de análisis directo de la mutación puntual usando una sonda de

oligonucleótidos específicos fue demostrado que esta mutación está en desequilibrio de

ligamiento con RFLP haplotipo-2 alelos que componen alrededor del 20% de los genes mutantes

PAH. En 1993 Ivanschenko y Baranov describió una rápida y eficiente prueba de de PCR/

prueba StyI para identificar la mutación

IVS12DS, GA, +1

Consiste en el cambio de base individual (G/A) en el empalme de la zona donante de 5´ del

intron 1217

En 1986 Marvit et al., encontró que el GT-a AT-sustitución en el empalme de 5´del intrón 12 dio

lugar a la omisión del exón precedente, durante el empalme de ARN Se demostró que había una

eliminación de 116 pares de bases internas correspondan exactamente a exón 12 y que conduce a

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la síntesis de la proteína truncada que carecen de la C-terminal de 52 aminoácidos, la supresión

suprimió la actividad de PAH en la célula como consecuencia de la inestabilidad de las proteínas,

de hecho una sustitución de un solo nucleótido en lugar de la supresión de una base fue la base

del producto del gen anormal.18

GLU280LYS

La mutación consiste en un cambio de GAA/AAA en el exón 7, en la secuencia 838, esta

mutación es considerada del tipo sin sentido y se encontró un cambio de glu280 a lis,

identificado en un niño con una variante de fenilcetonuria. La enzima mostro actividad residual

parcial, esta mutación se relacionaba con haplotipos en el sur de Europa y Norte de África. 19

A partir del análisis de la base de datos de mutación de PAH, Byck et al en 1997 demostraron

que el alelo E280K, el 1,5% de los cromosomas PKU en todo el mundo. S e presenta el 4 e

haplotipos diferentes en los europeos y en haplotipos 1 y 2 en Quebec.20

ARG261GLN

Mutación de tipo sin sentido CGA/CAA en el exón 7, en el nucleótido 782, en el codón 261 se

produce un cambio de arg a gln (R261Q). 21Para esta mutación especifica es interesante

mencionar el caso que fue observado por Zurich, Superti-Furga et al en 1992 donde observo

retraso intrauterino, microcefalia, microcefalia y retraso en el desarrollo de dos primos hermanos

de madres de 23 y 24 años, se encontró que había fenilalanina en concentraciones aprox de

1.2mmol/l, pero nunca había sido tratada y no presentaban retraso mental. Ambas madres

demostraron ser homocigotas para mutación arg261, esto nos indica que el estado homocigoto de

esta mutación se acompaña de manifestaciones clínicas leves, pero suficiente elevación de

fenilalanina en la sangrepuede causar el síndrome de fenilcetonuria materna en la descendencia22

 ARG252TRP

Hay un cambio de C-T para la transposición de la primera base en el codón 252, que da lugar a la

sustitución arg252 a trp, es una mutación sin sentido descubierta por Abadie et al en 199123

Se han realizado análisis de los vectores de expresión que contiene el cDNA mutantes y en los

mamíferos reveló células transfectadas con insignificante actividad de la enzima, en estudios

genéticos de la población italiana se mostro un marcado desequilibrio los a-trp mutación arg252

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y haplotipos RFLP 1. El arg252 a trp es una mutación que se encontró en el 10% de un hapotipo

de cromosomas mutantes24

ARG158GLN

En 1989 Dworniczak et al identifico una transición G a A (CGG/CAG) en el nucleótido 695 en

el exón 5. La sustitución de base prevé un arg158 a gln (R158Q). Veinticuatro por ciento de los

alelos PKU se encontraban en un contexto de haplotipo 4, todos los 7 de la a-Una transición G

estaban en el haplotipo 4 de fondo.  25

ARG243TER

Se trata de una mutación sinsentido en el exón 7 donde se produce cambio CGA/TGA en el

nucleótido727 esto causa un cambio de arg243 a un codón de parada. Alelo mutante se asoció

con el haplotipo 4. La mutación estaba presente en 2 de 9 haplotipo 4 alelos mutantes entre los

europeos del este, pero no se encuentran entre los europeos occidentales y los asiáticos.26

PRO281LEU

Consiste en una mutación sin sentido donde se produce cambio de CCT/CTT, en el exón 7 en el

nucleótido 842. El análisis de expresión revelo la actividad enzimática insignificante y los

niveles no detectables de proteínas inmunorreactivas HAP.  El pro281 a leu mutación se

encontró en el 20% de un haplotipo cromosomas mutantes en la población italiana 27

En 1994 Baric et al. Señalo que los datos que indican la mayor frecuencia de la mutación esta en

Croacia, donde se detecto 55% de los alelos de un haplotipo, que corresponde al 12% de todos

los alelos de PKU. Ellos interpretaron este resultado como una indicación de que la mutación se

origino en el suerete de Europa28

TYR414CYS

Consiste en el cambio de TAC/TGC en el exón 12 en el nucleótido 1241, causando el cambio de

tyr414 a CYS). La transición de Aa G en la segunda base del codón 414 fue la responsable   Los

estudios in vitro mostraron que la expresión-a-cis mutación tyr414 producía una proteína con una

cantidad significativa de los HAP actividad de la enzima, es decir, aproximadamente el 50% del

estado de equilibrio los niveles normales. 29

BIOLOGIA MOLECULAR DE LA FENILCETONURIA 12

En 2008 Gersting et al declaró que la mutación se produce en el Y414C produciendo

dimerización del dominio de oligomerización HAP, que interactúa con el dominio catalítico de la

subunidad HAP mismo. Encontraron que la tetramerización de HAP recombinante con la

mutación Y414C parecía a la de la proteína de tipo salvaje. La reducción en la actividad

resultante de la mutación Y414C parecía deberse a un cambio conformacional global en la

proteína que reduce alosterismo.30

GLY272TER

Es una mutación de tipo sin sentido que causa un cambio GGA/TGA en el nucleótido 814 del

exón 7 , que resulta en cambio de una gly272 a ter (G272X) de sustitución, y la deleción del

codón leucina CTT 364 ( 612349.0021 ).

En 1993 Alpod et al encontró datos recopilados en la frecuencia de la mutación G272X en las

poblaciones europeas. La mutación se produce al norte de los Alpes y tiene una alta frecuencia

en particular en el Fiordo de La Región de Oslo de Noruega con la Bohuslän región adyacente de

Suecia. Una frecuencia intermedia se observó en la parte oriental de Alemania con la parte

adyacente del oeste de Checoslovaquia.Los hallazgos sugieren un origen único para esta

mutación, por lo menos una población fundadora en el sureste de Noruega/Suecia adyacentes 31

IVS10AS, GA, -11

Se produce una mutación de tipo empalme de G/A en intron 10, hay una transición en la

posición 546, 11pb arriba del límite con el exón 10. La mutación se produce en un sitio de

empalme crítica y da lugar a un marco de inserción, de 9 de nucleótidos entre los exones 10 y 11

del ARNm procesado. Cantidades normales de proteína en el hígado PAH estaban presentes en

la PKU homocigotos de los pacientes, pero no la actividad catalítica. Esta pérdida de actividad

de la enzima fue causado probablemente por cambios conformacionales que resultan de la

inserción de 3 aminoácidos adicionales (Gly-Leu-Gln) entre las secuencias normales codificada

por exones 10 y 11. La mutación se encuentra en estrecha asociación con los haplotipos

cromosomas 6, 10 y 36. 32Debido a la alta frecuencia de estos haplotipos en particular en

Bulgaria, Italia y Turquía, Dworniczak et al.   (1991)  sospecha que esta mutación puede ser uno de

los defectos más frecuentes en el gen que causa la PKU clásica HAP en el sur de Europa. Perez

et al.(1992) también encontró esta mutación en España. Por otra parte, Pérez et

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al.   (1993)  encontraron que esta mutación es la lesión molecular predominante que causan la

fenilcetonuria en Chile, Argentina y México.

Terapia Génica

El tratamiento para esta enfermedad se ha basado principalmente en el control de la dieta del

paciente, pero en la actualidad se ha planteado una nueva alternativa que consiste en la terapia

génica, ya había sido revelado que el método había curado fenilcetonuria (PKU) en ratones.

La noticia de que esta técnica tiene efectivamente curar una enfermedad grave, aunque en

ratones, ha elevado las posibilidades y las expectativas.

Además de la PKU, esta técnica podría ser usada para curar otras enfermedades genéticas

causadas por falta de enzimas hepáticas como la hemofilia y las deficiencias de la enzima ciclo

de la urea, así como la limpieza de colesterol de la sangre y otros.

La técnica consiste en insertar genes en regiones no codificantes del genoma lo que no hay

peligro de interferencia con el funcionamiento de otros genes. Una vez insertado, el gen sigue

siendo una parte permanente del genoma de la célula.

El Dr. Woo y su colega Li Chen utiliza un gen de un bacteriófago , que reconoce una secuencia

específica de ADN. Esta secuencia sólo se produce varias veces en el genoma del ratón entero y

siempre se encuentra en la región no codificante entre los genes.

Woo y Chen fueron capaces de curar la PKU en ratones con sólo tres inyecciones por vía

intravenosa. Los niveles de fenilalanina en los ratones tratados se redujo a valores normales y se

mantuvo estable a partir de entonces.

Su color de piel también cambió de gris a negro, indicando que estaban produciendo los niveles

normales de melanina, un pigmento, que está siendo producida en ratones y seres humanos con

PKU.

"Debido a que los genes se insertan de forma permanente, algunas aplicaciones sería suficiente

para corregir de forma permanente una enfermedad", dijo Woo.

"El reto actual es identificar un medio adecuado para la introducción de ADN en las células del

hígado. Una vez que la tecnología se desarrolla, esta nueva técnica proporcionará un método

seguro y eficaz de integrar el ADN en el genoma de la célula."33

Diagnostico, tratamiento y Pronostico

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En relación a este trastorno es importante mencionar los métodos utilizados para el diagnostico,

como la prueba del cloruro férrico en la orina. Existen casos raros en los que no se encuentra el

ácido fenilpirúvico en la orina siempre, sólo cuando se ha expuesto al niño a una sobrecarga

dietética o cuando tiene fiebre este aparece estos casos se consideran como defectos parciales.

En cuanto al tratamiento habitual comprende una dieta extremadamente baja en fenilalanina,

especialmente cuando el niño está creciendo. Aquellos pacientes que continúen con la dieta hasta

la vida adulta tendrán una mejor salud física y mental. La fenilalanina se encuentra en

cantidades significativas en alimentos como la leche, los huevos y otros alimentos comunes.

Además, se encuentra en el edulcorante artificial Nutrasweet (aspartamo), razón por la cual

cualquier producto que contenga aspartamo se debe evitar.

Lofenalac es una leche en polvo infantil especial para bebés con fenilcetonuria que se puede usar

durante toda la vida como fuente de proteína, con un contenido extremadamente bajo en

fenilalanina y balanceada con respecto a los aminoácidos esenciales restantes.

El hecho de tomar suplementos, como el aceite de pescado, para reemplazar los ácidos grasos de

cadena larga faltantes de una dieta estándar libre de fenilalanina puede ayudar a mejorar el

desarrollo neurológico, incluyendo la coordinación motriz fina. Asimismo, se pueden necesitar

otros suplementos específicos, como el hierro o la carnitina.

Se espera que el desenlace clínico sea muy alentador si la dieta se sigue estrictamente,

comenzando poco después del nacimiento del niño; pero si el tratamiento se retrasa o el trastorno

permanece sin tratamiento, se presentará daño cerebral. El desempeño escolar se puede deteriorar

levemente.

Si no se evitan las proteínas que contengan fenilalanina, la fenilcetonuria puede conducir a

retardo mental hacia el final del primer año de vida.

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