Biología Molecular Christian A. García Sepúlveda MD PhD Facultad de Medicina Universidad...

Biología MolecularChristian A. García Sepúlveda MD PhD

Facultad de MedicinaUniversidad Autónoma de San Luis Potosí

Sesión #4

Cromosomas

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CA García Sepúlveda MD PhD

Condensación de Genomas Virales y Cromosomas Eucariotas

Laboratorio de Genómica Viral y HumanaFacultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

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Sesión #4 Cromosomas

Contenido

1. Introducción

2. Empaquetamiento

3. Condensación de genomas virales

4. Cromosoma bacteriano

5. Asas, dominios y andamiaje eucariota

6. Cromatina y cromosomas eucariotas

7. Cromosoma en escobillón “Lampbrush”

8. Cromosomas politénicos

9. Cromosomas eucariotas

1. Centrómero

2. Telómero

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Introducción

La célula humana promedio posee 2 metros de DNA dentro de un núcleo de 10-5 metros de diámetro.

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Introducción

Por principio, el material genético de los seres vivos ocupa un volumen limitado dentro del cual se llevan a cabo sus funciones (replicación y transcripción).

El almacenamiento del material genético debe permitir la transición de estado activo a inactivo.

Problema común: nunca hay suficiente espacio.

La longitud del Acido Nucleico (AN) superaría las dimensiones del compartimiento.

Por ello es necesario compactar al AN y organizarlo en paquetes (empaquetarlo).

En contraste a la imagen clásica del DNA existiendo como una molécula extendida, en realidad se encuentra deformada, doblada y enrollada en los seres vivos.

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La densidad del AN en estos compartimientos es elevada (equivalente a la de un gel de gran viscosidad).

En bacterias es de aprox 10 mg/ml.

En núcleos eucariotas es de aprox 100 mg/ml.

En el Fago T4 es de aprox 500 mg/ml.

El empaquetamiento de la cromatina es flexible, cambia durante el ciclo celular.

Durante la mitosis/meiosis se aumenta el nivel de empaquetamiento del AN para formar cormosomas.


Empaquetamiento

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La compactación del AN se describe por la Tasa de Empaquetamiento

PR = longitud del AN longitud del compartimiento

PR cromosoma humano más pequeño (Cromosoma 21)

Cantidad de DNA = 4.6 x 107 bp equivalente a 1.4 cm

Tamaño Cromo 21 = ± 2 µm (metafase)

PR Cromo21 Metafase = 14,000/2 = 7,000

Cromosomas de metafase entre 5 y 10 veces más compactos

que los de interfase

PR Cromo21 Interfase = 700 y 1400


Empaquetamiento

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Diferencia fundamental entre compartimientos pro/eucariotas y los virales: Tamaño

El núcleo de los eucariotas adaptado a un genoma de tamaño cambiante (duplicaciónes, deleciones y

rearreglos) = SOLO REQUIERE DE UN METODO GENERALIZADO DE EMPAQUETAMIENTO.

En los virus: 1).- Cantidad PREDETERMINADA de AN por empaquetar.

2).- Todo debe caber un compartimento codificado por dicho AN.

Estrategia viral de mantener las cosas lo más sencillas posible (partícula viral) obliga a diseños compactos.

El diseño de TODA partícula viral gira alrededor del AN.

El genoma está contenido por una CAPSIDE formada por una (o pocas) proteínas alrededor de la cual se

incorporan otras proteínas necesarias para la infección del hospedero.

El volumen interno del virus raramente posee más espacio del necesario para albergar a la cápside y AN.


Condensación de genomas virales

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El extremo más ergonómico lleva a que la cápside viral esté formada por un solo tipo de subunidad protéica.

Dos tipos esenciales de cápsides:

1.- Filamentosas u helicoidales = Empalmamiento

helicoidal de proteinas alrededor de AN.

2.- Icosaédricas = formada por estructura

pseudoesférica simétrica en forma de poliedro

icosaédrico.



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Dos formas de construir las cápsides:

1.- Ensamblar cascarón proteico alrededor del AN, condensando al AN a través de

interacciones proteícas.

2.- Construir una cápside vacía y posteriormente introducir el AN.



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Cápsides ensambladas alrededor del AN

Método usual para virus de ssRNA

La posición del RNA dentro de la cápside determinada directamente por interacciones RNA-proteína.

Ejemplo mejor caracterizado es el Tobacco Mosaic Virus (TMV)

Ensamblaje inicia en una asa de RNA duplex (centro de nucleación) y procede bidireccionalmente hasta llegar a los extremos.

Unidad repetitiva tiene forma de disco de 17 subunidades proteicas idénticas las cuales se empalman de manera helicoidal de tal modo en que el RNA queda protegido en el interior de la cápside.



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Cápsides pre-ensambladas

Método usual para virus de DNA

La posición del DNA dentro de la cápside determinada directamente por interacciones DNA-proteína.

Ejemplos mejor caracterizados son Bacteriófago T4 y Bacteriófago lambda.

Ensamblaje de una cápside esférica (cabezal) alrededor de un coro protéico es seguido de su ahuecamiento.

Ulteriormente, el genoma viral es insertado, expandiendo el cabezal. Finalmente se sella el cabezal con la adición de una cola.



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Inserción del DNA al cabezal involucra a dos tipos de reacciones:

1.- Translocación Proceso activo mediado por mecanismo ATP-dependiente.

2.- CondensaciónAun un misterio, mediado por interacciones ente los dominios proteicos del interior de la cápside con el DNA.

Las inserciones y deleciones del DNA y las substituciones de las proteinas no interfieren con el proceso.

Empaquetamiento viral no parece ser específico de secuencia.

No obstante, el DNA al ser introducido al cabezal sigue un patrón reproducible y predeterminado de condensación...otro misterio.



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Translocación de DNA en el fago



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Por otro lado, existen virus más complejos...

Reovirus y ortomixovirus (influenza) poseen genomas segmentados.

Influenza posee 8 segmentos de RNA diferentes (tamaños y secuencias), no obstante algún proceso aun desconocido permite ensamblar partículas virales con exactamente 8 segmentos diferentes.

Virus del Mosaico de la Alfalfa posee genoma segmentado empaquetado en cápsides diferentes.



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Cromosoma bacteriano (Genoforo)A pesar de que las bacterias no poseen estructuras morfológicas semejantes a las nuestras, su DNA se encuentra organizado en un cromosoma circular.

Usualmente forma dos o tres aglomerados difusos, ocupando un tercio del volumen celular (nucleoide).

Genoforo = Cromosoma sin cromatina

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Cromosoma bacteriano (Genoforo)

Al ser lisadas, la hebra de DNA se extiende pero permanece fija a la membrana celular.

Forma asas reconocibles.

El nucleoide bacteriano puede ser aislado in vitro y separado del resto de los componentes celulares por sedimentación.

El nucleoide puede ser lisado con RNAsas o Proteinasas.

El componente proteico que ayuda a mantener organizado el DNA en bacterias ha sido bien caracterizado.

El componente de RNA no lo ha sido.

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El genforo bacteriano se encuentra organizado en cerca de 100 dominios formados por asas de aprox 40 kb de dsDNA unidas por la base a un sustrato aun desconocido.

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El anclaje proteico permite que ciertas regiones del DNA bacteriano sean superembobinadas negativa o positivamente con el objeto de permitir su expresión sin afectar a las demás regiones del genoma bacteriano.

Esto ha sido determinado por el análisis del superembobinamiento (SE) inducido por Bromuro de Etidio o DAPI.

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El EtBr induce SE positivo del DNA al intercalarse entre las bases.

La cantidad de EtBr es proporcional al grado de SE.

Cuando un DNA circular naturalmente SE(-) como el bacteriano es expuesto a EtBr, pierde primero el SE(-) y de continuar la exposición, adquiere SE(+).

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Si el DNA bacteriano no estuviese anclado a este eje rotacional proteico en forma de dominios independientes, actuaría como un fragmento de DNA libre y el SE(-/+) sería disipado.

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Varias proteinas bacterianas fijadoras de DNA semejantes a las proteinas cromosómicas eucariotas han sido descubiertas.

La proteina HU es un dímero que condensa al DNA, envolviendolo en una estructura esférica.

Se ha demostrado que juega un papel fundamental en la condensación del nucleoide bacteriano.

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Otra proteina bacteriana involucrada en la condensación del genoforo es la H1 (también llamada H-NS) forma puentes entre dos hebras de dsDNA.

Específica para secuencias dobladas.

Unión al DNA afecta expresión génica al interferir con promotores.

Tanto H1 como HU representan los ejemplos mejor estudiados pero no los únicos.

Proteinas redundantes, es necesario acumular mutaciones en muchas de ellas para interferir con la condensación y estructura del nucleoide bacteriano.

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Asas, dominios y andamiaje eucariota

La cromatina de interfase se encuentra dispersa ocupando una gran parte del volumen nuclear.

En contraste, los cromosomas de la metafase representan corpúsculos organizados de estructura reproducible.

Los cromosomas eucariotas se encuentran formados por fibras de dsDNA de 10nm finamente enrolladas para formar asas y dominios.

Las asas se encuentran ancladas al andamiaje proteico cromosómico.

Andamiaje nuclear

300 nm

Asas

Andamio

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Los cromosomas eucariotas depletados de DNA conservan su aspecto morfológico.

El andamiaje del cromosoma de metafase constituye una red intrincada de fibras densas de la cual emanan asas de DNA de aprox 10 a 30 M (30 a 90 kb).

El DNA puede ser digerido sin deformar al andamiaje.

Andamiaje cromosómico

DNA depletado de histonas

Depleción de DNA

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Las células en interfase poseen un matriz nuclear filamentosa ocupando el interior del núcleo.

La cromatina se adhiere a dicha matriz lo cual es indispensable para la transcripción y replicación (Topoisomerasas).

Matriz nuclear de interfase = Andamiaje cromosómico de la metafase

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Los sitios del DNA que entran en contacto con el sustrato protéico de la matriz nuclear durante la interfase se denominan MARs o SARs.

MARs = Matrix Attachment Regions

SARs = Scaffold Attachment Regions •MARs o SARs:

•No hay secuencias de DNA conservadas.

•Secuencias de DNA son ricas (70%) en A-T.

•Secuencias poseen sitios con efectos-cis reguladores de la transcripción.

•Sitio de reconocimiento para la Topoisomerasa II usualmente presente.

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Topoisomerasa II es un componente importante tanto del andamiaje cromosómico como de la matriz nuclear = Resalta la importancia de la topología del DNA en ambas instancias.

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Cromatina y cromosomas eucariotas

Cada cromosoma está formado por una sola hebra de DNA.

Los cromosomas solamente son aparentes durante un tiempo muy breve del ciclo celular (metafase).

Los cromosomas clásicos compuestos de cromátides hermanas.

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Durante la interfase el genoma forma cromatina.

Eucromatina = Menor densidad a la del cromosoma mitótico, apariencia dispersa que ocupa la mayor parte del núcleo eucariota.

Heterocromatina = Densidad equiparable a la del cromosoma mitótico, pocos cambios con el ciclo celular (condensación). Forma cúmulos discretos llamados cromócentros.

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La heterocromatina se une a la eucromatina através de fibras nucleosomales (10 nm) lo que implica que solamente son diferentes estados de condensación del mismo DNA.

El material genético eucariota se encuentra oganizado de tal manera que permite estados alternativos de actividad (transcripción y replicación).

Correspondencia con la actividad:

Heterocromatina = DNA no transcrito, replicación tardía (en la fase S)

Eucromatina = Contiene a genes activos, pero solamente una pequeña parte está siendo transcrita en determinado momento.

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A nivel individual, los cromosomas adoptan ultraestructuras reproducibles y predictibles.

Los cromosomas originalmente definidos en base a su tamaño y localización del centrómero.

Hoy en día los cromosomas son identificados en base al patrón de bandeo (bandas Giemsa o bandas G)...o más recientemente por FISH.

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Las bandas son estructuras grandes (10 x 106 bp de DNA).

Cientos de genes en cada banda.

Técnica de enorme utilidad práctica, mecanismo sigue siendo un misterio.

Tinte Giemsa pinta por igual al cromosoma no tratado (tripsina seguida de giemsa), pero de manera diferente al tratado...sugiriendo que el tratamiento expone (o elimina) ciertas propiedades fisicoquímicas.

Bandas obscuras ricas en AT y pobres en genes (Z-DNA)

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Cromosomas escobillón

La expresión génica puede ser visualizada en algunos raros casos durante la meiosis pero durante esta fase del ciclo suele haber muy poca expresión génica.

En ciertos casos, algunos organismos como Notophthalmus viridescens (tritón) detienen el proceso meiótico durante varios meses.

Durante esta fase, los cromosomas adoptan una forma elongada facilmente visible al MO.

Estos cromosomas constituyen bivalentes meióticos consistentes en dos pares de cromátidas hermanas y se llaman cromosomas en escobillon o “lampbrush”.

Los cromosomas en escobillón de N. viridescens miden entre 400 y 800 nm.

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Cromosomas politénicos

Los núcleos de interfase (durante el politeno) de las larvas de algunos dípteros contienen cromosomas con diámetros superiores a los normales.

Resultado de endomitosis (replicación sin división celular).

Ejemplo clásico de los cromosomas politénicos de las glandulas salivales de D. melanogaster.

Ventaja transcripcional enorme, necesario en la larva para producir cantidades industriales de pegamento antes de la pupación.

D. melanogaster posee cuatro cromosomas agregados en un cromocentro de heterocromatina (contiene el cromosoma Y de machos).

El complejo tiene una dimensión de ± 2000 nm.

El DNA completamente extendido mediría ± 40,000 nm.

PR = ± 20.

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Cada cromosoma representa alineamientos paralelos de cromátides que han sido duplicadas durante la replicación y que han permanecido unidas.

Si haploide = 2Cromátidas en politene = 1024Cromátidas.

Cada uno de los cromosomas politenicos tiene una serie de bandas visibles (cromomeros).

Bandas miden entre 0.05 y 0.5 nm.

Interbandas captan menos tinte.

D. melanogaster posee ± 5000 bandas

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El patrón de bandas es característico para cada cepa de D. melanogaster.

Bandas primero reconocidas en 1930.

Buen método para realizar el mapeo citológico de genes.

La localización física de genes específicos puede ser determinada facilmente en estos cromosomas a través de la HIBRIDIZACION CITOLOGICA o HIBRIDIZACION IN SITU.

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Los sitios activos (de expresión génica) pueden ser fácilmente visualizados en los cromosomas politénicos.

Estos sitios provocan ensanchamientos de las bandas conocidos como “Puffs”.

Término correcto = Anillos de Balbiani.

Representan la extrusión del material genético como consecuencia de su des-empaquetamiento para expresar los genes codficados en ellos = Síntesis de RNA.

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El patrón de anillos de Balbiani depende del estadío de desarrollo al igual que del tejido en el cual son analizados.

Los anillos de Balbiani puede ser provocados por la expresión de un solo gen.

Las características tanto de los Cromosomas en escobillón como de los cromosomas politénicos implican que el material genético debe ser descompactado para poder realizar su función (transcripción y replicación).

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Cromosomas eucariotas

Los cromosomas de metafase poseen tres unidades estructurales funcionales:

• Dos cromátides hermanas en cuyos brazos se codifica la información genética.

• Un centrómero, ultraestructura encargada del tráfico de las cromátides.

• Cuatro telómeros, ultraestructura encargada de sellar la información de las cromátides y permitir su replicación integra.

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Cromosomas eucariotas - centrómero

La región del cromosoma responsable de la segregación y migración equitativa de las cromátides durante la mitosis y meiosis.

Centrómero contiene al sitio por el cual se mantienen unidas las cromátides hermanas durante la alineación ecuatorial y antes de su segregación y migración a los polos.

El centrómero es movilizado hacia un polo celular durante la mitosis llevando con el a la cromátide correspondiente (desde esta perspectiva constituye una herramienta para la segregación de genes durante la división celular).

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Los cromosomas se clasifican (y mapean) de acuerdo a la localización de su centrómero:

•Metacéntricos (Centrómero al centro)•Submetacentricos (fuera del centro)•Acrocéntricos (centrómero en extremo).

Definen brazos de cromosoma:

•p del frances “petit” (pequeño)•q la letra que inevitablemente le seguía

Kariotipo humano posee los tres tipos.

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Permiten mapear chromosoma físico.

Base del ISCN (International System for Cytogenetic Nomenclature)

Cada cromosoma designado con un número (1-23 XY).

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Dos brazos por cromosoma (p y q).

p

q

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Cada brazo del cromosoma posee una o dos áreas definidas por bandas (21q1 y 21q2). 21q1

21q2

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Cada brazo del cromosoma posee una o dos áreas definidas por bandas (21q1 y 21q2).

Cada area posee subdivisiones inferiores (21q11.1 y 21q11.2)

21q1

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Cada brazo del cromosoma posee una o dos áreas definidas por bandas (21q1 y 21q2).

Cada area posee subdivisiones inferiores (21q11.1 y 21q11.2)

Permite resumir anomalias citogenéticas

46,XX,del(21q11.2)

21q1

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Los centrómeros son esenciales para la división celular ya que permiten la segregación EQUITATIVA del material genético.

Evidencia: La ruptura de cromosomas puede dar lugar a la aparición de fragmentos cromosómicos SIN centrómero (acéntricos).

La ausencia del centrómero no les permite unirse al aparato mitótico y por ende no permite la repartición equitativa del material genético.

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Igualmente, los cromosomas que llegan a presentar dos centrómeros interfieren con la repartición equitativa del material genético.

Algunos tipos de translocaciones llevan a la formación de cromosomas dicéntricos, los cuales adoptan formas aberrantes durante la mitosis y rupturas cromósomicas al momento de la segregación y migración.

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Los centrómeros pueden ser visualizados con MO a través de la técnica de bandas-C.

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Los centrómeros tienen dos componentes:

Secuencias de DNAProteina

Primeramente, el componente proteico.

Llamado kinetocoro.

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Kinetocoro (o cinetocoro) corresponde a una estructura de ca 400 nm que forma la porción densa del bandeo-C.

Sitio de fijación de microtubulos.

Constituye el MTOC (Centro organizador de microtúbulos) del lado cromosómico.

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La manera en que los microtúbulos se fijan kinetocoro al parecer es aleatoria...es decir, pudiera ser que dos microtúbulos provenientes del mismo polo se fijen a ambos kinetocoros.

No obstante, la ausencia de tensión centromérica ocasionada por esta distribución de fuerzas obliga al cromosoma a re-orientarse (mecanismo desconocido).

La presencia de fuerzas contrarias lleva a la estabilización del cromosoma en el plano ecuatorial de la célula.

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El ensamblaje y desensamblaje de las subunidades estructurales del microtúbulo lleva a su alargamiento y retracción.

El “sensor” de tensión no está en centrómero sino en el extremo distal del microtúbulo...

Al “sentir” la tensión, el microtúbulo comienza a retraerse en sincronía con otros microtúbulos para segregar a las cromátides.

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No obstante, los kinetocoros per sé no son suficientes para permitir la migración de los cromosomas....

La levadura S. cerevisiae carece de kinetocoros y aun así presenta segregación y migración mitótica.

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Los centrómeros tienen dos componentes:

Secuencias de DNAProteina

Ahora, sobre las secuencias de DNA.

Los centrómeros poseen regiones especiales de DNA:

Considerable cantidad de heterocromatina (bandas-C).

Secuencias ricas en DNA satélite.

Nota: No todos los centrómeros poseen heterocromatina y al parecer esta no constituye un elemento esencial.

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Los centrómeros poseen fragments de DNA llamados secuencias o elementos CEN inicialmente caracterizados en S. cerevisiae.

La levadura que no poseía kinetocoros pero que sí presentaba segregación y migración mitótica.

Una región de 120 bp resistente a nucleasas.

Tres regiones indispensables para el funcionamiento del centrómero.

Región I, elemento CDE-I : Secuencia de 9 bp conservada en extremo 5’.Región II, elemento CDE-II: Secuencia variable pero tamaño constante, 80 a 90 bp, >90% AT

Función más asociada a tamaño que secuencia Contiene secuencias parecidas a STR (DNA satélite). Secuencia de DNA genera contorsiones helicoidales (zDNA)

Región III, elemento CDE-III: Secuencia de 11 bp, altamente conservada.

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Las mutaciones de CDE-I o CDE-II reducen pero no inactivan la función del centrómero.

Las mutaciones de la región central CCG de CDE-III si lo inactivan completamente.

CDE-I es reconocido por CBF1, pero su interacción no es indispensable para la función.

No obstante,la ausencia de CBF1 si disminuye la fidelidad de la segregación.

Un complejo protéico de 240 kD llamado CBF3 reconoce a CDE-III y esta asociación sí es indispensable para la función centromérica.

Es muy posible que otras proteinas se unan a estos complejos protéicos de reconocimiento.

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Concluyendo, seguramente la función centromérica depende de la presencia de secuencias de DNA que permiten la unión de complejos protéicos que sirven para anclar a los microtúbulos que sirven de motor para la segregación de las cromátides.

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Cromosomas eucariotas - telómero

Estructura encargada de sellar extremos del cromosoma.

Los extremos de moléculas de DNA lineares son “pegajosos” e inestables lo que ocasiona las estructuras anómalas observadas cuando se rompen los cromosomas.

Localizados en los extremos terminales de los cromosomas.

Brindan estabilidad a las moléculas de DNA lineares que son nuestros cromosomas.

P. Ej. Sobrevida de moléculas de DNA en S. cerevisiae.

Los plasmidos lineares son inestables y rápidamente degradados dentro de S. cerevisiae.

La transferencia de secuencias teloméricas de otro organismo estabiliza a las moléculas lineares.

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Varias secuencias teloméricas se han aislado a partir de organismos tan diversos como flagelados (Tetrahymena) y humanos.

El mismo tipo de secuencia se encuentra presente en plantas y el hombre.

Por ello la construcción y la función de los telómeros parece seguir un principio universal que ha sido conservado a lo largo de la evolución.

Secuencias de DNA teloméricas consisten en repeticiones cortas en serie (tandem) o STRs.

De hecho la secuencia telomérica del rDNA extracromosómico linear natural de Tetrahymena fue la responsable de la estabilización de plasmidos lineares en S. cerevisiae.

Función telomérica depende de dos propiedades:

Capacidad de alargarse y acortarse. Adopción de conformaciones extrañas (loops y tetraplex).

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Como se verá más adelante en el curso, el proceso normal de envejecimiento conlleva al acortamiento de los telómeros.

Diferencia de longitud de telómeros es visible y cuantificable entre infantes y ancianos.

Algunos linajes celulares cancerosos poseen la capacidad de volverlos a elongar o extender.

El proceso de replicación normalmente no se encuentra adaptado para terminar de replicar extremos cromosómicos.

Paradigma de replicación terminal.

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Paradigma de replicación terminal.

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La adición de secuencia de novo contrarresta a este acortamiento que se dá con cada división celular.

Esto permite lograr un equilibrio (bueno casi, a fin de cuentas se acortan con la edad) de la longitud.

Esto depende de la Telomerasa.

Ribonucleoporteina grande (verde)

Posee un fragmento de RNA (150 y 200 bp).

RNA posee secuencia (15 a 22 bp) idéntica a extremo libre de telómero.

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Tres bases especificidad.

Solo requiere dGTP y dTTP

En realidad es una Transcriptasa inversa (sintetiza DNA de RNA).

La porción proteica al parecer no toca al DNA, simplemente se limita a servir de sostén para el RNA.

La telomerasa no controla el número de veces que repite el proces, esto depende de otras proteinas.

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Otra de las características físicas que dictan la función de los telómeros es la adopción de conformaciones inusuales.

El telómero posee una región en que la hebra de DNA se encuentra libre (no-complementada) = ssDNA.

No obstante, la migración electroforética no concuerda con la de un fragmento de ssDNA sino que muestra aberraciones migratorias.

Hoy sabemos que el telómero posee una región circular que protege al cromosoma linear de la degradación (recordar sobrevida de plasmidos en levaduras).

Así que a fin de cuentas los cromosomas lineares se comportan como plásmidos gigantes....al menos en sus extremos.

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Este lazo (loop) de 5 a 10 kb no le permite el acceso a nucleasas que degraden el extremo del DNA linear y su formación es catalizada por proteínas (complejos TRF1 y TRF2).

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“telomere quartet.pdb”

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Introducción

Para concluir, un cromosoma requiere de tres cosas para realizar su función:

1.- Un TELOMERO para mantener su integridad.

2.- Un CENTROMERO que permita perpetuarlo.

3.- Un origen para iniciar la replicación (más adelante).

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