mportancia evolutivaLa estrategia procariota pretende alcanzar las mximas tasas de proliferacin cuando el entorno se lo permita. En cambio, la estrategia eucariota ha de ser distinta puesto que en los organismos pluricelulares donde el medio intercelular es relativamente constante, el control gnico est al servicio de la especializacin celular. As, nos encontramos con que la mayora de los gene no responden a cambios fisiolgicos y otros muchos que sufren un fuerte control como consecuencia del desarrollo, de la organizacin de clulas en tejidos, y de los tejidos en organismos completos. La genmica parece indicar que

El nmero de genes no vara mucho entre las especies (de 6000 genes en las levaduras, a 13.500 en las moscas y 25.000 en las plantas y los primates): los vertebrados tienen como mucho el doble de genes que los invertebrados. El aumento del nmero de genes o del material gentico no sirve para explicar la diversidad evoultiva por mutacin o duplicacin gnica. La variabilidad de los genes se debe a la duplicacin de genes en vez de la creacin de genes nuevos; eso queda patente al ver que cuantos ms genes tienen las especies, no aumenta equitativamente el nmero de familias gnicas. La divergencia entre los ORF de las ranas es mucho mayor que entre los ORF de los vertebrados, lo que indica que las variaciones entre las ORF no puede explicar la variacin entre especies. La mayora de los genes eucariotas tienen ms sitios de regulacin (y protenas reguladoras) que los genes bacterianos. La complejidad evolutiva se correlaciona con el aumento de genes reguladores: en las levaduras hay un gen regulador por cada 20 funcionales, pero en los humanos hay ms de 3 000 reguladores para unos 30 000 genes.

Por eso, la complejidad de los organismos emerge de una regulacin de la expresin gnica cada vez ms elaborada y no de cambios o mutaciones en los genes estructurales o enzimticos: la secuencia de las protenas se conserva mucho a travs de distintas especies, sin cambios importantes mientras que los cambios en el orden de los elementos del promotor o de sus elementos reguladores, o incluso de los reguladores de la remodelacin de la cromatina, provocan alteraciones drsticas. As, los mamferos son muy diferentes, pero sus ORF son parecidas; en cambio, la divergencia de secuencia en las ranas es muy alta a pesar de que forman un grupo bastante homogneo. Recientemente se ha encontrado que las regiones intergnicas van a ser mucho ms importantes para la regulacin (y la evolucin) de lo que se pensaba, ya que los anlisis transcriptmicos (con micromatrices) demuestran que hay muchos ms transcritos que genes. Estos transcritos de ms provienen de las regiones intergnicas regiones entre los genes se produce una elevada tasa de transcripcin de funcin desconocida o poco caracterizada. Estos transcritos intergnicos sufren las mismas restricciones que el resto de los genes, lo que restringe su tasa de cambio evolutivo y de seleccin al mismo ritmo que los genes que codifican las protenas. Precisamente, se ha observado que la mitad de las diferencias de expresin entre los humanos y los chimpancs se deben a los transcritos intergnicos.

Puntos de regulacinEn cada tipo celular no se expresan ms del 10-20% de los genes, pudindose distinguir 3 grupos:

Los que dan mRNA poco abundante, que suelen ser genes de mantenimiento (housekeeping). Se crea que haba unos 10 000 genes en esta situacin, pero la genmica revela que no son ms de 3000 Los que dan un mRNA medianamente abundante (hasta 1000 copias por clula), que suelen ser genes estructurales. Se cree que estaran implicados de 500 a 1000 genes.. Unos pocos genes que dan mRNA muy abundantes (ms de 10 000 copias por clula). Suelen ser los genes especficos de tejidos y estn regulados por potenciadores. Se crea que no estaran implicados ms de 5 genes, pero la genmica indica que son varios cientos.

Son muchos los puntos en los que se puede controlar la expresin gnica de eucariotas:Control pretranscripcional: determina la accesibilidad de la comatina a la maquinaria de transcripcin. Lo afectan el superenrollamiento y la metilacin. Tambin se conoce como regulacin epigentica (vase el seminario de Flor Correa) ya que no depende de la secuencia sino de la conformacin del DNA. Control transcripcional: determina la frecuencia y/o velocidad de inicio de transcripcin mediante la accesibilidad de los sitios de inicio, la disponibilidad de los factores de transcripcin y la eficacia de los promotores. La elongacin a penas se ve afectada ms que por la accin de algunos oncogenes que la hacen abortar prematuramente. Control postranscripcional: es el que se ejerce una vez que el transcrito ha terminado de sintetizarse. Puede ser de varios tipos: Control de la maduracin: Segn se pueda realizar elayustamiento del RNA, se conseguirn distintas cantidades del producto gnico. Control del transporte: la mayora de los RNA tienen que salir al citoplasma para ejercer su funcin. Para ello han de atravesar los poros de la membrana nuclear, donde se puede seleccionar los RNA que sern transportados y los que no Adems, la presencia de intrones impide la exportacin del mRNA ya que llevan asociados el ayustosoma e impiden que lo reconozcan las protenas TAP y Mex que interaccionarn con el poro nuclear. Control de la estabilidad: la vida media del RNA se puede regular mediante la expresin de las RNasas o de protenas estabilizadoras del mRNA en el citoplasma. Por ejemplo, la vitelogenina es una protena que se acumula en presencia de estrgenos, con una vida media del mRNA de 480 h; en cambio, al desaparecer los estrgenos, la vida media de este mRNA decae hasta las 16 h. Control traduccional: esta regulacin se ejerce sobre la frecuencia con que se comienzan a traducir los mRNA. Tambin puede afectar la frecuencia con la que las protenas maduran y la disponibilidad de efectores enzimticos, pero eso se ver en otro tema.

Seales que modifican la transcripcinLos tipos de seales que pueden alterar la transcripcin de un gen puede ser: Seales hormonales que interaccionan con un receptor de la membrana. En la mayora de los casos, la seal externa provoca la aparicin del segundo mensajero intracelular. La cascada de transduccin de seal subsiguiente produce un regulador de transcripcin especfico. En el caso de las hormonas esteroideas, el receptor est dentro de la clula y es el conjunto hormona-receptor el que acta de regulador.

Las seales nutricionales e inicas suelen darse en eucariotas unicelulares solamente porque son los nicos a los que va a afectar el medio en el que estn creciendo. La excepcin se encuentra en los hepatocitos (es el regulador de la concentracin sangunea de muchos metabolitos) y las clulas en cultivo. Contactos intercelulares especialmente durante el desarrollo embrionario. La sinapsis tambin pertenece a este grupo.

Protenas que modulan la transcripcinEn eucariotas, pueden actuar como reguladores tanto molculas de RNA como protenas. Entre las protenas, las hay que forman parte de la holoenzima polimerasa (los factores de transcripcin que se describen en el tema anterior), otras intervienen en la remodelacin de la cromatina y un tercer grupo se une al DNA para regular la transcripcin, que es el que nos ocupa.

1.- Los activadores transcripcionalesLos activadores son la protenas que se van a unir a los elementos distales (SDE y potenciadores) para activar la transcripcin. Son especficos de unos pocos promotores por lo que no estarn en todos los tipos celulares, reconocen entre 6 y 14 pb en el promotor y suelen tener dos dominios estructurales:

El dominio de unin a DNA (DNA binding domain) , que consta de 60 a 100 aminocidos consecutivos. El dominio de activacin de la transcripcin que consta de 30 a 100 aminocidos que no tienen por qu ser consecutivos. No tienen estructura definida. Hay tres tipos principales: 1. rico en Gln: por ejemplo el factor SP1 que vimos que se une a las cajas GC 2. rico en Pro: por ejemplo el factor CTF que se una a las cajas CAAT

3.

rico en residuos cidos: Gal4p y Gnc4p (activadores en levaduras) pierden su capacidad activadora cuando se eliminan los residuos cidos pero la mejoran cuando se mutan los residuos bsicos. Su capacidad activadora es superior que la de los otros dos tipos, y actan de forma heterloga.

La presencia de estos dominios las convierte en protenas modulares en las que el dominio de unin y el de activacin pueden funcionar independientemente.

2.- Coactivadores y correpresoresLa accin de un activador de transcripcin (o de un represor) puede ejercerse directamente sobre el complejo basal (bien sobre la RNA-polimerasa, alguno de los TFII o los TAFII), o a travs de una molcula intermediaria que puede ser un coactivador o un correpresor. Se denomina coactivador si ayuda a activar la transcripcin. Un mismo coactivador puede recibir seales de distintos activadores para transmitirlos hacia el complejo del promotor basal. Entre los coactivadores formados por una nica cadena polipeptdica estn los pertenecientes a la familia p160, como SRC-1 (coactivador del receptor de esteroides 1), GRIP-1 (el del receptor de glucocorticoides 1) y NcoA-1 (de los receptores hormonales nucleares 1). Entre los formados por varios polipptidos, los ms conocidos son Mediador (Mediator [MED]), TRAP/SMCC, PC2, DRIP, CRSP, NAT o ARC.

Se denomina correpresor si ayuda a inactivar el promotor. Los correpresores pueden tener actividad desacetilasa, con lo que hace que el DNA se una con ms firmeza a los nucleosomas, lo que inactiva el promotor porque no puede ser reconocido por los factores generales de transcripcin.

Entre los ms conocidos podemos encontrar SMRT (correpresor del receptor de hormonas tiroideas) y NCor (correpresor del receptor hormonal nuclear), formados por un nico pptido.

3.- TransactivadoresSon aquellos que directamente ejercen su accin interaccionando con el complejo de iniciacin formado en el promtor basal, bien sobre la propia polimerasa o, ms normalmente, sobre una de las TAF o de los TFII, para activar o reprimir la transcripcin, puesto que no son actividades exclulyentes. Uno de los requisitos para que un activador funcione como transactivador es que el sitio de reconocimiento se encuentre a menos de 200 nt del sitio de iniciacin de la RNA polimerasa II.

Pit-1 es un factor de transcripcin de la familia POU: se trata de una protena hometica que regula algunos genes especficos del desarrollo, al tener un dominio especfico POU y un homeodominio de unin al DNA. En el gen de la prolactina acta como un transactivador cuando reconoce su sitio de unin normal. Pero en el gen GH1 de la hormona de crecimiento, su sitio de unin contiene una TT en el centro, con lo que su dominio transactivador queda desorientado; en este caso acta comorepresor al interaccionar con el correpresor NCoR. Oct-1 es otro activador de la familia POU. Cuando se une a los sitios MORE, el dmero de Oct-1 acta como untransactivador relativamente dbil. En cambio, si el dmero se une a los sitios PORE, queda al descubierto el dominio de unin al coactivador OBF1, por lo que acta como activador. Curiosamente, los dominios encargados de reconocer a OBF1 son los mismos que intervienen en la dimerizacin de Oct-1 cuando se une a MORE.

Transduccin de las sealesLa transduccin de las seales es una cascada de protenas diversa longitud y complicacin cuya misin es transmitir al interior celular los mensajes que llegan desde el exterior, de manera que la clula active y reprima los genes correctos. Es diferente si la seal se reconoce en la superficie de la clula o es capaz de penetrar al interior. Uno de los campos donde ms se ha investigado sobre la transduccin de la seal son las clulas cancerosas. Para conocer ms en detalle las rutas que pueden desencadenar una tumorizacin, consulta el mapa del metro interactivo (necesita conexin a internet) o esttico que las esquematiza, por los puntos en los que se cruzan las distintas rutas, quin las desencadena y qu procesos se ven afectados.

Esta aproximacin puede resultar til para el estudio pero est bastante lejos de la realidad, puesto que en la clula existen numerosos componentes que interaccionan entre s para formar una Esta aproximacin puede resultar til para el estudio pero est bastante lejos de la realidad, puesto que en la clula existen numerosos componentes que interaccionan entre s para formar una red. Se trata de una una red heterogneay normalmente presenta un cierto nivel de jerarqua, adems de contener mdulos o bloques semiindependientes. Dos de las ms estudiadas son las de E. coli y la levadura Saccharomyces cerevisiae, en las que se logran superponer los reguladores y los regulados. Lo que ms hace diferenciar ambas redes es el diferente nmero de factores de transcripcin y de genes regulados en ambos organismos, o mejor an, en la diferente relacin entre genes regulados y factores de transcripcin: la relacin reguladores/regulados es tres veces mayor en la levadura.

En la red de factores de transcripcin que interaccionan con el DNA puede observarse que hay una serie de nodos clave que residen en las protenas TBP (1), la protena antitumoral p53 (2), histona acetiltranferasa (3), la protena del neuroblastoma (5), la subunidad p65 del factor nuclear NFB (6), c-jun (7), c-myc (8) y c-fos (9). Es de destacar que todas ellas intervienen en la aparicin de clulas tumorales.

En las plantas, la red de regulacin de los genes del metabolismo del nitrgeno est formada por procesos biolgicos diferentes, y estrechamente relacionada con el metabolismo del carbono. Resulta destacable que los nodos importantes sean, precisamente, factores de transcripcin tambin.

Mediante receptores en la superficie celularEn los casos en que la seal reconozca un receptor en la superficie celular, lo habitual es que este receptor medie la aparicin de segundos mensajeros como el cAMP y el fosfatidil-inositol (PI). Cuando el receptor desencadena la acumulacin de cAMP, una de sus dianas es la protena-cinasa A (PKA) que pasa de inactiva a activa, por lo que la subunidad cataltica es capaz de fosforilar una serie de protenas entre las que se encuentra CREB (CRE binding protein) que se activa y ahora reconoce las secuencias CRE (cAMP Response Element), activando los genes que la posean.

Mediante receptores nuclearesCuando la seal es liposoluble (como las hormonas esteroideas y tiroideas), es capaz de atravesar la membrana celular y llebar hasta su receptor en el ncleo y, en ocasiones, en el citoplasma. El receptor suele ser un dmero que recibe el nombre genrico de HRE (Hormone Response Element), y existe uno especfico de cada hormona. A veces son heterodmeros y ms raramente monmeros.

Cada subunidad contiene un dominio de unin al DNA (DBD) muy conservado y un dominio de unin al ligando (LBD). El DBD consta de dos dedos de Zn de tipo Cys2/Cys2. El primer dedo de Zn es el que reconoce realmente la secuencia y el segundo interviene en la dimerizacin, junto con el LBD. El LBD est formado por 11 a 14 hlices que forman un bolsillo hidrfobo en el que entra la hormona. El dominio de activacinest formado por dos regiones, una es la AF1 en el extremo N y la otra es la AF2 en el extremo C, que solo funciona si est unida la hormona.

Cuando se une la hormona, hay una hlice del LBD que rota y permite que interaccione con el coactivador o correpresor necesario por contacto con AF2 El receptor de las hormonas tiroideas (TR) puede actuar como represor si no tiene unida la hormona, al interaccionar con el correpresor N-CoR, SMRT o mSIN3. Acta como activador si est unido a la hormona, al interaccionar con el coactivador Mediador o bien CBP (CREB binding protein). En ambos casos reconoce la misma secuencia TRE (elemento de respuesta a hormona tiroidea) en el DNA. Si la secuencia que reconoce es un TRE negativo (N-TRE), funciona justo al revs, esto es, activa la transcripcin de los promotores con secuencias N-TRE sin la hormona, y los reprime cuando hay hormona.

Los receptores de los glucocorticoides (GR) se encuentran inactivos en el citosol unidos a otras protenas. Cuando se une a la hormona, se desprende de las dems protenas y forma un homodmero que acta como activador de la transcripcin si reconoce el sitio GRE (glucocorticoid receptor element, que forman parte de un potenciador) en forma de dmero, pero actan como represor si reconocen los sitios nGRE distintos a los anteriores y se unen a l como trmeros. Es probable que una de las subunidades de GR se la isoforma , que si est presente, el GR es incapaz de activar.

PotenciadoresLa mayora de los ejemplos anteriores son reguladores del tipo SDE (secuencias distales especficas). Pero la fuente de regulacin ms potente es al de los elementos distales: los potenciadores (enhancers o intensificadores). Su funcin es la de amplificar la transcripcin del promtor incluso ms de 1000 veces. Los hay especficos del tejido slo activan la transcripcin de su gen en determinados tejidos ,especficos de la etapa de desarrollo un grupo importante de estos son los que intervienen en la segmentacin y son regulados por los genes hometicos e inducibles por alguna seal externa como hormonas, metales pesados, choque trmico, infeccin viral, etc. Necesitan la mediacin de un coactivador. Los activadores son ms o menos especficos de cada potenciador, y reconocen secuencias de 6 a 14 pb. Un potenciador tpico tiene unas 500 pb que comprenden del orden de 10 sitio de unin para al menos 3 factores de transcripcin especficos, de los cuales frecuentemente dos son activadores y uno es represor. Es comn que los potenciadores no se atengan a un modelo sencillo, ya que:

la mayora contienen varias secuencias de reconocimiento para ms de un activador (recordar el caso del elemento de respuesta a estrgenos visto en el tema anterior); la misma secuencia de reconocimiento puede ser reconocida por ms de un activador, aunque en este caso, cada activador se sintetiza en distintos tipos celulares; distintos potenciadores comparten secuencias de reconocimiento para el mismo activador transcripcional. varios potenciadores puejen ejercer su accin a travs del mismo coactivador

Los distintos potenciadores de un gen actan de manera independiente unos de otros para asegurar la expresin compleja del gen. Puesto que un potenciador puede actuar a distancia y en cualquier sentido, existen unos elementos denominados aisladores (insulator) que sirven de barrera para que el potenciador no ejerza su accin ms all de l.

Para que un intensificador pueda actuar, se han de seguir las siguientes etapas:1. Unin de los factores de transcripcin a los elementos basales (fundamental) y proximales (prescindible) del promotor Unin del activador transcripcional a su secuencia diana en el potenciador. Contacto del dominio activador con el coactivador (por ejemplo, el Mediador) para modular los elementos basales normalmente a travs de las TAF de TFIID el que contiene la TBP. Si el potenciador est muy lejos, el DNA debe doblarse para acercar ambas regiones.

2. 3.

Cuando se produce la interaccin, se estimula o aumenta la afinidad de la RNA-polimerasa II y los TFIIx por el promotor y, en consecuencia, se generan ms mRNA. Cuando un potenciador puede actuar, si los aisladores se lo permiten, sobre varios promotores, no acta por igual sobre ellos, sino que tiene preferencias debido a las secuencias que existen en el promotor y las protenas que en ese momento se encuentran unidas a l. Los activadores que se unen a los potenciadores tambin reclutan protenas modificadoras de las histonas como la histona-acetiltransferasa (HAT) y otras protenas de remodelacin de la cromatina. De esta forma se hace que otros sitios de unin queden accesibles en el DNA y se relaje su condensacin. Se ha visto que el TFIID reconoce mejor el DNA con nucleosomas acetilados que sin acetilar.

Los genes GAL de levaduras como ejemplo de activacinLos genes GAL producen enzimas encargadas de metabolizar la galactosa en Saccharomyces cerevisiae. Dos de los genes, GAL1 y GAL10, se transcriben de forma divergente y se regulan coordinadamente por la misma UAS (los potenciadores se denominan UAS en levaduras).

Gal80p es una protena que se une a Gal4p bloqueando su funcin activadora. La UAS posee 4 sitios para la unin de GAL4p. La secuencia consenso es un palndromo de 17 pb. De hecho, la secuencia responde a lo esperado sabiendo que Gal4p es un homodmero, y la distancia de DNA que reconoce es de aproximadamente dos vueltas de hlice (unos 20 nt). El producto del gen GAL4 (Gal4p) es un homodmero con funcin transactivadora que se une a la UAS. Se conocen con exactitud la posicin de los distintos dominios funcionales de Gal4p: unin al DNA, dimerizacin, activacin de la transcripcin, y unin a Gal80p. Estas cuatro funciones son separables en la secuencia de Gal4p:

El dominio de unin al DNA de cada monmero de Gal4p es capaz de unirse a la secuencia consenso, pero incapaz de activar la transcripcin. Su estructura es similar a un dedo de Zn pero con 6 Cys coordinadas a 2 tomos de Zn: cada Zn se coordina con 4 de las 6 Cys, por lo que hay 2 Cys que estn coordinando a la vez a ambos Zn. La secuencia palindrmica que reconoce en el DNA es CGGN11CCG entre las posiciones 98 y 148 est el dominio de dimerizacin del tipo hlice arrollada (coiled coil). Consiste en 2 hlices que se unen paralelamente (y tambin un poco retorcidas entre s) gracias a las interacciones hidrofbicas que se producen entre 3 pares de Leu y un par de Val. Se trata de unacremallera de leucinas (Leu-ZIP). Desde la posicin 768 hasta 881 es capaz de actuar como activador, aunque lo hace mejor si est tambin la regin 148 a 196. Este dominio activador es de naturaleza cida. Ya que el dominio de unin de Gal80p y el de activacin son solapantes, est claro que la unin de Gal80p enmascara el dominio activador cuando ambos estn unidos.

Moviendo la imagen interactiva de la derecha se puede analizar la estructura del DNA unido al dmero de Gal4p (slo la parte del dominio de unin al DNA y el Leu-ZIP). Para conocer en ms profundidad la interaccin entre ambas molculas, consulta la gua de la interaccin Gal4p-DNA (necesitars tener instalado Chime en tu navegador). Gal4p y Gal80p forman un heterotrmero incapaz de activar la UAS, a pesar de que se encuentre unida a ellos. Cuando en el medio aparece galactosa esta molcula se une a Gal3p, una pequea protena que acomplejada a la galactosa tiene afinidad por Gal80p. La asociacin de Gal3p a Gal80p le hace cambiar de conformacin a Gal80p, por lo que ahora permite que el dominio activador de Gal4p active la transcripcin.

Tcnica relacionada: el doble hbridoLa modularidad de los activadores de transcripcin ha permitido realizar hbridos LexAp-Gal4p que permiten variar la especificidad del activador. Cuando se transforma levadura con estas protenas en presencia de DNA modificados por ingeniera, que contengan UASGAL4 (la UAS que reconocer GAL4) o el operador de LexA, slo se observa activacin cuando en el DNA est la secuencia reconocida por el dominio de unin. Se deduce que el dominio de unin de DNA sirve para llevar la protena a su sitio adecuado, para que, una vez all, el dominio de activacin ejerza su accin. La capacidad de estos dominios de funcionar en las protenas hbridas sugiere que cada dominio es capaz de plegarse independientemente y formar una estructura activa. La ventaja de utilizar un hbrido LexA-Gal4 reside en que solo se activar la construccin a la que se le haya puesto artificialmente el operador de LexA, mientras que el GAL4 original reconocer no solo la quimera con la UASGAL4, sino tambin la UASGAL4 del gen endgeno natural.

Gracias a los experimentos anteriores, se desarroll una tcnica que serva para para estudiar interacciones entre las protenas.

En una levadura se integra en el genoma una construccin en la que un gen delator tiene un sitio de unin especfico a un activador en su promotor (por ejemplo, la secuencia de LexAp o de Gal4p). En esta levadura se introduce un plsmido que fabricar una protena quimrica (hbrida) que contiene en el extremo amino un DBD (DNA Binding Domain) que reconocer el sitio de unin de nuestro gen delator. EL DBD estar fusionado a la protena (verde) que nos interesa conocer con quin interacciona. En otro plsmido se introduce otra protena de fusin entre un dominio activador (AD) y una protena desconocida (amarillo). Si la protena desconocida y la de inters interaccionan, se formar un dmero que reconoce el sitio de unin y es capaz de activar la transcripcin del gen delator.

Silenciamiento gnicoLa unin inespecfica de protenas reguladoras es un problema importante en los organismos con genomas grandes. Para combatirla, los eucariotas han hecho que los genes tengan en torno a 5 dianas para protenas reguladoras diferentes. Esta estrategia es til para los activadores de la transcripcin

porque es una estrategia eficiente y ahorra esfuerzo. Una estrategia similar no es factible con los inhibidores de la transcripcin, por lo que la regulacin por silenciamiento sirve para objetivos distintos que la activacin. El silenciamiento de un gen puede ocurrir por:

la inactivacin por interaccin con un regulador el silenciamiento gnico postranscripcional (PTGS, tambin denominada cosupresin o extincin gnica) la metilacin del DNA en los vertebrados (directamente ligada al superenrollamiento y al silenciamiento).

Inactivacin mediante una protena reguladoraSe consigue uniendo una protena reguladora a cualquiera de los distintos elementos que forman los promotores.Los que reconocen los elementos distales el silenciador especfico de tejido (tse): se encarga de silenciar en cualquier clula los genes que son especficos de clulas hepticas las hormonas esteroideas comentadas anteriormente el gen Pit-1 comentado antes Los que reconocen los elementos proximales la protena CDPC: recibe el nombre de desplazamiento de CAAT porque impide que la caja CAAT sea reconocida por sus protenas especficas Los que reconocen el promotor basal el represor global Dr1/DRAP1: es un heterodmero que se une a la TBP para evitar que interacte con TFIIB. Curiosamente, las mutaciones de esta protena son letales para las clulas.

Algunos de estos represores acaban silenciando los genes porque reclutan histona-descacetilasas (HDAC) e histona-metilasas, que hacen que el DNA se compacte con ms fuerza y se reprima la transcripcin del gen.

PTGS: silenciamiento gnico postranscripcionalConsiste en la degradacin especfica de los mRNA complementarios de una de las hebras del dsRNA. Se ver que existen analogas u homologas entre este mecanismo eucaritico y los sRNA que se describieron en los procariotas. Los mRNA eucariticos degradados suelen ser transcritos aberrantes de diversos orgenes. Tambin se denominacosupresin o extincin (quelling). Este RNA aberrante es sustrato de una RNA-polimerasa dirigida por RNA que genera una larga molcula de dsRNA, conocida con el nombre dedsRNA detonante. Esta RNA-polimerasa dirigida por RNA est codificada por la propia clula en las plantas, protozoos, hongos y nemtodos, pero an no se ha encontrado en los insectos ni en los invertebrados.

El dsRNA detonante lo fragmenta la ribonucleasa Dcer (troceadora) en una serie de dsRNA de 21 a 25 nucletidos de longitud denominados RNA interferentes pequeos (siRNA). Este siRNA se asocia a una serie de protenas para formar el complejo RISC (RNA-induced silencing complex). En este complejo, una de las hebras del siRNA sirve de gua para localizar cualquier mRNA complementario presente en la clula con vistas a su destruccin mediante una endorribonucleasa del complejo RISC (tentativamente llamada slicer, rebanadora). El hecho de que muy poca cantidad de RNA inicial consiga el silenciamiento total de los mensajeros se debe a que existe una RNA-polimerasa dirigida por dsRNA que es capaz de amplificar los dsRNA que se van formando. De esta manera, hay suficiente siRNA para formar complejos RISC activos que degraden el RNA diana. Se trata de un mecanismo extremadamente conservado entre los organismos eucariotas (protozoos, mamferos, plantas, peces, insectos, hongos, invertebrados y seres humanos) por lo que puede tratarse de un mecanismo de regulacin y defensa que tuvo su origen en el mundo RNA. Desempea un papel fundamental en varios procesos celulares:

Defensa contra la invasin de cidos nucleicos intrusos (normalmente virus) Integridad del genoma, ya que reprime la transposicin de los elementos mviles Destruccin de mRNA aberrantes que generaran desconcierto intracelular Regulacin mediante RNA horquillado y microRNA Mantenimiento de las zonas superenrolladas (heterocromatina) del genoma (vase ms adelante en el silenciamiento por metilacin).

Mientras en algunos organismos (por ejemplo, en las clulas humanas) se manifiesta como un fenmeno transitorio (que cesa con la desaparicin del dsRNA exgeno desencadenante), en otros (plantas y nematodos), se amplifica y difunde hacia el resto de las clulas del organismo, y puede llegar a ser heredable, al menos por algunas generaciones (en Drosophila y en los nematodos, pero no en las plantas).

La estructura de la RNA-polimerasa dirigida por RNA es dimrica y comprende varios dominios cuya topologa resulta sorprendentemente similar a la del ncleo cataltico de las RNA-polimerasas dirigidas por DNA (la tpica de la transcripcin). Esto tambin apoya el que las vas de transcripcin y replicacin funcionaban en el mundo RNA primigenio: el RNA se autorreplicaba hasta que aparicin la primera RNApolimerasa dirigida por RNA. Varios fenmenos de duplicacin llevaron luego a la aparicin de las diferentes RNA-polimereasas y la posterior divisin de estos pptidos en subunidades ms pequeas (el origen de las subunidades de la holoenzima polimerasa).

Silenciamiento por metilacinNo todos los organismos tienen el DNA metilado, aunque s todos los vertebrados. En los mamferos, el DNA metilado forma heterocromatina a la que no pueden acceder los factores de transcripcin. Por tanto, los genes metilados no se pueden transcribir ni tan siquiera residualmente. Se trata de un mecanismo muy eficaz de silenciamiento gnico que, adems, disminuye la cantidad de DNA que los factores de transcripcin y la RNA-polimerasa tienen que rastrear para buscar los promotores. Algo menos del 5% de las citosinas se encuentran metiladas en el genoma. De ellas, la ms abundante es la 5-metil-citosina. Esta metilacin aparece casi exclusivamente sobre la secuencia CG en lo que se denomina islotes CpG. Los islotes CpG son secuencias de aproximadamente 1 kpb cuya riqueza en el doblete CpG es mayor que en el resto del genoma. Los genes se expresan muy intensamente cuando sus islotes CpG estn poco metilados (hipometilados), mientras que no se expresan si estn hipermetilados. Pruebas de la importancia de la metilacin del DNA:

Cuando se transfectan clulas en cultivo con DNA metilado, el gen transfectado no se expresa, pero s se expresa si no est metilado. En las hembras de mamferos, el cromosoma X activo est hipometilado, mientras que el inactivo est hipermetilado.

Es frecuente que en los diploides, el alelo que no se expresa tenga su DNA promotor metilado, mientras que est hipometilado el que se expresa, y se denomina sellado gnico (genomic imprinting). Cada tejido presenta un patrn de metilacin diferente en sus clulas que se consigue y conserva durante el desarrollo embrionario gracias a las metilasas de mantenimiento (como DNMT1), que utilizan como molde las metilaciones en CG. La actividad desmetilasa es muy abundante en clulas tumorales por lo que su DNA est globalmente hipometilado. Por eso se expresan genes que deberan estar silenciados. Es cambio, se encuentran hipermetilados (muy reprimidos), los genes supresores de tumores.

Es muy frecuente que a este tipo de regulacin se le denomine regulacin epigentica. La metilacin consigue inactivar por dos vas distintas:

1- TGS: silenciamiento gnico transcripcionalSirve para detectar la expresin de genes o secuencias que deberan estar silenciados. Se produce cuando los siRNA se unen al complejo RITS (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing) en vez del al RISC (lo que llevara a la PTGS). Los siRNA tienen que ser complementarios a secuencias promotoras o no codificantes. EL complejo RITS-siRNA migra al ncleo y metila el DNA genmico en estas secuencias, esto es, en los promotores, de manera que se generan nuevos patrones de silenciamiento o se metilan zonas en las que se ha detectado transcripcin indeseada.

2.- Interaccin con factores de transcripcinEl mecanismo molecular de la represin por metilacin puede producirse por dos vas no excluyentes:1. 2. que los islotes CpG metilados se estructuren en forma de DNA-Z, por lo que los factores de transcripcin no reconoceran estos promotores; que sean reconocidos por las protenas MeCP1 y/o MeCP2 que impiden la transcripcin del gen. La presencia de estas protenas impide la transcripcin, bien porque bloquean el avance de la polimerasa, bien porque impiden la unin de los factores de transcripcin.

En el caso del sellado gnico (genetic imprinting), la situacin es completamente diferente. El caso ms conocido es el de los genes Igf2 y H19 de los humanos. Solo se expresa la copia materna de H19 porque no est melitado y se ve activado por la presencia de un potenciador. La presencia de un aislador hace que el potenciador no afecte al gen Igf2 y no se exprese en este cromosoma de origen materno. En el cromosoma prodecente del padre, el gen H19 y el aislador (ICR) se encuentran metilados, por lo que no se expresa, pero el potenciador ahora s puede ejercer su accin sobre Igf2, que s se expresa en este cromosoma.

Tcnica: ribointerferencia o interferencia por RNA (RNAi)Se sintetizan in vitro dsRNA cortitos (de 22 a d5 nt de longitud) con la misma secuencia del gen que se pretende silenciar, o en su defecto se transforman las clulas con uno de estos vectores que permite construir in vivo el dsRNA desencadenante del silenciamiento gnico de los genes homlogos a l. De esta manera se puede inhibir especficamente la expresin de un gen determinado. Se utiliza mucho en la tecnologa genmica. Esta tcnica se est utlizando corrientemente para:

Expresar RNA pequeos, como el shRNA, el snRNA U6 u otros. Bloquear los genes a escala genmica (algunos labos han conseguido bloquear 1715 genes en 16 meses). Silenciar genes para luchar contra ciertas enfermedades o el cncer. Enviar el siRNA inyectado slo a determinadas clulas. Determinar las dianas de los frmacos por inhibicin del gen diana. Producir transgnicos para suprimir un gen.

Esta tcnica ya ha salido del mero mbito de laboratorio y se est empleando en la medicina clnica. El primer tratamiento que se aprob fue para luchar contra la degeneracin macular debida a la edad que hace perder la vista a millones de adultos al ao, y ya tambin se usa para combatir virus como el HIV y los de la hepatitis, entre otros. Pero los tratamientos contra el cncer y las enfermedades neurodegenerativas estn todava en curso. Para las aplicaciones clnicas, los siRNA que se introducen tal cual (no en vectores) y tienen algunas o varias de las caractersticas siguientes:

modificaciones para aumentar su especificidad por la diana (por ejemplo, introducir 2-Ometil-purinas o 2-fluoropirimidinas) modificaciones para aumentar la estabilidad de los extremos de la horquilla y producir una estructura que sea un buen sustrato de Dicer. encapsulacin en liposomas o conjugacin con colesterol para que alcancen el intestino o el hgado cuando los siRNA se inyectan por va intravenosa conjugacin con Fab de anticuerpos que reconocen una protena en la clula de destino; por ejemplo, la protena de superficie del HIV que se aparece en las membranas de las clulas infectadas conjugacin con un pptido que reconoce el receptor de la acetilcolina para luchar contra el virus de la rabia, y otros aptmeros que se unan a marcadores especficos de la membrana de las clulas a tratar.

Llegado este punto, ya sabemos lo que son y lo que abundan los distintos tipos de DNA, incluida la heterocromatina constitutiva. Por eso conviene revisar el esquema de la composicin del genoma humano que se vio en el tema 8