Biologia Celular y Molecular 1

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA FILIAL NORTE

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BÁSICAS

Guía de prácticas

BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

2010-II Responsable de Prácticas:. Blgo Lezama Vigo, Hélmer Helí, MSc

Profesores de Práctica : : Blgo. Jerí Apaza Cèsar.: Blgo. Murrugarra Bringas, Victoria Isabel,: Blgo. Nolasco Cárdenas, Oscar, MSc.: Med. Sánchez Castillo, Jampieer.: Blgo. La Rosa Loli, Rafael, Mg.: Blgo. Rodríguez Alayo, Néstor, Mg: Blgo. Baca Dejo, Francisco, Mg: Q..F. Del Castillo Cotillo, Helda, Mg

APELLIDOS, NOMBRES:_________________________________________

1

GRUPO:___________DIA:____________ PROFESOR:______________

INTRODUCCIÓN

La biología es la ciencia de la vida que estudia la estructura y función de los organismos vivos y sus

componentes. Las aplicaciones de la investigación básica en biología molecular son numerosas, desde la

tecnología para trasplantar corazones, manipular genes, diseñar fármacos contra microorganismos

patógenos e incrementar la producción mundial de alimentos.

La guía de prácticas del curso de Biología Celular y Molecular tiene como objetivo entrenar al estudiante

con los procedimientos llevados a cabo en el laboratorio y desarrollar su pensamiento científico que lo

lleve comprender los términos básicos de la Biología Molecular.

El estudiante debe emplear esta guía en cada práctica de laboratorio y estar informado sobre la práctica

que se llevará a cabo en cada sesión.

La guía se ha dividido en tres partes de acuerdo a cada evaluación parcial. La primera parte comprende la

célula y componentes celulares. La segunda parte incluye procesos celulares como respiración,

permeabilidad, división celular y la visualización de organelas. En la tercera parte se analizara el proceso

de meiosis, comprensión del código genético y técnicas de manipulación de ácidos nucleicos.

El alumno debe cumplir con los objetivos planteados al final de cada práctica. Así mismo debe presentar

su guía de práctica terminada la misma.

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PROGRAMACIÓN DE CONTENIDO

Nº CONTENIDO

1Introducción y organización de grupos de práctica. Bioseguridad

2 Bioseguridad

3 Microscopía

4 Técnicas de coloración y preparación de muestras

5 Observación de células

6 Determinación de macromoléculas

7 Permeabilidad celular

8 EVALUACION

9 Observación de cilios y flagelos. Ciclosis

10 Organelas citoplasmáticas

11 Actividad enzimática

12 Fermentación

13 Mitosis

14 Meiosis

15 Extracción de DNA. Electroforesis

16 EVALUACION

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PRACTICA Nº 1

BIOSEGURIDAD

PRIMERA PARTE: BIOSEGURIDAD

El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten

posibles accidentes debido al desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de

los alumnos que estén en un momento dado, trabajando en el Laboratorio.

A continuación alistamos una serie de medidas e indicaciones de seguridad que deben tomarse durante

las prácticas de laboratorio.

NORMAS PERSONALES

1.Lea con atención, antes de cada práctica, las indicaciones de su guía. Siga todas las instrucciones a

menos que el profesor realice alguna modificación. 2.Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. Se trabajará con

cuidado y de manera organizada. Así mismo se mantendrá cada mesa de trabajo limpia, seca y

ordenada. 3.Es obligatorio la utilización de mandil que le cubra brazos, piernas, torso y pies. Están prohibidos el uso

de sandalias, pantalones cortos, faldas, polos cortos, etc. en el laboratorio. La persona

inapropiadamente vestida para trabajar en el laboratorio le será negado el ingreso. 4.No deben llevarse las manos a la boca ni a la cara pues pueden estar contaminadas.

5.Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.

6.Está terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas ni comidas.

7.En caso de derrame, accidente o daño avise inmediatamente al profesor.

8.Al término de cada práctica limpiar el área de trabajo y lavar los materiales utilizados con agua de

caño. Lavarse las manos meticulosamente con agua y jabón. Finalmente cerciorares que las llaves de

gas y agua estén cerradas.

REACTIVOS QUIMICOS

1. Usar lentes de seguridad cuando trabaje con reactivos químicos peligrosos que puedan salpicar o

derramarse. 2. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rótulo.

3. Como regla general, no coger ningún producto químico. El profesor o profesora te lo proporcionará.

4. Nunca devuelva los sobrantes de los productos a los frascos de origen sin consultar con el profesor.

5. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe,

aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua. 6. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos.

7. No pipetear con la boca. Utilizar una bombilla de succión.

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8. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos, siempre echaremos el ácido

sobre agua. 9. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben estar lejos de fuentes de calor. Si hay que

calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. 10.Manipule con precaución los solventes volátiles e inflamables como el éter, acetona y metanol. Nunca

evapore estos solventes en una hornilla al abierto. Utilice siempre un sistema de condensación

eficiente. 11.Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y

avisa al profesor. 12.Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.

13.Encienda fuego en el laboratorio solo si no existen solventes inflamables en la vecindad. La persona

que encienda el fuego debe primero verificar que no exista otra persona que este trabajando con

solventes inflamables en el laboratorio.

MATERIAL DE VIDRIO

1 Use material de vidrio limpio y no rajado. 2 El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar quemaduras use guantes o

trapos. 3 Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas

dos normas:

-Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente.

-Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente (mira la figura).

EQUIPOS ELÉCTRICOS

1 Manipule cualquier equipo eléctrico con las manos secas y asegúrese que el área de trabajo también este seca.

2 Ningún cordón electrifico debe colgar fuera de la mesa de trabajo. 3 Cuando desconecte algún equipo de tomacorriente, jálelo por el enchufe y no por el cordón.

UTILIZACION DE BALANZAS

1 Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel sobre los platos de la misma y si el producto fuera corrosivo, se utilizará una luna de reloj.

2 Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.

MANIPULACIÓN DE ESPECÍMENES

1 Manipule los microorganismos crecidos en una placa petri o tubo de cultivo con extremo cuidado. Siempre utilice técnicas de esterilidad (a la llama del mechero, guantes, palillos estériles, etc.).

2 Nunca llevar a la boca plantas o partes de ellas como semillas, frutos y hojas.

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PRACTICA GUIADA Nº 1

1.-Complete los nombres de los distintos símbolos de bioseguridad que se presentan a continuación.

1.- complete el recuadro :

NIVEL DE BIOSEGURIDAD

CARACTERISTICAS EJEMPLOS DE PATOGENOS

FECHA ACTITUDINAL MATERIAL PARTICIPACIÓNFIRMA/ SELLO

PROFESOR

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PRACTICA Nº 2

MICROSCOPÍA

I. FUNDAMENTO

La invención del microscopio se atribuye a Johannes y Zacharias Jansen (1590) y el

descubrimiento de la estructura celular de los organismos a Robert Hooke (1665). Posteriormente, en 1683 y con un microscopio muy rudimentario Leeuwenhoek descubrió un universo enmarcado sólo por decenas de micrómetros. Desde aquel entonces, el perfeccionamiento continuo al microscopio ha permitido a la Ciencia profundizar cada vez más en el conocimiento de la ultraestructura celular y de las relaciones intercelulares.

MICROSCOPIO COMPUESTO

El microscopio es un instrumento óptico que se compone de una serie de lentes para conseguir imágenes aumentadas de objetos diminutos que por su extrema pequeñez no son visibles al ojo humano.

El microscopio compuesto está constituido de un SISTEMA OPTICO destinado a obtener una imagen aumentada del objeto, un SISTEMA MECANICO que sostiene los distintos elementos ópticos y los objetos que se van a examinar y un SISTEMA DE ILUMINACIÓN.

CARACTERISTICAS DEL MICROSCOPIO

Dado que la imagen del microscopio no es real sino virtual, se han determinado algunos términos de medida microscópica:

En cualquier microscopio el poder de resolución define su rendimiento óptico, porque es su capacidad para ver como separados dos puntos que realmente lo están pero que nuestro ojo sólo puede ver como una entidad única (es decir es su capacidad de entregar imágenes bien nítidas).

El máximo poder de resolución del microscopio óptico es de 0,2 micrómetros(0,2 µm), debido a que la longitud de onda de la luz utilizada (400-700 µm) es un factor limitante. El ojo humano tiene un poder de resolución de aproximadamente 100 micrómetros.

El límite de resolución puede definirse como la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que se puedan distinguir como separados. El límite de resolución se puede calcular a partir de la siguiente ecuación:

Kλ

L.R. = ____________ K = constante = 0.61

A.N λ = longitud de onda de luz AN = apertura numérica de cada lente objetivo es su capacidad para captar la máxima cantidad de la luz difractada por el objeto. Depende del índice de refracción del medio.

Recuerda: A menor límite de resolución mayor será el poder de resolución Resolución y magnificación Máximas

Instrumento óptico Resolución Magnificación Ojo humano 0,1 mm Microscopio óptico 0,2 u 2500 Microscopio electrónico 0,1 nm 1000 000

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II. OBJETIVOS

Reconocer las partes del microscopio óptico. -Conocer su utilización para la observación de distintas muestras biológicas.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

En el laboratorio encontrarás:

- Microscopio compuesto- Aceite de inmersión- muestras fijadas

IV. PROCEDIMIENTO.

Se reconocerán las partes de un microscopio óptico. Señalar las partes del mismo en el dibujo adjunto.

1. SISTEMA OPTICO. El sistema óptico está constituido por:

Objetivos: sistema de lentes convergentes que actúa como una lente que se encuentran montados en el revolver. Lo usual es que cada microscopio tenga cuatro objetivos de diferentes aumentos ( 4x, 10x, 40x, 100x) los que se clasifican en:

Objetivos en seco: en los que el aire se interpone entre la lente y la preparación.

Objetivos de inmersión: en el cual un líquido ( aceite) se interpone entre la lente y la preparación.

Ocular: El ocular es una lente convergente que recoge la imagen intermedia producida por el objetivo y forma una nueva imagen virtual, derecha, y amplificada un cierto número de veces (X veces, según se indica en el propio ocular). Los aumentos más comunes son 10X y 16X.

2.-SISTEMA DE ILUMINACIÓN.

Condensador: Sistemas de lentes convergentes que concentra el haz de luz sobre la preparación.

Diafragma: Sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparación.

Fuente de luz: Puede ser natural o artificial (ampolleta).

Portafiltro: Opcional, sirve para colocar filtro de distintos colores para mejorar el contraste.

3.-SISTEMA MECANICO

Tubo óptico: Cilíndrico ahuecado destinado a llevar el ocular en su extremo superior y los objetivos montados en el revólver en su extremo inferior. La longitud del tubo debe ser siempre precisa.

Revólver: Pieza metálica situada en la parte inferior del tubo que por rotación sitúa los diferentes objetivos en posición de trabajo.

Platina: Superficie plana con una perforación central para permitir el paso de la luz hacia preparación. Posee un carro que sostiene la preparación y que puede desplazarla hacia delante y hacia el lado izquierdo o hacia el lado derecho.

Tornillo Macrométrico: Mecanismo de enfoque de avance rápido.

Tornillo Micrométrico: Mecanismo de enfoque con precisión o ajuste fino.

Base o Pie: Estructura sólida y pesada que sostiene y da estabilidad a todo el instrumento.

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Columna: Vástago vertical que se articula con la base y con el tubo del microscopio y lleva el mecanismo de movimiento del mismo.

NOTA IMPORTANTE. Presta mucha atención al manejo del microscopio que tienes a tu cargo. Debes hacerlo cuidadosamente porque son aparatos muy delicados y dejarás a consigna tu documento de identificación.

MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1 Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente.

2 Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

3 Comenzar la observación con objetivo de menor aumento. Si la preparación es de bacterias emplear el

objetivo de mayor aumento (objetivo de inmersión, ver punto 6).

4 Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto

debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el

objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación

con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener

un enfoque fino.

5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover

un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino.

6 El empleo del objetivo de inmersión es siempre utilizando aceite de inmersión.

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1.- Indique todas las partes del microscopio


PROFESOR

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PRACTICA Nº 3

TECNICAS DE COLORACION. PREPARACION DE MUESTRAS

I. FUNDAMENTOS

La coloración implica la penetración del colorante por fenómeno osmótico y su fijación se debe a fenómenos de absorción de partículas o iones. Químicamente la coloración es la unión de las moléculas del colorante con los elementos constituyentes de la célula. Algunas regiones celulares tienen pH alcalino y se tiñen con los colorantes ácidos; otros tienen pH ácido y se tiñen con colorantes básicos. Sin embargo es necesario señalar que tanto el núcleo como el citoplasma tienen características anfótericas de manera que se pueden teñir, el núcleo con algunos colorantes ácidos y el citoplasma con algunos colorantes básicos.

El mecanismo de coloración de las muestras biológicas pueden ser afectados por: Pureza del colorante Concentración del colorante pH de la solución del colorante Temperatura del medio ambiente Sustancias adicionales (mordientes) Tiempo de coloración.

Los preparados microscópicos, constituyen una serie de preparados rutinarios de laboratorios que tienen por objeto identificar en forma rápida el contenido de un determinado tipo de muestra, con la con la finalidad de resolver algún problema de interés particular. Los preparados microscópicos más frecuentes en Biología son:

Preparados “en fresco”Preparados “en seco”

Los preparados “en Fresco” son preparaciones microscópicas acuosas, que se caracterizan por que la sustancia examen, no está adherida de un modo fijo a la superficie de la lámina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada ésta en diferentes posiciones se corre el riesgo de perder u estropear el preparado.

Los preparados “en seco” son aquellos que sufren un procesamiento previo (extensión, fijación y coloración), y se caracterizan porque la sustancia examen se halla adherida a la superficie de la lámina portaobjeto y por lo tanto, al ser manipulada ésta en diferentes posiciones no se estropea o pierde la muestra.

Es importante ejercitar al estudiante en el manejo y aplicación de estos factores que inciden básicamente en la complementación del aprendizaje del estudio de estructuras celulares, identificación de tejidos y microorganismo.

II. OBJETIVO.

1. Diferenciar y explicar el fundamento de las distintas coloraciones2. Realizar coloraciones con muestras biológicas

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio. - Microscopio óptico - Safranina- Pipetas pasteur - Eosina- Goteros - Violeta de genciana- Agua destilada - Wright- Mechero - Fucsina- Azul de metileno - Verde de Janus

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- Giemsa - Hematoxilina

IV. PROCEDIMIENTO

PREPARADOS EN FRESCO1. Colocar una gota de agua estancada en una lamina2. colocar una laminilla cubreobjetos3. observar

PREPARADOS EN SECO1. Colocar la muestra en la lamina2. Realizar la coloración respectiva3. Secar al medio ambiente4. observa la microscopio

OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE CÉLULAS PROCARIOTES,

I. FUNDAMENTO

La principal característica de la célula procariota es que carece de núcleo celular. Las bacterias, los organismos procariotes más representativos, comprenden por una parte, especies de importancia médica puesto que producen una serie de infecciones y padecimientos en el hombre y en los animales pero, por otra parte, una gran mayoría representa beneficios para la agricultura, la industria y la salud humana y animal.

Para observar este tipo de células se utiliza la Tinción Gram, técnica diseñada por el médico danés Hans Christian Gram. Esta consiste en poner en contacto las células bacterianas con colorantes básicos como violeta de genciana, utilizando la solución de lugol como mordiente. Esto forma un compuesto yodado que se fija fuertemente en determinadas bacterias. Según la coloración que adquieran, las bacterias se clasifican en:

GRAM POSITIVAS: se tiñen fuertemente con violeta de genciana y adquieren una coloración violeta. GRAM NEGATIVAS: se tiñen muy superficialmente por lo que fácilmente se decoloran con solventes orgánicos. Se utiliza adicionalmente la safranina o fucsina, que se emplea como

colorante de contraste, adquierendo una coloración rosada.

La diferente tinción de bacterias se debe a la composición diferencial de sus paredes bacterianas. Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular con mureina y ácido teitoico. En cambio, las Gram negativas tienen una pared mucho más compleja que contiene, además del peptidoglucano, una asociación de proteínas lípidos y lipopolisacáridos Además de la coloración esta técnica nos permite distinguir en las bacterias: a) morfología: cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc) b) agrupación: pares, cadenas tétradas, racimos, sarcina A: forma de caña o bacilos B: Redondos en líneas: estreptococos C: redondos en cúmulos: estafilococos D: Redondos en pares: diplococos E: Forma de espirales: espirilos F: En forma de coma: vibriosII. OBJETIVOS

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Reconocer los distintos tipos de bacterias según se tiñan o no con la Tinción Gram.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio: Microscopio óptico - Alcohol acetona Soluciones para la tinción: - Fucsina o safranina

- Violeta de genciana- Aceite de inmersión - Lugol- Mechero de alcohol

IV. PROCEDIMIENTO

La tinción Gram se realizará sobre las muestras de yogur, sarro dentario y vinagre que los alumnos traerán.

Bacterias del yogurt

El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30µm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio.

Bacterias del vinagre

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.

Bacterias del sarro dental

El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

Realizar los siguientes pasos para la tinción Gram de cada una de las 3 muestras indicadas.

1 Realizar una extensión de la muestra de cultivo bacteriano sobre un portaobjetos 2 Secar ante un mechero. 3 Cubrir el preparado con violeta de genciana por 1 minuto. 4 Enjuagar la lámina con agua destilada 5 Añadir lugol por 1 minuto. 6 Lavar con agua destilada y decolorar con alcohol acetona. 7 Añadir fucsina o safranina y dejar que actúe por 1 minuto. 8 Lavar con agua corriente, secar 9 Coloque una gota de aceite de inmersión encima de la lámina cubreobjetos y observar al

microscopio con el objetivo de inmersión.

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PRACTICA GUIADA Nº 31.- completar el grafico

2.-Dibuje todas las muestras observadas en la práctica

Muestra:_________ Muestra:_________ Coloración:_______ Coloración:_______

Aumento:________ Aumento:________




PROFESOR

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PRACTICA Nº4

OBSERVACIÓN DE CÉLULAS EUCARIOTES

I. FUNDAMENTO

En 1939, en base a observaciones realizadas por los científicos alemanes Schleiden y Schwan, se plasmó la teoría celular, la cual produjo un cambio radical en las ciencias biológicas. Esta teoría postula que los “cuerpos de todos los animales y vegetales están formados de células y que solo pueden aparecer nuevas células por división de las células preexistentes”. De ahí que los organismos por muy sencillos que sean están constituidos por unidades vivas denominadas células.

La célula eucariota es más compleja que la célula procariota y contiene, a diferencia de esta última, núcleo celular. Los organismos más simples (protozoarios) están constituidos de una sola célula eucariota mientras que los más complejos o multicelulares están formados por un gran número de células eucariota que se hallan organizadas en tejidos, órganos y sistemas.

II. OBJETIVOS

Observar y caracterizar células eucariotas de tipo vegetal (epidermis de cebolla y mucosa bucal). Observar y caracterizar células eucariotas de tipo animal (epitelio bucal, tejido adiposo y sangre).

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio Microscopio óptico Cubeta de tinción Lugol Frasco lavador Mechero de Alcohol Alcohol absoluto Lanceta estéril Hematoxilina

Formol Eosina Sudan III

Cubeta de tinción

Cebolla Hisopos Tocino Agua estancada en frasco oscuro

Láminas portaobjeto y cubreobjeto Gotero Bisturí u hoja de afeitar Levadura de pan

Materiales de disección: tijera, pinza, estilete.

IV. PROCEDIMIENTO 4.1. Observación de células vegetales (Células epiteliales de Allium cepa )

Las células de la epidermis de las hojas internas del bulbo de la cebolla, son de forma alargada y bastante grande. La pared celular celulósica se destaca muy clara teñida por el colorante. Los núcleos son grandes y muy visibles. En el citoplasma se distinguen algunas vacuolas grandes débilmente coloreadas.

1 Separe una de las capas del bulbo de la cebolla. Con ayuda de una pinza desprenda la membrana epidérmica que cubre la parte interna de la cebolla y extiéndala en el portaobjetos.

2 Utilizando una hoja de afeitar obtenga una porción de medio centímetro cuadrado, cúbrala con una gota de lugol, coloque cuidadosamente el cubreobjeto y observe en el microscopio.

3 Reconozca las partes de la célula vegetal.

4.2. Observación de organismos unicelulares

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1 Coloque una gota de agua estancada sobre un porta objeto y cubran con una laminilla. 2 Observe con el objetivo de menor aumento. 3 Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. 4 Observe la forma, tamaño y movimiento de los organismos unicelulares (ver figura adjunta).

4.3. Observación de levaduras del pan

1 Diluya un trocito de levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) con agua destilada, en un tubo de ensayo.

2 Observe con el objetivo de mayor aumento. 3 Ajuste el diafragma para incrementar el contraste. 4 Observe la forma y tamaño de estos organismos.

4.4. Observación de células animales (Epitelio bucal)

El azul de metileno tiñe intensamente el núcleo y con menos color el citoplasma de las células. Éste suele ser algo granuloso.

1 Con un hisopo limpio extraiga suavemente la mucosidad de la cavidad bucal. 2 Deposite la mucosidad extraída en el centro de una lámina portaobjetos y extiéndalo con un frotis. 3 Agregue unas gotas de AZUL de metileno y espere 3 minutos. 4 Elimine el exceso de colorante utilizando agua y coloque un cubreobjetos. 5 Observe la muestra a menor aumento y localice: células asociadas y dobladas. 6 Luego visualice a mayor aumento y reconozca los componentes celulares.

4.5. Observación de células animales (Tejido adiposo) El Sudan III es un compuesto que tiñe lípidos de color rojo intenso. En el tejido adiposo, que contiene

gran cantidad de grasas, se observarán los adipocitos teñidos por el Sudan III.

1 Con ayuda de un bisturí, cortar una fina capa de grasa de tocino 2 Colocarla en un portaobjetos y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos. 3 Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudán III. Dejar actuar unos 5 minutos. 4 Volver a lavar la preparación con agua, cubrirla con un cubreobjetos 5 Observar al microscopio.

4.6. Observación de células animales (Sangre)

Al microscopio las células sanguíneas se verán predominantemente los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes. Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos:

Linfocitos: de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el glóbulo. -Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis. -Polimorfonucleares: núcleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinófilos, con abundantes granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos.

Los eosinófilos, con granulaciones abundantes de color rojizo y el núcleo teñido de color azul marino. Estos glóbulos aumentan su número en caso de parasitosis o procesos alérgicos.

Los basófilos presentan un núcleo teñido de rojo y las granulaciones del citoplasma de color muy oscuro. -Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción. Efectúa los siguientes pasos para ambas coloraciones, Wright y Hematoxilina-Eosina:

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1 Con ayuda de una lanceta desechable, realice una punción del pulpejo del dedo anular de la mano izquierda, previa desinfección con algodón y alcohol.

2 Tome una gota de sangre y haga un frotis fino sobre el portaobjeto 3 Colocar el frotis extendido ya seco, sobre una base plana en posición totalmente horizontal.

Para la coloración de Wright:

1 Coloree con unas gotas de colorante Wright, inmediatamente agregar sobre el colorante el mismo numero de gotas de agua destilada y mezclar rápidamente, soplando suavemente hasta que se forme una capa plateada .

2 Dejar reposar la mezcla por 8 - 10 minutos, observando la intensidad de color. 3 Lave con agua corriente y dejar secar al medio ambiente, si es posible con la lamina en forma

vertical. 4 Observe al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observación de las células y núcleos. 5 Diferencie las diferentes formas de núcleo en los neutrófilos, basófilos , eosinófilos, monocitos y

linfocitos. 6 Dibuje cada forma de núcleo.

Para la coloración de Hematoxilina-Eosina:

1 Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparación.

2 Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del colorante agregando más líquido.

3 Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina dejándola actuar 1 minuto. 4 Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante. 5 Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero. 6 Observar al microscopio. Utilice el objetivo de 100X para la observación de las células y núcleos.

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PRACTICA Nº4

1.- ¿Por qué los eritrocitos se tiñen con Eosina y los Leucocitos con Hematoxilina?__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________2.-¿para qué sirve el FORMOL en la coloración de adipositos?__________________________________________________________________________________________________________3. Dibuje las distintas muestras observadas en la práctica








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PRACTICA Nº 5DEMOSTRACIÓN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y

PROTEÍNAS

CARBOHIDRATOS

I. FUNDAMENTACION

Los carbohidratos, glúcidos, sacáridos son compuestos químicos formados por carbono, hidrogeno y oxigeno, cuya formula es parecida a CnH2nOn y los mas sencillos contienen carbono y los elementos del agua en proporción 1:1, de aquí resulta en 1,844 el nombre de hidratos de carbono. En la concepción moderna se define a los carbohidratos como Polihidroxiacetonas o Polihidroxialdehidos, pues los átomos de carbono están unidos a grupos alcohólicos (-OH hidroxilos) y a radicales hidrogeno; y por la existencia de grupos cetónicos (-CO) y grupos aldehídos (-CHO).

Los carbohidratos son sintetizados en las hojas verdes de las plantas mediante el proceso de fotosíntesis en el cual a partir de elementos inorgánicos resultan compuestos orgánicos alimenticios. En fases posteriores, y partir de los carbohidratos se sintetizan las grasas y proteínas por lo que se define que la vida depende directa o indirectamente de los carbohidratos.

II. OBJETIVOS

2.1. Identificar la presencia de CHO en substancias orgánicas

2.2. Verificar el poder reductor de algunos CHO

2.3. Inferir las principales características de los CHO

2.4. Esquematizar en forma sencilla los pasos de cada experiencia

III. MATERIALES

Encontraras en el laboratorio-tubos de ensayo- vaso de precipitación- embudos- papel de filtro- solución de Fehling A y B- glucosa al 5%- galactosa al 5%- lactosa al 5%- reactivo de Benedict- sacarosa al 5%- almidón al 1%- Lugol

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Determinación de Carbohidratos Reductores

Reacción de Fehling y Reaccion de Benedict

Ambos ensayos permiten el reconocimiento de carbohidratos reductores, contienen ion cúprico en medio alcalino que se reduce hasta óxido cuproso en presencia de azúcares con el hidroxilo hemiacetálico libre. En soluciones alcalinas a elevadas temperatura el azúcar se convertirá en D-gluconato y su ene-diol generándose dos fragmentos altamente reductores que reaccionan con el Cu++

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1. En un tubo de ensayo colocar 1 mL de reactivo de Fehling A y 1 mL de Fehling B ó 2 mL de reactivo de Benedict

2. Llevar a calor hasta ebullición para asegurarse que no hay autorreducción3. Observar y dejar enfriar4. Agregar 0.5 mL de cada una de las muestras a evaluar de acuerdo al siguiente esquema

1 2 3 4 5 6Reactivo de Fehling o Benedict 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL 2mLOrina normal 0.5mLOrina diabético 0.5mLJugo 0.5mLSacarosa 0.5mLGlucosa 0.5mLAgua 0.5mL

5 Calentar en Baño María o al mechero. Observar los cambios de coloración6. Explicar y esquematizar

LIPIDOS

I. FUNDAMENTACION

Los lípidos son compuestos orgánicos formados fundamentalmente por carbono, hidrogeno y oxigeno; ocasionalmente pueden contener fósforo y nitrógeno y tienen las propiedades comunes de: 1. Ser relativamente insolubles en agua y 2. Son solubles en solventes orgánicos. Se consideran 2 grupos de lípidos: a) Lípidos simples constituidos por los ácidos grasos y alcoholes, por ejemplo: grasas neutras y cebos, b) Lípidos compuestos (Lipoides) aquellos que además de los ácidos grasos y alcoholes (glicerina y esfingosina) tienen otros componentes, en este ultimo grupo se consideran los fosfatidos, cerebrósidos, esteroides y carotenoides.

Los lípidos constituyen reserva alimenticia para diferentes organismos y se encuentran en todas las células. En las plantas se hallan en las semillas, frutos y granos.

II. OBJETIVOS

2.1. Explicar la solubilidad de los lípidos

2.2. Determinar la presencia de lípidos en otras substancias orgánicas

III. MATERIALES

Encontraras en el laboratorio

- tubos de ensayo- vaso de precipitación- crisoles- placas petri- Erlenmeyer- papel tornasol- equipos (gradillas, termómetros y mecheros de Bunsen)- alcohol- acetona- benzol- tolvol o éter- Sudan III- Cloroformo- Éter- Bencina

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IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Solubilidad de los Lípidos

1. Adicionar 1 mL de aceite comestible en tubos de ensayo que contengan:a. 1 mL de agua destiladab. 1 mL de alcoholc. 1 mL de acetonad. 1 mL de benzole. 1mL de tolvol o eter

2. agitar cada uno de los tubos y observar3. dejar en reposo durante dos minutos y luego observar4. ordenar los tubos según la solubilidad creciente5. explicar y esquematizar

4.2. Reconocimiento de Lípidos en substancias orgánicas utilizando el Sudan III

1. Numere los tubos de ensayo del 1 al 52. Operar según el cuadro siguiente

MATERIAL 1 2 3 4 5Leche 3 mLAceite comestible 3 mLYema de huevo 3 mLClara de huevo 3 mLPecana o mani molido 3 ccSudan III 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL 3 mL

PROTEÍNAS

I. FUNDAMENTACION

Las proteínas son compuestos orgánicos formados básicamente por C, H, O, N, suelen, además, contener P y S y con menor frecuencia Fe, Cu, Mg, etc., estos elementos constituyen unidades monomericas denominadas AMINOACIDOS (20) ordenados en diversas secuencias o estructuras primaria (lineal), secundaria (transporte), terciaria y cuaternaria.

El nombre de proteínas significa “LO PRIMERO”, “LO MAS IMPORTANTE”, con ello se trata de magnificar el valor biológico de las proteínas y las funciones mas importantes que cumplen en los organismos vivos, los músculos, la piel; compuestos de la sangre, los órganos, tendones, huesos; en fin, todas las células contienen proteínas, también la síntesis de hormonas y enzimas es posible solamente en presencia de proteínas, lo que se resume en la expresión “NO HAY VIDA SIN PROTENAS”.

II. OBJETIVOS

2.1. Explicar las reacciones de precipitación de las proteínas

2.2. Explicar el fundamento de las distintas reacciones cualitativas en la identificación de proteínas

2.3. Diferenciar métodos para identificar proteínas

III. MATERIALES


- tubos de ensayo- vaso de precipitación- pipetas

- embudos- papel de filtro

- HCL 75%

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- NaOH 10%- NaOH 40%- CuSO4 1%- CuSO4 10%

- alcohol 75%- HNO3

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Reacciones de Precipitación

1. Numere 5 tubos de ensayo y coloque 3 mL de solución de albúmina en cada uno2. Al primer tubo adicionar 1 mL de HCL 75%

3. Al segundo tubo adicionar 1 mL de NaOH 40%4. Al tercer tubo adicionar 1 mL de CuSO4 10%5. Al cuarto tubo adicionar alcohol al 75%6. Al quinto tubo calentarlo ligeramente al mechero7. Observar el cambio de estado del contenido de cada tubo8. Explique y esquematice

4.2. Reacción de Biuret

1. Numere los tubos de ensayo del 1 al 52. Trabaje según el cuadro siguiente:

TUBO No

REACTIVO 1 2 3 4 5Solución de albúmina 2mLJugo de semillas 2mLLeche de vaca 2mLJugo de papas 2mLSuero sanguíneo 2mLNaOH 40% 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

3. Agite los tubos y agregue 5 gotas de CuSO4 1% en cada uno de ellos4. Observe el cambio de coloración en cada uno5. Explique, compare y esquematice

4.3. Reacción Xantoproteica

1. Numere los tubos de ensayo del 1 al 52. Trabaje según el cuadro siguiente:

TUBO No

REACTIVO 1 2 3 4 5Solución de albúmina 2mLLeche 2mLCarne molida 2mLSemilla molida 2mLGelatina 2mLHNO3 concentrado 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

3. Observe y caliente al mechero cada tubo4. Observar el cambio de color en cada uno de ellos y dejar enfriar5. Agregar 1 mL de NaOH 40% en cada tubo6. Observar el cambio de color, explicar y esquematizar

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1.-Esquematice todas las reacciones observadas en la práctica.


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PRACTICA Nº 6

OBSERVACIÓN DE PERMEABILIDAD CELULAR

I. FUNDAMENTO

La membrana celular permite el transporte de sustancias de manera selectiva. Muchas sustancias, además del agua, entran a la célula y salen de ella por efecto de los gradientes de concentración, aunque sólo unas cuantas (CO2 y O2) puedan hacerlo tan fácilmente como el agua. Si una membrana celular se deja atravesar por una sustancia, se dice que es permeable a dicha sustancia.

El volumen celular cambia cuando el agua penetra o sale de la célula por un proceso denominado osmosis.

En términos osmóticos las soluciones o medios separados por una membrana se pueden clasificar como hipertónicas, isotónicas e hipotónicas; se dice que un medio es hipertónico, cuando la concentración del soluto en la solución es mayor en relación con otro medio de solución. Por ejemplo, si tenemos dos soluciones, la solución 1 con agua destilada y la solución 2 con una solución de azúcar al 10%, se dice que la solución 2 de azúcar es hipertónica en relación a la solución 1. Por el contrario, la solución 1 es hipotónica en relación a la solución 2 azucarada, es decir que la concentración del soluto es menor en relación con el otro medio. Y una solución isotónica, se cuando la concentración de soluto es igual a la concentración de soluto de la otra solución. II. OBJETIVO.

2.1 Observar y describir los fenómenos de difusión y ósmosis y su importancia en el intercambio de sustancias en la célula.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio. - Microscopio óptico - Agua destilada - Tubos de ensayo - Algodón - Gradillas - Marcador de vidrio - Solución hipotónica NaCl 0.065 M - Ligadura - Solución hipertónica NaCl al 2% - Alcohol corriente -Azul de metileno- Solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico)

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IV. PROCEDIMIENTO

Parte A

1 En tres tubos de ensayo numerados coloque: -1 ml. de solución hipotónica NaCl 0.01 % -1 ml. de solución isotónica de NaCl al 0.9% (suero fisiológico) -1 ml. de solución de hipertónica NaCl al 2%.

2 Obtener 2ml de sangre venosa con la lanceta hematológica en un tubo limpio con heparina3 Dejar caer 5 gotas de sangre en cada uno de los tubos con un gotero. 4 Agite los tubos y dejar en reposo durante 2 ó 3 minutos. 5 Con un gotero coloque en una lámina portaobjeto una gota de cada uno de los tres tubos. 6 Luego examine en el microscopio su aspecto. Observar qué efecto ha tenido las distintas soluciones

sobre la morfología del eritrocito y explicar por qué.

Parte B

1. Colocar los tres huevos en un vaso de precipitación de 1 litro y verter el vinagre hasta cubrir completamente los huevos. Debe realizarse este proceso 48 horas antes de la práctica.

2. Al momento de la práctica lavar con mucho cuidado con agua de caño.3. Frotar cuidadosamente con los dedos para sacar la cáscara por el lado de cámara de aire. Realizar

este proceso hasta tener casi un tercio del huevo libre de cáscara.4. Coloquen agua de caño en uno de los vasos de precipitación de 100ml y ubiquen allí uno de los

huevos. El agua debe cubrir al huevo. 5. En otro vaso de precipitación colocar un huevo en la mezcla muy concentrada de sal en agua y colocar

allí otro de los huevos. 6. Llenar el tercer vaso con agua destilada y poner allí el tercer huevo. 7. en cada frasco se adicionó unas gotas de agua de metileno8. Dejar por una hora y observar.

NOTA: En todos los vasos de precipitación, los huevos deben quedar sumergidos en el líquido.

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PRACTICA GUIADA Nº 61. Mencione y dibuje las diferencias encontradas en cada uno de los huevos sometidos a cada proceso. TABLA: Observación de resultados

Solución de Sal Agua de caño Agua destilada

Huevo

2. Dibujar todas muestras observadas en la práctica



Muestra:_________ Coloración:_______

Aumento:________


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PRACTICA Nº 7

PRIMERA PARTE: OBSERVACIÓN DE MOVIMIENTO CELULAR. CICLOSIS

I. FUNDAMENTO

El citoplasma celular esta formado por el hialoplasma y el morfoplasma. El hialoplasma es un medio acuoso, con un 85% de agua en el cual esta disuelta gran cantidad de moléculas formando una solución coloidal; prótidos (AA, enzimas, proteínas estructurales), lípidos, glúcidos (polisacáridos, metabolitos), ácidos nucleicos (nucleótidos, nucleósidos, ADN, ARN, ARNt, ARNr) sales e iones.

El hialoplasma es un medio dinámico, ya que puede pasar del estado de sol a gel acumulando moléculas que establecen enlaces entre si y aumentando la viscosidad; pueden invertirse el proceso pasando el hialoplasma a sol al diluirse hasta que se separan las moléculas, esto permite la creación de corrientes internas o Ciclosis y algunas células pueden emitir prolongaciones del citoplasma o SEUDOPODOS como órganos de desplazamiento.

II. OBJETIVOS

2.1. Explicar los movimientos citoplasmáticos

III. MATERIALES


- microscopio compuesto- Lugol- Hoja de Elodea

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Movimientos Citoplasmáticos: Ciclosis

1. Colocar una hoja de Elodea sobre una lamina portaobjetos2. Agregar una gota de agua y colocar la laminilla3. A menor y mayor aumento observar las células e identificar los cloroplastos4. Con abundante luz observar los desplazamientos del citoplasma conjuntamente con los

Cloroplastos

SEGUNDA PARTE: OBSERVACIÓN DE CILIOS Y FLAGELOS

I. FUNDAMENTO

El movimiento ciliar esta adaptado al medio liquido y es cumplido por pequeños apéndices especialmente diferenciados. Se trata de filamentos contráctiles variables en numero y tamaño, que reciben el nombre de flagelos, si son escasos y largos y cilios, si son cortos y numerosos.

Estas prolongaciones motoras se presentan con relativa frecuencia en toda la escala zoológica y en algunas células vegetales. En los protozoarios, particularmente en los infusorios; hay centenares o miles de pequeños cilios cuyo movimiento permite al organismo desplazarse con rapidez en el medio líquido. En regiones especiales de estos infusorios ciertos cilios se fusionan y forman apéndices cónicos más gruesos denominados CIARIOS, o las membranas conocidas como ondulantes.

En Protozoarios, toda la clase flagelados se caracteriza por la presencia de flagelos. Entre los metazoarios, solo los espermatozoides tienen la propiedad de desplazarse como células aisladas por medio de esos apéndices. En cambio es relativamente fácil encontrar células epiteliales provistas de cilios

vibrátiles y capaces de constituir verdaderas laminas ciliadas del cuerpo y determinar el movimiento del animal como es el caso de algunos platelmintos y nemertinos, larvas de equinodermos, moluscos y anélidos.

II. OBJETIVOS

2.1. Reconocer el movimiento ciliar en Protozoos y Metazoos

III. MATERIALES


- microscopio compuesto- Estereoscopio- Ringer anfibio- Set de coloración neutra: Wrigth- Mechero de alcohol- Cajas Petri

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Observación de cilios en epitelio bucal de sapo

1. Obtenga un sapo espinal, seccionando el neuro eje entre la medula espinal y el bulbo Raquídeo

2. Coloque el animal en posición de cubito dorsal en una tabla de disección3. Pasando un hilo grueso a través de la mandíbula inferior, fijándolo a la tabla de disección de

modo que la boca del sapo quede abierta4. Humedecer frecuentemente el epitelio bucal con solución Ringer anfibio5. Sobre una zona determinada del epitelio bucal del paladar del sapo, colocar una pizca de

carbón animal6. Luego con la ayuda del estereoscopio, determine la dirección y sentido del movimiento ciliar.

Esquematizar

4.2. Observación de cilios en Protozoarios

1. Con una pipeta Pasteur, obtener una muestra de cultivo de protozoarios y realizar en fresco2. Observar a menor y mayor aumento un Paramecium3. Identificar los cilios en constante movimiento. Esquematizar


1. Dibuje y coloree las distintas muestras observadas en la práctica. Mencionando el aumento total.




Aumento:________


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PRACTICA Nº 8

OBSERVACIÓN DE ORGANELAS E INCLUSIONES CITOPLASMATICA

I. FUNDAMENTO

Todas las funciones intracelulares (síntesis de proteínas, replicación de DNA y rutas metabólicas en general) son realizadas gracias una compleja organización de las organelas. Una célula eucariota típica contiene organelas membranosas (retículo endoplasmático, aparato de golgi, peroxisomas, mitocondrias, etc.) y organelas no membranosas (ribosomas, proteosomas, etc.). Todas ellas efectúan una función puntual en la célula que le permite su supervivencia y replicación.

La supervivencia de la célula depende, entre otros factores, de la obtención de energía neta. Dicho proceso está a cargo de las mitocondrias y/o de los cloroplastos. Las mitocondrias se encuentran en mayor número en células animales pero también pueden presentarse en células vegetales, mientras que los cloroplastos son exclusivos de células vegetales y algunas bacterias fotosintéticas. Las mitocondrias oxidan moléculas orgánicas utilizando oxígeno del aire como aceptor de electrones y forman ATP. Los cloroplastos capturan energía de la luz y la transforman en ATP mediante el proceso denominado fotosíntesis.

II. OBJETIVOS

2.1Observar y diferenciar orgánulos de células vegetales: cromoplastos y cloroplastos. -Reconocer y diferenciar mitocondrias.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio:

- Microscopio óptico - Verde de Janus - Agua destilada - Lugol

- Gotero

IV. PROCEDIMIENTO

4.1. Observación de cromoplastos en células de pulpa de tomate

La pulpa del tomate nos muestra las células generalmente bastante sueltas unas de otras. En el citoplasma se percibe una serie de gránulos rojizos-anaranjados que son los cromoplastos. El núcleo puede llegar a observarse por su típico aspecto y tamaño. Es frecuente la presencia de gránulos de almidón de forma arriñonada. En las células menos alteradas por la compresión se ven grandes

vacuolas incoloras.

1 Cortar con el bisturí un pequeño trozo de uno o dos milímetros de grosor, de la parte pulposa del tomate.

2 Llevarlo sobre un porta, sin poner agua. 3 Poner el cubre-objeto y comprimir suavemente la preparación. 4 Observar al microscopio

4.2. Observación de cloroplastos en células de Elodea

1 En un portaobjetos coloque una porción pequeña de hoja de Elodea y agregue una gota de agua. 2 Cubrir la muestra con una lámina portaobjetos. 3 Aprecie la forma de los cloroplastos y el movimiento de estos.

4.3. Observación de mitocondrias en células epiteliales humanas

1 Preparar un frotis de epitelio bucal con un hisopo. 2 Secar al medio ambiente. 3 Agregar unas gotas de Verde de Janus y dejar reposar por 3 minutos. 4 Elimine el exceso del colorante con agua destilada. 5 Observe al microscopio y describa la forma de las mitocondrias en la célula.

PRACTICA Nº 8

1.-¿Qué función cumplen las inclusiones citoplasmática en las células vegetales y animales, respectivamente?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- Dibuje y coloree todas las muestras observadas en la práctica




Aumento:________


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PRACTICA Nº 9

ACTIVIDAD ENZIMÁTICAPRIMERA PARTE: CATALASA

I. FUNDAMENTO

Las enzimas son proteínas cuya función es acelerar (catalizar) reacciones químicas que ocurren dentro de la célula y que en ausencia de ellas no se llevarían a cabo o de lo contrario tomarían muchísimo tiempo. Como se aprecia en la siguiente figura, las enzimas son específicas para sus sustratos, los cuales quedan unidos complementariamente al sitio de unión de la enzima donde son modificados enzimáticamente, liberándose al final de la reacción los productos respectivos.

La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolismo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2

(agua oxigenada). Esta enzima, la catalasa, lo descompone en agua y oxígeno, por lo que se soluciona el problema. La reacción de la catalasa sobre el H2O2, es la siguiente:

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como muchas de las bacterias patógenas son anaerobias (no pueden vivir con oxígeno), mueren con el desprendimiento de oxígeno que se produce cuando la catalasa de los tejidos actúa sobre el agua oxigenada.

II. OBJETIVO. 2.1 Detectar la presencia de la enzima catalasa en un tejido animal.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio - Gradillas - Pipetas-tubos de ensayo

Deberás traer de casa

- Hígado de pollo - Agua oxigenada

IV. MÉTODOS

1 Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado. 2 Añadir 5 mililitros de agua oxigenada. 3 Se observará un intenso burbujeo debido al desprendimiento de oxígeno. 4 Discutir la formación de burbujas en distintas mesas, relacionándolo con la concentración de catalasa.

SEGUNDA PARTE: HIDROLÍTICA DE LA AMILASA

I. FUNDAMENTO

Mediante esta experiencia vamos a ver la actividad de otra enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva. Esta enzima actúa sobre el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace O-glicosídico, por lo que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa. Es importante que recuerdes las reacciones características de glúcidos para comprender esta experiencia.

II. OBJETIVOS. Comprobar que sólo bajo ciertas condiciones las enzimas funcionan óptimamente catalizando una reacción enzimática con su sustrato.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio. - tubos de ensayo - Baño maría -gradillas - Vaso de precipitados -solución diluida de almidón y sacarosa - Lugol

IV. MÉTODOS

1. Poner en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4.2. Proceder a llenar los tubos como lo indica la figura. 3. Agregar 3 gotas de lugol a cada tubo 4. Aparecerán diferencias entre los 4 tubos dependiendo de si hay o no almidón en el medio.

Recuerda: reacción positiva, color violeta, hay almidón. Reacción negativa, no cambia color, no hay almidón.

Nota: Para ayudarte y formar más saliva, piensa en un limón o en algo que te apetezca mucho comer... Así favoreces que se forme más saliva.


1.-¿En qué parte de las células encontramos la enzima catalasa y cuál es la función de dicha enzima?. ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.- ¿Qué factores, además de la temperatura, podrían afectar la actividad de una enzima?.________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Dibuje las reacciones observadas en la práctica. e incluya alguna observación a sus resultados

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PRACTICA Nº 10

METABOLISMO ANAEROBIO: FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

I. FUNDAMENTO La respiración celular es el proceso mediante el cual se oxidan moléculas energéticas (glucosa, principalmente), empleando al oxígeno como aceptor final de electrones, y obteniendo gran cantidad de energía para la realización de las funciones celulares básicas.

La fermentación, por el contrario, es un proceso anaeróbio que implica la ruptura de alimentos por un proceso de degradación química que no requiere oxígeno. Los alimentos no son degradados completamente hasta CO2 y H2O (como ocurre en la respiración), sino hasta compuestos intermedios tales como ácido láctico (fermentación láctica) o alcohol (fermentación alcohólica). Esta ruptura incompleta de los alimentos significa que menos energía es disponible durante la fermentación que el liberado durante la respiración.

Ambos procesos pueden tomar lugar en las células a la vez. Además, los primeros pasos en la ruptura de la glucosa en la respiración, son anaeróbicos.

Anaeróbica

Glucosa Ácido láctico

AeróbicaGlucosa CO2 + H2O

Ciertas bacterias y hongos derivan todo sino parte de su energía de la fermentación y los productos finales son frecuentemente el alcohol y CO2, el proceso en este caso es denominado fermentación alcohólica. Las levaduras y bacterias, las cuales conducen a la fermentación son capaces de emplear sus sistemas enzimáticos para liberar energía anaeróbicamente a partir de carbohidratos, particularmente almidón y azúcar.

DESTINO DE LA GLUCOSA EN CONDICIONES AEROBIAS (RESPIRACIÓN) O ANAERÓBIAS (FERMENTACIÓN)

ADP ADP ATP + P P ATP

GLUCOSA

1 ETANOL

II. OBJETIVOS

2.1 Comprobar que ante la presencia de oxígeno, el azúcar es oxidado hasta CO2 y agua. 2.2 Comprobar que en ausencia de oxígeno, el azúcar es convertido en etanol y CO2 por las

levaduras, mediante el proceso de fermentación alcohólica. 2.3 Comparar cualitativamente un proceso fermentativo vs. Respiración.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio -Tubos de ensayos -Reactivo de Fehling A y B - Gradillas - Baño Maria - Probetas -Algodón -Tiras de medidas de pH -Dicromato de potasio -Soluciones al 2% de fructosa, glucosa, almidón y sacarosa -Acido sulfúrico diluido

IV. MÉTODOS

Fermentación alcohólica 1. Preparar los tubos como lo indica la tabla:

REACTIVO 1 2 3 4 5 6

Agua Destilada .... .... .... ..... .... ....

Sol. de levadura 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL

Solución de Glucosa 2mL

Sol. Sacarosa 2mL

Sol. Almidón 2mL

Sol. Fructosa 2mL

Sol. Glucosa 2mL

2. La muestra con glucosa sola nos servirá para realizar la reacción de Fehling y comprobar que es glucosa por su poder reductor.

3. Para colocar la levadura en el tubo, previamente se tiene que disolver una punta de espátula de la cepa de panificación de Sacharomyces cerevisae en un poco de agua.

4. Llenar los tubos cuidando que no queden burbujas de aire, para conseguir un ambiente de anaerobiosis. Colocar un globo en la boca de los tubos para que el sistema quede cerrado herméticamente.

5. Llevar todos los tubos a 37ºC por 30 min. 6. Anotar la formación de CO2 para cada tubo (La fermentación se evidenciará por la presencia de

burbujas en el tubo y el globo hinchando, debido a la producción de CO2. 7. Detectar la presencia de glucosa aplicando reactivo de Fehling A y B, llevando a Baño Maria por

8 minutos 8. Medir el pH del medio. 9. Opcionalmente, el profesor del grupo detectará cuidadosamente la presencia de etanol en las

muestras. Hay que tener mucho cuidado porque hay que manipular Ácido sulfúrico y puede ser peligroso el manejarlo. Se tomarán 2 ml. de la solución del tubo herméticamente cerrado y la ponemos en otro tubo de ensayo. Añadimos unos cristalitos de dicromato potásico y a continuación 2 ml. de acido sulfúrico diluido. Al calentar al baño María debe formarse un compuesto aromático característico, y se pone de manifiesto porque cambia de color de amarillento a verdoso. Es una reacción que nos indica que existe etanol.

10. Observar, comparar y discutir los resultados de los experimentos planteados.


1.- Complete el dibujo y la tabla. .

CO2

glucosa

pH

etanol

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


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PRACTICA Nº 11

DIVISIÓN CELULAR: MITOSIS

I. FUNDAMENTO

El ciclo celular es un proceso que consiste en la replicación de material genético y formación de células hijas. Compromete dos etapas: La primera llamada interfase, donde no ocurre división celular propiamente dicha y la segunda de división celular (ver figura). Dependiendo del tipo de células donde se lleve a cabo, la división celular toma el nombre de Mitosis (si ocurre en células somáticas) o Meiosis (si ocurre en células germinales).

La mitosis implica cuatro etapas: Profase, Metafase, Anafase y Telofase. En las dos primeras ocurre la condensación y ordenamiento de los cromosomas y en las dos últimas se lleva a cabo la distribución de los cromosomas. El resultado final son dos células hijas diploides (2n).

II. OBJETIVOS

Reconocer las distintas fases del ciclo celular en células somáticas de raíz de cebolla.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio

- Placa Petri - Orceína acética - Pinza de madera - Microscopio - Mechero de alcohol - Acido Acético

- Etanol

IV. PROCEDIMIENTO

Con 8 días de anticipación a la práctica preparar el cultivo de cebolla de la siguiente manera: En un vaso con agua, de preferencia de borde oscuro, colocar una cebolla mediana de tal manera que haga contacto la parte terminal de la cebolla con el agua y dejar en lugar semioscuro.

Preparación de la Muestra

1 Disponer de gran número de raíces de cebolla, haciendo cortes de la parte terminal (aproximadamente de 0.5cm.) y depositar en una placa Petri.

2 Colorear con orceína por 10 minutos: contiene orceína A que interrumpe el proceso si se está dando en ese momento y reblandece la unión de las células muertas, así como orceína B que tiñe la cromatina o material hereditario.

3 Luego calentar la muestra sólo hasta que emane vapores por 2 veces consecutivas con intervalos de enfriamiento.

4 Trasladar las raíces a diferentes portaobjetos, separar solo el ápice (parte terminal de la raíz) y agregar una gotita de orceína y cubrir con el cubreobjeto.

5 Apretar la muestra suavemente con la yema de los dedos. 6 Secar el exceso de colorante con papel secante y llevar al microscopio para su observación a menor

y mayor aumento.

Interfase Profase Temprana Profase Tardía Metafase Anafase Temprana

Anafase Tardía Telofase Temprana Telofase Tardía Citocinesis

PRACTICA Nº 11

1.- dibuje las muestras observadas.



Muestra:_________ Muestra:_________ Coloración:_______ Coloración:_______ Aumento:________ Aumento:________




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PRACTICA Nº 12

DIVISIÓN CELULAR- MEIOSIS

I. INTRODUCCIÓN

La meiosis es un proceso celular, ligado a la reproducción sexual, por el cual, la célula madre de naturaleza diploide, da origen a los gametos de naturaleza haploide, de tal manera que en la fecundación se reestablece el número diploide de cromosomas. Así, mientras la mitosis es un proceso de división celular con formación de dos núcleos hijos con el mismo número de cromosomas que la célula original, en la meiosis en cambio hay dos divisiones celulares con reducción del número de cromosomas a la mitad.

La meiosis es un proceso citológico que comprende dos divisiones celulares. En la primera división meiótica ocurre una serie de intercambios de material genético entre los cromosomas homólogos. Este fenómeno es un proceso complejo que comprende una larga profase en la que, para su mejor estudio y comprensión, se distinguen los estadios: Leptoteno, Cigoteno, Paquiteno, Diploteno y Diacinesis. Entre la telofase I y el comienzo de la segunda división meiótica, a diferencia con la mitosis, no hay un período de síntesis y duplicación del ADN, por lo demás la división meiótica II, tiene lugar como la mitosis normal en cada una de las células haploides (meiocitos de segundo orden), resultantes de la división meiótica I. II. OBJETIVOS: Al finalizar la presente práctica los alumnos estarán capacitados para:

2.1 Reconocer y diferenciar los estados fisiológicos por los que atraviesan los cromosomas durante el proceso meiótico en células animales.

III. MATERIALES Y METODOS

Un excelente material para la observación de los procesos de división celular lo constituyen insectos de la especie Grillos asimilis “grillo domestico” y Laplatacris sp “langosta”. En los individuos machos debe recuperarse el testículo después de la disección en el que se estudiará la meiosis en células de maduración (espermatocitos) de la zona proximal al canal deferente. El material a usar en el presente ejercicio es el siguiente:

- Microscopio- Mechero de alcohol- Cloroformo- Carmín acético- Carnoy- Solución salina 0.7%- Placas petri- Laminas, laminilla- Algodón- Papel filtro- Estilete de punta fina

IV: PROCEDIMIENTO

- Anasteciar los animales en las placas petri, colocando dentro de un pedazo de algodón embebido en cloroformo.

- Disecar el animal con la ayuda del estereomicroscopio o lupas, colocándolo en posición dorsal. Separar los testículos adicionándoles la solución salina procurando no exponer los órganos al aire para evitar posibles desecaciones.

- Seccionar los testículos en partes pequeñas de 2 a 3 mm y colocarlos en un vial con fijador carnoy por espacio de 30 min.

- Traspasar los fragmentos a una luna de reloj que contiene carmín acético y lleve al calor del mechero hasta que entre en ebullición por espacio de 15 segundos de 5 a 7 veces.

- Retire el fragmento del testículo con una pinza de punta fina y colóquela sobre un portaobjetos y agréguela una gota de carmín acético.

- Tape la preparación con una laminilla cubre objetos y sobre esta ponga un papel absorbente. Presione el cubre objetos con la yema del dedo pulgar y luego con la extremidad plana de un

lápiz presionar un poco mas fuerte hasta convertir el material del porta objetos en una capa delgada (squash). Al realizar esta operación, tenga cuidado para no romper el cubre objetos.

- Limpie el exceso de colorante del porta objetos con papel higiénico y lleve el preparado al microscopio para su observación a menor y mayor aumento.

- Observar y esquematizar.

PRACTICA Nº 121.- Dibuje las muestras observadas.



Muestra:_________ Muestra:_________ Coloración:_______ Coloración:_______ Aumento:________ Aumento:________






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PRACTICA Nº 13

PRIMERA PARTE: EXTRACCIÓN DE ADN

I. FUNDAMENTO

El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotes es el componente de la cromatina o material genético. En la cromatina el ADN se encuentra asociado a proteínas conocidas como nucleoproteínas de tipo histonas, protaminas y en menor proporción con proteínas de tipo ácidas. Para extraer el ADN sin arrastrar sus proteínas asociadas se podría emplear soluciones ácidas. Sin embargo, éstas soluciones podrían dañar la estructura de la hebra, de modo que se prefiere emplear solventes orgánicos como cloroformo, el cual extrae proteínas dejando insoluble al ADN.

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción.

Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente.

La secuencia general de extracción es la siguiente:

1 Liberación del ADN en forma soluble por medio de la destrucción de los sistemas membranosos de los tejidos (membrana celular y nuclear). 2 Separación de los complejos de nucleoproteína por denaturación de la parte proteica. 3 Separación del ADN de las otras macromoléculas por solubilidad diferencial. 4 Precipitación del ADN por insolubilidad en alcohol y bajas temperaturas.

II. OBJETIVOS

1 El objetivo fundamental de esta práctica es utilizar unas sencillas técnicas para poder extraer el ADN de un tejido animal y por el aspecto que presenta, confirmar su estructura fibrilar. 2 A partir de la longitud enorme de las fibras también se confirma que en el núcleo el ADN se encuentra replegado.

III. MATERIALES

Encontrarás en el laboratorio: - 2 Tubos de prueba de 20 ml - Vaso de precipitación de 500ml. - 5 Baguetas - 1 embudo - Medio de homogenización: - Etanol helado - Lauril Sulfato de Sodio (SDS o -Hielo SLS) 50 g - 5 Pipetas de 10ml - Cloruro de Sodio 8. 770 g - Baño María - Citrato de Sodio 4.110 g

- Mortero con pilón - EDTA 0.292 g - Gasa esteril

IV. PROCEDIMIENTO

Para la extracción DE ADN del manto de choro, con etanol, seguiremos los siguientes pasos.

4.1. Homogenización del Tejido

El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un MORTERO y un pilón.

Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de enzimas endógenas que pudieran degradar el material de interés.

En esta práctica se empleará un método de ruptura con mortero (sin congelamiento). La principal ventaja de este método es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar parcialmente las moléculas de ARN. Para ayudar a la solubilización de los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos protéicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecilsulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas.

La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes, EDTA. Esto

impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg2+ ), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas.

Seguir los siguientes pasos:

1 Las células se homogenizarán en un mortero empleando el medio de homogenización. ES OBLIGATORIO el uso de guantes en todo momento para evitar la contaminación de la muestra con DNAasa proveniente del sudor de las manos que pueda degradar nuestras muestras de ADN.

2 Se lisarán las células agregando 10 ml de la solución de homogenización por cada gramo

de tejido con que se inició el proceso. Los componentes como el SDS, permitirá por una parte la separación de las proteínas asociadas a la cromatina y por otra parte la ruptura de membranas. El NaCl produce el estallido de los núcleos para liberar así las fibras de cromatina. El EDTA es un agente quelante que inactiva a las DNAasas.

3 Incubar la mezcla en un Baño María a 60°C por 15 minutos exactos. El calor ablandará el tejido permitiendo que los componentes de la solución homogenizadora ingrese a la célula. Además, esta temperatura denatura muchas enzimas que interfieren con el procedimiento.

4 Filtrar el homogenizado empleando la gasa esteril 5 Enfriar rápidamente la preparación filtrada en una cubeta con hielo, por 10 minutos a fin

de detener cualquier proceso degradativo del ADN.

4.2. Precipitación del ADN

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas y deshidratación de la molécula, lo cual posibilita su agregación y precipitación.

La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la resuspensión en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos.

Efectuar los siguientes pasos: 1 Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente hasta que comience a aparecer una consistencia blanca que significa que el ADN ha precipitado. 2 Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar enrollando a la vez con una bagueta de vidrio. 3 Reconoce 3 fases en tu solución: la del alcohol (que flota en agua), la de tu tejido triturado (abajo del todo) y la interfase entre los 2 que contiene ADN precipitado. 4 Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola dirección, se logrará apreciar el ADN en la bagueta, asemejando una madeja de un hilo sumamente fino o como copos de algodón.

Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN (protocolos de PURIFICACIÓN de ADN).

SEGUNTA PARTE: ELECTROFORESISI. FUNDAMENTO

El problema de realizar separaciones de biomoléculas grandes es enfrentado frecuentemente en las ciencias de la vida, tanto para análisis cuali- como cuantitativos de mezclas o de preparaciones individuales. En la mayoría de casos es deseable causar el mínimo de daño a las moléculas de manera que sus propiedades no cambien de manera significativa. Los métodos actuales para la separación de biomoléculas descansan por lo tanto en procesos físicos que causan el mínimo de desnaturalización, lo cual resulta en la máxima retención de cualquier actividad biológica. Un gran grupo de métodos de separación están basados en algunas propiedades químicas o biológicas, o en interacciones de la molécula que se investiga, y algunas otras están basadas en diferencias en pesos moleculares o cargas netas, o a veces una combinación de las dos propiedades. Los métodos electroforéticos pueden diseñar se para explotar cualquiera de los dos, o ambos parámetros, aunque las diferencias en tamaño son las principales en el caso de las separaciones de ácidos nucleicos.

La electroforesis en geles de agarosa es una técnica común en los laboratorios de Biología Molecular. El proceso consiste en la aplicación de una diferencia de voltaje a una muestra de ADN que se encuentra inmersa en un gel de agarosa, y esta a su vez en bañada por un buffer determinado. La generación de polos opuestos provoca la migración del ADN del polo cargado negativamente (Cátodo) al polo cargado positivamente (Anodo), debido a que el ADN tiene una carga neta negativa.

Los geles de agarosa son el medio más popular para separaciones electroforéticas de ácidos nucleicos de mediano y gran tamaño. Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5 %, y esta concentración depende de los tamaños de los ácidos nucleicos a separar. Aunque los geles de agarosa carecen de fuerza mecánica (especialmente los más diluidos), la manipulación se facilita por el uso de geles horizontales, los cuales pueden ser soportados por lámina de vidrio o de plástico

El gel resultante es fotografiado en un aparato llamado transiluminador, presencia de bromuro de etidio, para poner en evidencia los fragmentos de ADN en el gel. En la presente práctica analizaremos la fotografía de un gel de agarosa y observaremos las distintas bandas de ADN que en él aparecen, discutiendo la razón por las que unas aparecen más arriba que otras. Realizaremos un análisis como el que se hace en ensayos de diagnóstico molecular y de clonación.

II. OBJETIVOS

-Comprobar la movilidad del ADN en un gel de agarosa -Analizar la utilidad de esta técnica en ensayos de biología molecular aplicada

III. MATERIALES Y MÉTODOS

Analizaremos la siguiente Lámina de un gel de agarosa y discutiremos cuál es el significado y la interpretación de esas bandas en el gel.


1.- Dibuje sus resultados

2.-Discuta y resuelva los siguientes enunciados

En el gel aparecen 3 carriles o calles, cada uno con una muestra distinta (M, 1 y 2). Los pocillos son hechos en el gel para introducir ahí la muestra de ADN.

1 ¿qué hay en el primer carril? ____________________________________________________________________________________ 2 en la muestra 1, qué tamaño aproximado tienen las bandas de ADN? _______________________________________________________________________________3 ¿por qué aparece RNA en algunas nuestras y por qué aparece tan abajo, comparado al ADN? _______________________________________________________________________________4 ¿qué significado tiene que algunas bandas sean más gruesas que otras? _______________________________________________________________________________5 ¿qué hubiera esperado encontrar si corría un gel con su ADN recién extraído? Dibujelo. ______________________________________________________

M 1 2


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