BIÓLOGO MICROBIÓLOGO - Universidad Nacional de Trujillo

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Aislamiento de Bacillus thuringiensis con actividad

entomopatógena a partir de suelo de cultivos de

brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO DE

BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO

AUTORA: Br. JULIO CÉSAR AGUSTIN JUNIOR PADILLA

MOZO.

ASESOR: Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

TRUJILLO-PERÚ

2015

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.

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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL

DE BIOLOGO – MICROBIOLOGO

Dr. ORLANDO GONZÁLES NIEVES

Rector de la Universidad Nacional de Trujillo

Dr. RUBÉN VERA VÉLIZ

Vicerrector Académico de la Universidad Nacional de Trujillo

Dr. STEBAN ALEJANDRO ILICH ZERPA

Secretario General de la Universidad Nacional de Trujillo

Dr. JOSE MOSTACERO LEON

Decano de la Facultad de Ciencias Biológicas

Dr. WILLIAN ZELADA ESTRAVER

Secretario de la Facultad de Ciencias Biológicas

Dra. BERTHA SORIANO BERNILLA

Director de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y

Parasitología



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DEL ASESOR

El que suscribe, Asesor de la presente Tesis titulada:

Aislamiento de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena a partir de

suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.

CERTIFICA

Que ésta Tesis ha sido ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto

y con las debidas orientaciones brindadas al tesista.

Respecto al informe, éste ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias

pertinentes, por lo que autorizo al Br. Julio César Agustin Junior Padilla Mozo

continuar con los trámites correspondientes.

____________________________________

Dr. Heber Max Robles Castillo

ASESOR



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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de

Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, ponemos a vuestra

consideración y criterio el trabajo de investigación titulado: “Aislamiento de

Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena a partir de suelo de cultivos

de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú”, con el propósito de obtener el Título

Profesional de Biólogo – Microbiólogo.

Esperando que vuestro criterio sea de comprensión por errores u omisiones

cometidos en la elaboración del presente trabajo, me someto a vuestro dictamen.

Trujillo, Diciembre 2015

____________________________________

Julio César Agustin Junior Padilla Mozo

Bachiller en Ciencias Biológicas



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MIEMBROS DEL JURADO

________________________________________

Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG

PRESIDENTE

_______________________________________

Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

SECRETARIO

____________________________________

Dra. MANUELA LUJÁN VELÁSQUEZ

VOCAL



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APROBACIÓN

Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran

que la presente tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales,

siendo aprobada por UNANIMIDAD.

________________________________________

Ms.C. JUAN HÉCTOR WILSON KRUGG

PRESIDENTE

_______________________________________

Dr. HEBER MAX ROBLES CASTILLO

SECRETARIO

____________________________________

Dra. MANUELA LUJÁN VELÁSQUEZ

VOCAL



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DEDICATORIA

A Dios, porque un día tuvo misericordia de este pecador que escribe, y me permitió conocerlo a través de Jesús, en su vida muerte y resurrección. A Él sea toda la Gloria siempre.

A mis Padres Julio y Esther, espero algún día pueda retribuirles todo aquello que han hecho por mí, gracias por todo el apoyo a lo largo de mi corta vida. Los amo.

A mis amados hermanos, Christian y Kristina, gracias por estar a mi lado todo este tiempo, el solo saber que están ahí, me ayuda a seguir adelante. A mi mami Ivonne, su ejemplo de vida me desafía siempre a mejorar en muchos ámbitos. Este trabajo es fruto de sus incontables atenciones y consejos. Gracias por todo su tiempo para mí.



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AGRADECIMIENTOS

Un gran agradecimiento al Dr. Heber Robles Castillo, por su asesoramiento, enseñanzas y consejos. Muchas gracias por abrirme las puertas del laboratorio de Biotecnología sin reservas, y poder así cumplir con el objetivo de este presente trabajo. Muchas gracias.

Gracias a los profesores Ms.C. Juan Wilson Krugg, Ms.C. Jaime Agreda Gaitán y Ms.C. Miguel Muñoz Ríos, por su asesoramiento y consejos incondicionales a lo largo del desarrollo de este trabajo.

Muchas gracias a mis amigos: Alonso Novoa, Walter Rojas, Luis Mendoza, Claudia Marcelo, Diana Periche y Meily Mezarina, muchas gracias por su amistad y caluroso apoyo en este trabajo. Su amistad es un gran regalo que recibí sin merecerlo, gracias por todo, amigos.

Un gran agradecimiento a mis hermanos de Gracia Urbana, Carlos, Bruno, Sam, Karen, Hansvan, y a Belsci y Ruth, muchas gracias por su preocupación por mi persona al realizar este trabajo.

Thanks to my friend, who is like a father, Dave Pascoe, muchas gracias por tu tiempo, consejos, regaños, aliento, ánimos,; gracias por todo amigo mío. Gracias a Dios por permitirme conocerte.

Muchas gracias a mi hermana y amiga Lizeth Lugo. No importa la distancia para ser buenos amigos, gracias Li. por los ánimos siempre en el Señor, gracias por la preocupación, tanto en mi vida académica como espiritual. Gracias a Dios por tu amistad.



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RESUMEN

La investigación se realizó con el objetivo de aislar Bacillus thuringiensis con

actividad entomopatógena a partir de suelo de cultivos de brasicáceas en

Menocucho, Laredo-Perú. Se recolectaron en total 15 muestras de suelo de 1 Kg

cada una, de 15 campos de cultivos disponibles de brasicáceas, en una superficie

de 0,1m2 y hasta 5 cm. de profundidad, en bolsas plásticas de primer uso. Las

muestras de suelo fueron diluías en 10 ml. de agua destilada estéril y luego fueron

tratadas con choque térmico (incubándose en un baño de agua a 80°C durante 12

minutos y luego a 5 minutos en baño de hielo) para la selección de bacterias

esporuladas. Después se realizaron diluciones seriadas hasta 10-5, luego se

sembraron las dos últimas diluciones por superficie en placas Petri conteniendo agar

soya tripticasa y se incubaron a 30°C durante 24 – 48 horas. Se observaron las

características macroscópicas de las colonias en medio de cultivo, para comprobar

si pertenecían al género Bacillus. Posteriormente se realizó una coloración Gram,

para observar sus características morfológicas y tintoriales. Para la identificación

de los cristales paraesporales se realizó una coloración simple con azul de

coomassie. Se logró aislar 21 colonias de Bacillus thuringiensis en tres de 15

campos de cultivo de brasicáceas, como cada una ellas presentaron las mismas

características morfológicas, culturales y forma de cristal, se seleccionó un cultivo

por cada campo, CBt-4, CBt-6 y CBt-9. Posterior a esto, se purificaron los cultivos

y se evaluó su actividad entomopatógena frente a Spodoptera frugiperda ,

obteniéndose un promedio de tasa de mortalidad de 65%, 48,5% y 71,7% para CBt-

4, CBt-6 y CBt-9 respectivamente, cada uno de ellos a 48 horas de exposición con

un fotoperiodo de 16:8.



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INDICE

Pág.

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO…….…ii

DEL ASESOR…………………………………………………………………….iii

PRESENTACION………………………………………………………………...iv

MIEMBROS DEL JURADO……………………………………………………...v

APROBACIÓN…………………………………………………………………...vi

DEDICATORIA…………………………………………………………………vii

AGRADECIMIENTO…………………………………………………………..viii

RESUMEN……………………………………………………………………….ix

INDICE……………………………………………………………………..…......x

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………... 1

MATERIAL Y MÉTODO………………………………………...……………… 9

1. MATERIAL DE ESTUDIO…………………………………………….....9

1.1.Material de estudio……………………...…………………………......9

1.2. Material Biológico…………………………………………………….9

2. MÉTODOS ………………………………………………………………..9

2.1.Toma de muestra de suelo de los cultivos de brasicáceas

………………………………………….. …………………………….9



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2.2.Aislamiento de Bacillus thuringiensis a partir de suelo

agrícola………………....…………………………………………….10

2.3. Identificación de los cultivos nativos de Bacillus thuringiensis…….10

2.3.1 Morfología de colonias sospechosas

…………………..……………………………………………10

2.3.2 Tinción Gram………………………………………………...10

2.3.3 Identificación del cristal parasporal de Bacillus thuringiensis

mediante una tinción simple con azul de

coomassie…………………………………….………………11

2.3.4 Obtención de cultivos puros de Bacillus thuringiensis……….11

2.4.Bioensayo de toxicidad en insecto susceptible……………………….11

RESULTADOS…………………………………………………………………..13

DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 19

CONCLUSIÓN…………………………………………………………………. 23

RECOMENDACIONES…………………………………………………………24

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………...25

ANEXOS………………………………………………………………………....30

ANEXO 1. Mapa de Ubicación de Menocucho, y aproximación de los campos

positivos para el aislamiento de Bacillus thuringiensis, distrito de Laredo, Perú.

ANEXO 2. Campo de cultivo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.

ANEXO 3. Ficha de muestreo.

ANEXO 4. Diagrama para el aislamiento de Bacillus thuringiensis procedentes de

muestras de suelo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.



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ANEXO 5. Diagrama de Bioensayo, de Bacillus thuringiensis frente a Spodoptera

frugiperda.

ANEXO 6. Cultivo puros de Bacillus thuringiensis aislados a partir de muestra de

suelo de cultivos de brasicáceas.

ANEXO 7. Observación microscópica a 1000 aumentos. Bacilos Gram positivos,

pertenecientes a cultivo puro de Bacillus thuringiensis.

ANEXO 8. Tabla del número de larvas muertas de Spodoptera frugiperda durante

el bioensayo frente a Bacillus thuringiensis, por grupo evaluado.

ANEXO 9. Actividad entomopatógena de Bacillus thuringiensis sobre larvas 1 y 2

de Spodoptera frugiperda.



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INTRODUCCIÓN

Actualmente sigue existiendo una gran necesidad de contar con herramientas

seguras y efectivas para el control de plagas como alternativa ante los

insecticidas químicos. Esto estimula considerablemente el interés en usar

patógenos como agentes contra estas plagas1. Es por esto que el control

biológico ha sido fuertemente apoyado, principalmente a través del uso de la

bacteria Bacillus thuringiensis (Eubacteriales, Bacillaceae), el cual, debido a

su trayectoria exitosa, es el principal ingrediente activo en biopesticidas

alrededor del mundo2, 3. El éxito de esta bacteria como control biológico se

debe a su producción de inclusiones proteínicas cristalinas en el momento de

la esporulación, las cuales son tóxicas para muchos organismos,

especialmente insectos.

Bacillus thuringiensis (Bt) es un bacilo Gram positivo, de flagelo perítrico,

que mide aproximadamente de 3 a 5 µm. de largo por 1,2 µm de ancho,

poseyendo la característica de desarrollar espora de resistencia elipsoidales

que no deforma la estructura bacteriana4. Es un microorganismo

quimiorganotrofo, anaerobio facultativo y con actividad de catalasa5. Los

diferentes aislamientos de Bt presentan en general características bioquímicas

comunes. Poseen la capacidad de fermentar glucosa, fructosa, trealosa,

maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N-

acetil-glucosamina. Sin embargo, Bt tiene como característica principal

durante el proceso de esporulación la producción de una inclusión parasporal

formada por uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza proteica, los cuales



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son tóxicos para distintos invertebrados, especialmente larvas de insectos6. A

estas proteínas se les denominaron Cry (del inglés, Crystal) y constituyen la

base del insecticida biológico más difundido a nivel mundial.

B. thuringiensis pertenece a la familia Bacillaceae y se ubica dentro del grupo

1 del género Bacillus; forma parte del grupo de Bacillus cereus, el que incluye

a B. anthracis, B. mycoides, así como también a los más recientemente

descritos B. pseudomycoides y B. weihenstephanensis. Se encuentra

estrechamente relacionado con los dos primeros, de los que no logra

distinguirse por completo debido a que no existen suficientes diferencias en

sus características morfológicas y bioquímicas.

Genéticamente, Bt continúa siendo similar a B. cereus un agente causante de

la intoxicación alimentaria y con B. anthracis, el agente causante del ántrax

en los mamíferos7. La diferencia está en los detalles: sólo Bt forma cristales

paraesporales durante la esporulación, convirtiéndolo en un patógeno

facultativo de insectos, mientras que carece de las distintivas toxinas de

mamíferos activos. Las toxinas contra los insectos son codificadas por los

genes en elementos genéticos móviles, plásmidos, por lo que las cepas de Bt

que han perdido estos plásmidos son indistinguibles de B. cereus. Aunque,

normalmente Bt está asociado con las poblaciones de insectos, tanto Bt

como B. cereus, tienen una gran cantidad de hábitats, tales como el filoplano,

suelo, agua y productos de ventas agrícolas (granos). Para muchas de las

cepas aisladas de Bt, no siempre se le ha demostrado toxicidad para ninguna

especie de insectos, esto debido a su íntimo crecimiento junto a B. cereus.



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El consenso en la actualidad es denominar a Bt, como un entomopatógeno

facultativo8.

La actividad insecticida de Bt se atribuyen mayormente a un grupo de

proteínas llamadas δ-endotoxinas o ICP’s (“insecticidal crystal proteins”)

conformado por proteínas Vip ("vegetative insecticidal protein") secretadas

durante la fase vegetativa de algunas cepas, y por proteínas Cry ("crystal") y

Cyt ("cytotoxic") presentes en las estructuras cristalinas paraesporales9.

Siendo las más estudiadas por dicha actividad insecticida, las Cry. Existen

más de 500 proteínas Cry identificadas hasta la fecha y se presentan en

diversas combinaciones en las diferentes cepas conocida10.

Como se mencionó, los genes Cry que codifican para las proteínas Cry están

contenidos en plásmidos, ADN extracromosómico circular que se replica y

transcribe independientemente del ADN cromosómico. Esto, permite una

amplia variedad de arreglos y combinaciones dando lugar a una gran

diversidad de cepas con distintos espectros de acción9. Las toxinas Cry

presentan individualmente un restringido espectro de acción, lo cual les

confiere gran especificidad de acción y seguridad para su uso11. Las toxinas

Cry se diferencian entre sí en su secuencia aminoacídica; existen alrededor de

72 tipos de ellas descritas actualmente, y se dividen en subtipos, siendo las

más diversas Cry 1 con 256 subtipos, Cry 2 con 72, Cry 8 con 49 y Cry 7 con

3110,12 .



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Al momento de formación de la espora bajo condiciones de stress, Bt inicia

la síntesis de uno o más cristales protéicos13. Estas inclusiones cristalinas se

generan por fuera de la espora (paraesporales) y pueden presentar distintas

morfologías, permitiendo su clasificación en bipiramidales, cúbicos,

aplanados, esféricos, rectangulares y romboidales14.

Una vez que el insecto ingiere los cristales producidos por Bt, la toxicidad

característica de estas estructuras depende de un proceso complejo que

requiere tres etapas que son: solubilización de proteínas Cry, procesamiento

proteolítico de la pro-toxina a la forma activa y la inserción irreversible de la

toxina a la membrana intestinal15.

En el intestino medio del insecto, las proteínas Cry se encuentran inactivas

en forma de pro-toxina. El pH altamente alcalino junto con enzimas digestivas

produce la proteólisis de la pro-toxina10. Bajo su forma activa, las toxinas Cry

pueden acceder a las células epiteliales, insertándose a través de interacciones

univalentes con la caderina16. Luego, una cascada de señalización

dependiente de magnesio es responsable de la formación de poros en la

membrana celular de las células epiteliales, como resultado de la agregación

de proteínas Cry17. La formación de poros líticos en la membrana

inmediatamente produce cambios fisiológicos importantes y perniciosos a

nivel del intestino del insecto, hecho éste que provoca su muerte18. Estos

acontecimientos descritos concluyen en una parálisis intestinal y posterior

inhibición de la absorción de nutrientes produciendo muerte por inanición o

septicemia. Además del efecto directo e indirecto de la toxina, la muerte



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también puede darse por parte de las esporas una vez que comienzan a

germinar dentro del insecto19, 20.

El aislamiento de Bt puede proceder de una gran variedad de hábitats, siendo

el más común el suelo agrícola, sin embargo también se reportan aislamientos

de muestras de pastos, barredura de silos, insectos muertos y ambientes

acuáticos21, 22. En ambientes naturales, Bt se encuentra frecuentemente

enmascarado por la presencia de otras especies relacionadas que muestran

mayor capacidad para competir por los nutrientes del suelo23. Para lograr

mayor eficiencia en el aislamiento es necesario recurrir a estrategias

selectivas que permitan reducir en número aquellas especies no deseadas que

comparten un hábitat común.

La identificación, basada únicamente en pruebas bioquímicas

convencionales, no permite diferenciar entre B. thuringiensis, y otras

especies del grupo de B. cereus. La demostración de la presencia de

inclusiones cristalinas parasporales es una prueba fundamental en la

identificación de B. thuringiensis24. Existen varios métodos para el

aislamiento de Bt. Uno de ellos, y el más utilizado, es el método de selección

con acetato de sodio, basado en la inhibición de la germinación de esporas de

Bt en presencia de acetato, pre-tratamiento con calor en seco para eliminar de

forma eficaz las esporas de otros microorganismos distintos de Bt24, 25, a partir

de larvas o insectos, entre otros26.



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El método de identificación más utilizado es la visualización de los cristales

de proteínas Cry al microscopio27. Debido a que los métodos mencionados

resultan poco prácticos a la hora de identificar a Bt, se están intentando

desarrollar nuevas herramientas de identificación y caracterización a nivel

molecular basadas en genes distintos al gen de ARNr 16S. Algunos autores

han logrado caracterizar distintas cepas de Bt a partir de la identificación de

genes específicos (genes cry) por la técnica de PCR (“Polymerase Chain

Reaction”) 28.

Se ha logrado también diferenciar al grupo Bacillus cereus sensu lato, al que

pertenece Bt, con el método de Multiplex PCR29. Existen trabajos que

permitieron la tipificación de distintos aislados de Bt basados en técnicas

derivadas de PCR como ERIC–PCR ("Enterobacterial Repetitive Intergenic

Consensus") y de fingerprinting como REP–PCR ("Repetitive Element

Palindromic") 30.

Cuando nos preguntamos acerca de la producción de un biopesticida en base

a Bt resulta muy importante que las cepas utilizadas para producirlo sean

autóctonas, ya que un Bt de origen nativo incide positivamente en su

efectividad como biopesticida, y esto debido a que una cepa nativa estará

adaptada a las condiciones ambientales donde será utilizada como agente de

control biológico. Es de mencionar que lo anterior no es el pináculo del

propósito, porque sumado a ello, durante la búsqueda de cepas autóctonas

también pueden encontrarse nuevas proteínas Cry que tengan un a diferente

actividad insecticida y así generar un banco de cepas con el fin de disponer



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de un potencial genético necesario para permitir un manejo apropiado de la

generación de resistencia hacia Bt31,32.Actualmente varios grupos de trabajo

se encuentran enfocados en la búsqueda de nuevas cepas de Bt con nuevas

proteínas o actividad insecticida. Por ejemplo, se han reportado varios

trabajos en países como México33 Irán, Turquía, Siria34 entre otros, donde ya

se han caracterizado nuevas cepas de Bt.

En Perú existen plagas agrícolas de importancia económica como las plagas

de la papa (“polilla de la papa” Phtorimaea aperculella), caña de azúcar,

algodón, maíz (“gusano mazorquero” Heliotis zea), brasicáceas, camote,

hortalizas, cítricos y frutales. Existen también enfermedades por insectos

vectores de los géneros Anopheles, Culex, y la mosca negra del género

Simulium, responsables de enfermedades endémicas en Perú35, plagas que

normalmente son tratadas sólo con controladores químicos.

En nuestro país, las grandes agroindustriales están apostando por Bt, no sólo

en el uso de productos comerciales a base de este microorganismo, sino

también en su aislamiento y caracterización mediante biología molecular.

Esta situación promueve constantemente a la realización de estudios que

permitan establecer la búsqueda de Bt nativos, desde su aislamiento,

caracterización, producción y utilización como controlador de plagas

agrícolas y vectores de enfermedades endémicas, como una alternativa eficaz

a los controladores químicos.



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Es de esta manera que, el presente trabajo tiene como objetivo, el aislamiento

de cultivos de Bacillus thuringiensis con actividad entomopatógena, a partir

de muestras de suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.



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MATERIAL Y MÉTODO

1. MATERIAL DE ESTUDIO.

1.1. Material de estudio

Muestras de suelo de cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-

Perú.

1.2. Material biológico

Larvas del estadio 1 y 2 de Spodoptera frugiperda proporcionado por el

área de control Biológico de SENASA (SERVICIO NACIONAL DE

SANIDAD AGRARIA)

2. MÉTODO. (ANEXO 3)

2.1. Toma de muestra de suelo de los cultivos de brasicáceas (ANEXO 1)

Las muestras de suelo se recolectaron de los campos de

cultivos en dónde no se habían realizado aplicaciones previas de

bioinsecticidas a base de B. thuringiensis para el control de las plagas

agrícolas, esto se verificó mediante una encuesta hacia los agricultores de la

zona muestreada. (Anexo 3)

Se muestreó 15 campos de cultivos de brasicáceas (10 de

Brassica oleracea var. capitata L. y 5 de Brassica oleracea var. botrytis L.),

aproximadamente 1 kilogramo por campo (10 submuestras de 100 gramos

por cada campo) en bolsas de primer uso, en una superficie de 0,10 m2 y

hasta 5 cm. de profundidad. Se clasificó con una etiqueta y una ficha de

muestreo del campo de procedencia. Posteriormente se transportó al

laboratorio de Biotecnología de la Universidad Nacional de Trujillo para su

procesamiento.



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2.2. Aislamiento de Bacillus thuringiensis a partir de suelo agrícola

(ANEXO 4)

Previamente cada muestra de suelo de los cultivos se

homogenizó, para luego pesar 1 g. y ser disuelto en 10 ml. de Agua destilada

estéril (método descrito por la OMS). Posteriormente se llevó el resultante

a shock térmico (12 minutos a 80 °C seguido de 5 minutos a baño de hielo)

con el fin de seleccionar microorganismos formadores de esporas.

Se procedió a realizar diluciones seriadas con agua destilada

estéril, hasta una dilución de 10-5. Seguidamente se sembró por superficie

las dos últimas diluciones obtenidas en placas Petri conteniendo agar soya

tripticasa y se incubaron a 30°C durante 48 a 72 horas.

2.3. Identificación de los cultivos nativos de Bacillus thuringiensis

2.3.1. Morfología de colonias sospechosas

Tras la incubación se examinaron las colonias,

seleccionando mediante observación a simple a aquellas colonias típicas del

género Bacillus: grandes, blanquecinas, opacas, aplanadas, de bordes

irregulares.

2.3.2. Tinción Gram (ANEXO 7)

Una vez seleccionadas las colonias aisladas de la

placa Petri con agar soya tripticasa, se realizó una tinción Gram y se observó

a 1000 aumentos en microscopio óptico simple. Se observaron bacilos Gram

positivos, grupo al cual pertenece B. thuringiensis.

2.3.3. Identificación del cristal parasporal de Bacillus

thuringiensis mediante una tinción simple con azul de coomassie

De las colonias de bacilos Gram positivos, se preparó un

frotis sobre una lámina portaobjeto, secándose a temperatura ambiente.

Luego la muestra fijada se cubrió con la solución de azul de coomassie



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(0.25% azul brillante, en 50% de etanol y 7% de ácido acético) durante 3

min. Se retiró el exceso de colorante con pequeños chorros de agua destilada

y se dejó secar el frotis a temperatura ambiente. Se observó a 1000 aumentos

en microscopio óptico simple, describiéndose cristales parasporales y

determinando la positividad de la muestra. Así se confirmó que se trataba

de B. thuringiensis.

2.4. Obtención de cultivos puros de Bacillus thuringiensis (ANEXO 6)

Una vez que se identificó los cristales paraesporales

de Bacillus thuringiensis mediante la observación por microscopio, se

procedió a sembrar por estría las colonias seleccionadas, en frascos de vidrio

de 10 ml. de capacidad con agar soya tripticasa inclinado y se incubó a 30°C

durante 48 horas. Posteriormente se conservó a 4°C, hasta su posterior uso.

2.5. Bioensayo de toxicidad en insecto susceptible (ANEXO 5)

Para la determinación de su actividad

entomopatógena, se trabajó con larvas del estadio 1 y 2 de Spodoptera

frugiperda procedentes del criadero de insectos del Servicio Nacional de

Sanidad Agraria del Perú (SENASA) las cuales fueron alimentadas con

hojas de Lactuca sativa, en un ambiente con 25-27ºC y un ciclo de luz:

oscuridad de 16:8 horas. (ANEXO 9)

Se propagaron los cultivos puros obtenidos, en

frascos de vidrio de mayor capacidad (120 ml.) con agar soya tripticasa

inclinado y se incubó a 30°C durante 24-72 horas Se reactivó con agua

destilada y la solución se sometió a choque término, método descrito en el

punto 2.2 para la obtención de esporas y la eliminación de células

vegetativas. Se realizó un conteo de esporas utilizando cámara de Neubauer,

para así conocer la concentración de su aplicación.



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http://www.peru.gob.pe/directorio/pep_directorio_detalle_institucion.asp?cod_institucion=91

http://www.peru.gob.pe/directorio/pep_directorio_detalle_institucion.asp?cod_institucion=91

12

Se evaluó 3 grupos en este bioensayo (uno por cada

cultivo de Bt seleccionado); cada grupo estaba conformado por 60 larvas del

estadio 1 y 2 divididas en 3 pocillos de 20 larvas cada uno y un grupo control

para cada grupo evaluado. Una vez conocida la concentración, se aplicó la

suspensión de esporas en el alimento de las larvas mediante la técnica de

aspersión, dejando un tiempo de exposición de 2 a 3 días; al grupo control

por cada cultivo evaluado, se le asperjó agua destilada estéril en el alimento

de las larvas.

Luego del tiempo de exposición, se registró el número

de larvas vivas y muertas, y se obtuvo el porcentaje de mortalidad con la

siguiente fórmula:



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RESULTADOS

De 15 muestras de suelo procesada, fueron obtenidas 21 colonias de Bacillus

thuringiensis, en 3 campos de cultivo, de un total de 258 colonias del Bacillus sp.

(Tabla 1).

Las colonias aisladas se obtuvieron del campo N° 4, 6 y 9, todas ellas

procedentes del suelo de cultivos de Brassica oleracea var. capitata L (“repollo”).

Siendo el campo N° 9 el de mayor porcentaje de aislamiento (47,6%) seguido del

campo N° 6 (38,1%) y finalmente el N°4 (14,3%). Los tres campos descritos se

encontraban próximos a cultivos de Fragaria sp. (“fresa”), no presentaron similares

condiciones de humedad de suelo al tacto, siendo el campo N° 4 el de mayor

humedad, y el N° 9 el de menor.

En la Figura 1 se observa las características macroscópicas del Género

Bacillus a simple vista, colonias grandes, blanquecinas, opacas, aplanadas y con

bordes irregulares, y en la Figura 2 se observa las características macroscópicas a

100 aumentos de Bacillus thuringiensis, ambas sembradas en agar soya tripticasa e

identificadas posteriormente con una coloración Gram, como bacilos Gram

positivos. (ANEXO 4)

La observación de una coloración con azul de Coomassie, a través del

microscopio de óptico simple a 1000 aumentos, demostraron la presencia de células

vegetativas de forma bacilar, formación de esporas y cuerpos de inclusión

parasporal, a las 48 horas de incubación (Figura 3), mostrando predominantemente

una morfología bipiramidal.



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Las 21 colonias de Bacillus thuringiensis obtenidas, presentaron las mismas

características morfológicas, culturales, tintoriales y forma de cristal, por lo cual,

para la evaluación de su actividad entomopatógena, se seleccionó un cultivo

representativo por cada campo positivo a Bacillus thuringiensis, los cuales se

denominaron CBt-4, CBt-6 y CBt-9.

Los 3 cultivos seleccionados presentaron actividad entomopatógena: Campo

N°4, 6 y 9 (CBt-4, CBt-6 y CBt-9 respectivamente). Durante el bioensayo frente a

Spodoptera frugiperda, en promedio de 3 grupos evaluados CBt-4, presentó un 60%

de mortalidad a las 24 horas y un 65 % a las 48 h.; CBt-6, un porcentaje de 43,5%

a las 24h. y 48,5% a las 48h.; finalmente CBt-9 presentó un 71,7% de mortalidad

a las 24 y 48 horas, siendo éste último el de una rápida respuesta entomopatógena

(Tabla 2). No se registró ninguna muerte de larvas en el grupo control.



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Tabla 1. Aislados de Bacillus thuringiensis provenientes de muestras de

suelo de los cultivos de brasicáceas en Menocucho, Laredo – Perú.

Campo (N°) de

cultivo

Brasicácea NC(Bt) Código

1 R 12(0) ---------------

2 R 17(0) ---------------

3 R 25(0) ---------------

4 R 31(3) CBt-4

5 B 22(0) ---------------

6 R 13(8) CBt-6

7 B 10(0) ---------------

8 R 8(0) ---------------

9 R 29(10) CBt-9

10 R 9(0) ---------------

11 B 18(0) ---------------

12 B 21(0) ---------------

13 B 18(0) ---------------

14 R 15(0) ---------------

15 R 8(0) ---------------

*R, repollo; B, brócoli.

**NC, número de colonias de Bacillus sp; Bt, Número de colonias de Bacillus thuringiensis



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Figura 1. Observación de las características macroscópicas de colonias del

Bacillus sp. a simple vista.

Figura 2. Observación microscópica de las características de la colonia de

Bacillus thuringiensis, a 400 aumentos. Se observa la característica particular

de bordes irregulares de Bacillus thuringiensis a las 18 horas de incubación.



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Figura 3. Observación microscópica a 1000 aumentos, coloración azul de

coomassie a un cultivo de Bacillus thuringiensis (CBt-9) de 48 horas de incubación.

Se observa morfología bipiramidal de los cuerpos parasporales (Cp), de las esporas

(E) y de células vegetativas (Cv).

Cv

Cp

E



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Tabla 2. Promedio del porcentaje de mortalidad de Spodoptera frugiperda

frente a las 3 colonias por campo seleccionadas de Bacillus thuringiensis en un

periodo de 24-48 horas de exposición y un fotoperiodo de 16:8.

Cultivo de

Bacillus

thuringiensis

Concentración

(Esporas/ml)

(x)

Porcentaje de mortalidad

(%)

(x)

24 h 48h

CBt-4 7,61 x 106 60 65

CBt-6 7,12 x 106 43,5 48,5

CBt-9 6,84 x 106 71,7 71,7

*24 y 48h, tiempo de exposición.



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DISCUSIÓN

Desde que se descubrió el potencial y efectividad como controlador

biológico de B. thuringiensis, éste ha sido aislado de diferentes partes del mundo,

(razón por la cual se le considera ubicuo). El aislamiento de B. thuringiernsis a

partir de muestras ambientales es una tarea dificultosa debido, fundamentalmente,

a la baja proporción en que se encuentra ésta especie en relación a otras especies

del grupo B. cereus que comparten el mismo hábitat7, 8.

La aplicación de tratamiento térmico controlado aplicado en la primera fase

del procesamiento de las muestras favoreció el enriquecimiento selectivo de bacilos

esporulados. Este tratamiento contribuyó a la eliminación de los microorganismos

en la fase de crecimiento vegetativo, favoreciendo la selección de dichos bacilos.

La siembra por diluciones seriadas en agar soya tripticasa, permitió el aislamiento

de colonias bien diferenciadas y la selección de aquellas que mostraban morfología

circular, irregular de color crema y textura parecida a la cera, para posteriormente

colorear con azul de coomassie, y así confirmar la presencia de cristales

parasporales e identificarlos como Bacillus thuringiensis.

En este estudio, B. thuringiensis fue aislado de muestras de suelo y sólo se

obtuvo presencia en 3 de 15 campos de cultivos de brasicáceas. Para Bullé (2003)

la presencia de B. thuringiensis en suelo agrícola, para una buena fuente de

aislamiento, oscila entre un 25-60% de las muestras procesadas, por lo cual, el 8,1%

obtenido en los campos de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú nos permite



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describir, a estos campos de cultivo, como una fuente baja para el aislamiento de

esta bacteria. Pero, de acuerdo al trabajo de Ammouneh (2007)34, sobre el

aislamiento a partir de suelo agrícola (cultivos de vegetales) en Siria, con un

porcentaje de 13,2% en la presencia de Bt nativos, describe que las condiciones

para el crecimiento de Bt en suelo agrícola, depende de su interacción con las otros

bacilos del mismo Grupo, ya que es muy frecuente aislar un mayor porcentaje de

Bacillus cereus que de Bt, sin saber a ciencia a cierta, si Bt (al ser un

entomopatógeno facultativo) ha perdido la capacidad de producir cristales

parasporales y así terminar siendo descrito como B. cereus.

El éxito de aislamiento de Bt es variante en diferentes partes del mundo, hay

muchos factores asociados a ello, entre los cuales se puede mencionar a las

condiciones ambientales y las propiedades del suelo, el cual crea un ambiente

complejo que puede afectar la diversidad y densidad de la población microbiana.

Pocos estudios sobre el aislamiento de Bt han caracterizado las propiedades del

suelo, lo cual hace mucho más dificultoso que se pueda asociar directamente este

factor a la presencia de esta bacteria31.

Del 8,1% de Bt obtenidos (3 cultivos puros) en este estudio, cada uno de

ellos demostró con éxito su actividad entomopatógena frente a un huésped

susceptible como lo es Spodoptera frugiperda, siendo los porcentajes de mortalidad

relativamente altos comparados con otros estudios. Según Ibarra (2003), de 300

colonias de Bt obtenidas, menos del 1% presentaron actividad insecticida frente a

larvas Lepidópteros29. Los 3 cultivos puros de Bt obtenidos presentaron un

porcentaje de mortalidad mayor al 45%, lo cual, según Jouzani (2008) son cultivos



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potenciales para su caracterización molecular, y así identificar, si el porcentaje de

mortalidad de estos Bt se debe a la interacción de nuevos genes y toxinas aún no

descritas. Se requiere mencionar que Bt también posee otros factores de virulencia,

tales como β-endotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, enterotoxinas, quitinasas y

fosfolipasas; y puede ser que algunas de ellas, trabajen en conjunto con las delta

endotoxinas (Cry) y así presentar el porcentaje de mortalidad obtenido en el

bioensayo que se realizó frente a Spodoptera frugiperda31.

Los últimos proyectos para el aislamiento de cultivos de Bt nativos con un alto

potencial de actividad entomopatógena, incluyen dentro de las muestras procesadas

(suelo y hojas), a las larvas o insectos adultos con características típicas de infección

por Bt (cese de la ingesta de alimento, poca movilidad, diarrea, oscurecimiento de

tejido y muerte); esto, según los últimos estudios es recomendable para el éxito del

aislamiento de Bt con dicha actividad, sin embargo, la desventaja de esta inclusión

(y a su vez limitación de Bt en general), es la corta permanencia de las proteínas

Cry en el ambiente34.

El 100% de cultivos muestreados presentaron como plaga a Plutella xylostella

(Orden: Lepidóptera), pero no se observó en ninguno de los campos individuos con

sintomatología de infección por este microorganismo, esto se relaciona con el bajo

porcentaje de presencia de Bt en Menocucho, Laredo-Perú (sólo un 8,1%) 33.

En conjunto, los resultados presentados nos permiten afirmar, que a partir de las

muestras de suelo de campos de cultivos de Brassica oleracea var. capitata L. se

puede aislar Bt con actividad entomopatógena, sin embargo la proporción es baja



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comparada con el aislamiento a partir de las mismas muestras en otros campos, tales

como: suelo de maíz, caña de azúcar y frutales32.



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ENUNCIADO RESUMEN

Se aisló 21 colonias de Bacillus thuringiensis a partir de suelo de cultivos

de Brassica oleracea var. capitata L en Menocucho, Laredo – Perú, de las

cuales 3 de ellas (CBt-4, CBt-6 y CBt-9) fueron evaluadas su capacidad

entomopatógena, mostrando un promedio de porcentaje de mortalidad a

Spodoptera frugiperda mayor al 45% a las 48 horas de exposición.



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RECOMENDACIONES

Se deben realizar estudios posteriores (caracterización molecular) a los

cultivos obtenidos, para identificar aquellos genes y toxinas en la actividad

entomopatógena que presentaron estos 3 cultivos identificados, cultivos que

causaron un promedio en la tasa de mortalidad mayor al 45% frente a

Spodoptera frugiperda.

Se debe realizar un estudio de campo, donde se evalué la actividad

entomopatógena de estos tres cultivos puros de Bacillus thuringiensis frente

a otras larvas de Lepidópteros plagas, en condiciones no controladas.



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REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

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ANEXOS

ANEXO 1. Mapa de Ubicación de Menocucho, y aproximación de los

campos positivos para el aislamiento de Bacillus thuringiensis, distrito de

Laredo, Perú

6

9

4



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Anexo 2. Campo de cultivo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.



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Anexo 3. Ficha de muestreo.

Universidad Nacional de Trujillo

Facultad de Ciencias Biológicas

Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

Laboratorio de Biotecnología

N° de la Muestra:________

Código:________

Cultivo:

Uso de insecticida:

Punto de muestreo:

Fecha y hora de muestreo:

Cantidad de muestra

Número de submuestras:

Profundidad del muestreo:



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Anexo 4 . Diagrama para el aislamiento de Bacillus thuringiensis procedentes

de muestras de suelo de brasicáceas en Menocucho, Laredo-Perú.

Toma de muestra

Pesado de la

muestra (1 gramo) Dilución (10 ml. De

Agua destilada

estéril)

Homogenización y choque

térmico (80°C por 12 minutos)

Baño de hielo

Realización de

diluciones seriadas

Siembra por superficie en

medio agar soya tripticasa

Incubación a 30 °C

por 24-48 horas.

Lectura

Coloración Gram

Coloración Azul de

Coomassie

Obtención de Cultivo Puro



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Anexo 5. Diagrama de Bioensayo, de Bacillus thuringiensis frente a

Spodoptera frugiperda

Propagación de cultivos

puros, en frascos de vidrio de

mayor capacidad (120ml) con

agar soya tripticasa

Reactivación con 10 ml.

Agua destilada estéril

Obtención de la

suspensión de Bt

Homogenización y choque

térmico (80 por 12 minutos)

Baño de hielo

Recuento de esporas en

Cámara de Neubauer a 400

aumentos en microscopio

simple.

Aplicación por aspersión

de concentración de Bt

conocida

Exposición 24 a 48 horas.

Fotoperiodo 16:8 a

Temperatura ambiental

Lectura Tasa de

Mortalidad



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Anexo 6. Cultivo puros de Bacillus thuringiensis aislado a partir de muestra

de suelo de cultivos de brasicáceas.



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Anexo 7. Observación microscópica a 1000 aumentos. Bacilos Gram

positivos, pertenecientes a cultivo puro de Bacillus thuringiensis.



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Anexo 8. Tabla del número de larvas muertas de Spodoptera frugiperda

durante el bioensayo frente a Bacillus thuringiensis, por grupo evaluado.

*G1, G2, G3. Grupo de evaluación de bioensayo 1, 2,3 respectivamente.

Cultivo representativo

de Bt

Larvas muertas (N°)

CBt-4 11 11 14 13 12 14

CBt-6 10 7 9 10 9 9

CBt-9 15 13 15 15 13 15

24 H 48 H

G1

H

G2

H

G3

H

G1

H

G2

H

G3

H



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Anexo 9. Actividad entomopatógena de Bacillus thuringiensis sobre larvas

1 y 2 de Spodoptera frugiperda.

Larva viva

Larva muerta



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