BIOLOGIA FORENSE[1]

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Curso de verano Biología Forense La Rábida, 1 al 5 de agosto de 2005 Directores Dra. Pilar Sanz Nicolás Dr. Manuel López soto

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Curso de verano

Biología Forense

La Rábida, 1 al 5 de agosto de 2005

Directores Dra. Pilar Sanz Nicolás Dr. Manuel López soto

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LAS CIENCIAS FORENSES EN ESPAÑA. INTCF, IML, LABORATORIOS DE

POLICÍA CIENTÍFICA Y GUARDIA CIVIL PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.

La definición más sencilla de Ciencia Forense, de acuerdo con la

Forensic Science Society del Reino Unido, es la que la considera como la

aplicación de los conocimientos científicos a cuestiones legales. Cuestiones

legales que puedan requerir la intervención de un científico son todos los

sucesos que necesitan la decisión de un juez o un jurado y en los que hay que

investigar causas que excedan de los conocimientos que aporta el derecho (un

robo, una falsificación de documentos, el derrumbamiento de un edificio, un

vertido a un río, una homicidio...).

Expertos de cualquier rama del conocimiento pueden ser llamados a

colaborar con la justicia. En ese mismo momento pasan a ser expertos

forenses. Recogerán información de las personas que han intervenido en el

suceso, del lugar en que ha ocurrido o de los objetos relacionados, para aportar

datos objetivos que ayuden a esclarecer el caso judicial. El biólogo forense

recogerá esa información de pistas biológicas (fluidos corporales, restos

humanos o animales, vegetales) que han ido quedando sobre los propios

implicados y en el lugar de los hechos o los objetos. Las analiza, las identifica,

las individualiza y colabora así a aclarar los hechos.

Los biólogos forenses intervienen en casos civiles, como son los

estudios de parentesco (por ejemplo filiaciones: reconocimiento o impugnación

de paternidad), en casos penales como puede ser un robo en el que el ladrón

se ha herido y ha dejado su sangre en un cristal, o en casos criminales

(homicidios, agresiones sexuales) y en desastres en masa (accidentales o

terroristas).

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En la investigación de delitos (investigación de la escena del crimen,

CSI) intervienen muy distintos tipos de profesionales. Al lugar de los hechos

acuden distintos cuerpos policiales (local, nacional, guardia civil); también

puede ser necesaria la presencia de bomberos, si hay un incendio, una

inundación o cualquier otro percance que los requiera, del 061 y otros grupos

asistenciales si hay heridos o muertos. El primero que se entera avisa a la

policía y se pone el hecho en conocimiento del Juzgado de Guardia. Si hay

personas heridas o fallecidas acude el médico forense. También puede ocurrir

que una víctima de cualquier tipo de agresión acuda directamente a la policía,

al hospital o al Juzgado a poner la denuncia.

Esquemáticamente, el médico forense se encarga del reconocimiento de

las personas o de la autopsia en su caso, la policía inspecciona el lugar de los

hechos y busca al delincuente (que también puede ser atendido por el médico

forense). Tanto unos como otros, en el desempeño de su función, recogen

cuantos vestigios y objetos presenten interés y los envían al laboratorio para su

análisis.

Tanto Policía Nacional como Guardia Civil disponen de laboratorios

propios y los Médicos Forenses, actualmente organizados en Institutos de

Medicina Legal provinciales o regionales (según autonomías; algunos de ellos

disponen también de laboratorios), mandan las muestras al Instituto Nacional

de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF). Existen en España tres

Departamentos del INTCF, dependientes del Ministerio de Justicia, en Madrid,

Barcelona y Sevilla y una Delegación en Tenerife. No obstante esta

multiplicidad de laboratorios con funciones muy parecidas, pertenecientes a

distintos Ministerios, intercambian a menudo muestras e información.

Los laboratorios forenses realizan pruebas periciales y emiten informes

forenses.

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LA PRUEBA PERICIAL EN LA RESOLUCIÓN DE DELITOS PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.

La Administración de Justicia tiene una doble misión; por una parte el

conocimiento de la Ley y por otra la consideración de los hechos a los que se

aplica. En esta segunda misión, si se sobrepasa el conocimiento que

proporciona el Derecho es necesario recurrir a la prueba pericial.

“El Juez acordará el informe pericial cuando, para conocer o apreciar

algún hecho o circunstancia importante en el sumario, fuesen necesarios o

convenientes conocimientos científicos o artísticos” (Artículo 456 de la Ley de

Enjuiciamiento Criminal). Las pruebas periciales al ser actos jurídicos se rigen

por leyes, la de Enjuiciamiento Civil para los casos civiles (para nosotros los

estudios de filiación) y por la ley de Enjuiciamiento Criminal (LEC), donde están

definidos perfectamente todos los momentos y circunstancias de la prueba:

- La recogida y conservación de los vestigios o pruebas materiales

- Como debe describirse el lugar del delito y los objetos que se

encuentren.

- Como deben recogerse los vestigios o huellas para garantizar su

autenticidad

- En que circunstancias se recurre a la colaboración de peritos.

Es una ley que data de 1882 y aunque ha sufrido numerosas

modificaciones, la última en 2003, todavía conserva un lenguaje decimonónico

y habla de Ministerio de Gracia y Justicia como se denominaba antes. Cuando

habla de pruebas periciales se refiere normalmente a análisis de sustancias

químicas, y alguna vez cita los análisis biológicos. En la modificación última se

incluye un apartado dedicado al ADN.

El Perito se define como la persona no-jurista con conocimientos

especiales (“experto”), que informa al Juez sobre puntos litigiosos y el Perito

Biólogo es por tanto el facultativo especializado en Biología que proporciona

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conocimientos y experiencias conforme a su profesión y emite dictámenes no

jurídicos. La Biología forense es muy amplia, abarca muchos aspectos y en el

Laboratorio de Biología Forense lo mismo hay que identificar plantas que setas,

realizar estudios microbiológicos, buscar diatomeas en sangre o tejidos de

personas ahogadas, identificar alimentos en un contenido gástrico, pero el

grueso del trabajo lo constituyen los estudios de parentescos y la

individualización de vestigios en casos penales o criminales. La herramienta de

elección es la individualización genética por lo que los laboratorios de Biología

Forense actuales están altamente especializados en Genética Molecular.

De acuerdo con la LEC, los Peritos pueden ser titulares (con titulación

académica) o no titulares y a su vez los Titulares pueden ser oficiales o no

oficiales. Los Peritos oficiales son funcionarios de un organismo estatal como el

INTCF.

Normalmente los jueces prefieren peritos titulares y, siempre que los

haya, oficiales y la LEC exige que la prueba pericial se lleve a cabo por dos

peritos.

En resumen, la prueba pericial es el “examen” de las pruebas por un

experto aunque la LEC se refiere a ella como reconocimiento o acto pericial,

porque presupone (pensemos en el siglo XIX) que se realiza en el transcurso

del juicio oral. Como es lógico los recursos técnicos que se aplican hace que el

“acto pericial” biológico se lleve a cabo en laboratorios especializados donde el

perito. por orden del Juez Instructor y a través del Instituto de Medicina Legal,

hace los análisis y emite los informes.

La prueba pericial auxilia a la administración de justicia, es eficaz y a

menudo decisiva (exclusión de una paternidad), pero no es vinculante, es decir

que no es obligatorio que jueces y tribunales se atengan a ella y resuelven

libremente de acuerdo con todos los demás datos y circunstancias del hecho.

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MESA REDONDA

ACTUACION EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICIA JUDICIAL. LA INSPECCION OCULAR: BUSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS.

LA VICTIMA. EL AGRESOR.

MARIANO PERELLÓ RIUS Laboratorio Biología/ADN de la Brigada Provincial de Policía Científica de la Jefatura Superior de Policía de Andalucía Occidental. INTRODUCCION: LA POLICIA CIENTIFICA Se enuncia cual es la misión asignada a las unidades de Policía

Científica dentro de la estructura básica de la Dirección General de la Policía

así como las funciones desarrolladas por las mismas en la práctica habitual.

Breve explicación de cómo se incardina la actuación de la Policía

Científica en la investigación policial de un hecho delictivo.

LA INSPECCION OCULAR TECNICO-POLICIAL: OBJETIVO, FASES Y MEDIOS Definición genérica de la Inspección Ocular Técnico-Policial y su

concreción dentro del campo de actuación de la Biología Forense.

Antes de proceder a la Inspección Ocular propiamente dicha, es

preceptiva la realización de unas Actuaciones previas que abarcan tanto la

asistencia a la víctima como el aislamiento de la zona.

La Inspección Ocular tiene un triple objetivo: Comprobar la realidad del delito y servir de base a la investigación (saber que hecho delictivo ha

ocurrido), Evidenciar los medios empleados (como se ha producido el delito)

e Identificar a los autores. La investigación pericial de los indicios en general, y de los biológicos en

particular, consta de tres etapas:

- Búsqueda en la escena del delito.

- Recogida y envío al Laboratorio de los indicios.

- Investigación analítica de los mismos.

Es de capital importancia señalar que el resultado final de “la prueba del

ADN” va a depender en gran medida de la correcta ejecución de los procesos

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de recogida y envío de muestras al laboratorio; y además, la admisibilidad de

dicha prueba en los Tribunales de Justicia también vendrá condicionada por el

cumplimiento de la cadena de custodia.

En cuanto a los medios que habitualmente se emplean en el examen del

lugar de los hechos, a efectos de la búsqueda y recogida de indicios biológicos

podemos englobarlos en dos apartados:

- Medios que facilitan la búsqueda y localización de los indicios

(reactivos químicos y equipos de iluminación).

- Medios empleados para la recogida de muestras (maletines de

Inspecciones Oculares y Kits de recogida).

BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Como introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos más

frecuentes en los Laboratorios Forenses.

La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por las

circunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muy

conveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes de

manipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudio

dentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito.

La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática,

extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirlo

inadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir la

escena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien en

círculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos más

importante, por ejemplo, la ubicación del cadáver.

En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentar

la localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger mediante

esquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear una

hipótesis sobre los hechos.

En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por las

circunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se

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describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado,

abierto, vehículos, víctima y agresor).

RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS Durante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una serie

de precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personal encargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última para

evitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmente

la posible contaminación de las mismas).

Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchos

casos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia o indubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué persona

proceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidencias

recogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas).

En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de los

hechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correcta

recogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchas

en soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables,

soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.)

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MESA REDONDA

ACTUACIÓN EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICÍA JUDICIAL. INSPECCIÓN OCULAR: BÚSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS

LA VÍCTIMA. EL AGRESOR

FÉLIX SÁNCHEZ UGENA Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz.

La existencia de una persona fallecida en condiciones extrañas o de

forma violenta, supone un acontecimiento desde el punto de vista Policial y

Judicial que pone en marcha un dispositivo específico encaminado a esclarecer

las causas y circunstancias de ese fallecimiento.

Entre las actuaciones previstas está la práctica de la autopsia Médico

Legal, conforme a lo establecido en la Ley de Enjuiciamiento Criminal (Art. 343)

La autopsia judicial no se limita al examen interno del cadáver como

podría pensarse, sino que comprende una serie de pasos bien diferenciados y

de gran trascendencia cada uno de ellos, a saber:

- Inspección ocular y levantamiento del cadáver.

- Examen externo y examen interno del cadáver.

- Pruebas y estudios de laboratorio complementarios.

EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER

Se trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar de

los hechos la Comisión Judicial, formada por el Juez, el Secretario, el Médico

Forense y el Agente Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena el

LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya a

realizarse la autopsia.

La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es de

extraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert un

examen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar y

hacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias.

En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo para

comprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y el

posible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que

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recoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruir

los hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y la

posible intervención de terceros.

Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo y

relaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación de

lesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y no

biológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar la

recogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos.

Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudio

biológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón de

la cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejores

recursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indicios

buscar, como los tiene que recoger y conservar y enviar y que tiene que

solicitar al laboratorio.

VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGAL

BIOLÓGICOS NO BIOLÓGICOS - Sangre - Ropas - Semen - Balas, tacos, perdigones - Restos - Fibras diversas. - Tejidos - Restos de pintura - Uñas - Fragmentos de vidrio - Mordeduras / saliva - Tierra -Otros - Otros

CONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOS A.- DURANTE EL TRASLADO

- Evitar pérdidas y contaminaciones.

- Proteger las manos

- Envolver el cuerpo.

B.- EN EL DEPÓSITO

- Mínima manipulación.

- No retirar envoltorio.

- No desnudar ni lavar.

- No obtener la necrorreseña.

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RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO

- Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel.

- Toma de muestras de sangre.

- Toma de muestras de uñas

- Toma de muestra de boca / ano / vagina.

II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOS

III.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOS

RECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTOR

INSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos de

lucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos.

RECOGIDAS DE INDICIOS. Ropas que llevaba en el momento de la agresión. Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico... Muestras de sangre y/o saliva. Hisopo lavado de glande.

OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVER LA BIOLOGÍA FORENSE

− INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO. − INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS.

− IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS.

− ESTUDIO BIOLÓGICOS DE LA MUERTE POR SUMERSIÓN.

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ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

El estado actual de las técnicas de identificación genética hace posible el

análisis de cantidades trazas de restos biológicos y la convierten en una

herramienta imprescindible en la investigación de vestigios biológicos de

interés forense. Desde una colilla dejada en el lugar del crimen, un pelo o unos

escasos restos epiteliales restantes en unas uñas tras un arañazo son hoy

valiosas “pruebas” que pueden por si solas arrojar la información suficiente

para identificar a un sospechoso.

Sin embargo, paralelamente al aumento de sensibilidad en las técnicas

de detección de ADN, ha crecido el riesgo de contaminaciones exógenas de las

que puede derivarse el fracaso de la investigación. Además, una mala praxis

en la toma de muestras o el incumplimiento de la cadena de custodia puede

incurrir en la invalidación de la prueba ante los Tribunales.

Conscientes de estos riesgos, se han realizado desde hace tiempo

muchos esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de recogida de

indicios, su preservación y envío al laboratorio, como son la elaboración de

recomendaciones y normas para la recogida de muestras, diseño de protocolos

de actuación en su recogida y formularios que permitan sintetizar toda la

información referente a una muestra concreta.

En el año 1996, el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses

(INTCF) elaboró unas “Normas para la preparación y remisión de muestras

objeto de análisis por el Instituto de Toxicología”, que se publicaron en el BOE

nº 308 de 23 de diciembre de 1996 (Orden de 8 de noviembre de 1996) que

contiene, entre otros apartados, información sobre el tipo de muestras que

deben estudiarse, cómo deben enviarse y los formularios que deben

cumplimentarse cuando se solicitan análisis genéticos. Estas normas se

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encuentran hoy en revisión para adaptarlas a las nuevas técnicas y se espera

su pronta publicación en el BOE.

Por otro lado, dentro del GEP-ISFG (Grupo Español y Portugués de la

Sociedad Internacional de Genética Forense) se elaboró un documento de

“Recomendaciones para la recogida y envío de muestras con fines de

identificación genética” en el año 1999, cuya misión es la de difundir buenas

practicas en la toma y manejo de muestras que permitan garantizar la

autenticidad e integridad de las mismas, así como asegurar el cumplimiento de

la cadena de custodia. Este documento se aprobó en la reunión del GEP-ISFG

del 2000 y fue publicado por el Ministerio de Justicia en el 2001 y difundido

entre todos los Médicos Forenses del Estado.

No existe aún en España una normativa oficial para la recogida de

muestras, aunque esperamos que se derive de actuales proyectos tales como

los de la ley de bases de datos de ADN y los procesos de acreditación de los

laboratorios forenses.

Entre los puntos más importantes que observaremos en relación con el

envío de muestras al laboratorio forense destacaremos las precauciones

destinadas a la protección del personal, las precauciones destinadas a la

protección de las muestras, la documentación necesaria y la toma de muestras.

1. Precauciones destinadas a la protección del personal. En la manipulación de evidencias biológicas será necesario tomar

precauciones universales asumiendo que cualquier muestra puede ser

infecciosa: uso de guantes, mascarilla, bata u otra ropa protectora; prohibición

del consumo de bebidas, comidas y tabaco; uso de material desechable

siempre que sea posible y uso de contenedores específicos para residuos

biológicos; vacunación del personal (hepatitis, tétanos, etc.).

2. Precauciones destinadas a la protección de las muestras. Todo lo expuesto anteriormente tiene cabida también en cuanto a la

protección de la muestra, que debe ser protegida tanto de la contaminación

biológica por otro material genético ajeno al de la evidencia como de la

degradación por una incorrecta manipulación de la misma.

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La prevención de contaminaciones biológicas de la muestra debe

contemplarse en todos los estadíos de recogida, procesado previo y análisis de

las muestras y en este sentido la primera regla de oro a observar será: Nunca,

bajo ninguna circunstancia, se permitirá al sospechoso ocupar el mismo área

de la víctima (o viceversa) hasta que todas las evidencias se hayan recogido.

Esto incluye vehículos, salas de espera, salas de interrogatorio, etc. La misma

regla cuenta para el envío de muestras dubitadas e indubitadas que jamás

deben compartir el mismo embalaje, e incluso en el laboratorio durante el

alicuotado y procesado de las muestras debe observarse una separación

espacial y temporal entre evidencias y muestras indubitadas.

Además, deben preservarse las evidencias de la exposición a condiciones

medioambientales adversas que podrían favorecer la proliferación microbiana,

utilizar embalajes de papel con preferencia al plástico y nunca añadir

conservantes del tipo del formol.

3. Documentación necesaria. - Formularios de envío de muestras en casos de interés criminal y de

investigación de la paternidad, especificando el tipo de estudio solicitado.

- Datos de identificación de la muestra.

- Cadena de custodia: nombre y firma del personal que recoge la muestra,

fecha y hora, y condiciones de almacenamiento hasta su envío. Fecha de

envío y medio de transporte utilizado.

- Documentos adicionales: informe preliminar de autopsia, antecedentes

clínicos, fotografías de la localización de los indicios, etc.

4. Toma de muestras. - Muestras de referencia en personas vivas: sangre, saliva, pelos.

- Muestras de referencia en cadáveres: sangre, saliva, pelos.

- Muestras de referencia en cadáveres en avanzado estado de putrefacción

o esqueletizados: dientes, hueso largo.

- Otras posibles muestras de referencia: biopsias, preparaciones

histológicas, objetos personales del fallecido.... .

- Indicios biológicos: recoger en función de la naturaleza del indicio y del

soporte sobre el que se presenta. Empaquetar cada indicio por separado.

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CRITERIOS DE ORGANIZACIÓN Y CALIDAD

PILAR SANZ NICOLÁS Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. El Laboratorio Forense reúne una serie de requisitos que lo hacen muy

diferente de otros tipos a los que estamos más acostumbrados como son los de

centros de investigación, universitarios o incluso los de algunas empresas.

Estos requisitos se refieren al propio tipo de trabajo, que por ser judicial

está sujeto a absoluta confidencialidad. El perito también tiene que reunir una

serie de requisitos, independientemente de su preparación técnica, y no puede

participar en una pericia si existen relaciones de parentesco, consanguíneo o

de afinidad, o amistad o enemistad, con el acusado o la víctima, tampoco si

tiene algún tipo de interés en la causa judicial. Y por último una de las

diferencias más importantes en el trabajo pericial lo constituyen las propias

muestras, sobre todo en los casos criminales.

Por tratarse de pruebas para el esclarecimiento de un delito, se les

denomina vestigios, suelen ser únicas, las más de las veces irrepetibles (salvo

las muestras de referencia que se toman a un acusado o a una víctima viva),

son limitadas y muy frecuentemente muy escasas, sobre todo desde que

disponemos de la tecnología del ADN y podemos analizar muestras mínimas.

Todo ello exige por parte del experimentador (facultativo o auxiliar de

laboratorio) altas dosis de cuidado y responsabilidad. Pero además, como

necesariamente tienen que estar perfectamente autentificadas, es obligatorio

conservar al menos una parte para futuros análisis y muchos de los objetos son

también piezas de convicción que hay que aportar al momento del juicio (un

arma, unas ropas), es necesario tener rigurosamente establecida y controlada

la cadena de custodia.

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La cadena de custodia no debe presentar ni una sola discontinuidad;

debe en todo momento estar documentada la localización exacta de las

muestras originales, de las muestras de análisis, sus alícuotas y extractos.

Esta custodia abarca desde la entrega al Centro por el transportista, la entrega

al laboratorio, la conservación hasta el momento del análisis y durante el

mismo y la custodia postanálisis hasta la devolución de las muestras originales

al Juzgado cuando procede o su destrucción. Todos los cambios de ubicación

o de mano deben estar registrados y los posibles envíos al exterior

documentados (devoluciones al Juzgado o envío a otros Laboratorios para

ampliación de análisis).

El informe escrito está también estipulado y la LEC exige que conste una

descripción detallada de las muestras y de su estado, una relación detallada de

los análisis y de los resultados. Esto y la necesaria rigurosidad de los estudios

hace que se disponga de protocolos normalizados de trabajo para todas las

operaciones del laboratorio, de hojas de recogida de datos en los que se

consignan todas las circunstancias de cada ensayo y sus resultados y que

estos estén contrastados por los dos peritos que firman el informe. El

laboratorio forense debe estar por tanto sometido a medidas de control de la

calidad basadas en la norma internacional ISO17025 y a la larga tendrá que

estar acreditado.

Por último y como ya se ha dicho al comentar la necesidad de conservar

una parte de las muestras originales, las pruebas periciales pueden estar

sometidas a contraanálisis por otros peritos, para confirmar resultados no

aceptados por alguna de las partes (acusación o defensa). Por ese motivo y

para que los análisis puedan ser comparativos, los laboratorios forenses deben

utilizar Métodos Normalizados Oficiales desarrollados por Centros de

Referencia y regirse por normativas de carácter internacional. En el caso de la

Genética Forense estas normas las dicta la Sociedad Internacional de Genética

Forense a los que todos los miembros de los laboratorios de Biología Forense

de España pertenecemos. Para revalidar la calidad de nuestras pericias

realizamos además controles de calidad internos y ejercicios anuales

interlaboratorios.

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TIPOS DE ESTUDIOS EN UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA FORENSE

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Si nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que no

hay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, y

esto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna suele

ser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes del

sensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avances

tecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta de

una mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados más

frecuentemente en un laboratorio de biología forense son:

Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigación

biológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o bien

contando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Las

complicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitor

cuestionado por fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisis

de otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos de

éste que permitan reconstruir su genotipo o incluso a la exhumación del

cadáver.

Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza mediante

el análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis de

otros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puede

recurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetos

personales del mismo.

Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo

de análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los

indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos

deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar,

conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las

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características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes

son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y

restos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes son

la orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este curso

tendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detección

de estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte más

frecuentes sobre los que se encuentran así como sus posibilidades de

individualización.

Identificación de especie: determinados restos hallados casualmente

pueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir una

investigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentemente

ligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro resto

orgánico del que pueda sospecharse un origen humano.

Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión-asfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha

que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesario

confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudio

anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de

hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del

derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que

deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión.

Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas e intoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos que

se investigan son la histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casos

de muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina y

cloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos se

procederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas.

Identificación de setas y plantas superiores en casos de intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantas

tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es el

responsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de la

intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en

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función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio los

especimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos,

o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos de

setas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN,

como veremos a lo largo de este curso.

Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos de etiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamente

en el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz en

aquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche un

origen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algún

patógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, en

colaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a la

consejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de los

dispositivos de control epidemiológico.

Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estado

de la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datos

en una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimento

hallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión,

sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata al

momento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen esta

correlación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como la

propia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión y

permanencia de los alimentos en el estómago.

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IDENTIFICACIÓN DE INDICIOS

VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Los tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio de

biología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva y

pelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todos

tienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y son

únicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste a

menudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilización

de diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescencia

típica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una de

estas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintos

filtros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en el

campo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebas

preliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremos

el diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio.

Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados

soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen

de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol,

verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se

presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo,

piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escena

del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.

Semen: el principal componente celular del semen es el

espermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55

µm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puede

variar entre 50 x 106 y 150 x 106 por mililitro de eyaculado, con una media de

unos 100 x 106/ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculado

también varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe

Page 21: BIOLOGIA FORENSE[1]

una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino también

dentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Además

de los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementos

formes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque en

número mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperar

unos 450 µg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmico

esperaremos unos 30 µg, esto es, sólo un 6,3% del normal.

Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y su

capacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiado

con luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones de

fosfatasa ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgos

que se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación de

restos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación de

espermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de las

muestras a analizar.

Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógeno

bajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa en

esta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en la

presencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sin

embargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeres

amenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) y

sufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles más

altos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas del

epitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca y

en el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, el

hallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da a

veces cuando se solicita la localización de células procedentes del epitelio

vaginal en un hisopo penil.

Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por lo

que es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o la

obtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros de

saliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las células

descamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN

Page 22: BIOLOGIA FORENSE[1]

en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección de

actividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra

también en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los

fluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de

saliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de

fluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfa-

amilasas) y en plantas (tipo beta-amilasas). Para la confirmación de presencia

de restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en los

extractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos,

sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... .

Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo de

crecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase de

crecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican por

mitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente. Un cabello humano

crece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es una

transición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento.

En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo.

Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000

folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena y

entre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria,

los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito es

consultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena de

un crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fue

arrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido a

la base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fase

telógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, la

ausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído y

no arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempo

en fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremos

en casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias,

los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias.

Page 23: BIOLOGIA FORENSE[1]

Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señales

desaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñas

suficientes para obtener un perfil de ADN por PCR.

Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriaciones

leves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores al

experimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazos

más largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobre

regiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo se

recuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidas

como el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y la

cantidad de ADN recuperado.

Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a veces

se solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales,

pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado.

Entre estos restos podemos citar:

Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de

iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en

otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes en

sudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene células

epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas en

la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de

orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los

procesos de degradación en la muestra.

Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia de

pigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimo

sustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear en

estos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural

(aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias).

Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, en

concreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas.

Otros restos también analizados en el laboratorio son secreciones

nasales, uñas, restos de tejido, caspa...

Page 24: BIOLOGIA FORENSE[1]

TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSES

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta que

a continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial y

profesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez que

tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el proceso

analítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN,

AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.

Extracción de ADN Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción

constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la

muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte,

siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para

resolver un delito.

Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de

extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la

enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden

dividir en tres grupos:

a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una

purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con

etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de

interés forense.

b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una

precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha

cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.

Page 25: BIOLOGIA FORENSE[1]

c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante

membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita

normalmente a muestras de sangre líquida.

Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en la

digestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, es

decir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todas

las estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas,

citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza un

tampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzima

proteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas.

Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entre

sí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperará

el ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es el

de extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar esta

solución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión se

genera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar el

ADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separen

otras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso de

amplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posibles

restos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. A

continuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltración-

purificación para obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para el

proceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevar

a cabo una precipitación con etanol.

Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos la

extracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros.

Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestras

que llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconseja

aplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación del

ADN humano y sus diferentes métodos.

Page 26: BIOLOGIA FORENSE[1]

Amplificación de ADN Sin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de la

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biología

molecular ha permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a un

ritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solo

unos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias)

cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecular

se requiere exclusivamente dNTPs, Cl2Mg, cebadores, polimerasa

termorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El proceso

de amplificación se puede dividir en tres etapas:

a) Desnaturalización del ADN a 95ºC

b) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADN

c) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nueva

cadena de ADN.

Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador.

En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido y económico.

Sistemas de detección de ADN Hace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genética

molecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamida

seguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de los

secuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto en

su formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida la

calidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino que

además ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN del

mismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece que

ha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otras

razones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permite

reanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen varios

modelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis y

noventa y seis capilares.

Page 27: BIOLOGIA FORENSE[1]

APLICACIÓN FORENSE DE MICROSATÉLITES AUTOSÓMICOS

MARÍA JOSÉ FARFÁN Espuny Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

La primera aplicación de la tecnología del ADN a la resolución de un

caso judicial data de 1985, cuando las autoridades británicas exigieron una

prueba biológica de filiación en un asunto de inmigración en el que con la

batería de ensayos disponibles en ese momento se pudo deducir que el joven

ghanés investigado pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, pero

no se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. Para resolver el caso

se solicitó la colaboración de Alec Jeffreys que acababa de publicar la

posibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muy

polimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos los

estudios de filiación. Mediante el análisis de la huella genética del joven y de

sus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad.

Desde entonces, la tecnología del ADN ha experimentado un

espectacular avance del que se ha visto beneficiada enormemente la Genética

Forense. Actualmente la “prueba del ADN” constituye una pericia de enorme

trascendencia en muchos casos judiciales lo cual ha supuesto en los últimos

años un incremento considerable en la intervención de este tipo de pericias en

los tribunales de justicia.

En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo,

aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias, de

cuya aplicación forense se hablará en otro capítulo. El ADN nuclear se

encuentra dividido y muy compactado en los cromosomas, que son unas

estructuras muy densas formadas por ADN y proteínas. El genoma humano

nuclear está constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de

cromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino

(XX) o masculino (XY).

Page 28: BIOLOGIA FORENSE[1]

La mayor parte de los análisis de identificación genética humana se

centra en marcadores polimórficos localizados en regiones no codificantes de

los cromosomas autosómicos. Casi la mitad del ADN no codificante está

constituido por ADN repetitivo, en el que destacan las secuencias repetidas en

tándem, constituidas por una secuencia determinada que se repite

consecutivamente una detrás de la otra un número variable de veces.

Atendiendo al tamaño de la unidad de repetición, estas secuencias se

denominan satélites (unidad de repetición: 1 000-10 000 nucleótidos),

minisatélites (unidad de repetición: 7-100 nucleótidos) y microsatélites o STRs

(“Short Tandem Repeats”) (cuya unidad de repetición contiene de 2 a 6

nucleótidos), siendo éstos últimos los más ampliamente utilizados en Genética

Forense.

Análisis de STRs mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible el

análisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposible

mediante las técnicas convencionales. La PCR permite la obtención in vitro de

millones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidad

ínfima de ADN mediante una reacción enzimática cíclica.

Dados los espectaculares avances científicos y tecnológicos

experimentados en los últimos años (que incluyen el desarrollo de múltiples

fluorocromos para el marcaje diferencial de fragmentos de ADN y plataformas

complejas de detección capaces de discriminar selectivamente entre ellos), hoy

en día se pueden analizar de forma conjunta 15 STRs o más a partir de tan

sólo 0,1-1 ng de ADN, obteniéndose un perfil genético suficiente para la

individualización de un resto biológico.

La principal ventaja de la aplicación de la PCR al laboratorio forense

reside en el espectacular incremento en la sensibilidad de la técnica de

individualización por ADN. No obstante, ello conlleva el inconveniente de un

elevado riesgo de contaminación. Además, aunque la PCR ha supuesto una

revolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a veces

son muy difíciles de salvar y que se refieren principalmente a las posibilidades

Page 29: BIOLOGIA FORENSE[1]

de degradación, inhibición de la reacción de PCR o la modificación del ADN.

Por otra parte hay que tener en cuenta que durante la amplificación por PCR de

marcadores STRs pueden originarse una serie de artefactos que pueden

interferir con una clara interpretación de los resultados y cuya consideración es

necesaria para garantizar un correcto genotipado.

Por otra parte, con cierta frecuencia llegan al laboratorio muestras en las

que se detectan perfiles genéticos que reflejan la presencia de una mezcla de

células procedentes de más de un individuo cuyo análisis es más complicado y

laborioso que en casos de perfiles únicos y requiere un alto grado de formación

y experiencia por parte del perito para distinguir entre los alelos verdaderos

presentes en la mezcla y los posibles artefactos, lo cual no siempre es posible.

STRs autosómicos de uso generalizado en genética forense Con fines de identificación humana es importante disponer de

marcadores de ADN que exhiban una alta variación entre individuos y que en

conjunto permitan discriminar entre ellos. Actualmente existen miles de STRs

identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000

pares de bases. En los criterios a seguir para la selección de STRs con

aplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: alto

poder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintos

cromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y

reproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación y

longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases.

Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintos

laboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticos

comunes. Actualmente, los marcadores más extendidos en el ámbito mundial

son los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (“Combined

DNA Index System”) establecido en 1997 por el FBI para la creación de un

banco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entre

individuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores del

CODIS es inferior a uno en un billón.

Page 30: BIOLOGIA FORENSE[1]

APLICACIÓN FORENSE DE LOS CROMOSOMAS X e Y MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla

Aparte de los STRs autosómicos, estrellas de la individualización

mediante técnicas de ADN y a los que hemos dedicado el capítulo anterior,

existen marcadores genéticos de especial relevancia en los cromosomas

sexuales, cuyas peculiaridades los hacen idóneos para determinadas

aplicaciones concretas.

Un marcador de sexo: amelogenina

La amelogenina es un locus localizado en una región homóloga de los

cromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre el

tamaño del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a una

pequeña deleción en el cromosoma X. El resultado de la amplificación por PCR

de este locus en un ADN femenino (XX) será de una única banda, mientras que

si el ADN es masculino (XY), el resultado serán dos bandas de distinto tamaño.

La mayoría de los kits comerciales actuales incluyen este marcador, que

permite la designación del sexo del individuo donante de la muestra. No

obstante, hay que tener en cuenta que, aunque ocurre con muy baja

frecuencia, se ha detectado la existencia de deleciones en esta región del

cromosoma Y, de tal forma que una muestra masculina podría asignarse

erróneamente como femenina. En este caso, el análisis de marcadores

específicos del cromosoma Y permitirían una correcta asignación del sexo.

STRs del cromosoma Y

El cromosoma Y presenta una diferencia importante respecto al resto de

cromosomas, su herencia es exclusivamente paterna, es decir, se transmite de

padres a hijos varones sin que exista la posibilidad de recombinación. Por

Page 31: BIOLOGIA FORENSE[1]

tanto, la información genética contenida en el mismo se hereda como haplotipo,

o sea, los genotipos para cada uno de los marcadores del cromosoma Y se

transmiten en bloque y no de forma independiente. De esta forma, salvo

posibles mutaciones, todos los individuos varones emparentados por vía

paterna comparten el mismo haplotipo para el cromosoma Y.

En los últimos años, el análisis de marcadores del cromosoma Y se ha

extendido en los estudios de evolución humana para trazar linajes paternos. En

Genética Forense, estos marcadores han demostrado también su utilidad en

casos de mezclas complejas, en estudios de filiación cuando los individuos

implicados son varones y resultan de especial utilidad en los casos de agresión

sexual. En éstos es común encontrar indicios donde existe una mezcla de

células femeninas de la víctima y masculinas del agresor. Aunque existen

métodos de extracción basados en una lisis diferencial que permite la

separación del ADN de las células epiteliales (normalmente vaginales) del ADN

de los espermatozoides, esta separación no siempre es posible, especialmente

si los espermatozoides están muy deteriorados o el agresor es azoospérmico.

En estos casos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y aumenta

las posibilidades de detectar pequeñas cantidades de ADN masculino

presentes en un fondo de abundante ADN femenino, el cual en otro tipo de

análisis (STRs autosómicos, por ejemplo) enmascararía la obtención de

resultados a partir del ADN masculino.

La limitación de este tipo de análisis reside en que, dado que el

cromosoma Y no está sujeto a recombinación, es menos variable entre

individuos, por lo que es necesario el análisis de muchos marcadores para

obtener un alto poder de discriminación.

STRs del cromosoma X

En las células femeninas existe una pareja de cromosomas X de forma

que éstos pueden recombinar entre sí comportándose de la misma forma que

los cromosomas autosómicos, hablando en términos de su herencia. No

obstante, los individuos varones transmiten a su descendencia femenina todos

los marcadores localizados en su cromosoma X en bloque, es decir, uno de los

cromosomas X de cada mujer es idéntico al de su padre. Esta peculiaridad

Page 32: BIOLOGIA FORENSE[1]

proporciona una herramienta útil en casos de paternidad con descendencia

femenina así como en estudios de filiación o identificación en los que el

presunto padre no está disponible y hay que recurrir a familiares en primer o

segundo grado de parentesco.

Page 33: BIOLOGIA FORENSE[1]

APLICACIÓN FORENSE DEL ANALISIS DEL ADN MITOCONDRIAL

MANUEL CRESPILLO MÁRQUEZ Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona.

Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos se

encuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dando

nombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) y

ADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentra

empaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentran

ubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras de

energía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerrado

que se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000

copias).

Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que

en la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas

(adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde,

para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timina

y citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a la

segunda L (Light o ligera).

El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye

37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínas

constitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondrial

es no codificante.

El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al.

La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región no

codificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases y

denominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región de

control) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta región

aparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y región

hipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para la

comunidad forense.

Page 34: BIOLOGIA FORENSE[1]

Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen del

ADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense.

1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y

10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Esta

peculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nula

cantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de mera

probabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegras

dispuestas para ser analizadas.

Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y su

escasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmente

vulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” al

proceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en el

laboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt.

2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membrana

interna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilación

oxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicales

libres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de lo

que ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera que

dicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Por

último la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora.

El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutación

superiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad es

siempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poder

discriminar entre individuos.

3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todos

aquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvo

mutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt.

Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación de

cadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos y

se tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna.

Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la

Page 35: BIOLOGIA FORENSE[1]

identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de su

familia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revolución

bolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referencia

de parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificación

certera mediante el análisis del ADNmt.

Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resulta

especialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado de

degradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula

(por ej. pelos caídos o carentes de raíz).

Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediante

secuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras la

reacción de PCR.

En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, los

métodos y procedimientos de secuenciación han experimentado un

espectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis y

gran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadores

automáticos y el empleo de fluorocromos.

Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijado

sus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en el

genoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (Single

Nucleotide Polymorphisms).

En este caso las variaciones entre individuos están basadas en

mutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma.

Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para el

análisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismo

dentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamos

muestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable o

en aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente y

requerimos una mayor discriminación.

El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones que

convienen describir aunque sea sucintamente:

Page 36: BIOLOGIA FORENSE[1]

1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que supone

uno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. El

análisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones,

pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportando

ADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copias

de ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados no

interpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tanto

fundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitar

contaminaciones.

2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en un

individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es

siempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los que

coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos

heteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: de

secuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en una

determinada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmias

de longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el número

de citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2.

La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en la

dubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación y

posterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando la

heteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la de

referencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia.

3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente en

casos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidencia

entre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se hace

imprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho

“match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamente

materna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar la

secuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otra

parte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG)

consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante

Page 37: BIOLOGIA FORENSE[1]

comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número de

secuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sido

detectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente se

disponen están nutridas con un número de secuencias relativamente

escaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si lo

comparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muy

importante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcando

la comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base de

datos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas

(EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org).

En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne una

serie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible en

los laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendo

grandes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales de

Justicia de todo el mundo esté ampliamente aceptado.

El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes en

casos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es por

tanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con las

ventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.

Page 38: BIOLOGIA FORENSE[1]

NUEVAS TECNOLOGÍAS EN GENÉTICA FORENSE

LOURDES PRIETO SOLLA Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica. Introducción

La genética forense es una ciencia que no ha dejado de evolucionar y

que sigue en constante cambio. Desde sus comienzos en España a principios

de los años 90, hasta hoy, se han producido muchos avances en el campo

molecular que se han ido incorporando a la rutina de los laboratorios forenses.

Hace unos años se requería una mancha de sangre de considerable tamaño

para poder realizar una identificación y hoy se puede obtener un perfil genético

de un filtro de cigarrillo e incluso de los restos epiteliales presentes en las

prendas de vestir producidas por el contacto continuado con la piel.

Pero ¿qué podemos esperar en los próximos años?; si el análisis de

ADN con fines forenses es una técnica tan estandarizada y establecida ¿por

qué buscar nuevas tecnologías?

Aunque es verdad que la tecnología del ADN ha permitido mejorar las

investigaciones criminales, todavía existen limitaciones que actualmente están

tratando de superarse. En la mayoría de los casos, los resultados de “la prueba

del ADN” son claros y no están sujetos a debate. Sin embargo, no podemos

obviar que los resultados analíticos de algunos casos son ambiguos.

Desgraciadamente, las muestras biológicas relacionadas con el delito se

encuentran a veces, diluidas, degradadas o proceden de varios contribuyentes.

En estos casos, el análisis estándar de ADN y las búsquedas en las bases de

datos son menos productivas y los resultados que ofrecen no son de elevada

confianza. Por otro lado, el tiempo que transcurre desde que las evidencias

biológicas llegan al laboratorio hasta que se emite el informe pericial puede ser

considerablemente largo si el número de muestras involucradas en el caso es

elevado. Por ello, las nuevas tecnologías en el análisis forense de muestras

biológicas con fines identificativos se centran fundamentalmente en: posibilitar

Page 39: BIOLOGIA FORENSE[1]

el análisis de muestras degradadas, facilitar el análisis de mezclas y aumentar

la rapidez y eficacia de los análisis.

Estrategias en el estudio de muestras degradadas La identificación genética puede complicarse cuando existen largos

períodos de tiempo entre la muerte y la aparición del cadáver, cuando la

muerte ocurrió en unas condiciones críticas (explosiones por ejemplo), o

cuando las muestras han estado sometidas a condiciones ambientales muy

desfavorables (temperatura, humedad, cambios en el pH, agentes oxidantes,

radiación, etc.), incluso aunque el tiempo transcurrido no sea muy largo. En

estos casos el escaso ADN que pueda permanecer en las muestras se

encuentra totalmente degradado (rotura de hebras, pérdida de nucleótidos,

etc.).

En estas muestras críticas, el análisis de STRs convencionales es

problemático, pues los de mayor tamaño (300-400 pares de bases) no se

logran amplificar en la reacción PCR. Actualmente, para evitar este problema,

muchos laboratorios están centrándose en el diseño de nuevas PCR

multiplexes con el fin de obtener amplicones más cortos (miniSTRs) que no den

problemas en muestras de ADN de escasa calidad. Los miniSTRs, por tanto,

son polimorfismos STR que se analizan mediante el diseño de los “primers” en

una zona cercana al propio polimorfismo, evitando grandes regiones

flanqueantes. Con ello se pueden analizar muestras degradadas que

típicamente producen perfiles genéticos parciales y ausencia de información

para loci grandes.

Otro tipo de polimorfismos que pueden utilizarse en muestras

degradadas son los SNPs (single nucleotide polymorphisms). Se trata de

cambios de una única base dentro de una secuencia concreta de ADN. Pueden

amplificarse mediante PCR produciendo amplicones muy cortos (50-100pb),

pero además presentan otras ventajas como: su abundancia en el genoma

humano, su baja tasa de mutación (característica muy importante en los casos

de paternidad e identificación cadavérica) y la posibilidad de automatizar su

análisis. Es ya una realidad en muchos laboratorios el estudio de SNPs

situados en el ADN mitocondrial y el cromosoma Y, pues al tratarse en estos

Page 40: BIOLOGIA FORENSE[1]

casos de genomas haploides, su análisis es menos dificultoso. Sin embargo, ya

se están comenzando a estudiar SNPs autosómicos, sobre todo con fines de

fenotipaje. Cuando no disponemos de una muestra de referencia para

comparar con una evidencia, no se puede deducir ninguna información útil a

partir del ADN que habitualmente estudiamos (excepto el sexo). Por ello,

actualmente se están buscando SNPs que ofrezcan información sobre el

individuo que dejó la evidencia en el lugar del delito. Así se podrá orientar la

investigación hacia uno u otro sospechoso en casos delictivos, pero también

será una herramienta útil a la hora de facilitar la investigación de la identidad de

una víctima en casos de cadáveres en mal estado de conservación. Aunque la

ciencia forense está encaminada hacia estas investigaciones, el tipaje de SNPs

autosómicos probablemente tardará años en ser aceptado en los tribunales.

Estrategias en el análisis de mezclas El análisis de mezclas de ADN es una práctica habitual en la rutina

forense. Su interpretación es delicada dado que se hace imposible diferenciar

qué alelos pertenecen a cada contribuyente a la mezcla. Si además la mezcla

está desequilibrada (uno de los contribuyentes aportó más cantidad de fluido

biológico que el otro u otros) podemos cometer errores al asignar alelos que en

realidad son artefactos de la amplificación (sttuters) o al no detectar alelos que

realmente existen en la mezcla (drop out alélico).

Si la mezcla está formada por el mismo tipo de fluido procedente de dos

o más individuos la posibilidad de separar los perfiles genéticos se complica,

pero si los fluidos que formaron la mezcla presentan diferentes características

puede lograse la separación. Tal es el caso de las agresiones sexuales, en las

cuales nos encontramos mezclados el perfil genético de la víctima procedente

del fluido vaginal con el perfil genético del sospechoso procedente del semen.

Habitualmente estas muestras se procesan extrayendo su ADN mediante lisis

diferencial, basada en la resistencia que presentan los espermatozoides (y no

las células del epitelio vaginal) a la digestión mediante proteinasa K. Sin

embargo, cuando el número de espermatozoides es escaso (bien por que la

toma de muestra se realizó transcurrido un tiempo desde la agresión, porque la

Page 41: BIOLOGIA FORENSE[1]

víctima retirara la mayoría mediante lavado, o porque el agresor sea

oligospérmico) la lisis diferencial no es eficaz.

Para solucionar estos problemas se han creado programas informáticos

que nos ayudan a la interpretación de mezclas (Pendulum) cuando no existe la

posibilidad de la separación física de los perfiles genéticos. Por otro lado, en

casos de delitos contra la libertad sexual, donde la separación física es posible,

es cada vez más frecuente el uso de microscopios capturadores de

espermatozoides. Estos microscopios permiten aislar mediante láser cada

espermatozoide que visualizamos e introducirlos en un tubo para extraer su

ADN independientemente del de la víctima, evitándose así los perfiles mezcla.

Automatización y rapidez del análisis forense Uno de los principales problemas hoy en los laboratorios forenses es el gran

número de datos electrónicos que se generan regularmente. Desde que una

muestra llega al laboratorio hasta que se escribe el informe pericial son muchos

los pasos que se dan y los resultados analíticos que se producen. Hemos de

tener en cuenta el carácter judicial de las muestras que analizamos, y como

tales han de estar controladas en todo momento, siguiendo una cadena de

custodia tanto de los efectos como de las sub-muestras que se generan de

ellos. Por tanto, en los últimos años ha sido necesario desarrollar sistemas

informáticos que permitieran el manejo fácil y seguro de toda esta información

generada, los LIMS (Laboratory Information Management Systems). Estos

sistemas nos permiten saber dónde están en cada momento las muestras que

se analizan y en qué fase del análisis se encuentran (trazabilidad), nos

proporcionan las herramientas necesarias para las revisiones administrativas

de cada caso y contienen módulos analíticos para estudios de ADN

(comparación y almacenamiento de perfiles genéticos, análisis estadísticos,

etc.).

Las técnicas de análisis en sí también están automatizándose. Existen

hoy en día robots para extraer ADN de un elevado número de muestras en un

par de horas, aunque aún no están preparados para muestras críticas.

También se está realizando un gran esfuerzo en acortar los tiempos de análisis

utilizando tecnologías que permitan realizar PCR multiplexes de un gran

Page 42: BIOLOGIA FORENSE[1]

número de loci (zip-code primers) así como técnicas de genotipaje alternativas

a la secuenciación. La mayor parte de los nuevos métodos de genotipaje se

basan en dos principios: hibridación con oligonucleótidos específicos de alelo y

uso de enzimas modificadores de ADN. Ejemplos del primer tipo serían el uso

de sondas ASO (allele specific oligonucleotides) o de primers específicos de

alelo durante la PCR. Entre los enzimas modificadores de ADN podemos

nombrar la ADN polimerasa (minisecuenciación), la ADN ligasa (ligamiento de

oligos) y las ya clásicas enzimas de restricción).

Estos diferentes métodos de análisis pueden combinarse con multitud de

nuevos métodos de detección. Los sofisticados biochips en todas sus

modalidades (conventional spoting microarrays, electronically activates

microarrays) y la espectrometría de masas (MALDI-TOF), son algunos de los

ejemplos que ya hoy son una realidad en los laboratorios forenses más

punteros.

Page 43: BIOLOGIA FORENSE[1]

TÉCNICAS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN

DE SETAS CON INTERÉS FORENSE Mª JESÚS ITURRALDE PARDO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid. Introducción

A lo largo de los últimos 50 años las intoxicaciones por setas presentan

un crecimiento significativo en todo el mundo. Las causas de este hecho se

deben tanto a la mayor afición de recolectar y consumir setas como al

incremento del consumo voluntario de setas alucinógenas. En cuanto a la

etiología médico legal, la mayor parte son accidentales; le siguen el uso

intencionado de hongos psicoactivos siendo excepcional la etiología homicida o

suicida.

La importancia de los micetismos se encuentra, no tanto en la frecuencia

con que se presentan sino porque los pacientes pueden haber ingerido setas

con toxinas potencialmente mortales. El análisis de laboratorio no sólo sirve

para confirmar el diagnóstico de un micetismo y aportar nuevos taxones al

catálogo de especies tóxicas, sino también para evitar tratamientos agresivos,

hospitalizaciones innecesarias y diagnosticar síndromes mixtos o micetismos

cuyos períodos de incubación queden solapados.

La identificación tradicional de las setas tóxicas se basa en criterios

morfológicos y en la detección de toxinas. Estos análisis en ejemplares muy

deteriorados e incluso triturados, cocinados y a veces en vómitos o heces

suelen ser muy difíciles. Por ello un método de identificación independiente

tanto de la calidad del material fúngico como de la cantidad sería

extremadamente útil. La determinación de especie mediante el estudio de

marcadores genéticos podría ser una buena herramienta.

Page 44: BIOLOGIA FORENSE[1]

Tabla 1. Clasificación de los micetismos en función del periodo de latencia y del órgano sobre el que actúa la toxina.

Periodo de latencia Organo diana Tipo de reacción Toxinas Especies

- Colinérgico Muscarina Clitocybe/Inocybe

- Glutaminérgico Ac. iboténico

Muscimol

Amanita muscaria

Amanita pantherina

- Epileptogénico Hidracinas Giromitra

Sistema nervioso

- Alucinogénico Psilocina

Psilocibina

Psilocybe

- Reacción disulfiram Coprina Coprinus atramentarius Gastrointestinal

- Miscelánea gastrointestinal Boletus sp; Entoloma sp, etc

- Inmunohemolítico Paxilus involutus

Inferior a 6 horas

Alérgico

- Neumónico Lycoperdon sp.

Hígado - Hepototóxico Amatoxinas Amanita phalloides

Lepiota sp; Galerina sp.

Riñón - Nefrotóxico Amanita proxima

Amanita smithiana

Entre 6-24 horas

Otros - Eritromelalgia Acidos acromélicos Clitocybe acromelalga

Clitocybe amoenolens

Riñón - Nefrotóxico Orellanina Cortinarius sp

Sistema nervioso - Neurotóxico Hapalopilus rutilans

Superior a 1 día

Músculo - Rabdomiolisis Tricholoma equestre (*)

Russula subnigricans (*) considerada gran comestible hasta el año 2001

Regiones polimórficas del ADN en hongos. De los diferentes genes del ADN

que han sido investigados en micología, gen de la Beta-tubulina, gen de la

Orotidina descarboxilasa, gen de la Chitina sintetasa, gen de la Actina, gen del

Factor de elongación, son las regiones ITS-1 e ITS-2 (internal transcribed

spacer) del nrDNA las que más se han utilizado para la identificación molecular

de hongos.

Metodología de análisis del ADN. Basada en la Técnica de Amplificación

génica por PCR (Reacción en cadena de la polimerasa). Para amplificar cada

una de las regiones diana de interés en taxonomía se diseñan cebadores

específicos para ellas. Los productos amplificados pueden ser caracterizados

de diferentes maneras. Las técnicas más utilizadas en micología son:

PCR/RAPD (Análisis del ADN amplificado al azar). Se trata de un método en el

que no se necesita tener conocimientos previos sobre el genoma de un

determinado organismo y se realiza a partir del genoma entero. Se utilizan diferentes iniciadores de secuencia arbitraria. Los productos amplificados se

Page 45: BIOLOGIA FORENSE[1]

separan mediante electroforesis. Se obtiene un patrón de bandas PCR/RAPD

para cada especie.

PCR/RFLP (Análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos de

restricción). Esta técnica permite obtener, para cada organismo, una serie de

fragmentos del ADN de diferentes tamaños que dan lugar a un patrón de

bandas PCR/RFLP. Ello se consigue fragmentando la región amplificada

mediante el uso de enzimas de restricción. Comentarios: técnicas rápidas y

económicas pero dan patrones difíciles de interpretar y poco reproducibles.

PCR/SSCA (Análisis conformacionales del ADN de una sola cadena). Es un

método rápido y económico para detectar polimorfismos de secuencia sin

necesidad de secuenciar. Se basa en la movilidad de las cadenas sencillas de

ADN. Los cambios en la migración tienen un alto grado de sensibilidad, de tal

manera que dos cadenas del ADN que difieran en una sola base migrarán de

forma diferente. La región amplificada se desnaturaliza y se realiza una

separación electroforética en condiciones desnaturalizantes. El patrón de

bandas PCR/SSCA es propio para cada organismo. Comentarios: Al igual que

ocurre con las técnicas anteriores, el perfil que se obtiene no es siempre

reproducible pero puede utilizarse como método de screening previo a la

secuenciación.

PCR/Secuenciación. El método más fiable y sensible para detectar la

diversidad genética es la secuenciación directa de los productos de

amplificación de la región diana. La técnica más utilizada es la secuenciación

cíclica con terminadores de cadena marcados con fluorocromos. Las

secuencias de nucleótidos que se obtienen para la región diana en cada

organismo y en diferentes laboratorios pueden ser publicadas en bases de

datos electrónicas (GENBANK, EMBL, etc). Comentarios: en ocasiones puede

que el material de herbario no esté identificado correctamente o que no se

utilice la misma nomenclatura sin olvidar las contaminaciones del laboratorio

debido a una mala praxis. Estas situaciones dan lugar a que existan

secuencias erróneas en las bases de datos públicas. Por ello sería conveniente

disponer de bases de datos propias, cuidadosamente generadas, de las

especies tóxicas.

Page 46: BIOLOGIA FORENSE[1]

Análisis de las secuencias de la región ITS para la identificación de hongos

El análisis comparativo de una secuencia desconocida con las bases de

datos públicas, EMBL o Gen Bank, puede ser un método útil de identificación

de especie. Estas bases de datos disponen, via Internet, de programas de

comparación de secuencias: FASTA y BLAST (Based Local Alignment Search

Tool). Comentarios: aunque existen muchas secuencias publicadas de las

regiones ITS todavía son insuficientes para identificar algunos hongos. El

constante aumento de secuencias permitirá ir identificando las setas

responsables de producir intoxicaciones.

Diseño de test rápidos para la identificación de especie

El alineamiento y comparación de las secuencias nucleotídicas de una

determinada región diana entre ejemplares de la misma y de distinta especie,

permite conocer la variabilidad de la región y si es apta para el diseño de

nuevos test. Cada vez se investiga más el diseño de iniciadores específicos de

especie o sondas TaqMan mediante Real-Time PCR (RT-PCR). Comentarios:

son sistemas de identificación menos problemáticos y más rápidos que la

secuenciación.

Page 47: BIOLOGIA FORENSE[1]

GENETICA FORENSE NO HUMANA: IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES

LOURDES PRIETO SOLLA Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica

La necesidad de estudiar ADN no humano con fines forenses se hace

cada día más patente y actualmente es frecuente que se solicite a los

laboratorios el análisis de muestras de origen no humano. Existen multitud de

situaciones en las que cabe este tipo de análisis: restos de origen no humano

en la escena del crimen (pelos de animales domésticos, restos vegetales, etc),

tráfico ilegal de especies protegidas o en peligro de extinción, identificación de

fauna cadavérica con el fin de estimar la data la muerte (identificación de larvas

de insectos), fraude en la composición de alimentos procesados, investigación

de accidentes de tráfico causados presuntamente por animales, negligencia

médica en casos de infecciones (transmisión de VIH o hepatitis C),

bioterrorismo (ántrax), etc.

El análisis de restos biológicos no humanos con interés forense se ha

abordado tradicionalmente mediante estudios inmunológicos o análisis de proteínas. Estos métodos encuentran su limitación cuando las muestras a

estudiar no se encuentran en condiciones idóneas de conservación. Con el

desarrollo de la biología molecular han surgido nuevos métodos basados en las

diferencias genéticas entre especies. El análisis de ADN mitocondrial (ADNmt)

es el más apropiado para estudiar restos no humanos fundamentalmente por

dos motivos: (i) la gran cantidad de copias por célula permite que muestras

críticas, que no dan resultados con el estudio de ADN nuclear, puedan ser

analizadas (pelos, alimentos tratados) y (ii) su tasa de mutación es más rápida

que la del ADN nuclear, hecho que permite encontrar diferencias en las

secuencias de especies muy cercanas.

Las regiones de ADNmt más utilizadas en genética forense con fines de

identificación de especie son el gen responsable del citocromo b (cytb) y los

ADNs ribosómicos 12S y 16S. Los análisis se realizan mediante PCR y

posterior secuenciación del producto amplificado. Para ello, dentro de estas

tres regiones se han buscado dos tipos de zonas nucleotídicas: (i) zonas muy

Page 48: BIOLOGIA FORENSE[1]

conservadas (con poca variabilidad entre especies) con el fin de poder diseñar

primers universales que permitan la amplificación de ADN de los principales

grupos taxonómicos y (ii) zonas menos conservadas que permitan la

discriminación entre las muestras estudiadas al menos a nivel de género. Así,

con un único par de primers se puede amplificar cada región en distintas

especies y la secuencia obtenida tras la amplificación puede comparase con

secuencias conocidas de diferentes especies.

El uso de esta técnica implica el conocimiento de la filogenia de las

especies involucradas, el manejo de las bases de datos de secuencias de ADN

disponibles en la red (GenBank, EMBL), así como el uso de los softwares de

comparación de secuencias (ej: BLAST, CLUSTAL). Es fundamental, por tanto,

que el biólogo forense se familiarice con las herramientas que la bioinformática

pone a nuestra disposición.

Una base de datos biológica es una lista de datos persistentes larga y

organizada, asociada generalmente a un software automatizado diseñado para

actualizar, buscar y recuperar los datos almacenados dentro del sistema.

Actualmente existen organismos que proporcionan bases de datos gratuitas

para que los usuarios las puedan utilizar a través de Internet. Uno de los

organismos que más ha desarrollado las bases de datos biológicas y las

herramientas bioinformáticas es el NCBI (National Center for Biotechnology

Information). Este organismo dispone de una página web

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) muy útil que y que la mayoría de investigadores

del campo de la genómica y la proteómica manejan habitualmente. El NCBI

tiene múltiples bases de datos biológicas (de secuencias, de proteínas, de

genomas, taxonómica, de publicaciones, etc) ligadas entre sí, de tal forma que

se puede usar un único sistema de búsqueda y recuperación de datos llamado

ENTREZ. Este sistema de búsqueda permite que un usuario tenga acceso y

recupere información de muchas bases de datos a la vez. Por ejemplo, la base

de datos de secuencias de ADN Entrez está ligada a la base de datos de

taxonomía Entrez. Esto permite al investigador encontrar información

taxonómica de la especie a la que pertenece la secuencia.

Otro de los recursos que ofrece el NCBI y que más se utilizan en biología

forense es el software BLAST (Basical Logical Alignment Search Tool). Entre

otras aplicaciones este software ofrece la posibilidad de comparar la secuencia

Page 49: BIOLOGIA FORENSE[1]

que hemos obtenido en el laboratorio con las secuencias presentes en las

bases de datos de manera automática.

Aunque las bases de datos de ADN están en constante crecimiento,

para ciertos organismos no existen datos de las secuencias que nos interesan.

Como consecuencia de esto, el éxito en la identificación del origen de una

muestra forense no humana depende en gran medida de la disponibilidad de la

secuencia de interés en la base de datos. Sin embargo, este problema puede

superarse cuando en la base de datos existen secuencias de especies

relacionadas con nuestra muestra problema o tenemos idea de qué especie

puede tratarse mediante datos no genéticos del caso en cuestión (por ejemplo,

el análisis de pelos encontrados en un vehículo involucrado en el robo de

abrigos de visón). En estas situaciones podemos recurrir al análisis de una

muestra indubitada de la especie que sospechamos y a la comparación de

dicha muestra de referencia con nuestra muestra problema.

Por otro lado, no es extraño que tanto cytb, como 12S y 16S presenten cierto

nivel de polimorfismo, lo cual complica la interpretación de los resultados. Así,

secuencias similares en un 98% de sus nucleótidos pueden derivarse tanto de

distintos miembros de la misma especie como de dos especies estrechamente

relacionadas que se han separado recientemente.

En ocasiones el problema que se nos plantea es comprobar si los restos

biológicos encontrados en el lugar de los hechos coinciden en cuanto a especie

con los restos encontrados en, por ejemplo, las ropas de un sospechoso. En

los casos en los que no tenemos idea de a qué tipo de organismo pueden

pertenecer o el posible organismo está pobremente caracterizado a nivel

genético en las bases de datos, podemos recurrir al análisis de sus ADNs por

medio de RAPDs (random amplified polimorphic DNA). La técnica consiste en

el desarrollo de una reacción PCR en la que los primers se han diseñado al

azar. Estos primers de corta longitud (8-12 nucleótidos) anillan en diferentes

regiones del genoma del organismo problema generando productos

amplificados al azar de diferente longitud. Los fragmentos pueden separarse

mediante electroforesis dando un patrón de bandas característico de la

especie.

Muchos laboratorios forenses españoles tienen ya la tecnología

necesaria para el análisis de los fragmentos mitocondriales cytb, 12S o 16S.

Page 50: BIOLOGIA FORENSE[1]

Sin embargo queda mucho trabajo por hacer en identificaciones de restos

vegetales o de microorganismos. Sin duda, la genética forense no humana es

una nueva puerta que se abre para responder a las preguntas aquí expuestas,

pero el campo es tan amplio que se necesitarán grandes inversiones para

satisfacer tan amplia demanda.

Page 51: BIOLOGIA FORENSE[1]

VALORACIÓN ESTADÍSTICA DE LA PRUEBA DE ADN

MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla.

Una vez obtenidos los perfiles genéticos resultantes de la

individualización de una muestra biológica mediante la aplicación de la

tecnología del ADN, éstos carecen de valor sin una valoración estadística

apropiada. En otro capítulo se tratará con más detalle la valoración estadística

en casos de filiación, por lo que aquí nos referiremos sólo a los casos de

investigación criminal.

En la mayoría de estos casos, la prueba del ADN sólo tiene sentido si es

posible una comparación de perfiles de un vestigio frente a una muestra

indubitada o entre diferentes vestigios. Cuando se trata de investigar si un resto

biológico puede pertenecer a un determinado individuo o al donante de otros

vestigios, es necesario realizar un cotejo de los perfiles genéticos obtenidos. Si

los perfiles son distintos, puede asegurarse que ese resto biológico no

pertenece al individuo en cuestión o que ambos vestigios proceden de

personas diferentes. Pero si existe una coincidencia entre los perfiles

comparados es necesario hacer una valoración estadística para estimar el

grado de incertidumbre de que esos perfiles coincidan entre sí sólo por

cuestiones de azar y no porque procedan del mismo individuo. Para ello se

requiere disponer de datos fiables sobre las frecuencias de los alelos presentes

en la población de referencia, las cuales se estimarán mediante la realización

de estudios poblacionales basados en el tipado de numerosos individuos no

relacionados.

Para estimar el valor de la prueba es necesario considerar (al menos)

dos hipótesis alternativas para su ocurrencia. La prueba debe evaluarse

calculando su probabilidad bajo cada una de las hipótesis. Por ejemplo, se

detecta una mancha de semen en la prenda de una víctima de agresión sexual

y el perfil genético del semen coincide con el del sospechoso. Es necesario

establecer dos hipótesis alternativas, que en este caso serían: H0: el semen

Page 52: BIOLOGIA FORENSE[1]

pertenece al sospechoso; H1: el semen pertenece a un individuo al azar de la

población. A continuación se procede a calcular la probabilidad de obtener ese

perfil genético para el semen bajo la hipótesis H0, y bajo la hipótesis H1. La

valoración más correcta consiste en calcular, mediante la aplicación del

teorema de Bayes, la razón de verosimilitud o LR (“Likelihood Ratio”) que es

el cociente entre ambas probabilidades. El resultado obtenido refleja cuántas

veces la coincidencia de perfiles es más probable si consideramos la hipótesis

H0, (o sea, que el semen pertenezca al sospechoso) que si consideramos la

hipótesis H1, (que el semen pertenezca a un individuo al azar de la población).

Un elemento importante en la comparación de perfiles genéticos con

fines de investigación criminal o en casos de identificación reside en la creación

de bases de datos de ADN, aspecto que se tratará más detalladamente en otro

capítulo.

Page 53: BIOLOGIA FORENSE[1]

ORÍGENES POBLACIONALES MEDIANTE MARCADORES DE HERENCIA

UNIPARENTAL: ADN MITOCONDRIAL y CROMOSOMA Y

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. La primera pregunta que tal vez pudiera plantearse un alumno de este

curso podría ser ¿qué sentido tiene hablar de los orígenes poblacionales en un

curso de Biología Forense?. La respuesta a esta pregunta hay que buscarla en

los propios fundamentos de la genética forense, que no son sino, la aplicación

de conceptos de la Genética de Poblaciones a la identificación de individuos.

En este sentido, siempre que obtenemos un perfil genético (STRs autosómicos,

ADN mitocondrial, STRs de cromosomas X e Y) es necesario realizar una

valoración estadística de dicho perfil mediante comparación con la población de

referencia. Esto requiere, por un lado, conocer qué frecuencias alélicas definen

a dicha población y por otro, qué distribución haplotípica o de haplogrupos

presenta respecto al ADN mitocondrial y al Cromosoma Y. Estos dos

marcadores, como ya se ha explicado a lo largo del curso, se caracterizan

entre otras cosas, por presentar un modo de herencia uniparental; el ADN

mitocondrial es transmitido por la madre a todos sus descendientes y el

cromosoma Y es transmitido por el padre a sus hijos varones. Este hecho

biológico nos permite trazar linajes a lo largo de la historia hasta remontarnos al

origen de nuestros antepasados.

Con respecto al origen de los humanos anatómicamente modernos (del

que derivan las poblaciones humanas actuales) se han expuesto dos hipótesis

alternativas. La primera de ellas, llamada multirregional o policéntrica, explica

que los humanos modernos surgieron al mismo tiempo en cuatro regiones

distintas, llevando una evolución paralela a través de largos períodos de

tiempo, teniendo a la migración y a la selección natural como principales

motores del proceso evolutivo. La otra hipótesis, conocida como OUT OF

AFRiCA, se basa en que los humanos modernos se originaron en África y

desde allí emigraron hacia Asia y Europa y después a América y Oceanía. Esta

Page 54: BIOLOGIA FORENSE[1]

segunda hipótesis, más aceptada por la comunidad científica internacional, ha

sido apoyada por estudios de ADN mitocondrial y de cromosoma Y. En otras

palabras, parece claro que los humanos anatómicamente modernos del que

derivan todas las poblaciones actuales surgieron como un único proceso de

especiación originado en África, aunque no está del todo claro si estos

humanos llevaron un reemplazamiento total o parcial de las otras especies de

homínidos existentes, como los neardentales en Europa.

Como hemos dicho anteriormente, estos humanos anatómicamente

modernos llegaron a Europa. Existen opiniones contrarias en relación con

cómo se produjo el poblamiento de este continente. Para muchos genetistas,

encabezados por la figura de Cavalli-Sforza, Europa se pobló durante el

Neolítico a través de la llegada de colonos agricultores procedentes de Oriente

Medio, a juzgar por lo que muestran los análisis genéticos de marcadores

clásicos. Sin embargo, para otros genetistas como M. Richards, V. Macaulay y

A. Torroni, basados en los análisis de ADN mitocondrial, y O. Semino en los de

Cromosoma Y, llegan a la conclusión de que Europa ya estaba poblada

durante el Paleolítico, que además se produjo una expansión desde los pocos

territorios libres de hielo en la última glaciación y que hubo una pequeña

colonización durante el Neolítico.

Una controversia parecida se da con respecto al poblamiento de

América. Para A. Torroni et al. y basados en estudio de ADN mitocondrial, el

poblamiento llegó procedente de Asia, entrando un haplotipo de cada uno de

los haplogrupos existentes en América en tres oleadas diferentes. Sin

embargo, para Merriwheter et al. en América entraron varios haplotipos de ADN

mitocondrial en una sola oleada.

Haremos una pequeña mención a dos poblaciones: la brasileña y los

inuits. Brasil se caracteriza por ser la población más diversa del mundo desde

el punto de vista genético-poblacional. De hecho, podemos encontrarnos dos

individuos fenotípicamente muy distintos (blanco y mulato) y presentar ambos

el mismo haplogrupo de ADN mitocondrial o de Cromosoma Y. A modo de

ejemplo, el 28% de la población blanca de Brasil tiene una ADN mitocondrial

africano, que puede explicarse por ser el resultado de la masiva llegada de

esclavos desde el Golfo de Guinea ocurrida en siglos anteriores. Algo similar,

pasa con la población de los Inuits, en la que al analizar el ADN mitocondrial y

Page 55: BIOLOGIA FORENSE[1]

el Cromosoma Y se observa que el marcador materno es amerindio y el

paterno, europeo. Se sabe que a estos territorios de hielo llegaron colonos

procedentes de Europa y que era costumbre en estas poblaciones esquimales

ofrecer alimento, alojamiento y la mujer a sus huéspedes, de ahí el haplogrupo

europeo observado en esta población.

Se presentarán los datos obtenidos de un estudio de ADN mitocondrial

realizado por el departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y

Ciencias Forenses en la población andaluza. Cuestiones tales como ¿qué

legado genético han dejado los ocho siglos de invasión árabe en Andalucía?

¿encaja el sustrato mitocondrial en la variabilidad europea? ¿qué origen tiene

la población andaluza? ¿hay homogeneidad genética entre las provincias?,

entre otras, serán resueltas en este curso.

Por último, y enlazando con el principio de este resumen, se presentarán

ejemplos de la aplicación forense que tiene conocer la distribución geográfica o

el origen de los patrones de ADN mitocondrial y de Cromosoma Y.

Page 56: BIOLOGIA FORENSE[1]

INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO

JUAN ANTONIO LUQUE GUTÍERREZ Jefe del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona.

La investigación biológica de la paternidad en un sentido amplio

(investigación biológica del parentesco), abarca cualquier estudio de la relación

biológica entre dos individuos, ya que una relación genética entre dos

individuos, siempre puede resolverse como una sucesión de relaciones

paternofiliales ascendentes y descendentes dentro de un árbol genético, por

muy distantes que sean sus posiciones. Así podemos hablar del estudio más

simple como es el caso estándar (trío Presunto Padre-Madre-Hijo/a), de

paternidad/maternidad con un solo progenitor, de estudios con abuelos, estudio

de hermanos, paternidades a partir de familiares (cuando el padre está fallecido

o no disponible), etc...

Casos especiales de estos estudios son los casos de desastres en

masa, identificaciones de restos cadavéricos, o la búsqueda de familiares del

autor de un delito a través de una base de datos, que tienen como base los

estudios de paternidad pero que conllevan una problemática asociada adicional

que se verá en otro momento en este mismo curso.

También pueden considerarse paternidad/maternidad en su sentido

amplio el estudio de marcadores de cromosoma Y y de ADN mitocondrial,

estudiando en este caso no una relación p(m)aternofilial directa, sino una

relación genética de toda una línea genética padres/hijos o madres/hijos. En

ocasiones (algunos laboratorios de rutina) emplean estas técnicas como

complementarias en los estudios de paternidad.

El estudio de la paternidad en su sentido más estricto, como es el aclarar

la paternidad (maternidad) biológica de un hijo cuestionado, tiene unas

implicaciones legales (aunque se haga de forma privada y no judicial) que hay

que tener presentes. Por suerte, tanto la legislación como la ciencia han

Page 57: BIOLOGIA FORENSE[1]

llegado a un punto en el que es posible la investigación de la paternidad con

garantías suficientes, pero no siempre ha sido así.

Desde el principio de la historia de una u otra manera se ha permitido o

prohibido la investigación de la paternidad. En un principio la ciencia no

disponía de herramientas adecuadas para su resolución, pero se recurría a la

investigación de otros indicios. Así podemos considerar que el Rey Salomón

celebró el primer juicio de paternidad (en este caso maternidad) documentado

históricamente (en la Biblia), en el que se recurrió a métodos “psicológicos”.

Durante mucho tiempo, la ciencia no pudo aportar métodos adecuados para

dicha investigación, recurriéndose a métodos circunstanciales (como el tiempo

de gestación) o físicos (color de pelo, ojos, parecido...). No fue hasta la

descripción del grupo ABO por Landsteiner en 1900 y la descripción de su

transmisión hereditaria en 1910, que se dispuso de pruebas objetivas, naciendo

así la hemogenética forense. Desde entonces se han utilizado gran cantidad de

sistemas genético moleculares hasta nuestros días en que los estudios de ADN

han desplazado por su potencia y facilidad al resto de técnicas.

En España, no es hasta 1978 que la Constitución Española en su

articulo 39.2 establece que “...La ley posibilitará la investigación de paternidad”,

y posteriormente en 1981 se produce la reforma del Código Civil recogiendo en

su artículo 127 que “En los juicios sobre filiación será admisible la investigación

de la paternidad y de la maternidad mediante toda clase de pruebas, incluidas

las biológicas”. Desde entonces, el desarrollo ha sido vertiginoso, uniéndose, a

los escasos laboratorios que por entonces hacían pruebas, un sinfín de

laboratorios cada vez más dotados, y que hoy día pueden considerarse de

primer nivel a escala mundial.

En cuanto a las técnicas utilizadas, los primeros laboratorios utilizaban

una larga batería de grupos sanguíneos, enzimas y proteínas polimórficas y

HLA, mediante reacciones antígeno-anticuerpo o mediante técnicas

electroforéticas. Dichas técnicas suponían un gran trabajo, pero la potencia

obtenida era la justa. La aplicación en el campo forense por Jeffreys en 1985

del análisis de VNTR de ADN mediante las llamadas “sondas” supuso una

revolución, ya que permitía poder analizar directamente genotipos y no

fenotipos como hasta entonces. Al final de los 80 ya se hacían en España,

permaneciendo hoy día un par de laboratorios que todavía mantienen una

Page 58: BIOLOGIA FORENSE[1]

variante, dado que tienen gran capacidad de discriminación. Sin embargo, en el

mismo 1985, K. Mullis descubrió un proceso al que denominó reacción en

cadena de la polimerasa (PCR), por la que luego recibiría el premio Nobel, que

imita la replicación del ADN de las células en un tubo, consiguiendo hasta un

millón de copias de pequeños fragmentos de ADN. Desde el principio de los 90,

la mayoría de los laboratorios trabajan mediante análisis de marcadores de

PCR.

La prueba biológica la podemos dividir en varias fases:

● Toma de muestras Este punto es fundamental para una buena pericia. No puede haber un

análisis de calidad si las muestras no son adecuadas. Ya antes de comenzar

hay que hacer una selección de las personas que realizarán la prueba. En

casos estándar (PP-M-H) los individuos vienen predefinidos, pero hay que

tener mucho cuidado en asegurarse de que se toman las muestras con todas

las garantías necesarias, y que se rotulan y se procesan de forma que se

minimice la posibilidad de un cambio de muestras o un fraude de identidad. En

casos complejos (cuando no se dispone del padre), la elección de familiares es

crucial para poder alcanzar un resultado fiable, siendo uno de los puntos que

más aumentan el resultado final el disponer de la madres del hijo dubitado y de

otros hijos “legítimos” si es que se necesita. En ocasiones los individuos vienen

condicionados por el propio caso, y por tanto no se pueden elegir teniendo que

realizar la prueba con las muestras disponibles.

● Obtención de perfiles de ADN y análisis genético Como ya hemos comentado anteriormente, la mayoría de laboratorios

usan hoy día marcadores de PCR. Es necesario disponer de una amplia

batería de marcadores para conseguir lo que llamamos un “poder de exclusión

a priori” alto, o lo que es los mismo, la probabilidad de excluir de forma directa

a un presunto padre falsamente acusado. Para casos de tríos, con 13-15

marcadores suele ser suficiente. A partir de ahí, es como un puzzle, cuantas

más piezas tengamos, más fácil es saber que dibujo contiene. Por tanto si la

información genética que se aporta es baja (por falta de individuos o por

Page 59: BIOLOGIA FORENSE[1]

tratarse de relaciones genéticas lejanas), la cantidad de marcadores que se

usen debe incrementarse.

Los análisis genéticos en estos casos suelen ser fáciles, ya que las

muestras se suelen recoger en abundancia y en condiciones óptimas. En casos

forenses, a veces las muestras no son tan buenas, teniendo que recurrir a

estrategias especiales.

Hay que tener en cuenta que además de las leyes de la genética y de la

estadística, hay que tener en cuenta las leyes de Murphy, y saber que todo el

proceso se realiza partiendo de unos supuestos teóricos, que a veces se

alteran con anomalías varias como pueden se mutaciones, trisomías,

superfecundaciones, etc.

Una vez que tenemos unos perfiles genéticos, hay que contrastar los

resultados para comprobar la compatibilidad genética antes de pasar a la

siguiente fase, que es la valoración estadística. La valoración genética se basa

en los principios de la herencia mendeliana, sabiendo que cada individuo de los

dos alelos (variantes) que presenta para cada marcador (pseudogen) hereda

uno de su padre y otro de su madre. Si sabemos cual es el alelo que transmite

la madre, tendremos cual es el alelo “obligatorio” que ha transmitido el padre

biológico, y podremos contrastar con el presunto padre si posee dicho alelo o

no. En caso de que no lo posea hablamos de exclusión, y por tanto de

incompatibilidad genética. En caso de compatibilidad habrá que valorar

estadísticamente los resultados como veremos más adelante. No obstante,

debido a que en ocasiones hay anomalías como hemos comentado

anteriormente, en caso de exclusiones aisladas o incluso de únicamente dos

exclusiones, se suele valorar igualmente la prueba con las pertinentes

modificaciones.

En casos más complejos, la solución se complica, puesto que puede ser

que la madre no esté disponible, o lo que es peor, que no lo esté el presunto

padre. En estos casos, lo que se hace es reconstruir el posible perfil genético.

Si no se obtiene el perfil completo, habrá que valorar todas las combinaciones

genéticas compatibles con los individuos analizados, y a su vez comprobar si al

menos una de las combinaciones es compatible con el hijo. Si todas son

incompatibles, volveremos a hablar de exclusión. En caso contrario, habrá que

valorar estadísticamente todas las combinaciones de forma ponderada.

Page 60: BIOLOGIA FORENSE[1]

● Valoración estadística Una vez demostrada la compatibilidad de las personas estudiadas,

habrá que valorar dicha compatibilidad.

De forma simplificada y genérica podemos decir que el cálculo de

paternidad se basa en calcular la probabilidad del genotipo del hijo (aunque

este cálculo se ve afectado por múltiples circunstancias). Habrá que diferenciar

cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.

Hijo homozigoto (AA):

Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita A

Pr(AA) = P->A x M->A

Hijo heterozigoto (AB):

Prob. genotipo hijo = prob. Padre trasmita A x prob. Madre trasmita B +

+prob. Padre trasmita B x prob. Madre trasmita A

Pr(AB) = P->A x M->B + P->B x M->A

Estas fórmulas las vamos a usar continuamente para valorar las

paternidades, y en función de cada tipo de caso este padre (P) y esta madre

(M) variarán y por tanto las probabilidades de transmisión variarán.

De forma genérica podemos decir que si tenemos un progenitor de

genotipo conocido homozigoto la probabilidad de transmisión del alelo es 1, ya

que no tiene otra opción y en el 100% de los casos lo trasmite. Si el progenitor

es heterozigoto, la probabilidad de transmisión de cada alelo es la mitad, o sea

0,5. Si el progenitor no tiene el alelo, la probabilidad de transmisión será 0.

Page 61: BIOLOGIA FORENSE[1]

Probabilidad de transmisión del alelo

A

AA -> 1

AB -> 0,5

BB,BC -> 0

Si desconocemos el genotipo del progenitor la probabilidad de

transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador, es decir la

probabilidad de transmisión del alelo A será a.

Para la valoración, se establecen siempre dos hipótesis excluyentes:

H1: el presunto padre (PP) es el padre biológico del hijo

H0: el presunto padre (PP) no es el padre biológico del hijo y por

tanto es otro hombre

Estas dos hipótesis tienen una probabilidad (condicionada) en función de

la información del caso (I) y del análisis genético (E de evidencia genética). A

través del teorema de Bayes podemos expresarlas en forma de cociente u

“odds”:

I)|(HI)|(Hx

I),H|(EI),H|(E=

I)E,|(HI)E,|(H

0

1

0

1

0

1

PrPr

PrPr

PrPr (Fórmula 1)

Como podemos ver hay tres términos:

Odds a posteriori = LR x Odds a priori

El odds a posteriori es lo que intenta determinar el juzgador, es decir,

saber en función de la información del caso que tiene, genética (E) y de otro

tipo (I), la relación a favor/en contra de la paternidad. Para ello hay que

combinar el LR (likelihood ratio o coeficiente de verosimilitud) con los odds a

priori. El LR es el valor que puede obtener el laboratorio, que en casos de

Page 62: BIOLOGIA FORENSE[1]

paternidad de denomina Índice de Paternidad (IP).

Los odds a priori es un valor que debe proporcionar el juzgador, y que no

viene a ser otra cosa que la relación a favor en contra de la paternidad que se

tiene antes de realizar la prueba genética (con las evidencias no genéticas).

Tradicionalmente se establece, a falta de otra indicación, un a priori neutro, es

decir, que hay las mismas probabilidades a favor que en contra. No obstante,

este valor puede no ser adecuado, y de hecho se discute que es incluso

erróneo. En varios países, los tribunales proporcionan un a priori concreto e

incluso se hace el cálculo con un panel de a prioris diferentes.

En el caso de las paternidades

Pr(H1|E,I)=1- Pr(H0|E,I)

Pr(H1|I)=1- Pr(H0|I) (Fórmula 2)

Por lo que sustituyendo nos queda

[ ]I)|(H+I)|(HLRI)|(HLR=I)E,|(H

11

11 Pr1Pr

PrPr−×

×

Donde Pr(H1|E,I) es la probabilidad de paternidad o W (Wahrscheinlickeit

según Essen-Möller) y Pr(H1|I) es la probabilidad de paternidad a priori. Si

consideramos que la probabilidad de paternidad a priori es igual que la

probabilidad de no paternidad, y por tanto igual a 0,5 (aplicar fórmula 2),

tendríamos la ecuación de Essen-Möller:

W=LR/(LR+1)=1/(1+1/LR) (por tanto LR=W/(1-

W))

En general, para simplificar tendremos que asumir una serie de

premisas:

1. Ambos progenitores biológicos (Padre y Madre) no están relacionados

genéticamente

Page 63: BIOLOGIA FORENSE[1]

2. Hay equilibrio de Hardy-Weinberg en la población de referencia (lo que

implica que no hay subestructuración poblacional, que los marcadores son

independientes y que no hay alelos silentes)

3. No ocurren mutaciones

4. La herencia es mendeliana con sistemas codominantes

Ninguna de las premisas son ciertas en mayor o menor grado, y hay que ser

conscientes de si conocemos dichas circunstancias y en que manera pueden

alterar nuestros resultados.

Asumiendo todas las premisas expuestas vamos a abordar el caso más

simple al que podemos enfrentarnos, el caso estándar (trío PP-M-H). Para

calcular el IP (LR) lo que tenemos a nuestra disposición es el tipaje genético

del presunto padre (padre alegado), madre e hijo para un número adecuado de

marcadores. Suponemos la maternidad cierta, y que a priori se excluye

cualquier pariente próximo del presunto padre. El IP total será el producto de

los IP de cada marcador.

Tradicionalmente se expresa el IP como el cociente X/Y siendo

X=Pr(E|H1,I) e Y=Pr(E|H0,I). La evidencia genética que tenemos (E) son los

genotipos del presunto padre, madre e hijo (GP, GM, GH). Por tanto:

I),H|(GI),H|(G=

I),H|(EI),H|(E=

YX=LR=IP

HMP

HMP

0

1

0

1

G ,G ,PrG ,G ,Pr

PrPr

Dónde aplicando la tercera ley de la probabilidad

I),H|(GI),H|(G

I),HG|(GI),HG|(G=

YX=IP

MP

MP

MPH

MPH

0

1

0

1

G ,PrG ,Pr

,G ,Pr ,G ,Pr

×

(Fórmula 3)

En esta ecuación en el segundo término, los genotipos de los padres son

independientes de las hipótesis, por lo que serán iguales en el numerador y en

el denominador, y por tanto su valor será 1. En otros casos (complejos) no será

así y no se eliminarán de los cálculos. Aun así hay autores que prefieren no

Page 64: BIOLOGIA FORENSE[1]

eliminarlos de las fórmulas y por tanto la X y la Y serán algo diferentes a las

que veremos.

Para hacer más comprensible la explicación abandonaremos la notación

estadística a partir de aquí y volveremos a la notación más genética y genérica

que es más intuitiva. El desarrollo completo puede encontrarse en varios

textos.

Como vimos antes se trata de calcular la probabilidad del genotipo del

hijo condicionada al genotipo de los padres bajo ambas hipótesis diferenciando

cuando el hijo es homozigoto y heterozigoto.

Hijo homozigoto (AA):

AMAAMA=

YX=IP

→×→→×→

PobPP

Hijo heterozigoto (AB):

AMB+BMAAMBPP+BMA=

YX=IP

→×→→×→→×→→×→

PobPobPP

En la X usaremos los genotipos de los padres (presunto padre: PP y

madre biológica: M) y aplicaremos las probabilidades de transmisión que vimos

anteriormente.

En el caso de la Y (denominador), consideramos que el padre no es el

presunto padre, sino otro individuo no relacionado (padre alternativo), lo que se

conoce como padre de la población (Pob). En este caso la probabilidad de

transmisión será la frecuencia poblacional para dicho marcador. Para la madre,

que conocemos su genotipo hacemos igual que en el numerador (X).

Habrá casos en los que el padre es incompatible con la combinación

Madre-Hijo, por lo que el valor de X será cero, y por tanto el IP será cero.

Para casos más complejos, las premisas modifican los cálculos, y en

casos defectivos hay que jugar con el calculo ponderado de todas las

Page 65: BIOLOGIA FORENSE[1]

combinaciones posibles. Con unos ejemplos prácticos podremos entender

mejor la forma de calcularlo.

● Emisión de informe y defensa ante los tribunales

Una vez valorada la prueba, tanto genéticamente como

estadísticamente, hay que emitir un informe. En dicho informe se deben reflejar

todos los datos que afecten a la valoración, como técnicas y marcadores, las

referencias poblacionales empleadas, y las hipótesis valoradas y los

resultados.

Deben evitarse aseveraciones como “es el padre”, ya que lo que hace el

laboratorio es evaluar únicamente la evidencia genética mediante el IP, y por

tanto siempre hablamos de probabilidades que no son absolutas.

Si es requerido, el perito deberá defender y explicar su informe ante los

tribunales, cuestión harto difícil, dado el desconocimiento de personas ajenas a

la genética de temas tan complejos.

Page 66: BIOLOGIA FORENSE[1]

IDENTIFICACIÓN DE RESTOS CADAVÉRICOS

MANUEL LÓPEZ SOTO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla. La aparición de restos humanos en lugares tan diversos, la exhumación

de restos óseos cuando está en litigio alguna prueba de filiación, los

accidentes domésticos y de tráfico, los últimos atentados terroristas que están

conmocionando al mundo, están haciendo que la identificación de restos

cadavéricos forme parte de la rutina diaria de un laboratorio de biología legal o

forense.

Cuando se trata de identificar a individuos vivos podemos recurrir a

multitud que mecanismos que permiten resolver esta cuestión de forma rápida,

como por ejemplo, los datos fisonómicos, el peso, la talla, el registro de voz, el

D.N.I. Sin embargo, cuando queremos identificar un cadáver, es decir,

reconocer si una persona es la que se busca, todos esos mecanismos que en

principio parecen tan obvios para los sujetos vivos, en el caso de los

cadáveres, brillan por su ausencia en ocasiones.

Cuando nos encontramos ante unos restos cadavéricos que

necesitamos identificar unos restos cadavéricos, es preciso observar en primer

lugar el estado de conservación en el que se encuentra. Éste dependerá de si

se han puesto en marcha o no los procesos de destrucción natural tales como

los mecanismos de autólisis, originados por la fermentación anaeróbica de las

enzimas propias del organismo y los mecanismos de putrefacción originados

por la contaminación bacteriana. No obstante, en algunos casos, el cadáver se

puede encontrar, de forma natural o artificial, conservado en estados de:

momificación, embalsamación, saponificación, corificación o congelación.

De forma general, un cadáver se puede identificar siguiendo tres etapas

independientes entre sí o consecutivas: datación de los restos cadavéricos

mediante unos criterios morfológicos y químicos; un diagnóstico de especie

mediante análisis inmunológicos o de ADN y por último, un diagnóstico

Page 67: BIOLOGIA FORENSE[1]

individual mediante la determinación de la etnia, sexo, talla, y por supuesto,

ADN.

Cuando un laboratorio de biología forense se enfrenta a la identificación

genética de unos restos humanos, se va a encontrar con el problema de que

posiblemente en dichos restos se han puesto en marcha los mecanismos de

modificación del ADN postmortem, cuyos agentes causales son los agentes

oxidantes, las radiaciones ultravioletas, la humedad, la temperatura, los

microorganismos y el pH ambiental. Todos estos factores, además de producir

daños moleculares van generar un foco de contaminación y una fuente de

posibles inhibidores que requerirá una excelente praxis pericial por parte del

laboratorio.

Desde el punto de vista del análisis genético y con relación a qué tipo de

muestra se selecciona para su análisis, existe un gran consenso en el ámbito

internacional. El orden más lógico de selección sería, en primer lugar, sangre;

en segundo lugar, músculo o pelos con raíz y, en tercer lugar, dientes o

huesos, prefiriendo de estos últimos, los huesos largos a los cortos o planos.

Aunque cada laboratorio puede elegir el método de extracción que más

crea más conveniente, nosotros recomendamos para la sangre fenol-

cloroformo-isoamílico (FCI) seguido de un paso de microfiltración-purificación o

precipitación con etanol (si la sangre está en mal estado) o mediante columnas

de extracción del tipo GFx o NSB (si la sangre es líquida y está en buen

estado); para el músculo, los pelos, los huesos o los dientes también

recomendaríamos el mismo método de extracción expuesto para la sangre en

mal estado. No obstante, tanto los huesos como los dientes necesitarán de un

procesado previo consistente en: limpieza, para eliminar restos de suciedad

adheridos a los mismos, exposición a U.V., para eliminar contaminantes

superficiales, pulverización en nitrógeno líquido, descalcificación (opcional) y

extracción orgánica con FCI. Los huesos, además, se someterán a un lijado y

corte en secciones transversales de la superficie que se va a analizar entre el

paso de lavado y pulverización.

Una vez extraído el ADN de los restos cadavéricos se cuantificará y se

decidirá si analizar marcadores de STRs (autosómicos como de cromosoma Y)

o ADN mitocondrial.

Page 68: BIOLOGIA FORENSE[1]

Por último, se comentarán algunas de las identificaciones de interés

histórico como fueron las de Josef Mengele y Martin Bormann, las de Jesse

James, las de la familia Romanov y las del Tercer Presidente de los Estados

Unidos, Thomas Jefferson. También abordaremos, dado el interés social que

ha generado en la actualidad, la identificación de los restos óseos de Cristóbal

Colón y de Diego Colón, su hermano, así como las de Hernando Colón, hijo del

afamado almirante.

Page 69: BIOLOGIA FORENSE[1]

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA EN GRANDES CATASTROFES

ANTONIO ALONSO ALONSO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid.

La utilización de bases de datos de ADN cobra también una vital

importancia en los procesos de identificación humana en grandes catástrofes

en los que a menudo se requiere el uso de herramientas bioinformáticas

capaces de realizar búsquedas sistemáticas de un alto número de perfiles de

ADN de acuerdo a diferentes algoritmos y que al mismo tiempo permitan

evaluar con rapidez la significación estadística (LR) de los distintos grados de

coincidencia observados entre los perfiles genéticos de las muestras post-

mortem y los perfiles obtenidos de las posibles muestras antemortem de las

víctimas (utensilios de aseo personal, biopsias,...) o de muestras de referencia

(sangre o saliva) de sus familiares vivos.

Existe un conjunto interrelacionado de factores y circunstancias que

pueden comprometer o dificultar el objetivo final de la identificación genética de

las víctimas de una gran catástrofe, tales como: (1) el número de víctimas y

modelo poblacional (población abierta o cerrada), (2) los mecanismos de

destrucción de los cuerpos, (3) el grado de fragmentación, (3) el estado de

degradación del ADN, (4) la accesibilidad a las muestras post-mortem o (5) el

tipo de muestra de referencia disponible.

En esta lección examinaremos las diferentes fases del proceso de

identificación genética (toma de muestras, análisis de ADN y tecnología

aplicable, sistemas de búsqueda y comparación de perfiles de ADN en base de

datos, valoración estadística y criterios de significación de los distintos grados

de coincidencia) y revisaremos la problemática de este tipo especifico de

análisis de ADN en diversos casos de grandes catástrofes descritos en la

literatura científica. Pondremos especial énfasis en el progreso científico

obtenido de los esfuerzos de colaboración entre diversos laboratorios públicos

y privados de EEUU durante la identificación de victimas del atentado terrorista

contra el WTC de Nueva York el 11 de Septiembre de 2001. Incluyendo no

solamente el desarrollo de nuevas tecnologías (Min-STRs, SNPs, ) aplicables

Page 70: BIOLOGIA FORENSE[1]

al estudio de muestras post-mortem altamente degradadas, sino también

diversos aspectos de la toma de muestras y su registro y documentación

electrónicas, así como de la interpretación estadística de la prueba del ADN y

su significación en distintos escenarios.

Analizaremos los principales retos y los posibles obstáculos para la

identificación de las más de 200.000 víctimas producidas por el Tsunami (26

de Diciembre de 2004) que afectó a 12 países del sur del continente Asiático.

Presentaremos también nuestra propia experiencia y la problemática

surgida en algunos casos recientes tales como el ataque terrorista en Madrid

del 11 de marzo de 2004 que arrojo 191 víctimas, o el accidente aéreo del

Yakolev-42 en Trabzon (Turquía) el 23 de Mayo de 2003 en el que perdieron la

vida 62 militares españoles que volvían a España de una misión de paz en

Afganistán.

Page 71: BIOLOGIA FORENSE[1]

BASES DE DATOS DE ADN

ANTONIO ALONSO ALONSO Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Madrid.

Las bases de datos de ADN con fines de investigación criminal son

actualmente las bases de datos genéticas de mayor interés para los

laboratorios forenses. Gracias a la experiencia acumulada por un gran número

de países en todo el mundo (que ya han desarrollado una legislación

específica) hoy sabemos que la comparación sistemática de los perfiles de

ADN provenientes de distintas causas penales estructurados en una misma

base de datos, puede ser una herramienta muy eficaz para reducir el índice de

criminalidad de determinados delitos sin autor conocido y, especialmente,

aquellos en los que existe una alta reincidencia. De esta forma la prueba del

ADN ha dejado de ser un mero testigo “a posteriori" de los hechos criminales

para convertirse potencialmente en una herramienta preventiva de la

criminalidad. Serán, por tanto, estas bases de datos las que centren gran parte

del contenido de esta presentación en la que realizaremos una revisión de la

situación en Europa para, con posterioridad, hablar de la situación especifica

de nuestro país en este tema.

No debemos de olvidar, sin embargo, que existen otro tipo de bases de

datos genéticas de gran interés para la comunidad científica forense y que

también serán abordadas en esta lección del curso. Me estoy refiriendo por

ejemplo a las bases de datos de ADN para la identificación de desaparecidos

entre las que destacan los proyectos de identificación de victimas de conflictos

bélicos o de victimas de catástrofes. (Los retos a los que se enfrenta la prueba

del ADN en la identificación genética de victimas de grandes catástrofes,

serán tratados por el autor en otra lección de la presente edición del curso de

Biología Forense).

Por otro lado, se abordarán las bases de datos poblacionales de

marcadores de ADN humanos utilizados en genética forense (muchas de ellas

Page 72: BIOLOGIA FORENSE[1]

públicas y accesibles por Internet) que se han convertido en una herramienta

esencial para poder realizar una evaluación bioestadística adecuada del valor

de la prueba del ADN, tanto de marcadores STR autosómicos como de datos

haplotípicos (Y-STR o mtDNA).

Haremos también una breve referencia a un grupo heterogéneo de

bases de datos de ADN que emergen en los diversos ámbitos de aplicación de

las ciencias forenses y que pueden ser de utilidad en muy diversos

diagnósticos que van desde la identificación genética de vestigios de distintas

especies animales en la escena del crimen a la identificación de especies

tóxicas o patógenas.

Por último, nos asomaremos al futuro de las bases de datos de ADN

forense en la era de la genómica.

Page 73: BIOLOGIA FORENSE[1]

MESA REDONDA

EL INFORME PARCIAL Y SU DEFENSA ANTE LOS TRIBUNALES

PONENTE: CARLOS PUIGCERVER ASOR Profesor de Derecho Procesal de la Universidad de Valencia

LA VALORACIÓN DE LA PRUEBA PERICIAL 1.- INTRODUCCIÓN Cuando un Juez o Tribunal dicta una sentencia realiza un acto de

pensamiento que es un juicio lógico jurídico que responde a la estructura del

silogismo en el que, la premisa mayor es la norma, la premisa menor es el

hecho y la consecuencia es el fallo o parte dispositiva de la resolución judicial.

La sentencia es, pues, aplicación del derecho mediante la subsunción de

un hecho en una norma jurídica de manera que se produzca una determinada

consecuencia jurídica.

En uno de los estadios de este proceso intelectual el juez debe fijar los

hechos ocurridos en la realidad y para ello deberá valorar la prueba practicada.

2. LA VALORACIÓN DE LOS MEDIOS DE PRUEBA En definitiva, para que el juzgador conozca si se han producido o no los

hechos afirmados en el proceso debe valorar la prueba practicada lo que

implica dos operaciones, una primera denominada interpretación en la que

deberá extraer cuáles son las afirmaciones, las consecuencias que se

desprenden de las pruebas y una segunda que será la de darles valor para fijar

o no unos determinados hechos como producidos o existentes.

A) Valoración libre y valoración tasada o legal de los medios de prueba Esa segunda labor que consiste en la de fijar el valor de ese medio de

prueba, puede estar reglada por la ley, en el sentido de establecer unas

normas o criterios para valorar, son los llamados medios de prueba de

Page 74: BIOLOGIA FORENSE[1]

valoración legal o tasada, o, por el contrario, puede dejarse a la libre

apreciación del juzgador, son los llamados medios de prueba de valoración

libre.

B) La valoración de la prueba pericial La prueba pericial es un medio de prueba de libre valoración, es decir,

desde el plano teórico, los informes periciales, cualquiera que sea la autoridad

científica de la que emanan no constituyen verdad intangible o incontrovertible,

sino que sólo son una opinión científica o técnica que será valorada por el Juez

o Tribunal, pues de otro modo, como afirma ALONSO PÉREZ, se le llegaría a

vincular de tal manera que el perito se convertiría en juez sustituyendo a éste

en su función.

Ahora bien, prueba de valoración libre no quiere decir prueba arbitraria

de modo que el Tribunal no puede rechazar de manera irrazonada o caprichosa

un dictamen pericial, sino que deberá expresar las razones que le llevan a no

darle valor y el proceso lógico llevado a cabo para llegar a esa conclusión, lo

que no resultará fácil cuando deban de manejarse conocimientos científicos o

técnicos de gran precisión o complejidad, por lo que en innumerables

ocasiones el juzgador concederá a la prueba pericial un valor absoluto.

3. TRATAMIENTO JURISPRUDENCIAL DE LAS PRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDAD El valor que se concede por los Tribunales a las pruebas biológicas de

paternidad es absoluto, casi de certeza, aunque dicho valor no se atrevan a

confesarlo directamente en todos los casos, disimulando el valor determinante

de la misma mediante referencias a otros medios de prueba que valorados

conjuntamente les llevan a la misma conclusión.

Es significativo que en todos los casos en que se ha practicado una

prueba de paternidad y su resultado ha dado alta probabilidad de paternidad, la

sentencia ha terminado por declarar la filiación, eso sí declarando que no se le

está dando valor absoluto o de certeza.

Sirva de muestra la Sentencia del Tribunal Supremo (Sala de lo Civil), de

20 mayo 1991 en donde se afirma que la probanza biológica de la paternidad

constituye una prueba directa, pero no plena y absoluta, no obstante ha de

atribuírsele valor de casi total aproximación a la verdad, sobre todo, cuando

Page 75: BIOLOGIA FORENSE[1]

sucede, como en la presente controversia, que dicho informe pericial, ha sido

emitido por un órgano técnico oficial, dotado de medios y eficacia, para su

elaboración más exacta, cual es el Instituto Nacional de Toxicología,

dependiente del Ministerio de Justicia y que concurren el 99,9998 por cien de

probabilidad, y con un índice (IP) de paternidad de 840191:1, y según la

posición científica de K. Hammel, ello supone una «paternidad prácticamente

probada».

También la Sentencia del Tribunal Supremo núm. 1070/1992 (Sala de lo

Civil), de 24 noviembre que con un porcentaje del 99,9324% en las pruebas

biológicas afirma que debe entenderse que la paternidad está prácticamente

probada, encontrándonos con ante una prueba de casi absoluta fiabilidad.

Finalmente es de destacar la Sentencia del Tribunal Supremo de 2 de

enero de 1991 en donde se decía que «La probabilidad de paternidad (w)

obtenida es de 99,91% valor que se encuentra dentro del rango considerado

por K. Hummel y colaboradores como Paternidad prácticamente probada.

Asimismo el Índice de Paternidad (IP) obtenido es de 1293,48, valor que se

encuentra dentro de rango considerado por los mismos autores como

Paternidad prácticamente probada, y de aquí, que proyectando cuanto

antecede al meritado caso de que se trata, es de llegar a la conclusión de que

en él, se consiguió una certeza casi absoluta en el resultado de la valoración de

la prueba».

4. VALORACIÓN JUDICIAL DE LA NEGATIVA A SOMETERSE A LAS PRUEBAS BIOLÓGICAS DE PATERNIDAD Para concluir debemos hacer una referencia a las graves y negativas

consecuencias que tiene el no someterse a las pruebas biológicas, pues,

generalmente, dan lugar a una sentencia declarando la paternidad siempre y

cuando en el proceso se hayan acreditado otras circunstancias tales como la

existencia de relaciones, sostenimiento económico o relación personal,

habiéndose rechazado todos las excusas alegadas para negarse a su práctica

cuando están basadas en los derechos constitucionales a la intimidad personal

y familiar o a la integridad física y moral, admitiéndose tan solo en dos casos, a

saber, cuando exista un grave peligro para la salud, o cuando no exista un

mínimo de prueba que permita deducir la posibilidad de paternidad.

Page 76: BIOLOGIA FORENSE[1]

Recogen esta doctrina las siguientes sentencias: Sentencia Audiencia

Provincial núm. 14/2004 Asturias (Sección 5ª), de 22 enero de 2004, Sentencia

del Tribunal Supremo de 11 de septiembre de 2003 y Sentencia del Tribunal

Constitucional 95/1999, de 31 de mayo.

BIBLIOGRAFÍA DE INTERÉS: 1.- FONT SERRA, EDUARDO; El dictamen de peritos y el reconocimiento

judicial en el proceso civil. Ed.: La Ley, 1ª edición, mayo de 2000. Las Rozas

(Madrid)

2.- LÓPEZ-MUÑIZ GOÑI, MIGUEL; La prueba pericial. Guía práctica y

jurisprudencia. Ed.: Colex. 2ª edición. Madrid 2004.

3.- ALONSO PÉREZ, FRANCISCO; Medios de investigación en el proceso

penal. Ed.: Dykinson, 2ª edición. Madrid 2003.

3.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,

JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional I”, Ed.

Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.

4.- MONTERO AROCA, JUAN; BARONA VILAR, SILVIA; GÓMEZ COLOMER,

JUAN-LUIS Y MONTÓN REDONDO, ABERTO, “Derecho jurisdiccional II”, Ed.

Tirant lo Blanch. 13ª edición, Valencia 2004.

5.- ALMAGRO NOSETE, JOSÉ; GIMENO SENDRA, VICENTE; CORTÉS

DOMÍNGUEZ, VALENTÍN Y MORENO CATENA, VÍCTOR, “Derecho procesal”

Tomo I (Vol. I), Ed. Tirant lo Blanch. 4ª edición, Valencia 1989.

PONENTE: FELIX SÁNCHEZ UGENA

Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz

El Juez solicitará un informe pericial cuando, para conocer o

apreciar algún hecho, fueran necesarios conocimientos científicos

especializados. Aunque tradicionalmente se dice que los Jueces sentencian

según se les informa, lo cierto es que nuestra Legislación establece que “Los

Jueces y Tribunales apreciaran la prueba pericial según las reglas de la sana

crítica, sin estar obligados a sujetarse al dictamen de los peritos”.

Page 77: BIOLOGIA FORENSE[1]

REQUISITOS Y CUALIDADES QUE DEBE REUNIR EL PERITO

1.- CUALIDADES PERSONALES

a) Objetividad.

b) Capacidad de reflexión y sentido común

c) Prudencia.

d) Imparcialidad..

e) Veracidad.

2.- FORMACIÓN CIENTÍFICA.

3.- CONOCIMIENTOS JURÍDICOS.

VALOR JERÁRQUICO DE LA PRUEBA PERICIAL

− CERTEZA MATEMÁTICA. Consiste en la comprobación de las leyes

mismas del pensamiento, por lo que partiendo de postulados ciertos se

ha de llegar a resultados exactos.

− CERTEZA MORAL. Se trata de una convicción sin pruebas sólidas

que la sustenten.

− CERTEZA FÍSICA. Se encuentra entre lo absoluto de la certeza

matemática y la relatividad de la certeza moral.

− CERTEZA LEGAL. A estos tres grado de certeza podemos añadir en

la práctica la denominada certeza legal. Es aquella que aunque no es

absoluta, si es suficiente para la administración de justicia, ya que

“permite razonablemente fijar una conclusión que responda a criterios

científicos y lógicos, aunque no alcance una evidencia integral”.

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EL INFORME PERICIAL

Es un documento médico-legal emitido por orden de las autoridades o

a petición de particulares sobre el significado de ciertos hechos con

trascendencia judicial o administrativa. Puede ser evacuado por un solo

perito o por una corporación científica: Instituto Nacional de Toxicología,

Cuerpo de Médicos Forenses, Colegios de Médicos, Reales Academias, etc.

y suele ser solicitado en actuaciones judiciales ya adelantadas.

Sus características fundamentales serian:

a) Se trata de un documento oficial, parte integrante e importante en el

procedimiento, que contienen datos médico-biológicos y datos

susceptibles de ser discutidos.

b) La discusión tiene como objetivo reconstruir un hecho de interés judicial

sucedido en el pasado.

c) No se trata de aportar una opinión, sino una demostración.

d) El informe generalmente se continua en una declaración verbal ante el

tribunal.

Desde el punto de vista formal, un Informe Pericial debe constar de

consta de las siguientes partes

PREÁMBULO. Se inicia con los hombres del perito o peritos, sus títulos,

residencia, autoridad o persona que ha solicitado el informe y objeto del

mismo, reproduciéndolo literalmente de la orden recibida.

RELACIÓN Y DESCRIPCIÓN DE LOS OBJETOS ACERCA DE LOS CUALES DEBE EMITIRSE EL INFORME. Pueden ser documentos médico-

legales, objetos (armas, manchas, huellas o cualquier otro tipo de pruebas

de convicción) o personas (inculpado lesionado, cadáver). Tanto la

trascripción de los documentos como la descripción de los objetos y

Page 79: BIOLOGIA FORENSE[1]

personas será minuciosa y fidedigna, y a ser posible acompañarse de

fotografías, croquis...

OPERACIONES PRACTICADAS. Conviene su descripción, puntualizando

las técnicas que se hayan usado en cada caso.

VALORACIÓN. Es lo fundamental del informe. Se trata de la discusión de

estos resultados, de su estudio científico, doctrinal y técnico. Precisa un

razonamiento lógico y claro que sirva de nexo de unión entre los hechos que

se recogen y las conclusiones que se sientan.

CONCLUSIONES. Deben ser entresacadas de las consideraciones

efectuadas en el razonamiento anterior. Se formulan numerándolas en

párrafos separados, haciendo tantos apartados como afirmaciones o

negaciones se hagan.

FÓRMULA FINAL. Generalmente es la siguiente: “Lo cual es cuanto puede

manifestar en cumplimiento de la misión que le había sido encomendada”.

Fecha y firma.

EXPOSICIÓN DE CASOS PRÁCTICOS