PRODUCCIÓN, UTILIZACIÓN Y ALGUNOS ASPECTOS TECNICOS DE LOS BIOFERMENTOS.

Por: Ing. Agro. Fabián Pacheco R.

1 INTRODUCCIÓN

Los biofermentos son el producto de un proceso de fermentación de materiales orgánicos. Dicho proceso se origina a partir de la intensa actividad de microorganismos que se encuentran en la naturaleza de manera libre. Muchos microorganismos de los que se pueden encontrar en los biofermentos juegan un papel importante en la agricultura así como también en la producción de algunos alimentos. Tal es el caso, de los microorganismos responsables de producir yogurt, chicha, vino, entre otros.

Los biofermentos son un excelente sustituto de los fertilizantes químicos altamente solubles de la industria. Estos representan una alternativa para los agricultores dependientes de insumos agrícolas sintéticos. La elaboración es sumamente sencilla y los materiales son de alta disponibilidad. Los biofermentos son abonos líquidos ricos en energía y en equilibrio mineral. Están compuestos básicamente de boñiga fresca disuelta en agua, melaza, suero de leche o leche, sales minerales, harinas de roca molida, entre otros componentes. El proceso de hacer biofermentos es un proceso anaeróbico en donde diversos microorganismos son responsables de que se genere del proceso de fermentación. (Restrepo 2002)

El presente documento contiene una serie electos técnicos y metodológicos que permitirán al lector comprender el proceso para elaborar y utilizar biofermentos de buena calidad. Dicho proceso, es netamente bioquímico. Por lo tanto en este documento se presentarán, analizarán y aplicaran muchos conceptos propios de la biotecnología en producción de alimentos así como también principios básicos de la microbiología ambiental.

Fotografía 1: Planta de biofermentos en Finca Integrada Orgánica. Universidad EARTH

2 REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 FERMENTACIÓN

Cameron (SF) Indica: “El Origen de la palabra fermentación se debe a la liberación de anhídrido carbónico al actuar la levadura sobre el azúcar, lo cual genera una efervescencia parecida a la ebullición (del latín fervimentum: ebullición)”.

Pasteur demostró que la fermentación era originada por micro-organismos vivos. Butchner en 1897 agregó que este proceso bioquímico de fermentación se debía a sustancias que segregaban los microorganismos, específicamente las levaduras. A estas sustancias, técnicamente se les puede denominar como biocatalizadores o como enzimas, Cameron (SF). Sin embargo, actualmente se conocen más de 1000 enzimas diferentes y cada una de ellas puede catalizar una reacción química específica. Las enzimas provienen de la síntesis bioquímica que realizan diversos organismos. (Alberl y Lehninger 1975).

Bruchmann (1980) indica que las fermentaciones son procesos anaeróbicos que liberan energía. En las fermentaciones, un sustrato orgánico -producto de la degradación de hidratos de carbono la mayoría de las veces- cede equivalentes de reducción, o sea, electrones o hidrógeno ligados a coenzimas que son captados por un aceptor orgánico. Smith y Wood (1998) indican que la fermentación se puede entender como una estrategia catabólica para utilizar una fuente de energía en ausencia de un aceptor externo de electrones. Este aceptor externo sería el oxígeno, pero como la fermentación se desarrolla en medios anaeróbicos, la fuente de energía serían la glucosa para el caso de los biofermentos. En términos más generales, Ward (1989) indica que la fermentación implica el uso de microorganismos para transformar la materia orgánica mediante procesos de catálisis generados por enzimas.

La elaboración de biofermentos es un proceso bioquímico y el éxito en la elaboración de éstos depende, en gran parte, del entendimiento y potenciación de los procesos que se gestan en las fermentaciones. Bruchmann (1980) indica que la fermentación puede resumirse de la siguiente forma: “Se trata de la degradación de un azúcar hasta la obtención del producto intermediario central llamado ácido pirúvico, del cual se originan los diferentes productos de la fermentación”. Dentro de los productos obtenidos se encuentran: etanol, butanol, acetona, isopropanol, acetoina, ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido propiónico, ácido propiónico, ácido butírico, ácido succiónico, dióxido de carbono, hidrógeno y metanol.

2.2 SUSTRATOS PARA LA FERMENTACIÓN

Los microorganismos en la mayoría de los casos se desarrollan sobre el propio sustrato fermentable. Este sustrato, por consiguiente, es apropiado como medio de cultivo porque posee todos los requerimientos nutricionales. Las excepciones a esta norma se presentan cuando el hombre prepara el sustrato idóneo para un tipo de microbiología específica, que posteriormente es inoculada y de esta forma se obtiene un producto final

específico. El yogurt u otros alimentos fermentados son un buen ejemplo de lo anterior. Sin embargo, en la inmensa mayoría de las fermentaciones, la microbiología a establecerse y él producto final son influenciados, al fin y al cabo, por el tipo de sustrato que se utilice. (Bruchmann 1980)

Las materias primas para la fermentación provienen de las plantas en su inmensa mayoría. Las materias primas que facilitan el proceso de fermentación contienen hidratos de carbono, compuestos nitrogenados y otros compuestos nutritivos. Este tipo de compuestos están presentes en productos ricos en azúcares como por ejemplo las melazas, lejías, sueros, lactosa, entre otros. Además, estos nutrientes se pueden encontrar en materiales ricos en almidón como es el caso de las diferentes harinas de cereales o de raíces. (Bruchmann 1980) Los nutrientes tienen tres funciones: proveer la materia prima requerida para que se desarrolle una síntesis protoplasmática, suplir la energía necesaria para que se dé el crecimiento celular y las reacciones biosintéticas correspondientes. Finalmente los nutrientes deben servir como aceptores de los electrones liberados en la reacción que brinda energía a los organismos. En los organismos aeróbicos, el O2 juega el papel de aceptor y en los organismos anaeróbicos estrictos o facultativos, algún producto orgánico del metabolismo o alguna sustancia inorgánica remplaza al O2. (Martín| 1980)

Dentro de las fuentes de energía más usadas por los microorganismos heterótrofos del suelo se encuentran: celulosa, hemicelulosa, lignina, almidón, sustancias pécticas, inulina, quitina, hidrocarburos, azúcares, proteínas, aminoácidos y ácidos orgánicos (Martín, 1980). Analizando lo expuesto por Frazier y Westhoff (1991), no solo es importante el tipo de alimento energético, sino su concentración, ésta incide directamente en aspectos como agua disponible y algunos efectos osmóticos sobre la microbiología. Para un porcentaje de azúcar dado, la presión osmótica varía dependiendo del peso molecular del azúcar. Ejemplo de ésto es que una solución de glucosa al 10 % tendría el doble de presión osmótica que una solución de maltosa o sacarosa a la misma dilución, o bien, presentaría el doble de retención de humedad. A manera de ejemplo, se puede señalar que las levaduras crecen bien en concentraciones de azúcar bastante altas, caso contrario son las bacterias que se desarrollan mejor en condiciones bajas. Sin embargo, siempre existen excepciones a la regla y algunas bacterias no presentan problemas al desarrollarse en concentraciones de azúcar más elevadas.

Aplicando algunos conceptos microbiológicos de la industria vinícola, es importante destacar que los grados Brix finales de un biofermento no deben de sobrepasar de 24, ésto fundamentado en que por cada 2 grados Brix se produce un uno por ciento de alcohol. Porcentajes mayores al 12 % de alcohol inhiben el desarrollo microbiológico en un proceso de fermentación. Según Borrad (1988) “el etanol es 4 o 5 veces más inhibidor que el azúcar”, por lo que se puede considerar que la elaboración de un biofermento es un proceso muy similar a la elaboración de un vino, se deberían de aplicar los conceptos anteriormente mencionados para asegurar el éxito del proceso.

2.3 BIOLOGÍA DE LA FERMENTACIÓN ANAERÓBICA.

Considerando que el proceso bioquímico para obtener los biofermentos, es un proceso anaeróbico de fermentación, es importante destacar y discutir aspectos microbiológicos del proceso. De esta forma, se podrán ampliar los criterios necesarios

para interpretar acertadamente los diferentes resultados obtenidos en los análisis microbiológicos.

De todos los micro-organismos vivos que existen en el planeta, solo unos cuantos son estrictamente anaeróbicos. Generalmente este tipo de micro-organismos viven en ambientes que carecen de oxígeno o que la presencia de éste elemento es mínimo, por ejemplo, en suelos o aguas profundas o en lodos marinos. Aunque existen pocos organismos anaeróbicos, éstos realizan procesos bioquímicos de singular importancia para el hombre. Por ejemplo, son capaces de extraer energía de la glucosa y otras moléculas nutrientes en ausencia de oxígeno, dando como resultado del proceso diversos productos de singular importancia, como serían muchas de las sustancias contenidas en los biofermentos (Alberl y Lehninger 1975). Según Frazier y Westhoff (1991) es importante señalar que algunos micro organismos considerados aerobicos pueden proliferar de forma precaria en condiciones anaeróbicas. Esto permite inferir que el biofermento, a pesar de haber sido producido bajo condiciones anaeróbicas, es un producto que a la hora de ser aplicado en campo también es responsable de inocular microorganismos aeróbicos.

Se debe indicar que existen una gran cantidad de microorganismos que se pueden adaptar tanto a condiciones aeróbicas como anaeróbicas. A este tipo de microorganismos se les denomina facultativos. Se caracterizan por poder tomar energía de la glucosa en condiciones anaeróbicas, mediante el mismo tipo de mecanismo bioquímico que utiliza microorganismos estrictamente anaeróbicos. Este proceso es conocido como fermentación anaeróbica. Sin embargo, en presencia de oxígeno, éstos organismos prefieren oxidar sus alimentos mediante dicho elemento y de esta forma tomar su energía. (Alberl y Lehninger 1975)

Por otro lado, se debe de señalar que los distintos microorganismos difieren unos de otros en los productos finales que originan a partir de la glucosa. Ejemplo de éstos es el alcohol etílico y el CO2 obtenidos por un proceso de fermentación con levaduras o la acetona o el ácido acético producto de la fermentación de algunas bacterias. En fin, los productos finales de la fermentación de la glucosa permiten identificar diferentes micro-organismos. (Alberl y Lehninger 1975).

La composición elemental de los microorganismos es muy similar. Entre los diferentes tipos de bacterias, hongos, actinomicetos, algas y protozoarios se presentan los mismos elementos: Nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, azufre, hierro, calcio, magnesio, zinc, cobre, cobalto y molibdeno son parte integral de la estructura protoplásmica. Finalmente se debe de indicar que la célula microbiana está constituida de estos nutrientes esenciales además de carbono, hidrógeno y oxígeno. (Martín 1980)

2.4 MICROORGANISMOS: IRREMPLAZABLES CATALIZADORES.

Bruchmann, (1980) indica: “En la técnica pueden llevarse a cabo innumerables reacciones hidrolíticas y muchas reacciones redox enzimáticas libres de células, pero las reacciones enzimáticas complejas que llevan hasta el producto deseado mediante el trasporte de energía necesitan, en la mayoría de los casos, el empleo de microorganismos vivos como productores de enzimas y de preparados enzimáticos”. Los microorganismos

más importantes para realizar procesos de fermentación se encuentran principalmente entre las bacterias (Schizomycetes) y hongos (Fungi), aunque también las algas juegan cierto papel.

Entre los representantes de las bacterias con mayor importancia técnica, se pueden mencionar a las eubacterias y a los actinomicetos. A manera de ejemplo, dentro del grupo de las eubacterias se encuentran: Streptococus lactis (Fermentación de verduras y productos lácteos así como también los ensilajes), Bacterias lácticas o Lactobacteriaceae (Productos lácticos, ácido láctico), Escherichia coli (contaminación del agua, flora intestinal). Además, dentro de éste grupo se encuentran algunos grupos de Pseudomonas y otros de Bacillus de singular importancia. Entre los actinomicetos de importancia técnica se pueden destacar los Actinomicetes (responsables del olor a tierra y responsables de la síntesis de colorantes y de vitamina B12). (Bruchmann 1980)

En lo que concierne a los hongos, principalmente los relacionados con procesos de biofermentos y concentrados microbiales como el “MM” (ver anexo 1 para mas información sobre el MM), cabe destacar que de acuerdo a los estructuras de sus hifas, los hongos altamente organizados se dividen en eumicetos y ficomicetos. Entre los eumicetos se deben de resaltar a las levaduras como hongos de importancia en la agricultura orgánica. En especial las diversas cepas de Saccharomyces cereviciaea (levaduras de panadería, cerveza, vinos, etc). Además, están las especies de Merulius, Boletus y Polyborus, quienes tienen habilidades especiales para degradar celulosa y lignina. Finalmente, en la categoría de Fungi imperfecti, se encuentran todos aquellos eumicetos que no tienen estructuras sexuales. Representantes importantes en la elaboración de fermentos de este grupo son diversos organismos del género Fussarium sp (fermentación alcohólica de pentosas). (Bruchmann. 1980)

2.5 CARACTERÍSTICAS DE LOS BIOFERMENTOS

Los biofermentos se originan a partir de la fermentación de materiales orgánicos, como por ejemplo los estiércoles de animales, plantas verdes y frutos. El proceso de fermentación es desarrollado gracias a la acción de diversos microorganismos capaces de transformar el estiércol, el suero, las mieles y otros materiales que integran el biofermento en vitaminas, minerales y ácidos orgánicos. Dichas sustancias son esenciales para el buen desarrollo de las plantas. (Restrepo. 2001)

Dentro de las sustancias más comunes que se pueden encontrar en los biofermentos, según Restrepo (2001) se encuentran:

La tiamina (Vitamina B1): Participa en el metabolismo de los carbohidratos y la función respiratoria, juega un rol importante en la trofobiosis “al aumentar la inmunidad adquirida en los vegetales”

Pirodoxina o piridoxol (vitamina B6): Es biosintetizada principalmente por levaduras y es estable a la luz y al calor.

Ácido nicotínico (vitamina B3): También conocida como niacina, es precursor de enzimas esenciales al ciclo de la respiración y al metabolismo de los carbohidratos.

Ácido pantoténico (vitamina B3): Se encuentra en todas las células vivas. Es producido por microorganismos e insectos y es esencial para la síntesis de coenzimas, principalmente la A.

Riboflavina (vitamina B2): Promueve el crecimiento mediante la acción de oxi-reduxión. Producida por bacterias y unida al ácido fosfórico, forma coenzimas como la FAD o FMN, también conocidas como fermentos respiratorios amarillos, los cuales tienen atributos importantes sobre el metabolismo de las proteínas y los carbohidratos. Se degrada con la luz solar, pero sí es termo resistente. Ward (1989) indica que existen diferentes microorganismos a nivel industrial que se han utilizado para la obtención de riboflavina, ejemplo de ellos son: Emerothecium ashbyii, Ashdya gossypii, Bacillus subtilis, así como algunos Ascomycetes.

Cianobalamina (vitamina B12): la producen bacterias como Streptomices, Bacillus y Pseudomonas. También la producen los actinomicetos. Químicamente, es un complejo de varias sustancias similarmente activas. Ward (1989) indica que la síntesis química de la vitamina B12 es sumamente complicada y por lo tanto, la única forma de obtenerla comercialmente es a través de procesos de fermentación con Pseudomonas sp.

Ácido ascórbico (vitamina C): Cuando Bacillus y Asperjillus fermentan glucosa se forma esta vitamina, es soluble en agua y en alcohol y se degrada a la luz solar.

Ácido fólico (miembro del complejo de vitamina B): producido por los microorganismos que están presentes en la leche, por ejemplo Streptococus, Lactobacillus y Streptomyces.

Ergosterol (vitamina E): Los biofermentos que se preparan utilizando leche o suero, producen cantidades significantes de estas sustancias cuando se encuentran presentes hongos como el Penicillium y el Asperjillus.

Aminoácidos: Las sustancias fermentadas tienen todos, o casi todos, los aminoácidos posibles, producidos por los microorganismos. Estos aminoácidos se encuentran en cantidades muy variables. Es por ésto que se puede indicar que los biofermentos son fuentes muy ricas en aminoácidos. Bruchmann, (1980) indica que los aminoácidos constituyen la fuente de nitrógeno más importante para los microorganismos de la fermentación. Siendo éste el punto de partida para la formación de compuestos secundarios en la fermentación alcohólica, Smith y Wood (1998) indican que la conversión de ciertos aminoácidos en hormonas específicas o neurotransmisores es absolutamente posible, ésto evidencia que la riqueza de los biofermentos no solo debe de ser cuantificada por los macro y micro elementos disponibles a las plantas, sino que el biofermento debe de concedirse como un complejo bioquímico donde las hormonas juegan un papel muy importante.

Ácidos orgánicos: Aconítico, cárlico, carolínico, fúlvico, fumárico, gálico, gentístico, glucurónico, kójico, láctico, puberúlico, entre otros. (Restrepo 2001) A manera de ejemplo, se puede mencionar que el Aspergillus niger ha sido utilizado en procesos industriales de fermentación para la producción de ácido cítrico. Lactobacillus deldruckii ha sido utilizado desde 1981 en la producción industrial de ácido láctico. (Ward 1989). Según Martín (1980) el mecanismo microbiológico principal por el cual los compuestos insolubles de fósforo son movilizados es la producción de ácidos orgánicos.

2.6 INTERACCIONES EN LAS POBLACIÓNES MICROBIANAS

De acuerdo con Allee et all, citado por Atlas y Bartha (2002), en una misma población microbial se desarrollan interacciones positivas y negativas. Estas interacciones dependen absolutamente de la densidad de población. Concretamente se debe de indicar que las interacciones positivas van en favor de un incremento en la población, caso contrario en lo referente a las interacciones negativas. Asimismo, las interacciones positivas –cooperación- se presentan cuando la densidad es baja y las negativas -competencia- cuando la densidad es alta. Las relaciones anteriormente expuestas originan que se genere una densidad de población óptima para una tasa de crecimiento máxima.

2.6.1 Interacciones positivas

La cooperación se presenta por extenso periodo de latencia o cuando se usa un inóculo muy pequeño, lo cual causa un déficit de crecimiento. La cooperación entre microorganismos se debe principalmente a que las membranas semipermeables de la pared celular de los microorganismos son imperfectas, dejando escapar metabolitos indispensables para importantes procesos de biosíntesis y de crecimiento. Una elevada población de microorganismos logra contrarrestar el efecto, debido a que dan origen a altas concentraciones extracelulares de los metabolitos en cuestión y de ésta forma se reabsorben, evitando que los microorganismos sean afectados. Cuando hay pocos microorganismos y las pérdidas de metabolitos son mayores a la síntesis, se impide el crecimiento de la población microbial. (Atlas y Bartha. 2002)

Las interacciones cooperativas se desarrollan frecuentemente cuando las poblaciones microbianas utilizan sustratos insolubles como la lignina y la celulosa, los cuales son sustratos ampliamente usados en la elaboración de diferentes productos de la agricultura orgánica. La producción de enzimas extracelulares es responsable que dichos sustratos estén mucho más accesibles para todos los microorganismos. Al presentarse densidades de población bajas, los compuestos solubles liberados por las enzimas se pierden por dilución con mayor facilidad, afectando así el desarrollo de la población microbial. (Atlas y Bartha. 2002)

2.6.2 Interacciones negativas

A éste tipo de interacciones se les denomina de competencia, debido a que los individuos de una misma población utilizan los mismos sustratos y ocupan el mismo hábitat. Además la presencia de fugas de algunos compuestos metabólicos específicos a través de las membranas celulares causa una retroalimentación negativa que detiene el crecimiento de la población. (Atlas, R y Bartha, R. 2002)

2.7 INTERACCIONES ENTRE POBLACIONES MICROBIANAS DIFERENTES

En la naturaleza constantemente se presentan interacciones entre las diferentes poblaciones microbianas. Es importante comprender las interacciones en cuestión cuando se trabaja con inóculos de microorganismos como el “MM” (ver anexo 1) para que el inóculo a utilizar sea de buena calidad y potencie los procesos bioquímicos esperados. A

continuación se describirán algunas de las interacciones, con la intención de enriquecer el contenido de este documento.

Las categorías que se usan para describir cada interacción microbiana son de orden conceptual y muchas veces la complejidad de las interacciones en el medio ambiente sobre pasan los límites de tales categorías. Las posibles interacciones entre poblaciones microbianas se clasifican como interacciones negativas -competencia y amensalismo-; interacciones positivas -comensalismo, sinergismo y mutualismo- o interacciones positivas para una población y negativas para la otra -parasitismo y depredación-. Cabe destacar que en poblaciones ya establecidas, las interacciones positivas entre poblaciones autóctonas se desarrollarían con mayor frecuencia. Poblaciones invasoras o foráneas enfrentarían una mayor taza de interacciones negativas con las poblaciones ya establecidas. Por lo tanto, se puede inferir que el concentrado microbial MM (ver anexo 1) aplicado en los biofermentos, es un tipo de inóculo microbial que podría presentar mayor cantidad de interacciones positivas que negativas. Ésto debido a que la microbiología utilizada para elaborar el inóculo microbiano es extraída del bosque circundante a la región de aplicación. Por lo tanto, no se están introduciendo poblaciones totalmente ajenas o foráneas a la microbiología ambiental de la región. (Atlas, R y Bartha, R. 2002)

2.8 ANTECEDENTES EN INVESTIGACIÓN DE BIOFERMENTOS

En la Finca Integrada Orgánica de EARTH, en años anteriores se realizaron dos proyectos de graduación, que investigaron sobre la respuesta de los cultivos a diferentes dosis de biofermentos. Estos trabajos contienen insumos de vital importancia para establecer lineamientos técnicos que permitan dar un uso adecuado de los biofermentos.

En el primer trabajo realizado por González y Valiente (2001), se evaluaron los efectos de 5 tratamientos de biofermento (0, 2, 4, 8 y 16%) sobre el cultivo de lechuga (Lactuca sativa). La frecuencia de aplicación fue de tres veces por semana. Se pudo determinar que los tratamientos con dosis de 4, 8 y 16 % no presentaron diferencias significativas entre sí, en lo que a peso fresco se refiere, pero presentaron diferencias significativas contra el testigo y el tratamiento al 2%. Además, se pudo observar que el tratamiento al 8 % fue el tratamiento que presentó mayores respuestas, tanto en el desarrollo de peso fresco como en el de desarrollo de área foliar. En lo referente a los pesos secos aéreos y radicales de las lechugas, se pudo determinar que el peso seco aéreo presentó diferencias significativas de los tratamientos de dilución al 4, 8 y 16 % con respecto al testigo y el tratamiento al 2%, ocupando el peso más alto el tratamiento al 16 %. Sin embargo, en lo referente a los pesos secos de las raíces, se presentó una disminución estadísticamente significativa en el tratamiento al 16 %, colocando el peso de este tratamiento a la misma altura que el testigo. Dentro de las conclusiones presentadas en ese proyecto, se debe de destacar la validación positiva del efecto de los biofermentos sobre el cultivo de lechuga, indicando que la variación entre los tratamientos 4, 8 y 16 % no es significativa.

El segundo proyecto de graduación mencionado fue elaborado por Mazariegos y Colindres (2002). Se probaron cinco concentraciones de biofermentos (2%, 4%, 8 %,16 % y 32%) en el cultivo de chile (Capsicun frutesces). La frecuencia de aplicación fue de

dos veces por semana. Dentro de los resultados más importantes a considerar, se debe de indicar que dentro de los tratamientos de 4% y 16% se pudo evidenciar que a medida que se aumentaba la concentración del biofermento, aumentaba la producción de las plantas, sin embargo, al aumentar la dosis por encima del 16 %, los rendimientos se redujeron en un 33% (la P obtenida es menor a 0.05). Es posible que esta reducción tenga que estar siendo causado por un proceso de osmosis, ya que la concentración de solutos en dosis superiores al 16% pueden estar provocando la salida de agua a través de las membranas celulares, y por consiguiente, teniendo impactos contraproducentes en el buen desarrollo del cultivo.

3 MATERIALES PERMANENTES PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOFERMENTOS

3.1 BARRILES PLÁSTICOS PARA ELABORAR BIOFERMENTOS

Se deben de utilizar barriles o toneles plásticos de 200 litros de capacidad. Dichos barriles deben tener un aro metálico en buenas condiciones para poder sellar herméticamente el bioferlizante. Si se presentan entradas de aire en el proceso de fermentación el producto final podría no presentar la calidad deseada. Es importante asegurarse que la tapa del barril presente un sello de hule en buen estado en la parte interna del mismo.

Foto 2. Tapas y aro metálico para biofermento. Figura 1. Barril para biofermento

3.2 VÁLVULAS DE ESCAPE PARA GASES DE LA FERMENTACIÓN

Considerando que en el proceso de fermentación se producen gases. Es importante facilitar la salida de los mismos por medio de una válvula de escape. Dicha válvula debe evitar la entrada del aire al tanque de biofermento. A continuación se presenta un modelo sencillo de válvula para la cual se necesitan los siguientes materiales: Una manguera, una botella plástica, una arandela de aluminio, alambre, agua, un macho una hembra de PVC y una pieza de 10 cm de tubo PVC.

Figura 2. Válvula de escape de gases Foto 3. Válvula de escape de gases

La válvula de escape permite que los gases del biofermento escapen en forma de burbujas a través del agua contenida en la botella. La salida de los gases se facilita debido a que la presión del gas en el interior del barril es más fuerte que la presión creada por el sello de agua en la botella. Sin embargo el aire no puede ingresar al barril debido a que el sello de agua en la botella se lo impide.

3.3 OTROS MATERIALES

Dos a tres cubetas plásticas de 10 a 20 litros de capacidad, un colador y un palo para mover la mezcla.

4 INGREDIENTES PARA HACER BIOFERMENTOS

Figura 3. Biofermento

4.1 INGREDIENTES REQUERIDOS PARA UN BIOFERMENTO SIMPLE:

Las cantidades sugeridas a continuación son las que se han establecido gracias a la experiencia y el análisis en la Finca Integrada Orgánica de la Universidad EARTH. Sin embargo, la elaboración de biofermentos debe de ser un proceso flexible y adaptable a la realidad de cada finca. Tómense las cantidades sugeridas a continuación como punto de partida para desarrollar su propio abono y no como una receta inquebrantable.

4.1.1 Ingredientes principales y cantidades de los mismos:

50 Kg. de boñiga muy fresca de animales rumiantes (vaca o búfalo por ejemplo).

2 litros de leche o 4 litros de suero (como mínimo).

5 kilogramos de ceniza de leña.

180 litros de agua sin clorar y libre de contaminantes o antibióticos.

6 litros de melaza o 30 litros de jugo de caña.

4.1.2 Ingredientes Opcionales:

A continuación se presenta (cuadro 1) una lista de sales minerales y algunas harinas de roca que pueden ser usadas para enriquecer nutricionalmente los biofermentos. Las sales minerales pueden ser usadas a razón de 1 kilogramo por cada barril, pero esto no debe de ser inquebrantable. Por ejemplo, la harina de roca fosfórica se puede adicionar en volúmenes de hasta 10 kilos. La escogencia de las determinadas fuentes minerales de elementos, se recomienda hacerla considerando los requerimientos del cultivo en cada etapa de desarrollo. El uso de las fuentes minerales propuestas a continuación está permitido en la agricultura orgánica.

Otro ingrediente opcional es un concentrado microbial denominado como microorganismos de montaña (MM). Este es un inóculo microbiológico de alta efectividad (Anexo 1). También para inocular levaduras se puede utilizar un bloque de 500 gramos de levadura de panadería, esto acelera el inicio del proceso de fermentación.

Cuadro 1: Algunas sales minerales y harinas de roca que pueden usarse para enriquecer un biofermento.

Fuente Mineral Elemento

Sulfato de potasio K Roca fosfatada P Carbonato de calcio Ca Sulfato de zinc Zn Sulfato de magnesio Mg Molibdato de sodio Mo Sulfato de manganeso Mn Molibdato de boro Br Sulfato de hierro Fe

5 PREPARACIÓN

Figura 3. Mezclando ingredientes

Paso 1. Mientras se agita constantemente con el palo, se mezcla la boñiga con unos 100 litros de agua en el tanque de 200 litros.

Paso 2. Se diluye muy bien la melaza en una cubeta de 20 litros. Cuando la melaza se diluye por completo, se agrega lentamente al barril de 200 litros mientras se continúa agitando constantemente la mezcla.

Paso 3. Se diluye muy bien la ceniza de leña (o la sal mineral) en una cubeta de 20 litros. Cuando la ceniza se diluye por completo, se agrega lentamente al barril de 200 litros mientras se agita constantemente.

Paso 4. Se añade lentamente la leche o el suero de leche mientras se continúa agitando

Paso 5. Llenar el barril hasta un volumen total de 180 litros y dar una agitación final. No se debe llenar totalmente el barril de líquido. Esto con el objetivo de dejar un espacio libre para la generación de gases.

Paso 6. Tapar el barril herméticamente y colocar la válvula de escape de gases para que dé inicio la fermentación anaeróbica.

Paso 7. Dejar reposar la mezcla en el barril bajo sombra a temperatura ambiente. El tiempo de reposo oscila entre los 20 y 30 días (en lugares muy fríos puede durar hasta 90 días). Una señal de que el biofermento está listo es cuando deja de producir gases. Se debe de destacar que cuando se añade levadura para pan, el tiempo de fermentación se acelera considerablemente. Incluso un biofermento inoculado con levadura podrá ser usado hasta 10 días después de haber sido elaborado.

Paso 8. Verificar la calidad del biofermento. El color es un indicador muy importante. Colores violetas y azules no son deseados e indican que el biofermento está dañado. El color deseado es un verde ámbar. El olor debe ser agradable, a fermento. Olores a putrefacción son un indicador claro que algo falló en el proceso y el producto debe de ser descartado.

Foto 4. Agitando mezcla final. Foto 5. Colocando la boñiga en el barril

6 APLICACIÓN DE BIOFERMENTOS

Los biofertilizantes pueden ser utilizados de muy diferentes formas, por ejemplo, pueden ser usados foliarmente, directamente en el suelo o bien pueden ser incorporados en las aboneras para enriquecerlas microbiológica y nutricionalmente. A continuación se detallarán algunas de las formas más utilizadas. Se debe señalar que cuando el biofermento va a ser aplicado en sistemas de riego o en bombas, es importante filtrarlo. De esta forma se separan las fibras y las partículas grandes evitando que se bloqueen las boquillas del sistema de aplicación (Foto 6 y Figura 4).

Foto 6. Filtrado de biofermento para aplicarlo vía foliar

Figura 4. Preparación de bomba de aspersión con biofermento.

6.1 APLICACIÓN FOLIAR.

Generalmente los biofermentos se aplican con una bomba de aspersión de espalda sobre el follaje. Se aplica hasta que el follaje sea mojado por completo. A manera de ejemplo, se puede destacar que algunas bananeras han estado incorporando biofermentos en las aplicaciones realizadas por avioneta.

La fertilización foliar tiene la completa capacidad de suplir todas las deficiencias de micronutrientes en una planta. Según Singh (2003) quien es profesor en la Universidad EARTH: las múltiples y complejas moléculas orgánicas presentes en un biofermento aumentan la permeabilidad de la cutícula en el follaje. Al aumentar dicha permeabilidad en el follaje, también aumenta la capacidad de absorber nutrientes vía foliar. Se debe indicar que existen muchas plantas como las orquídeas o las plantas de la familia Bromeliáceaes (piñas y bromelias) que suplen hasta más de un 90 % de sus necesidades nutricionales vía foliar. La utilización de biofermentos en cultivos como los mencionados anteriormente presenta un gran potencial.

6.2 RIEGO DIRECTO A RAÍCES.

La implementación de biofermentos vía raíz es una práctica que también presenta bastantes ventajas. Lo anterior porque se facilita mucho la aplicación de los mismos. Esta práctica se puede realizar artesanalmente, usando baldes y regaderas. La aplicación de los mismos se puede tecnificar incorporando el biofermento a los sistemas de riego por aspersión o por goteo.

6.3 DOSIS Y FRECUENCIA

Se debe de indicar que hay dos aspectos que juegan un papel fundamental en la aplicación de biofermentos. El primero es la dosis de aplicación, la cual se refiere al volumen de biofermento que será mezclado con determinado volumen de agua. El segundo aspecto importante es la frecuencia de aplicación. La cual es determinada por el número de aplicaciones que se hacen en un determinado tiempo, por ejemplo el número de aplicaciones por semana.

En lo referente a la dosis de aplicación. Se recomiendan dosis de aplicación que oscilen entre el 5% y el 17%, o sea, se aplican de 5 a 17 litros de biofermento hasta llegar a un volumen de 100 litros de agua. La escogencia de la dosis adecuada depende en gran medida del estado de desarrollo fenológico de la planta. Por ejemplo, bandejas de plántulas jóvenes deben de ser aplicadas con dosis mucho menores que las utilizadas para nutrir plantas adultas, arbustos o árboles frutales.

7 ALGUNOS ANTECEDENTES EN INVESTIGACIÓN DE BIOFERMENTOS

7.1 ANALISIS DE CALIDAD REALIZADOS EN LOS BIOFERMENTOS DE UNIVERSIDAD EARTH

A continuación se presentan algunos resultados tanto de análisis químicos como microbiológicos que fueron realizados a la planta de biofermentos de la Universidad EARTH (Anexos 3 y 4). Dichos análisis apenas son el comienzo de un proceso de investigación que la Finca Integrada Orgánica de la Universidad a decidido iniciar. Generar información técnica sobre los biofermentos es importante para poder determinar parámetros de calidad de los mismos. Se debe de indicar que dichos análisis no deben caer en el error de solo analizar el contenido de macro y micro nutrientes de los biofermentos. Como se presentó en el punto 2.5 de la revisión de literatura del presente trabajo; los biofermentos aportan una gran cantidad de vitaminas, aminoácidos, ácidos orgánicos entre otros compuestos orgánicos complejos, que de una u otra forma cumplen un papel importante en el desarrollo de las plantas.

Cuadro 2. Resultados de análisis microbiológico de la planta de biofermentos de FIO. (Análisis elaborado por el CIA, 2003)

Bacterias Lactobacillus Bacillus Levaduras

UFC/ml UFC/ml UFC/ml UFC/mlk 10160000 1400000 140000 <1P 9005000 150000 150000 <1

Ca 5596000 90 6000000 <1Zn 7075000 2000000 17000000 <1Mg 190000 18000000 4000000 4000Mo 210000 3000000 10000000 6000Br 13000000 1000000 150000 <1Mn 21000000 8000000 2000000 <1

Mezcla total 8000000 102000000 30000000 <1

Biofermentos enriquecidos

UFC/ml: Unidades formadoras de colonias por mililitro de muestra.

El cuadro 2 presenta el análisis microbiológico de ocho biofermentos diferentes, cada uno de éstos enriquecido con una fuente mineral distinta. El último punto del cuadro -mezcla total- se refiere a la mezcla homogénea de cada uno de los ocho biofermentos enriquecidos expuestos en el cuadro. Dicha mezcla es la que se utiliza generalmente en la EARTH para aplicar los cultivos.

El cuadro 2 deja en evidencia que el biofermento no solo es un producto que debe ser analizado desde parámetros estrictamente químicos. Puede observarse con claridad la inmensa riqueza microbiológica que este producto presenta y lo importante que es evaluarla. Al conocer la microbiología que actúa en este tipo de fermento, se puede inferir en cuales serán algunos de los productos bioquímicos a obtener después que se haya completado el proceso de fermentación.

Es curioso ver que la población de levaduras es baja si se compara con las poblaciones correspondientes a bacterias, ésto considerando que en condiciones ácidas, las levaduras que se encuentran en poblaciones heterogéneas de microorganismos terminan desplazando a las bacterias. (Comisión Internacional de Microbiología de Alimentos. 1980). Asimismo Frazier y Westhof (1991) indican que es aconsejable conocer el tipo de ácido responsable del pH, ya que algunos en especial, como los ácidos orgánicos tienen mayor poder de inhibición sobre algunos microorganismos en especial. Según la Comisión Internacional de Microbiología de Alimentos (1980), el pH es uno de los factores más importantes que determinan la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos. Ejemplo de ésto es que los aniones de algunos ácidos débiles (Acético o Láctico) son metabolizados dentro de células bacterianas, liberando H+ que acidifica el interior de la célula hasta alcanzar niveles inhibitorios. Sin embargo, muchos organismos pueden adaptarse a rangos bastante amplios de pH.

En general las levaduras y los hongos pueden crecer a pH mucho más bajos que las bacterias, sin embargo los valores máximos en que se puede dar el crecimiento son similares para hongos levaduras y bacterias. Los límites de crecimiento difieren mucho entre los microorganismos, dentro del rango de pH de 1 y 11. Sin embargo un buen desarrollo puede darse entre un pH de 5 a 8 (Comisión Internacional de Microbiología de Alimentos. 1980)

Cuadro 3: Análisis microbiológico para determinar problemas de inocuidad en los Biofermentos. (Análisis elaborado por el CIA, 2003)

Coliformes totales Coliformes fecales Escherichia coli

NMP/100 ml NMP/100 ml NMP/100 ml

K 9 <2 <2Mezcla 2 <2 <2

Biofermentos

NMP/100 ml. Número Más Probable en 100 ml de muestra.

Para interpretar correctamente los resultados presentados en el cuadro 3, se procedió a realizar una visita al Laboratorio de Microbiología Alimentos y Aguas de la Universidad de Costa Rica. En ese lugar se entrevistó a la Doctora Arias. Dentro de las observaciones que la Doctora dio con respecto a los resultados, se debe de destacar que éstos reflejan la inocuidad de los biofermentos y evidencian que este tipo de abono foliar no representa riesgos significativos para la salud del consumidor. Además, considerando lo expuesto anteriormente en la revisión de literatura (ver punto 2,6), en relación a las interacciones entre poblaciones de microorganismos, el principio de cooperación muy difícilmente se podría cumplir en las densidades de población tan bajas obtenidas. Por lo tanto, la fuga de metabolitos sería mayor a la síntesis y por consiguiente se impediría el crecimiento de la población de los microorganismos en cuestión. Además, Atlas y Bartha (2002) indican que: “Normalmente se necesitan miles de patógenos para causar una enfermedad, puesto que un único individuo raramente puede superar las defensas del hospedador”.

Cuadro 4. Análisis químico de la planta de biofermentos de FIO en EARTH. (Laboratorio de Suelos, Universidad EARTH)Identificación K Ca Mg Fe Cu Zn Mn

K 3530 560 185 1.5 nd 1.6 10 K 3435 433 170 4 nd 0.5 7Mg 1653 689 1405 15 nd 1.3 10 Mg 1728 775 1508 14.7 nd 1.6 11 Mn 1788 722 300 76.5 nd 3.1 331 Mn 1788 463 275 68.8 nd 2.8 350 Fe 1308 592 152.5 261 nd 0.8 15.9 Fe 1550 508 185 362 nd 1.5 14.5Zn 1518 1064 157.5 2.8 nd 110.2 8.6 Zn 1565 564 170 0.6 nd 111.3 7.7 Ca 1438 986 170 4.4 nd 2 7.7 Ca 1600 1128 190 5.8 nd 18.9 8.6

suero 1845 426 130 nd nd 3.1 ndsuero 1853 451 125 nd nd 1.6 nd

ppm

El cuadro 4, presenta un análisis químico con repetición. Se analizaron diferentes biofermentos enriquecidos con una fuente mineral del elemento indicado. El biofermento identificado como “suero” es diferente a los demás ya que en este no se usó boñiga en su mezcla y el mayor porcentaje de líquido correspondió a suero de leche de vaca.

El objetivo de los análisis presentados en el cuadro 4 fue evidenciar la solubilización de las fuentes minerales utilizadas. Por ejemplo, se puede apreciar que el biofermento enriquecido con sulfato de potasio, es el que presenta una concentración mayor del mismo elemento. Además dicho análisis permite ver el aporte nutricional de los biofermentos desde una reducida óptica química elemental, mostrando algunos de los macro y micro nutrientes más importantes.

Cuadro 5. Cantidades obtenidas de nutrientes, pH y grados Brix a través del proceso de fermentación en un biofermento.

Muestra Ca Mg K Zn Fe PO4 pH Brixppm ppm ppm ppm ppm ppm

1 365 160 1511 0.008 8.82 0.25 5.32 52 461 201 1479 0.2 4 0.75 4.5 3.33 344 160 1227 0.17 17 0.72 4.5 44 480 225 1545 0.55 53 0.42 4.46 3.15 494 190 1328 0.56 33 0.36 4.48 3.66 498 208 1508 0.9 26 ND 4.41 3.15

El cuadro 5 presenta una serie de análisis químicos y mediciones a través del proceso de fermentación. En este experimento se elaboró un biofermento enriquecido con sulfato de Fe. Se tomaron dos muestras por semana, hasta que el proceso de catálisis de glucosa se hubiera gestado casi en su totalidad y la mezcla llegara a cierta estabilidad bioquímica. El tiempo de muestreo fue de tres semanas. La primera muestra se tomó el día cero, día en que se realizó la mezcla de los componentes del biofermento. El objetivo principal fue evaluar los cambios químicos a través del proceso de fermentación. Sin embargo, se debe de resaltar que este tipo de análisis químicos no pretenden exponer en su totalidad la riqueza nutricional de los biofermentos.

Los materiales que se utilizaron para hacer el biofermento presentado en el cuadro 5 fueron los siguientes: 20 Kilos de boñiga fresca de búfalo, 10.5 kilos de melaza, 500 gramos de levadura, 25 litros de suero de leche de vaca, 6 litros de concentrado microbial “MM” activado (ver anexo 1), un kilo de sulfato de hierro, y agua hasta alcanzar un volúmenes el tanque de 180 litros.

8 CONCLUSIONES

Los biofermentos son una eficaz herramienta para independizar a los agricultores de los fertilizantes químicos y de otros insumos externos. Si bien, todavía hay mucho que investigar sobre este tipo de fertilizantes, no se puede pasar por alto que los biofermentos funcionan, permitiendo a los agricultores obtener buenas cosechas y plantas sanas. Los biofermentos son una forma de tecnologías muy sencilla, lo cual facilita la implementación de los mismos en cualquier finca, sin importar que tan difíciles sean las condiciones de campo. Los biofermentos no sólo son una forma de incentivar la autogestión en el agro, también son una forma de impulsar la creatividad y la imaginación de los productores.

9 LITERATURA CITADA

Alberl, L y Lehninger J. 1975. Bioenergética, la base molecular de las trasformaciones biológicas de energía. DF, México. Fondo Educativo Interamericano. 242 p.

Atlas, R y Bartha, R. 2002. Ecología microbiana y microbiología ambiental. Cuarta Edición. Madrid, España. Pearson Educación S.A. 677 p.

Borrad, R. 1988. Introducción a la microbiología moderna de alimentos. Zaragoza, España. ACRIBIA.271 p.

Bruchmann, E. 1980. Bioquímica Técnica, química alimentaria de las fermentaciones y agrícola. Zaragoza, España. ACRIBIA. 233 p.

Cameron, A. S.F. Manual de bioquímica. Segunda edición. DF, México. Editorial Nacional S. A. 431 p.

Comisión Internacional de Microbiología de Alimentos. 1980. Ecología Microbiana de los Alimentos 3. Zaragoza, España ACRIBIA. 332 p.

Frazier, W y Westhof, D. 1991. Microbiología de los alimentos. Zaragoza, España. ACRIBA. 522 p.

Gonzáles, P y Valiente, F. 2001. Evaluación y validación del efecto de un abono orgánico líquido fermentado sobre el crecimiento de lechuga (lactuca sativa cv. emperador) en Finca Integrada Orgánica de EARTH, Costa Rica. Trabajo de graduación para obtener grado de licenciatura en agronomía. Guácimo, CR, Universidad EARTH. 31 p.

Martín, A. 1980. Introducción a la microbiología del suelo. AGT Editor SA. DF, México. 491p.

Mazariegos, S y Colindres, C. Producción de chile picante (Capsicum frutences L,) con y sin presencia de arvenses y bajo cinco concentraciones de abono líquido orgánico fermentado, en las Mercedes de Guácimo, Costa Rica. Trabajo de graduación para obtener grado de licenciatura en agronomía. Guácimo, CR, Universidad EARTH. 44 p.

Restrepo, J. 2001. Elaboración de abonos orgánicos fermentados y biofertilizantes foliares. Experiencias con agricultores en Mesoamérica y Brasil. San José, Costa Rica. IICA. 155 p.

Restrepo, J. 2002. Biofertilizantes. Preparados y Fermentados a base de mierda de vaca. A Preguntas directas, respuestas prácticas. Santiago de Cali, Colombia. Fundación Juquira Candiru. 105 p.

Smith, C y Word, E. 1998. Energía en los sistemas biológicos. Addison – Wesley Iberoamericana. Estados Unidos. 171 p.

Ward, O. 1989. Biotecnología de la fermentación, principios procesos y productos. Traducido por Calvo, M. Editorial ACRIBIA, SA. Zaragoza, España. 274 p.

10 ANEXO

ANEXO 1. ELABORACIÓN DE INÓCULOS MICROBIOLÓGICO “MM” PARA ENRIQUECER LOS BIOFERMENTOS

Existen diversas formas en las que se pueden usar microorganismos para hacer concentrados o inóculos microbiales. En la Finca Integrada Orgánica de la Universidad EARTH, se produce un inóculo microbiológico de alta eficiencia, denominado como Microorganismos de Montaña (MM). La elaboración de este tipo de inóculo es sencilla y se divide en dos procesos que serán expuestos a continuación:

El primer paso es ir a un ecosistema natural cercano (bosques de preferencia) y recolectar un saco de mantillos de bosque (Hojas, ramas, urrú, etc). Esta materia orgánica es una fuente rica en microorganismos. Seguidamente se prepara un sustrato que tenga óptimas características físicas y nutricionales para que se desarrollen los microorganismos colectados en el mantillo de bosque. Dentro de los materiales a utilizar para crear el sustrato se encuentran: 4 L de melaza, 2 litros de leche o 4 de suero, ½ sacos de semolina de arroz, ½ saco de salvado de trigo, 1/3 saco de carbón vegetal molido, 1½ sacos de granza de arroz o aserrín blanco y agua hasta alcanzar un 60 % de humedad. Seguidamente se deben mezclar todos estos componentes dejando por último el saco de mantillos de bosque. Finalmente se coloca la mezcla en un tanque plástico sellado de 200 litros que presente una válvula de escape anaeróbica coma la presentada en el punto 3.2. Es importante que no entre oxígeno en el sistema ya que se busca estimular la fermentación anaeróbica.

La segunda etapa del proceso de producción del MM es denominada como activación o “MM líquido”. Esta inicia una vez que el MM sólido ha dejado de emitir gas, lo cual ocurre después de la tercera semana en climas tropicales. Lo anterior indica que la actividad microbiológica ha disminuido iniciando un proceso de latencia y que el sustrato está bioquímicamente estable. Se deben colectar unos 10 kilogramos del MM sólido ya estabilizado y colocarlos en otro tanque igual al primero. Este otro tanque debe de contener una solución de agua con melaza al 10 %. Seguidamente se debe agitar y dejar reposar unos tres días. Finalmente obtenemos el MM líquido que es un producto con cientos de miles de microorganismos listos para degradar de forma efectiva los desechos orgánicos y colonizar nuevos sustratos. La forma de utilizar éste producto es muy simple, basta con diluir el MM líquido en agua al 50 % y después aplicarlo sobre el sustrato de interés, por ejemplo los biofermetos. La inocular biofermentos con MM se acelera el proceso de fermentación y se asegura que el producto final presenta las características bioquímicas deseadas.

El MM activado sirve para inocular cualquier tipo de abono orgánico, además facilita la eliminación de los malos olores cuando se aplica en porquerizas o lecherías. El MM activado facilita los procesos de descomposición de la materia orgánica en cualquier tipo de sistema de manejo de desechos. Por ejemplo se pueden atomizar los desechos orgánicos caseros y de esta forma se eliminan problemas con moscas y malos olores.

ANEXO 2, ANÁLISIS DE MM.

Análisis microbiológico del MM líquido y sólido.

MM sólido 60000000 <1 3000000 100000MM Líquido 5241000 <1 21000000 86000

Bacteria Actinomicetes Lactobacillus Levaduras

Análisis químico del MM activado de FIO.

Identificación K Ca Mg Fe Cu Zn Mn

MM 0 0 0 nd nd 1.7 0.02 MM 0 0 0 nd nd 1 0.05

ppm

ANEXO 3. FOTOS

Foto 7. MM sólido Foto 8. Barriles de MM activado

Foto 9. Planta de Biofermentos Universidad EARTH Foto 10. MM activado

ANEXO 4. ESQUEMA DEL FLUJO DE FUNCIONAMIENTO DE LA PLANTA DE BIOFERMENTOS DE FIO, EARTH.

Línea de reserva

Línea en uso

Fe Fe

Suero

K

Suero

K

Mn Mn

MM

Mo Mo

MM

Ca

P

Ca

P

Zn Zn

B B

Biomezcla

MM activado

MM activado

Área de filtrado y mezclado para

llenado de bomba de aplicación

Barriles de biofermentos enriquecidos

Concentrado microbial ”MM” sólido