Tipos de alteraciones del DNASe consideran alteraciones todos aquellos procesos en los que el DNA es sustrato de la reaccin y no molde. Adems, al final del proceso el DNA resultate es distinto al DNA inicial. Restriccin: mediante actividades metilasa y endonucleasa se protege el DNA propio del forneo. Recombinacin: se redistribuyen o reorganizan dos molculas de DNA Reparacin: corrige aquellos errores introducidos en la secuencia del DNA. Transposicin: es un tipo especial de recombinacin con el que se consigue cambiar de posicin un DNA, o sea, reorganizarlo, y en otras lo que hace es amplificarlo.

RestriccinSe descubri estudiando por qu una clula restringe el tipo de huesped que acoge (esencialmente virus) y la modificaciones que sufren los DNA que han sido restringidos (experimentos de Werner Arber en los aos 60 en la Universidad de Ginebra, en los que acu los trminos restriccin y modificacin): Se vio que el fago infectaba muy eficazmente la cepa K12 de E. coli, pero muy poco la cepa B, ya que la mayor parte del DNA del fago infectante se degradaba en las infecciones no productivas. Sin embargo, los fagos aislados de la cepa B s eran capaces de infectarla con gran eficacia, pero infectaban mal la cepa K.

Para defenderse de la restriccin de su propio DNA, los procariotas metilan las secuencias que reconocen las restrictasas y forman las N6-metil-A y N4-metil-C. En los aos 70, Hamilton Smith descubre que las restrictasas son endonucleasas con sitios de corte preciso y repetible. No poda imaginar la importancia biotecnolgica de su hallazgo. Los fragmentos de restriccin separados por electroforesis en gel pueden colocarse de manera ordenada para obtener mapas fsicos de las molculas de DNA (mapas de restriccin). Daniel Nathans fue el primero en obtener uno, en 1971. Arber, Smith y Nathans recibieron el Nobel en 1978 por estos trabajos. Segn la naturaleza de la metilasa y la restrictasa se pueden definir distintos sistema de restriccin. Tipo I La actividad metilasa y nucleasa se encuentran en la misma molcula proteica, formada por tres subunidades (la tercera sirve para reconocer la secuencia de corte). El sitio reconocido es al azar y el corte se produce a bastante distancia (hasta 1.000 pb) del sitio de reconocimiento, gastando mucho ATP. Tipo II Son las que ms utilidad han tenido en investigacin por cortar dentro de la secuencia de reconocimiento. La metilasa y la nucleasa son protenas distintas. Se conoce la estructura tridimensional de muchas de ellas, como EcoRI acomplejada al DNA que reconoce. Tipo III La actividad metilasa y nucleasa tambin residen en una nica protena, pero formada por tan solo 2 subunidades. No gastan ATP en la hidrlisis, que se produce ms cerca del lugar de reconocimiento (a 25 pb). Tambin se ha descubierto un sistema de restriccin distinto: se trata del sistema McrA, McrBC y Mrr que digiere el DNA metilado siempre que la metilacin no provenga de una de la metilasas de la clula. Se ha visto que inactivar este sistema es muy importante para introducir con eficacia fragmentos de DNA genmico grandes en las bacterias. 1.- Metilacin del DNA En los procariotas se puede encontrar modificada menos de un 1% de las A y las C en forma de N6-mA y N4-mC en sitios especficos. En los eucariotas hay ms metilacin: se metilan entre un 3% y un 5% de las C en sitios no especficos y en relacin con la inactivacin gnica El papel principal de la metilacin en procariotas est ligado a los fenmenos de restriccin, y un poco a la regulacin de la replicacin. En los eucariotas, la metilacin determina el control de la replicacin y la transcripcin (aunque los insectos no metilan el DNA); as, la mayora de los genes eucariticos se reprimen cuando estn hipermetilados y se expresan cuando estn hipometilados. En procariotas la metilacin la realizan las metilasas de los sistemas de restriccin y las dam as como las Mcr. En cambio, en eucariotas lo realizan las metilasas de mantenimiento y algunos de los procesos de ribointerferencia.

2.- Sistema de tipo II Fue el primero que se descubri. La nucleasa tiene una masa entre 30 y 40 kDa, necesita Mg (no ATP), y la metilasa ha de asociarse a la nucleasa para reconocer el sitio especfico. Sobre DNA hemimetilado por ejemplo, tras la replicacin, acta antes la metilasa que la nucleasa; si actuara la nucleasa, slo cortara en la cadena sin metilar. El sitio reconocido es casi siempre palindrmico, dentro del que se suele producir un corte asimtrico que provoca extremos protuberantes en 5' o en 3', que tambin se denominan extremos cohesivos. A veces el corte es simtrico y se liberan extremos romos.

En 1986 John Rosenberg cristaliz la primera enzima de restriccin (EcoRI) acomplejada a un oligonucletido bicatenario que contena la secuencia de reconocimiento. La secuencia del DNA se reconoce por el surco mayor y la protena tiene un brazo N-terminal que envuelve el DNA. La secuencia es reconocida por 12 puentes de hidrgeno entre las purinas y 2 Arg y un Glu. Las dos bases centrales del sitio reconocido sufren un empuje hacia el surco menor, lo que hace que no estn apiladas con las dems. El otro monmero de la enzima reconoce lo mismo, pero en la otra cadena. Esta afinidad provoca el acercamiento de los nucletidos reconocidos especficamente, por lo que se debilitan los enlaces fosfodister en esa regin facilitndose, por tanto, su corte. En el caso de EcoRV, el reconocimiento se produce por el surco menor

3.- Aplicaciones de las enzimas de restriccin

La cartografa (mapeo) de genomas, que comenz con el mapa fsico de pequeas molculas de DNA a comienzos de los 70. Sirve para localizar genes en un genoma en distancias reales en lugar de genticas. En 1973 Herber Boyer y Stanley Cohen se dieron cuenta de que podan utilizar las enzimas de restriccin para clonar un gen mediante la ligacin del DNA interesante a un plsmido que dirigiera su autorreplicacin. Esto fue el origen del DNA recombinante.

La bsqueda de los recombinantes deseados se facilita con nuevos vectores (plsmidos) con numerosos sitios de restriccin adecuados, marcadores de fcil seleccin, y que sirven para la expresin del gen clonado. Produccin industrial: mediante el DNA recombinante y los nuevos vectores de expresin, se ha conseguido en la industria farmacutica purificar insulina humana expresada en bacterias. Se consigui en 1977 y se consigui comercializar en 1982 (Humulina). Factores de coagulacin, hormona de crecimiento o interferones son otras molculas que hoy en da tambin se fabrican as. Mutagnesis dirigida en la que se modifica un nucletido en una secuencia clonada en un plsmido. Hoy se realiza por PCR.

Reparacin Tanto por daos fsico-ambientales como por errores de sntesis, las biomolculas pueden sufir alteraciones qumicas. Puesto que el DNA no puede recambiarse como otras biomolculas ya que permanece intacto de una divisin a otra, la estabilidad de la molcula se consigue mediente dos maquinarias: la fidelidad de la replicacin y la reparacin de daos. Los mecanismos de reparacin se van a clasificar en 5 grupos principales: 1. 2. 3. 4. 5. Reparacin directa Reparacin por escisin de nucletidos (REN) Reparacin por escisin de la base (REB) Reparacin de apareamientos errneos (mismatch) Sistemas de recuperacin: reparacin por recombinacin y respuesta SOS

Los agentes que causan daos en el DNA tienen distintos orgenes. Por una parte, estn las alquilaciones (metilaciones principalmente), las desaminaciones, la oxidacin y los rayos UV. La acumulacin de mutaciones en clulas somticas es el origen de muchos cnceres y las clulas cancerosas reparan mal las mutaciones. Por eso muchos tratamientos antineoplsicos sobre la base de inducir mutaciones que los tumores no saben reparar. Un caso que se ver es la xerodermia pigmentaria. La tasa global con la que se producen mutaciones espontneas oscila entre 106 y 10 11 nt por ronda de replicacin. Existen puntos calientes donde surgen con ms frecuencia y otros donde son bastante escasos, comolos microsatlites(repeticiones de dos, tres o cuatro nucletidos durante al menos 12 nt). Por ejemplo, los microsatlites CA en los humanos son sitios donde la polimerasa tiende a resbalar con frecuencia, por lo que aumenta o disminuye el nmero de repeticiones CA de esa regin. Por eso se utilizan mucho como marcadores moleculares (por su elevado polimorfismo) y se ha visto que son responsables de enfermedades, como el sndrome del cromosoma X frgil o la enfermedad de Huntington. Los sistemas de reparacin se vern con detalle en los procariotas, pero a continuacin puede verse una representacin general de los mismos en los eucariotas, donde puede verse que BRCA1 y p53 son un punto clave del mecanismo. Existen ms de 130 genes de reparacin implicados en alguna enfermedad.

Reparacin directa Se trata de una reparacin en la que solamente se cambia la base nitrogenada daada, en lugar de eliminar una zona ms o menos extensa. Son dos los mecanismos que se conocen: Fotorreactivacin y la eliminacin de la O6-alquil-guanina. 1.- Fotorreactivacin La luz UV en torno a los 260 nm (que es donde absorbe el DNA) provocan serias mutagnesis en el DNA debido a la formacin de fotoproductos. Los ms importantes son los dmeros de timina formados por dos T consecutivas en la misma hebra y el fotoproducto 6-4 formado por dmeros pirimidina-pirimidina (principalmente timina-citosina). La fotoliasa (55-65 kDa) es la enzima que, tomando energa a partir de la luz, la convierte en energa qumica a travs de dos cromforos (uno el FAD y otro especfico de especie) elimina estos dmeros. El mecanismo de reaccin sera anlogo a la fotosntesis, de manera que el cromforo variable capatara la luz y el FAD sera el centro de reaccin fotoqumica transferencia de un electrn al ciclobutano.-

Las clulas humanas no tienen esta actividad fotoliasa, aunque muchos otros procariotas s, por lo que es la capa de ozono la nica defensa contra el UV con que contamos: de ah la importancia de mantenerla intacta. 2.- Reparacin de O6-alquil-guanina Las bases modificadas por alquilacin son principalmente las purinas y a veces los O de los fosfatos. El ms peligroso de ellos es la O6-alquil-guanina por su capacidad de aparearse con la timina. La eliminacin de este derivado se debe a una enzima poco habitual: la O6-alquilguanina alquiltransferasa, que cataliza la transferencia del alquilo (metil o etil) a una Cys del centro activo de la enzima.

Esta forma modificada acta como activadora de los sistemas de reparacin celular.

Reparacin por escisin de nucletidos (REN) Este sistema acta principalmente sobre genes transcripcionalmente activos, por lo que a veces se dice que est acoplada a la transcripcin. En este tipo de reparacin, se eliminan de la cadena daada una serie de nucletidos que posteriormente se rellenan con una DNA polimerasa y una DNA ligasa. Se descubri al observar que las bacterias eran capaces de eliminar los dmeros de T en la oscuridad.

Los genes procariticos que intervienen son los uvr. Antes tambin se inclua uvrD, pero hoy se sabe que es una helicasa II que interviene en ms procesos de reparacin. UvrA2B reconoce el dao. Despus UvrA2 se disocia del complejo y entra UvrC que corta la cadena daada unos 3-5 nt hacia el lado 3 del dao y luego unos 7-8 nt hacia 5, dejando unos 10-13 nt entre ambas mellas, un 3-OH y un 5-fosfato. Esta ruptura gasta ATP.

Finalmente se une UvrD que es una helicasa II necesaria para eliminar el fragmento monocatenario que quedan entre ambas mellas. La accin de la DNA polimerasa I seguida de una ligasa rellena el hueco dejado y sella la cadena. Por su mecanismo de accin tan peculiar, el complejo uvrABC se denomina escinucleasa. En los mamferos intervienen 16 pptidos para cortar en -22 y +6 respecto a un dmero de timina. Dos endonucleasas distintas cortan a cada lado del dao. El complejo contiene su propia actividad helicasa y tambin las subunidades encargadas de reconocer la lesin. Tambin interviene el factor de transcripcin TFIIH, que se piensa que es el nexo de unin con la maquinaria de transcripcin, El rellenado lo realizan las polimerasas . La enfermedad de la xerodermia pigmentaria que hace la piel muy sensible a la luz y al cncer de piel se debe a mutaciones en alguno de los 16 pptidos que intervienen en este proceso.

Reparacin por escisin de base (REB) Este proceso puede implicar la escisin de nucletidos, pero a diferencia de REN, REB siempre comienza con la escisin de la base modificada por la hidrlisis del enlace Nglucosdico. Este proceso siempre comienza con una escisin de la base modificada por la hidrlisis del enlace N-glucosdico. Implica la accin de una DNA-N-glucosidasa para eliminar la base modificada y una endonucleasa para eliminar la ribosa sin base. Se han identificado varias glucosidasas que hidrolizan especficamente ciertas bases modificadas.

En caso de que el error sea la aparicin de un dmero de timina se rompe el enlace Nglucosdico de la T en 5' del dmero (reparacin REB) pero luego se elimina el nucletido que se queda con las dos T. En los eucariotas superiores, la reparacin la realiza la DNA-polimerasa cuando se elimina slo el nucletido absico, mientras que interviene la DNA-polimerasa o si se elimina un fragmento ms largo. Un caso tpico se produce cuando en el DNA una T se convierte en U de manera que la uracil-DNA-N-glucosidasa (color turquesa) elimina la (color verde) que se encuentra apareada con una A (color claro). En primer lugar separa el U del DNA (blanco/amarillo) para luego hidrolizarlo y dejar una (rojo) . Por la accin de unaendonucleasa de apirimidinas se rompe el enlace fosfodister, generndose una mella delante de la base apirimidnica. La DNA polimerasa I repara el DNA. Una ligasa finalmente sella la molcula. Este tipo de reparacin tambin se encarga de eliminar los daos oxidativos del DNA, principalmente la formacin de 8-oxo-guanina por la accin de las especies reactivas de oxgeno producidas en la fotsintesis y la cadena respiratoria. Para su reparacin existe una nucletido-hidrolasa que lo elimina antes de que pueda ser utilizado para replicar el DNA. En E. coli, los genes mutM (elimina la oxo-G), mutY (elimina la A que puede aparecer apareada a la 8-oxo-G) y mutT(hidroliza 8-oxo-dGTP en 8-oxo-dGMP y PPi). A pesar del nombre, estos genes no tienen nada que ver con la reparacin de apareamientos errneos. Reparacin de apareamientos errneos Con este mecanismo se elimina la presencia de bases sin aparear o cuyo apareamiento no implique puentes de hidrgeno de tipo Watson y Crick (mismatch). Puede deberse, por ejemplo, a errores de replicacin o a la desaminacin de la 5-metil-C para dar T. En E. coli se sabe que los genes mutH, mutL y mutS son los responsables de esta reparacin. Originalmente se crea que tambin intervena mutU, pero se ha visto que es el mismo gen que uvrD, esto es, la helicasa II. MutS2, con gasto de ATP, recorre el DNA en busca de apareamientos incorrectos o prdidas/aumentos de una base inmediatamente despus de la replicacin. Se asume que la base errnea es la que est en la cadena sin metilar en GmATC por la accin de la metilasa Dam. MutS2 se une al error con un dominio diferente al usado para recorrer el DNA. Luego se aade MutL2, de manera que MutL2S2 se mueve en ambas direcciones del DNA hasta encontrar el 5'GATC ms prximo. Entonces se una la endonucleasa de MutH y corta la cadena no metilada entre GATC y el complejo Mut. Ahora entra la helicasa II para desplazar la cadena recin sintetizada, y una exonucleasa que digiere esta cadena, con lo que queda un hueco en el DNA que lo rellena la DNA polimerasa III. Si el sistema de reparacin llega demasiado tarde y Dam ya ha metilado la hebra hija, este sistema de reparacin pierde el 50% (por probabilidad) de su eficacia. Este sistema aumenta 100 veces la fidelidad de la replicacin.

En los eucariotas existen 6 homlogos de MutS (genes MSH) y 5 de MutL (genes MLH y PMS), que forman heterodmeros para reconocer distintos tipos de errores. En las levaduras, el heterodmero MSH2-6 reconoce errores que implican una base y el MSH2-3 los que implican a 2-4 nt. En los humanos se ha visto que la predisposicin al cncer de colon reside en una mutacin en un MSH. Como no hay metilacin de tipo dam en los eucariotas, esta reparacin reconoce la cadena recin sintetizada gracias a que los MSH y MLH interaccionan directamente con la PCNA de la horquilla de replicacin. Adems, en el caso de la cadena retrasada, el ltimo fragmento de Okazaki hara las veces de la mella que introduce MutH.

Para ver el mecanismo, consulte la pgina del FISHEL Lab. Al menos in vitro, se ha demostrado que es la DNA-polimerasa la que se usa en este proceso de reparacin (JBC 1997, 272:10917-10921). MISMATCH REPAIR DNA mismatch repair (MMR) is responsible for the recognition and repair of mispaired nucleotides. Mispaired bases in DNA can occur as a result of chemical or physical DNA damage, polymerase errors during DNA replication, or recombination between nonhomologous parental DNA sequences. The most widely studied system for MMR is the DNA Adenine Methylation (Dam)Instructed pathway of Escherichia coli. The Dam-Instructed pathway promotes a longpatch (approximately 2 kilobases) excision repair reaction which is genetically dependent on the mutH, mutL, mutS and mutU(uvrD) gene products. Discrimination of the newly replicated DNA strand from the original template DNA strand is dependent on transient undermethylation of the adenine nucleotide within a GATC Dam sequence. The MutHLS pathway appears to be the most active MMR pathway in E. coli and is known to increase the fidelity of DNA replication and to act on recombination intermediates containing mispaired bases.

This system has been largely reconstituted in vitro and requires the MutH, MutL, MutS and UvrD (helicase II) proteins along with DNA polymerase III holoenzyme, DNA ligase, single-stranded DNA binding protein (SSB) and one of the single-stranded DNA exonucleases, Exo I, Exo VII, RecJ or ExoX. Conservation of MMR Genes from Bacteria to Man MutS homologs (MSH) and MutL homologs (MLH/PMS) have been conserved throughout evolution. While there is a single MutS and MutL in bacteria, there are at least five MSH and four MLH in eukaryotes, which includes humans. In bacteria MutS and MutL operate as homodimers.

Bacteria

Yeast

Human Human Function Locatio HNPC Heterodime n C r N/A 2p21 16.3 5q11 q12 1p31 hMSH2hMSH3/6 hMSH2hMSH3 hMSH4hMSH5 hMSH4hMSH5 hMSH2hMSH6 hMLH1hPMS1/2/hMLH3 hMLH1-hPMS2 hMLH1-hPMS1

E.coli MutS . . . . .

B.subtilis MutS . . MutS2 . .

S.cerevisia None e MSH1 MSH2 MSH3 MSH4 MSH5 MSH6

Mitochondri a

hMSH2 MMR

+

hMSH3 MMR

-

-

hMSH4 Meiosis

-

hMSH5 Meiosis

6p22.3 21.3 2p21 16.3 +

hMSH6 MMR

MutL . . .

MutL . . .

MLH1 PMS1 MLH2 MLH3

hMLH1 MMR/Meiosis 3p21.3 + hPMS2 MMR/Meiosis 7p22 hPMS1 ? hMLH3 Meiosis +

2p31.33 14q24.3

(+/hMLH1-hMLH3 )

Studies from our lab and others have demonstrated that most eukaryotic MSH and MLH/PMS proteins operate as heterodimers. There are three conserved MSH heterodimers (hMSH2-hMSH3; hMSH2-hMSH6; hMSH4-hMSH5) and three MLH heterodimers (MLH1-PMS1; MLH1-PMS2; MLH1-MLH3). The evolution of a bacterial MutS homodomer to a eukaryotic MSH heterodimer has solidified a separation-of-function between subunits and increased the mismatch/structure/lesion recognition range of the complex.The overall effect of the evolution of the MSH and MLH/PMS proteins was to enhance the efficiency of the MMR system as would be expected under the evolutionary theory. Such a process would be an obvious evolutionary consequence since the human genome is far more complex than the relatively simple bacterial chromosome.

MutH and the Dam-instructed system has not been found outside a narrow window of gram-negative enteric bacteria such asE.coli. Thus, beginning with gram-positive bacteria the MutH-Dam system for introducing a specific strand scission that directs excision-resynthesis during MMR appears unnecessary. Possible reasons for this difference are discussed below. Molecular Mechanism(s) for Mismatch Repair Our work with the bacterial and human proteins has allowed the development of a complete Molecular Switch Model for MMR in bacterial (Bacterial model animation) and eukaryotic cells (Eukaryotic model animation; Figure 1). Since we study the human MMR proteins, the eukaryotic model will be discussed in detail. The MSH proteins functions as a mismatch sensor (Figure 1A). Recognition of mismatched nucleotides provokes ADP for ATP exchange by MSH that defines it as aMolecular Switch. ATP binding by MSH results in the formation of a hydrolysisindependent sliding clamp that is capable of diffusion for at least 1 Kb along the DNA adjacent to the mismatch. Following the dissociation/diffusion of one ATP-bound MSH sliding clamp, the mismatch site is exposed to iterative loading of multiple MSH sliding clamps (Figure 1B). These results are consistent with a threshold number of localized ATP-bound MSH sliding clamps, which distinguish the mismatch-containing region from the vast majority of duplex DNA. Because the loading of multiple MSH sliding clamps appears to continuously alter the location of the rearward reflecting-barrier for random-walk diffusion, an exponential increase in the linear rate of sliding clamp movement away from the mismatch might be expected. The concept of a mismatch-provoked molecular switch that results in stable sliding clamps solves two crucial requirements for an MMR model: mispair recognition and a DNA tracking process that orients lesion recognition to the site of excision initiation (elevated concentrations of MSH clamps nearer the mismatch). The role of MLH proteins has been enigmatic. We have found that the MutL protein only interacts with ATP-bound MutS sliding clamps (Figure 1C). Additional studies have shown that both MutS-MutL and the human MSHMLH complex are capable of hydrolysisindependent diffusion along the DNA.

No qualitative difference between the diffusion properties of MSH sliding clamps and the MSH-MLH sliding clamps has been observed. The Molecular Switch Model suggests that the MSH-MLH sliding clamp complex diffuses along the DNA backbone until it encounters a downstream effector that drives ATP-binding by the MLH protein (a protein interaction-driven molecular switch). In the case of E.coli, the first downstream effector is MutH. In eukaryotes, the first downstream effector is likely to be the PCNA-polymerase complex on the leading strand or the 3 or 5 strand-break on the lagging strand (Figure 1D). The ultimate goal of these interactions is to identify and/or introduce a strand scission on the newly replicated DNA strand. This would likely require a protein displacement event on the leading strand in eukaryotic cells (PCNA-polymerase) (Figure 1D). In support of this idea, several groups have demonstrated a physical and genetic interaction(s) between MSH and MLH proteins with PCNA. We note a remarkable similarity between the MSH-MLH signaling process(es) and G protein signaling systems. Based on the bacterial model, the next downstream effector in MMR is likely to be a helicase that recognizes and begins to displace the incised DNA strand (Figure 1E). A significant increase in helicase processivity has been demonstrated for the E.coli MMR reaction when MutS-MutL and UvrD (helicase II) are included together on a mismatched DNA substrate. Based on genetic similarities for colorectal cancer susceptibility and biochemical interaction with MLH1, it would appear possible that one of the human helicase activities may be attributed to BLM1 the Blooms Syndrome helicase. However, BLM1-deficient cells do not appear to be defective for MMR in vitro; either suggesting another helicase or significant redundancy in the reaction. Concerted displacement of the newly-replicated strand provides a ssDNA substrate for an exonuclease (Figure 1F). In eukaryotic cells this function has been ascribed to Exonuclease I (ExoI). The combined actions of MSH-MLH-(Helicase)-Exonuclease results in excision of the newly-replicated strand. Fundamental Redundancy - Two dynamic ATP protein switches (A-proteins; MSH and MLH) introduce significant redundancy into the Molecular Switch Model for MMR. At any stage of the MMR process the protein components may encounter thermal (Brownian) catastrophe and complex dissociation. However, at all stages of the Molecular Switch Model redundant A-protein complexes are associated with the remaining MMR intermediates. This is because MSH-MLH sliding clamps are continuously loading at the site of the mismatch. If the MSH-MLH-(Helicase)Exonuclease complex disintegrates, the entire excision complex may be reformed as a trailing MSH-MLH sliding clamp encounters the residual excision intermediate along with new (helicase)/exonuclease proteins (Eukaryotic Model animation; Figure 1E-G). The process is completely iterative until the excision tract eliminates the mismatch site that is required for the initial MSH sliding clamp loading. The complete Molecular Switch Model then satisfies the final and perhaps most significant requirement of MMR: the excision tracts are directional and cover only the DNA region between initiating strand scission to just past the mismatch.

Sistemas de recuperacin (reparacin dependiente de RecA) Cuando se realizan reparaciones incorrectas o la tasa de alteraciones es demasiado rpida como para que los sistemas anteriores puedan reparar el DNA, se desencadenan estos sistemas, menos eficientes, pero ms rpidos, todos ellos dependientes de la presencia de la protena RecA. Es una situacin letal porque aparecen sitios apurnicos y dmeros de timina, que bloquean la replicacin de la DNA-polimerasa III La protena RecA cataliza el apareamiento de las hebras de DNA mediante apareamiento de bases complementarias entre s. Por otra parte, RecA cataliza la autoprotelisis de LexA un gen que reprime la expresin de 43 genes de reparacin y al propio RecA para permitir la snteis de los genes de reparacin del DNA. Las bacterias recA- reparan mal el DNA por lo que son tiles en la tecnologa del DNA recombinante para evitar que los plsmidos se reorganicen entre s o con el genoma. 1.- Reparacin por recombinacin Cuando la polimerasa es incapaz de reconocer una hebra para replicarla porque hay bases modificadas, el complejo replicativo lo salta y comienza ms adelante, generndose un hueco en el DNA muy cerca de la horquilla de replicacin en la zona en la que las dos cadenas en formacin estn todava fsicamente prximas. Ante el colapso de la horquilla, RecA inicia el retroceso de la misma para formar el intermedio de pata de pollo ayudada por otras protenas RecF,O,R que intervienen en la recombinacin. Este intermediario tambin puede formarse por la energa del superenrollamiento. A continuacin la DNA-pol I rellena la brecha monocatenaria que sobresale y despus, gracias a la intervencin de RecG o RuvAB, se restaura la horquilla de replicacin de manera que la mutacin ya tiene cadena complementaria.

Este proceso tambin se puede realizar si se comienza con la invasin, mediada por RecA y RecB,C,D, de la hebra daada, con formacin de un intermediario de Holliday que intercambia las hebras y, finalmente, RuvC resuelve el intermediario de Holliday. Ntese que este proceso no repara en ningn caso la mutacin, sino que regenera una horquilla de replicacin viable que luego se reparar mediante la maquinaria REN. Este tipo de reparacin puede explicar los que en gentica se denomina conversin gnica, ya que permite copiar un alelo (el de la cadena que va a reparar) y eliminar otro (el que contiene la mutacin). En el caso de que se rompa un brazo de un cromosoma, si existe el cromosoma hermano, la reparacin por recombinacin lo puede arreglar como antes, pero cuando se produce durante la replicacin, antes de generar la otra cromtida, entra en juego un sistma de seguridad conocido como unin de extremos no homlogos (NHEJ: non homologous end joining). Las molculas rotas se unen entre s por un alineamiento aproximado entre los extremos rotos, cuya longitud mnima es de 2 pb (microhomologas casuales). Esta unin se produce gracias a la protena Ku, que se encuentra muy conservada desde las bacterias a los humanos. Esta protena une los extremos y recluta otras protenas del sistema NHEJ. Esta unin es muy ineficaz, pues solo consigue que sobreviva una de cada 1000 clulas con este tipo de lesiones.

2.- Reparacin propensa a errores (respuesta SOS) Con una horquilla de replicacin colapsada, la DNA-pol III es incapaz de seguir la replicacin. Entonces se la sustituye por otras DNA-polimerasas de la familia Y (pol IV y pol V) que son capaces de seguir replicando a pesar de las modificaciones, pero sin actividad correctora 35, por lo que tiene poca fidelidad y adems son poco procesivas; por eso se las conoce como DNA-polimerasas propensas al error.

Pol IV es el producto del gen dinB. Se encarga de saltarse el nucletido desconocido, lo que provoca un cambio en el marco abierto de lectura. Pol V es producto de los genes UmuC y D (Ultraviolet MUtagenesis) en forma del trmero umuCD'2 (D' es umuD tras un autoprocesamiento proteottico inducido por RecA) y junto con las SSB, RecA y otras protenas de la horquilla que tambin se asociaban a la DNA-pol III se conoce como mutasoma pol V (o pol-V Mut) porque tiende a incorporar casi la mitad de G que de A, porque suele colocar una A cada vez que pasa por encima de una posicin errnea. Afortundamente, este mutasoma no suele introducir ms de 7 nt, y luego se sustituye por la DNA-pol III para seguir la replicacin normal hasta que se encuentre otra lesin.

Las pol V han definido el grupo de las polimerasas Y, que en los eucariotas seran la polimerasa , que inserta A frente a un tmero de T, pero carece de actividad editora, por lo que incorpora 1 nt errneo cada 20 a 400 nt; por eso est muy regulada para evitar incorporar demasiados errores. Otras del mismo tipo son y . Puesto que, en cualquier caso, es un proceso muy mutagnico, slo se inicia unos 50 minutos despus de la induccin de la respuesta SOS, si es que no se lograron reparar las lesiones antes. Parece que la misin de esta reparacin es generar una diversidad genmica que favorezca la adaptacin de la bacteria al nuevo entorno. Esto se utiliza en el laboratorio para inducir mutaciones en las clulas. Recombinacin Una de las contribuciones a la diversidad gentica son las mutaciones que alteran genes nicos o pequeos grupos de genes en un individuo. El contenido de un genoma se redistribuye entre varios individuos mediante la recombinacin, que es cualquier proceso que comporte la formacin de un nuevo DNA a partir de molculas de DNA distintas ya existentes. Podemos distinguir tres procesos basados en la recombinacin:

Recombinacin homloga: cuando se requiere que las dos molculas de DNA que se recombinan posean una amplia homologa de secuencia, como la que se produce durante la replicacin celular. Recombinacin especfica de sitio: cuando los DNA a recombinar lo hacen a travs de un pequeo elemento de secuencia casi idntico, ayudado de protenas especficas (integrasa). Son las interacciones especficas DNA-protena las que determinan el sitio de recombinacin, y no tanto la homologa DNA-DNA.

La transposicin, que es una especie de recombinacin que no se basa en una homologa de secuencia ni en la presencia de RecA, sino una secuencia especial en uno de los DNA y una protena especfica (transposasa). Se ha visto que es lo mismo que la recombinacin ilegtima como consecuencia de los procesos de reparacin y recombinacin. Suelen desorganizar genes, hacer perder la regulacin y otro tipo de mutaciones, o provocar la reparacin NHEJ.

Recombinacin homloga La recombinacin homloga se produce entre dos molculas de DNA bicatenario que comparten una buena homologa en su secuencia. Se produce entre los cromosomas homlogos, pero su frecuenta no es constante a lo largo del mismo debido a factores globales y locales. Es un proceso que ocurre durante la profase de la meiosis. Meselson y Weigle demostraron que la recombinacin consista en la ruptura y reunin de dos molculas de DNA. Coinfectaron E. colicon fagos pesados cultivados en medio con 13C y 15N fagos pesados, junto con otros normales livianos. Los fagos resultantes de la infeccin se centrifugaron en CsCl y observaron fagos en todas las partes del gradiente entre lo que quedaban todava livianos y pesados. En 1964 Robin Holliday propuso un modelo de recombinacin homloga que comienza con una mella en cada una de las hebras de un DNA recin copiado, en una de las regiones donde los cromosomas an estn apareados. El corte permite un desenrollamiento de las hebras y favorece la invasin de las hebras en la cadena contraria no cortada. Lo ms importante de este modelo es la forma en que se llega al intermediario de Holliday y cmo se resuelve. La existencia del intermediario se ha probado experimentalmente, pero su principal pundo dbil es el doble corte inicial.

1.- Modelo El modelo de Meselson-Radding supera los inconvenientes del modelo de Holliday y mantiene los puntos ms importantes como el intermediario en cruz y la migracin en rama: un par de hebras cruzadas se desplazan en ambos sentidos con la contribucin de topoisomerasas que controlen el superenrollamiento. En funcin de canto ha migrado y de cmo se resuelva este intermediario se obtendrn distintos tipos de recombinantes. Adems, se ajusta al hecho experimental de que los extremos 3' o 5' libres siempre desencadenan recombinaciones. Otro de los fenmenos que explica este modelo es que se sintetice una pequea cantidad de DNA durante la recombinacin, algo que no tena en cuenta el modelo de Holliday. Las regiones en las que las dos cadenas no son perfectamente complementarias (producto de la recombinacin) se denominan heterodplex. La reparacin de las discordancias entre las dos cadenas es posible que tenga consecuencias genticas importantes.

En cualquiera de los dos modelos, la resolucin de los intermediarios de Holliday depende de cunto ha migrado (entre 10 y 75 nt) y se obtendrn distintos tipos de recombinantes: la resolucin de las hebras no cruzadas produce la recombinacin de los genes, mientras que la de las cruzadas produce molculas parcheadas (o en parche) que realmente no han intercambiado los genes. 2.- Mecanismo molecular en los procariotas Intervienen en este proceso RecA, B, C y D (RecBCD tiene actividad helicasa, endonucleasa y exonucleasa) junto con las DNA-polimerasas, DNAligasas, topoisomerasas y protenas que se unen al ssDNA (SSB). La recombinacin suele ocurrir en unos sitios determinados preferentemente (puntos calientes) denominados Chi (crossover hotspot instigator, que coincide con el nombre de la letra griega ) en E. coli cuya secuencia es el octanucletido GCTCCTGG, apareciendo cada 5-10 kpb. Son puntos calientes porque es donde comienza la recombinacin, pero no son imprescindibles.

RecBCD se une al DNA y se desplaza a 1000 pb/s hasta encontrar una secuencia chi, donde se detiene unos 10 s. Su actividad helicasa desaparea el DNA para formar un lazo, y su actividad nucleasa 3'->5' degrada parcialmente el extremo 3' que est siendo desplazado mientras el ssDNA se protege con varias SSB. Pierde la subunidad RecD (nucleasa) y sigue avanzando ms despacio; se libera el lazo de DNA y ahora RecBC degradar de 5'->3'. La presencia de extremos 3' libres permite la llegada de RecA y su unin al DNA, con lo que se inicia la invasin de una cadena de DNA cercana.

La unin entre las SSB y el ssDNA es muy estable, por lo que no dejara seguir el proceso de recombinacin. Para que prosiga es necesario la intervencin de protenas de la familia de lasprotenas mediadoras de la recombinacin/reparacin (RMP). En procariotas se trata del heterodmero RecOR, que se encarga de desestabilizar termodinmicamente la unin de SSB para permitir el acceso de RecA, que envuelve una hebra de ssDNA como

una hlice dextrgira formada por mltiples subunidades dispuestas como 6 monmeros RecA por vuelta. A continuacin, RecaA localliza la regin de la otra cadena (dsDNA, amarillo/verde) que es complementaria a la hebra de ssDNA en un proceso que necesita ATP, pero no lo hidroliza!.

El ssDNA se va alojado en el surco menor del dsDNA, hasta encontrar la secuencia complementaria. Una vez que se ha producido la complementariedad, se produce el intercambio/desplazamiento de hebra y se hidroliza el ATP para permitir la rotacin del DNA y el desplazamiento de la hebra. Los intermediarios de Holliday que se forman durante la recombinacin homloga tambin pueden aparecer en procesos de reparacin y replicacin. La migracin de los brazos que forman la estructura, as como la resolucin del complejo estn catalizados por las protenas RuvA, RuvB y RuvC en E. coli. El modelo molecular de esta estructura ha sido desarrollado a partir de los artculos de Rafferty et al (1996) Science 274, y los de Parsons et al.(1995) Nature 374, 375.. RuvA se une especficamente a las cuatro hebras del intermediario de Holliday en forma de tetrmero. RuvB es una ATPasa que es activa en forma de como hexmero y se une a extremos opuestos del intermediario de Holliday. Acta como motor del desplazamiento. El consumo de ATP permite que RuvB haga girar el DNA y, por tanto, migre el intermediario de Holliday entre 10 y 75 pb de donde se form. RuvC es una endonucleasa que reconoce especficametne los intermediarios de Holliday y permite su resolucin. RuvC corta preferentemente en la secuencia ATTG, que se encuentra de media cada 64 nt.

La recombinasa Cre del fago P1 es un homotetrmero unido al intermediario de Holliday que funciona igual que el conjunto RuvABC. En los eucariotas: no se han encontrado homlogos claros de las protenas Ruv. En cambio existen las protenas RAD51 y DMC1 tienen homologa de secuencia y funcin con RecA, as como la UvsX de las arqueas. Por otro lado est RAD52que, adems de ayudar a formar los filamentos de RAD51-DNA, realiza la misma funcin que RecOR, ya que pertenece a las familia de protenas RMP desestabilizantes de la unin de ssDNA a protenas del tipo SSB. Sin embargo, la recombinacin homloga en los eucariotas se dedica ms a la reparacin que a la reorganizacin de los genomas, ya que, en los eucariotas, la ruptura de una cadena suele repararse a partir de su cromosoma alelo.

Las protenas eucariticas Spo11 y MRX seran las equivalentes a RecBCD: la primera generara los cortes y la segunda digerira el DNA para formar los huecos necesarios para iniciar la recombinacin. No hay homlogos claros de las protenas Ruv. 3.- El intermediario de Holliday en movimiento En el Krebs Institute de la Universidad de Sheffield han generado unas figuras animadas que sirven para visualizar ms facilmente esta estructura. Las imgenes ests sujetas al copyright del Krebs Institute, y por eso figura en cada una la nota (c)KI.

La representacin ms simple (arriba izquierda) muestra las protenas de manera poco intensa para que se pueda apreciar facilmente el DNA en una conformacin plana siguiendo las diagonales de un cuadrado. A esta estructura se le unen cuatro molculas de RuvA de forma especfica de estructura, actuando como andamiaje sobre el que se organizan y distribuyen los brazos de DNA. La misma representacin anterior se puede modificar de manera que ahora el DNA ocupe el espacio tridimensional (arriba derecha) que le corresponde y la protena RuvA, que es la que se une al punto central de la encrucijada de las hebras del DNA, tambin aparezca de manera ms real. Puede verse cmo el DNA se aloja en los surcos cncavos que tiene RuvA, siendo perfectamente complementarios la forma de la protena y el DNA, as como las cargas de las superficies en contacto. La unin de RuvA al cruce central facilita el que dos hexmeros de RuvB (a la derecha) se unan a brazos opuestos de DNA. El hexmero de RuvB envuelve el DNA bicatenario, permitindole girar de manera que se produzca la migracin del intermediario de Holliday. Este movimiento necesita la accin concertada de RuvA y RuvB con consumo de ATP. En las dos representaciones 3D puede observarse que las hebras que se han duplicado (azul/celeste arriba y roja/rosa abajo) se encuentran en lados opuestos de la estructura de forma que las hebras del DNA son forzadas a separarse a medida que avanza el complejo proteico. Las hebras separadas son conducidas hacia una orientacin ortogonal de manera especfca, consiguiendo que se reapareen las dos hebras progenitoras (azul y roja) y las dos hebras hijas(celeste y rosa).

Tambin pueden consultar la estructura que mantiene el DNA en el intermediario de Holliday desde todos los puntos de vista posibles. Estn sealados los extremos 5' como 5* en cada cadena. Observa cmo cada cadena est siempre apareada con al menos otras dos. Se ha resaltado en color magenta el enlace fosfodister de la cadena roja que se ha girado para permitir que bases consecutivas se apareen con cadenas distintas.

Recombinacin especfica de sitio En este caso, la especificidad de recombinacin se produce por el reconocimiento DNA-DNA a travs de la complementariedad entre unas pocas (15 a 50) bases y por la intervencin de una protena muy especfica que reconoce el pequeo tramo homlogo. La enzima que reconoce dicha secuencia es una recombinasa, que aunque no presenta similitud de secuencia con las topoisomerasas, s presentan homologa estructural con las topoisomerasas de tipo I. Las hay de dos tipos: serinarecombinasas y tirosina-recombinasas, segn generen un intermedio serina-DNA o tirosina-DNA, respectivamente, durante la reaccin. Las etapas por las que pasa una recombinasa de este tipo son las siguientes:

En primer lugar, a cada sitio del DNA se une una pareja de recombinasas. Una permanecer en la forma activa y la otra en la inactiva. El par de subunidades opuestas que son activas cortan cada una en la molcula a la que estn unidas, de manera que el extremo 3'-OH del DNA se une covalentemente a una Tyr o Ser de la recombinasa A continuacin se intercambian las cadenas de DNA y se forma una estructura equivalente al intermedio de Holliday Se produce una isomerizacin del intermedio de manera que ahora estn activas las subunidades de recombinasa que antes no actuaron y viceversa Se repite la reaccin de corte y formacin de un intermedio covalente enzimaDNA Al producirse otro intercambio de hebras, se resuelve el intermedio de Holliday y se recuperan las recombinasas libres.

En ningn momento se necesita aporte de ATP ya que la energa de romper un enlace se utiliza directamente para formar el siguiente. Este mecanismo realmente es comn a todas las topoisomerasas. Como se ve en el modelo, se necesita al menos un tetrmero de recombinasa para que se produzca la reaccin.

Por ejemplo, el fago se integra en el sitio attB (23 nt) de la bacteria. El fago se integra a travs de su sitio attP de 230 nt. Para esta integracin es necesario la intervencin de las protenas Int del fago (se trata de la integrasa de la familia de las recombinasas, con actividad topoisomerasa) e IHF(Factor de Integracin del Hospedador) de la bacteria, que es un homodmero.

La unin de IHF provoca dobla en 90 el DNA y permite que entren 2 molculas de Int en attB y 7 monmeros en attP (todos forman el integrosoma o intasoma, donde Int est en la parte central de attP e IHF en los bordes, con lo que protegen unos 230 nt que dan dos vueltas en torno al intasoma). El reconocimiento de los dos sitios att no depender de su secuencia sino de la capacidad de las protenas Int por acercarlas en el intasoma.

La estructura formada deja muy accesibles los 15 nt cuya homologa es completa entre ambos sitios att, de manera que, mediante un corte asimtrico, se produce la integracin. Una vez integrado el fago, los sitios att ya no son como los originales (y son distintos entre s), por lo que se denominan attL y attR; ambos contienen la regin central, pero difieren en sus regiones perifricas.

Cuando el fago ha de escindirse, se invierten los pasos que acabamos de relatar al asociarse IHF con la protena Xis del fago (que reconoce los nuevos attRy attL e introduce la misma acodadura que IFH) y FIS de la bacteria. Otro ejemplo de este tipo de integracin lo constituye la protena Cre del fago P1, que promueve la recombinacin para pasar de la forma lineal a la forma circular del fago, a travs de los xitios LoxP. El dmero de Cre va unido a cada extremo (donde estn los sitios LoxP de 34 pb); se reconocen entre s y permite la recirculacin de P1 con la prdida de un sitio LoxP. Puedes ahondar en la estructura de la recombinasa Cre. Adems, esta recombinasa y su sitio tienen gran aplicacin en la clonacin de fragmentos genmicos de DNA. Transposicin La transposicin es el fenmeno por el cual un elemento de DNA cambia de ubicacin fsica en el cromosoma sin aprovechar ningn tipo de homologa de secuencia, sino a travs de una protena especfica denominada transposasa. Las caractersticas que distinguen la transposicin de la recombinacin son:

No requiere homologa de DNA entre la secuencia dadora y la aceptora, aunque hay puntos calientes en regiones ricas en AT Se produce una duplicacin de la secuencia aceptora (entre 3 y 12 pb) antes y detrs del transposn No necesita la comparecencia de RecA (en procariotas) sino la intervencin de la transposasa y, en algunos casos, la resolvasa.

La transposicin puede reestructurar drsticamente la organizacin del cromosoma hospedador. Adems, puede alterar la expresin de un gen, bien inactivndolo, bien sobreexpresndolo.

Su presencia la demostr Barbara McClintok en los aos 50, pero se la ignor porque 1) era una mujer, 2) su propuesta iba contra la ortodoxia gentica del momento que aseguraba que los genes slo estn en un orden determinado, y 3) no trabajaba en los organismos de moda por entonces (bacterias y fagos). Hoy se sabe que hay transposones en todos los organismos y que la tasa de transposicin es similar a la de mutacin espontnea, por lo que cabe la posibilidad que sean los transposones (y no las mutaciones aleatorias) las que introduzcan la variabilidad en las especies. Recordemos que los modelos evolutivos son previos al conocimiento de los experimentos de McClintok.

Transposones procariticos

1.- Tipos La clasificacin se basa principalmente en los genes que aparecen Tipo I Se conocen como transposones simples o secuencias de insercin (IS) lo que en 700 o 2000 pb contienen el gen TnpA que codifica la transposasa flanqueado por dos secuencias invertidas repetidas cortas (15 a 25 pb). Cuando un gen (normalmente una resistencia a antibitico) est flanqueado por dos IS en repeticin directa o invertida y se transponga todo el elemento, se denominan transposones compuestos. Ejemplos: Tn5, Tn9 y Tn10. Tipo II Contienen al menos tres genes: una transposasa (TnpA), una resolvasa (TnpR) y un gen que suele ser de resistencia a antibiticos. Eso se encuentra flanqueado por secuencias repetidas invertidas (IR) a la izquierda (IR-L) y a la derecha (IR-R). Ejemplos: Tn3 y Tn21. Tipo III Aquellos fagos que, en lugar de insertarse en el genoma por recombinacin lo normal, lo hace mediante transposicin. El ms conocido es el fago .

2.- Mecanismo general La transposicin parte de un corte asimtrico en la secuencia diana que, al ligarse al transposn y repararse, genera las secuencias repetidas de 3 a 9 pb. Puesto que el transposn nunca se encuentra libre sino integrado en el cromosoma, al ligar el corte del genoma con los extremos del transposn se forma una estructura que se puede resolver de dos maneras: No replicativa (simple): Se resuelve con un corte en el lado 5' del transposn con lo que los nuevos extremos 5' del transposn se unen a los extremos 3' del receptor. En este caso, el DNA receptor recibe una copia del transposn, pero el DNA donador ha perdido su copia del transposn y ha quedado roto. Si se logra reparar esta ruptura, es una transposicin conservativa; el nico rastro de transposn que queda en la molcula original son las repeticiones directas. Se parece mucho a la recombinacin especfica de sitio y la usan muchos fagos y plsmidos.

Replicativa Se produce con los transposones de tipo II y III ya que tienen resolvasa. Los extremos 3' del DNA cromosmico actan como cebador de la replicacin para rellenar los huecos que han quedado, duplicando el transposn y generando un cointegrado estructura circular que contiene los cromosomas donante y receptor as como dos copias del transposn. La resolvasa, mediante recombinacin especfica de sitio entre los dos transposones, separa los cromosomas, cada uno con una copia del transposn.

Transposones eucariticos La gran mayora de los transposones eucariticos utilizan RNA como intermediario de la transcripcin, excepto unos pocos que utilizan DNA, como los procariticos. 1.- Transposones de DNA Tienen secuencias invertidas en los extremos recuerdan a los IS procariotas y suelen codificar una transposasa. La transposasa que suele estar interrumpida por intrones sirve para su propia relocalizacin mediante un mecanismo similar a la transposicin no replicativa. Es frecuente encontrar copias truncadas (transposones no autnomos) que necesitan la transposasa de otro transposn para transponerse.

A modo de ejemplos citaremos los elementos P y FB de Drosophila y los elementos Ac y Spm de maz, as como los mariner de humanos, que suponen el 1,5% del DNA humano. 2.- Retrotransposones con LTR Son transposones que pueden encontrarse como dsDNA libre, generalmente en forma de virus retrovirus, que se integran en el genoma por un mecanismo de transposicin que implica un RNA intermediario por lo que nunca contienen intrones. Los retrovirus son virus de RNA que utilizan la transcriptasa inversa (retrotranscriptasa) para sintetizar un dsDNA que se inserta en la clula hospedadora usando de cebador un tRNA. Se considera que los retrotransposones son unos virus intracelulares que se mueven dentro del mismo genoma a una velocidad mucho menor de la que se observara en una infeccin vrica propiamente dicha.

El retrotransposn/retrovirus est flanqueado por dos repeticiones terminales largas (LTR: long terminal repeat) de 250 a 1400 pb cada una. Cada LTR est, a su vez, flanqueada por secuencias repetidas invertidas (IR: inverted repeats) cortas de 5 a 13 pb. Cuando se integra, se duplica a los extremos la secuencia diana.

En su interior poseen tres genes estructurales (que a veces pueden contener intrones): gag codifica un polipptido que se procesa proteolticamente para dar las protenas centrales del virin

pol codifica la retrotranscriptasa del virin env codifica la glucoprotena principal de la cubierta vrica

Tambin pueden llevarse genes de la clula hospedadora cuando saltan de un sitio a otro. De hecho, el primer retrovirus conocido fue el virus del sarcoma de Rous (RSV) en 1911, que causaba tumores en los pollos porque contenan, adems, el gen src, que es una tirosina cinasa localizada hacia 3' del gen env descubierto en 1978. Este gen adicional se detecta cuando es oncognico y, a veces, puede sustituir alguna de las secuencias de pol, env o gag, dando lugar a un virus defectuoso que necesitara la ayuda de otro normal para poder saltar o encapsidarse. La LTR de la izquierda de un retrotransposn integrado contiene el promotor necesario para que los genes gag, pol y env se transcriban. Por ser casi idntica, la LTR de la derecha puede promover la transcripcin de los genes situados a su derecha, sobreexpresndolo y provocando un fenotipo mutante, a menudo oncognico.

El elemento Ty de levaduras, copia en Drosphila, o MoMLV (virus de la leucemia del ratn de Moloney) son otros ejemplos tpicos. En algunos casos, como Ty o copia, nunca pasan por un estado viral independiente, sino que siempre estn integrados en el genoma, aunque se transponen por el mismo mecanismo que los retrotransposones.

3.- Retrotransposones sin LTR Son dos los tipos principales: LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) secuencias repetidas dispersas y largas SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) las secuencias repetidas dispersas y cortas

La forma en la que se replican siempre es desde el extremo 3', a partir de su poli-A, y por eso, cuando no se completa totalmente, se pueden formar pseudo-LINE y -SINE que no son autnomos.La retrotranscripcin de un mRNA puede hacer que se inserte en el genoma como si fuera un transposn, pero formarn lo que se conoce como seudogenes procesados porque ya no contienen los intrones del gen original, carecen de promotor que los transcriba, y aparecen con una cola de poliA en el extremo 3'. Se encuentra flanqueado por una pequea repeticin de 6 o 7 pb y suelen acumular mutaciones que lo diferencian de un mRNA, ya que no son genes activos. Parece que la retrotrancriptasa responsable de esto es la de los LINE. Con todo esto, podemos resumir, a modo de ejemplo, cmo queda la composicin y distribucin del genoma humano en funcin de la abundancia de elementos repetitivos, intrones, genes y heterocromatina constitutiva.

Tipos de reorganizaciones El descubrimiento de los transposones fue la primera prueba de que el DNA puede desplazarse de un sitio cromosmico a otro sin relacin aparente con los procesos de desarrollo. Ejemplos de reorganizaciones producidas de forma natural:

La reorganizacin de los genes de las inmunoglobulinas La inversin o prdida de genes La amplificacin gnica. El control del tipo sexual de las levaduras: el locus MAT se encuentra flanqueado por los locus HMR (tipo a) y HML (tipo ) que se encuentran silenciados. La transposicin de uno de los locus HM sobre el locus MAT (que es el que se expresa) har variar el tipo sexual entre a y . Los tripanosomas expresan miles de antgenos de superficie diferentes a partir del gen de la VSG (glucoprotena variable de superficie) situado en el genoma y otro cerca del telmero. Los protozoos mantienen miles de copias de parte de los cromosomas (o parte de ellos), por lo que los genes de VSG estarn tambin multiplicados y no todas las copias van a ser idnticas La interaccin del plsmido Ti de Agrobacterium con el genoma de plantas: la bacteria transfiere un fragmento del plsmido de unas 23 kpb (T-DNA) en forma de ssDNA que se convierte en dsDNA y se integra en un cromosoma del ncleo.

La diversidad de los anticuerpos La mayora de la diversidad de inmunoglobulinas se genera por reorganizaciones gnicas de una muy pequea porcin del genoma durante la seleccin clonal de los linfocitos. Vamos a ver cmo surge tal diversidad con las cadenas ligeras , puesto que el mecanismo de las dems es el mismo, slo vara el nmero de fragmentos que se reorganizan.

La unin V/J (o V/D/J en las cadenas pesadas) se produce por recombinacin especfica de sitio mediada por la recombinasa V(D)J, que est formada por las enzimas RAG1 y RAG2, as como las protenas Ku70, Ku80, ligasa, protenacinasas, protenas de torsin del DNA y otras. RAG1 y RAG2 forma el complejo RAG que reconoce unas regiones ricas en AT al final de V y al comienzo J que son casi complementarias entre s, denominadas secuencias de seal de recombinacin: presentan unos 7 primeros nucletidos casi complementarios y luego otros 9 nucletidos tambin casi complementarios, separados por una regin de entre 15 y 25 nucletidos sin aparear. RAG introduce mellas en los heptmeros apareados y deja un intermediario mecanismo similar al de la transposicin. Esta estructura se resuelve con el resto de las protenas de la recombinasa V(D)J de manera que se unen los dos segmentos V y J, y se libera en forma de molcula circular todo el DNA que estaba entre ellos. Esta recombinacin produce la unin de V y J en fase, pero es imprecisa con eliminacin de nucletidos de uno o ambos lados debido a cmo lo resuelve la recombinasa, con lo que se genera una diversidad adicional. La unin de J a C se produce por ayuste del mRNA. Debido a los parecidos de este mecanismo con la transposicin, se sugiere que el mecanismo de recombinacin especfica de sitio de las inmunoglobulinas ha podido evolucionar a partir de los transposones de DNA. De hecho, RAG1 tiene homologa con las transposasas.

Inversin o prdida de genes Suelen ser consecuencia de fenmenos de transposicin cuando dos transposones iguales (o muy similares) se encuentran cerca en el mismo cromosoma y se produce una recombinacin homloga. Se produce la inversin cuando las secuencias que se recombinan estn orientadas de forma invertida (opuesta) y se produce una prdida cuando las dos secuencias repetidas van en el mismo sentido.

Amplificacin gnica Se detectaron por primera vez como respuesta a las situaciones de presin selectiva. La escisin de las secuencias amplificadas se produce mediante recombinacin homloga dentro de la regin amplificada. No est claro el mecanismo de la amplificacin, pero parece ser debido a

una recombinacin desigual del gel natural, una transposicin conservativa del gen.

Ejemplos:

En la ovognesis de los anfibios se ha visto un aumento de los rRNA de hasta 2000 veces por la presencia de elementos extracromosmicos circulares que contienen estos genes En Drosophila se ha detectado un aumento de las protenas implicadas en la sntesis del huevo debido a reinicios de la replicacin dentro de un fragmento de cromosoma. Al tratar las clulas leucmicas con metotrexato se pueden encontrar poblaciones resistentes al frmaco debido a la amplificacin del gen de la dihidrofolato reductasa la diana del metotrexato tanto en el extremo delmismo cromosoma en que se encuentra el gen normal como en forma de minicromosomas Se ha observado la amplificacin de algunos oncogenes en las clulas tratadas con agentes antitumorales

Tcnicas desarrolladas Mutagnesis dirigida: plsmido con gen y oligo con mutacin. Se basa en los mencanismos de reparacin. Disrupcin gnica en levaduras basada en la recombinacin especfica de sitio. Genosupresin (knockout) en eucariotas superiores basada en la recombinacin no especfica de sitio. Transfeccin (transformacin de clulas): aprovecha la integracin (transformacin con DNA lineal) en plantas y animales.