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MAYO 2007

BÁSICO

DISCIPLINA

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7

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N:

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RMACÉUTICCA

2

ÍNDICE

NÚMERO DE LA PRÁCTICA

TITULO DE LA PRÁCTICA PÁGINA

PRÁCTICA No. 1

INTRODUCCIÓN AL TRABAJO DE LABORATORIO

4

PRÁCTICA No. 2

OBSERVACIÓN DE GRUPOS MICROBIANOS 6

PRÁCTICA No. 3

PREPARACIÓN DE MATERIAL 9

PRACTICA NO 4

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 10

PRÁCTICA No. 5 TÉCNICAS ASÉPTICAS PARA TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS

12

PRÁCTICA No. 6 TÉCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

14

PRÁCTICA No. 7

MEDIOS DE CULTIVO Y MORFOLOGÍA COLONIAL

17

PRÁCTICA No. 8 EFECTO DE AGENTES FÍSICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

20

PRÁCTICA No. 9 EFECTO DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO

24

PRACTICA No 10

CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO 27

PRÁCTICA No. 11

TÉCNICAS PARA RECUENTO DE BACTERIAS 28

PRÁCTICA No. 12

TÉCNICAS DE TINCIÓN DIFERENCIALES 31

PRÁCTICA No. 13 TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA ESTRUCTURAS BACTERIANAS

33

PRÁCTICA No. 14

PRUEBAS BIOQUÍMICAS 36

PRACTICA No 15

MORFOLOGÍA DE HONGOS 41

PRACTICA No 16

EVALUACIÓN DEL LABORATORIO

3

El presente manual ha sido elaborado con el fin de proporcionar a los estudiantes el

conocimiento sobre el manejo y condiciones adecuadas en las que se debe trabajar a

los microorganismos. El laboratorio de microbiología general representa los cimientos

que apoyan la formación del profesional que de desarrollará en las diferentes disciplinas

de esta materia, así que desde este momento el alumno debe adquirir la mentalidad de

que su desempeño debe ajustarse correctamente a la ejecución de buenas prácticas de

laboratorio.

El orden de este manual va de lo general a lo particular iniciando con el

conocimiento microscópico hasta la revisión de las características bioquímicas que

identifican a un organismo en particular. Para su realización se ha contado con el apoyo

de los diferentes profesores del Departamento de Microbiología encargados de impartir

la materia, quienes con su experiencia han hecho las aportaciones necesarias para que

este manual represente un verdadero apoyo académico para el alumno de licenciatura.

4

PRACTICA No.1 (SEMINARIO)

INTRODUCCION AL TRABAJO DE LABORATORIO

Para cumplir con un buen desempeño en este laboratorio presentamos la

siguiente:

Guía para el desarrollo del Trabajo en el Laboratorio de Microbiología 1. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, después de ese tiempo, se

tomará como retardo, cada retardo equivale a medio punto menos en la calificación

final del laboratorio.

2. La asistencia deberá ser del 100 %

3. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada.

4. Colocar todo su material y ropas en los cajones de las mesas de trabajo o en las

mesas laterales del laboratorio.

5. Lavarse las manos antes y después de iniciar la sesión práctica.

6. No comer ni fumar en el laboratorio, ni introducir ningún objeto en la boca.

7. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de usar.

8. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo debe realizarse sentado.

9. Hablar solo lo necesario con los compañeros.

10. Antes de iniciar la práctica lea cuidadosamente las instrucciones, siga instrucciones

del profesor, si no entiende pregunte. 11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos, debe de esterilizarse en la flama

del mechero antes y después de su uso.

12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.

13. Todo el material que va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por

el profesor.

14. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporcione, el material de

desecho no contaminado deposítelo en los botes de basura, el material contaminado

no lo lave y deposítelo donde le indique el profesor.

15. Etiquete todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos:

• Grupo.

5

• Sección.

• Equipo.

• Nombre del alumno.

• Fecha

MANEJO DE MATERIAL INFECTO-CONTAGIOSO

NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.

Referencias

Para la correcta aplicación de esta Norma es necesario consultar las siguientes:

1 NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separación, envasado,

almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los residuos

peligrosos biológico-infecciosos.

2 NOM-009-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el

almacenamiento, transporte y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y tóxicas en

los centros de trabajo.

3 NOM-012-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los

centros de trabajo donde se produzcan, usen, manejen, almacenen o transporten

fuentes generadoras o emisoras de radiaciones ionizantes.

4 NOM-114-STPS-1994, Sistema para la identificación y comunicación de riesgos por

sustancias químicas en los centros de trabajo.

6

PRACTICA No.2 OBSERVACIÓN DE GRUPOS MICROBIANOS

Introducción.

La Microbiología estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su

morfología, función, relación con el ambiente y los métodos que nos llevan a su

identificación. Los estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas

específicas de la microbiología, como son:

Bacteriología (bacterias).

Micología (hongos)

Ficología (algas).

Protozoología (protozoarios).

Virología (virus.

En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basándose en tres puntos

principales: complejidad celular (procariontes y eucariontes), complejidad tisular(unicelular, multicelular-multinucleados) y nutrición (absorción, fotosíntesis,

ingestión) los cuales son: Monera, Protista, Fungí, Vegetal y Animal.

Protozoarios: Son clasificados dentro del reino Protista, siendo microorganismos

unicelulares y eucariotes. Son en tamaño mayores a las bacterias y sus estructuras

internas muchas veces fácilmente observables. Por su morfología se puede

diagnosticar la especie.

Hongos: Son clasificados dentro del reino Fungí, siendo organismos multinucleados y

eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorción. En cuanto a su tamaño es

variable, presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme.

Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de

hifas es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se le

denomina VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominándose micelio

7

AEREO. Estos hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento

radial.

El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme, el cual se caracteriza por su tipo

de multiplicación o división llamado GEMACIÓN. En tamaño son mayores a las

bacterias, son unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos géneros

forman el llamado pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el

núcleo, otros organelos como mitocondrias o inclusiones como gránulos de volutina,

están presentes en el citoplasma, las colonias de levaduras son de aspecto cremoso.

Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera, son células procariotas y

unicelulares, se reproducen por fisión binaria, pueden ser móviles por la presencia de

flagelos simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esféricas (cocos),

alargadas (bacilos), helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse en pares,

cadenas, racimos o tetradas, dependiendo del género.

Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma

fundamental es diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o

en forma cuadrangular, la característica principal de este grupo microbiano es su

crecimiento, requieren condiciones especiales extremas, como altas temperaturas o

altas concentraciones de sal.

Objetivo 1. Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupación, usando

microscopía óptica

Material

• Preparaciones fijas de Bacterias, Hongos y Protozoarios.

• Microscopio óptico.

Desarrollo

Hacer la observación microscópica de cada preparación proporcionada, anotando el

aumento al que se observo.

8

Cuestionario 1. ¿Quién apoyó la clasificación de Whittaker en 5 reinos y bajo que fundamento?

2. ¿Qué características microscópicas diferencian a los hongos de las bacterias?

3. ¿Cuál es el tamaño promedio de cocos, bacilos, levaduras y virus?

4. Menciona 5 beneficios de los microorganismos para la humanidad

5. Menciona 5 consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la humanidad

6. Menciona en forma ascendente en tamaño, los organismos observados.

7. Dibuja tus observaciones

9

PRACTICA No.3 (SEMINARIO)

PREPARACION DE MATERIAL

El material del laboratorio de Microbiología requiere de una preparación especial,

deberá ser estéril, para que no ofrezca un riesgo de contaminación de la(s) muestra(s).

ya que de ellos dependerá el éxito o fracaso del estudio microbiológico a realizar.

La esterilización se mide en grado absoluto, es decir, se encuentra o no estéril,

y se define como el proceso (ya sea físico o químico) por el cual se elimina toda forma

de vida microbiana, incluyendo formas bacterianas esporuladas y vegetativas, virus,

hongos y parásitos.

La desinfección no es sinónimo de esterilización, es un proceso químico o físico,

por el cual son eliminadas solo formas bacterianas vegetativas y no formas

esporuladas.

Dentro de los procesos físicos para la esterilización se encuentra el calor

(húmedo y seco), la filtración, las radiaciones, ultracentrifugación y ultrasonido.

Dependiendo de la naturaleza del material (ya sea termo resistente o termolábil)

se deberá elegir el método de esterilización.

Los métodos de esterilización pueden ser evaluados a través de agentes físicos

(termopares y termómetros), químicos( cinta testigo) y biológicos (ampolletas Sterikon)

10

PRACTICA No.4 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Introducción Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios

para el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan

diferencias en sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad

bioquímica y fisiológica. El agua, sales inorgánicas, fuentes de carbono, fuentes de

nitrógeno y metales son necesarios a todos microorganismos. Existen bacterias que

necesitan la presencia de determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse,

este nutriente se denomina: factor de crecimiento y las bacterias que necesitan de

ellos se llaman auxótrofos.

Los medios de cultivo con base en su contenido de material gelificante pueden

ser: líquidos, semisólidos y sólidos (los líquidos carecen de material gelificante). En

Microbiología el material gelificante más utilizado es el agar, químicamente es un

polisacarido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas que la

mayoría de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia y cantidad

de éste permite diferenciar los medios semisólidos y sólidos, de 0.5-1.5% y una

concentración mayor o igual al 2% respectivamente.

Los medios de cultivo para Microbiología se fabrican o bien de forma granulada o

de polvo, ambas presentaciones son higroscópicas por lo que deben mantenerse

perfectamente cerradas y en ambientes secos.

Objetivo 1. Preparar diferentes medios de cultivo sólidos y aplicar la esterilización por calor

húmedo.

Material

• Cajas Petri estériles.

• Matraz Erlenmeyer.

• Pipetas.

• Mechero.

• Autoclave.

11

• Medios de Cultivo en polvo

• Probeta.

• Balanza.

• Espátula o cuchara.

• Parrilla de calentamiento

• Guantes para calor.

Desarrollo

La forma en al cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada

etiqueta y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente:

a) Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar.

b) Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejándolo

reposar unos 15 minutos.

c) Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando

continuamente, evitar el calentamiento prolongado.

Proceso de Esterilización 1) Verificar el nivel de agua de la autoclave.

2) Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de

esterilizar medios de cultivo en tubos con tapón de rosca, estos deben estar

tapados flojamente y cerrados perfectamente después de esterilizar).

3) Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de

poner válvula de presión.

4) Esterilizar a 121°C (15 lbs. de presión) por 15 minutos.

5) Deben incluirse controles de esterilización para autoclave.

6) Compuestos termolábiles no deben ser autoclaveados.

Cuestionario 1. Define los términos: esterilización, desinfección, sepsis y antisepsis.

2. Menciona los métodos existentes para esterilizar.

3. Menciona que es un medio enriquecido, selectivo y diferencial.

4. Menciona las formas de cultivar antes de la existencia del agar

5. ¿Qué ventajas presenta el agar?

12

PRACTICA No. 5 TECNICAS ASEPTICAS PARA TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS

Introducción El grupo de bacterias Gram negativas incluye una amplia variedad de tipos

bacterianos. Se encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos

hospederos como parte de su flora normal o hasta contaminando alimentos.

Independientemente de su respuesta a la tinción de Gram, los microorganismos

poseen complejidad bioquímica y fisiológica con características que se hacen

evidentes al emplear medios de cultivo de composición química especial, que ponen de

manifiesto alguna propiedad metabólica.

Dependiendo de su composición y de su empleo los medios de cultivo pueden

ser: Diferenciales: aquellos que sirven para la clasificación de microorganismos en

base a una característica bioquímica individual; Selectivos: contienen inhibidores que

impiden el crecimiento de un tipo de bacterias pero no de otras; Enriquecidos:

carecen de inhibidores y son abundantes en su contenido de nutrientes por lo que en

ellos se puede aislar a la mayoría de las bacterias; De enriquecimiento: son medios

que favorecen el crecimiento de un tipo bacteriano sin que necesariamente impida el de

otros; De transporte: sirve para preservar una muestra en las condiciones originales y

se emplea cuando existe demora entre la toma y el procesamiento.

Objetivo

1. Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gram negativas e

interpretar los cambios bioquímicos presentados en ellos.

13

Material

• Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde

Brillante y Sulfito de Bismuto.

• Mechero Bunsen

• Asa bacteriológica

• Cepas: las que proporcione el profesor

Desarrollo

1. Sembrar por el método de estría cruzada cada uno de los medios, con la cepa

proporcionada por el profesor.

2. Incubar las placas sembradas a 37°C por 18-24 hrs.

3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios

sembrados y determinar el medio de cultivo óptimo para el aislamiento de cada

cepa.

Cuestionario 1. ¿Qué componentes están presentes en un medio de cultivo?

2. De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro: Medio Tipo de medio Indicadores Vire del indicador (pH) Inhibidores Fuente de

carbono ácido neutro básico

3. ¿Qué indica el vire del indicador en los medios empleados?

4.- Dibuja las placas antes y después de inocular

14

PRACTICA NO. 6 TECNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Introducción.

Definición de aislamiento: Es la separación de un microorganismo determinado

de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de

las poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en

condiciones de laboratorio. El proceso mediante el cual se separan los

microorganismos se denomina “aislamiento” y el microorganismo separado “aislado.

La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de

cultivo

Medio líquido: la inoculación se efectúa mediante el asa bacteriológica, pipeta o hisopo.

Medio semigelificado (semisólido): con ayuda del asa bacteriológica recta

Medio gelificado (sólido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la inoculación se

realiza por estría o picadura.

Un cultivo en el que se desarrolla solamente un tipo población bacteriana se

conoce como cultivo puro o axénico. Un cultivo que tiene más de una población

bacteriana se conoce como cultivo mixto; en el caso especial de que contenga sólo dos

clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua asociación se

denomina cultivo bimembre.

Objetivo:

1. Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas de medio de

cultivo simple, con el asa bacteriológica por el método de estría cruzada.

Material:

• 2 Placas con agar nutritivo por alumno

• Mechero Bunsen.

15

• Asa bacteriológica

• Cepa bacteriológica: Escherichia coli.

• Benzal

• Algodón

• 2 placas de agar nutritivo

Desarrollo:

1. Limpiar el área de trabajo con benzal y algodón

2. Flamear el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.

3. Dejar enfriar el asa

4. Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema

5. Tomar la muestra con el asa bacteriológica y volver a tapar el tubo.

6. Hacer las estrías sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el

esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie

de estrías y enfriarla en una orilla de la placa. Con la última serie de estrías

no volver a tocar la primera serie de estrías.

1ª serie 2ª serie 3ª serie 4ª serie

7. Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del material

que se va a meter a incubar

8. Colocar las placas en la estufa bacteriológica y dejarlas durante 24 horas a

37° C.

9. Limpiar nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón

10. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias

aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto

16

11. Colocar el material “sucio” en el cuarto de lavado

Otras de formas para la siembra de cepas con asa bacteriológica empleadas en

microbiología son:

Cuestionario: 1. ¿Por qué se incuban las cajas con las tapas hacia abajo?

2. ¿Qué ventajas e inconvenientes ofrece el método de estría cruzada?

3. ¿Con que propósito se emplean las otras técnicas de siembra diferentes a la

estría cruzada?

4. ¿Cuál es la diferencia entre un medio sólido, semisólido y líquido?

17

Practica 7 MEDIOS DE CULTIVO Y MORFOLOGÍA COLONIAL

Introducción Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones

ambientales óptimas crecerán como un agregado macroscópico de muchas e idénticas

células provenientes de una, formando una colonia en la superficie de un medio de

cultivo “sólido”. Una vez aisladas las colonias los pasos a seguir para llegar a la

identificación del tipo bacteriano son:

a) Determinar las características de la morfología colonial.

b) Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.

c) Observación de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad

metabólica.

d) Realizar pruebas metabólicas diferenciales.

Morfología Colonial. Las características que determinan la morfología colonial son:

1. Tamaño de las colonias en milímetros.

2. Color de las colonias.

3. Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa

4. Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada, embonada, umbicada

5. Superficie: lisa, rugosa, granular

6. Aspecto: húmedo, seco.

7. Bordes: enteros, ondulados, filamentosos

8. Luz reflejada: brillante o mate.

9. Luz transmitida: opaca, translúcida, transparente.

10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.

Objetivo:

1. Aprender a leer la morfología colonial.

18

Material:

• Mechero.

• Asas bacteriológicas.

• Placas sembradas con diferentes microorganismos.

Desarrollo Reporte la Morfología macroscópica de las colonias aisladas utilizando la siguiente

tabla. Característica Agar: Agar: Agar: Agar:

Tamaño (mm)

Color

Forma: puntiforme

circular

irregular

Elevación: plana

elevada

convexa

pulvinada

umbonada

Superficie: lisa

rugosa

Aspecto: húmedo

seco

Bordes: enteros

irregulares

filamentosos

Luz brillante

Reflejada: mate

Luz opaca

transmitida: translúcida

transparente

Consistencia butirosa

suave: mucoide

friable

Consistencia dura

19

Cuestionario 1.- ¿Se presentó la misma morfología en los diferentes medios de cultivo?, si hubo

variaciones explica ¿a que crees que se deban?

2.- ¿Por qué es importante conocer la morfología en los diferentes medios de cultivo?

3.- Realiza la tinción de gram y dibuja tus observaciones

20

PRACTICA No.8 EFECTO DE LOS FACTORES FÍSICOS SOBRE

EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Introducción Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben

satisfacer todos sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en

condiciones de cultivo que aseguren por un lado, el suministro de los sustratos

adecuados y por otro el mantenimiento de las condiciones físicas optimas, que nos

ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los factores físicos que mas influyen en

este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un control preciso, son: temperatura,

pH, concentración de azúcares, luz y concentración de sales.

Temperatura: este factor influye sobre las reacciones metabólicas que cada m.o.

realiza, de manera que cada especie se desarrolla mejor en ciertos rangos de

temperatura. Así tenemos que los m.o. que crecen a temperaturas menores de 20°C se

denominan Psicrofílicos. En el otro extremo encontramos a los m.o. que crecen a

temperaturas mayores de 45°C y se denominan Termófilos. Otros m.o. crecen en

rangos de 20°C a 45°C y se les llama Mesofílicos. En los rangos, los extremos superior

e inferior se designan como temperaturas máxima y mínima de crecimiento

respectivamente, sin embargo los m.o. se desarrollan mejor a un valor específico de

temperatura que se designa entonces como temperatura óptima de crecimiento.

pH: Según el pH a la que se desarrollan las bacteria se clasifican en Acidófilos:

Se desarrollan en un rango de pH entre 1 y 5; Neutrófilos: Su rango es entre 5.5 y 8.5

y Basófilos: Crecen entre 9 y 12.

Sales y azúcares: Existen organismos que para su crecimiento necesitan de

altas concentraciones de sales y se les denomina halofílicos, mientras otros soportan

esas altas concentraciones denominándose como sal tolerantes, debe entenderse

entonces que en el primer caso se refiere a un requerimiento mientras en el segundo es

una adaptación a las condiciones de cultivo.

21

Objetivos: 1. Determinar las condiciones óptimas de crecimiento de microorganismos

cultivados bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentración de sal y

de azúcar.

2. Determinar las diferencias en los parámetros anteriores de acuerdo al grupo

microbiano.

Material

• Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida sp, Staphylocuccus aureus

proporcionadas por el profesor.

• Tubos con Caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables:

a) pH: 2, 5, 7 y 12.

b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%.

c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%.

d) Normales para incubación a diferentes temperaturas.

Desarrollo 1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables

de cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearán para analizar el

comportamiento de una sola cepa.

2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos

anteriores. El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo.

3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y Sacarosa a 37°C durante 24 hrs.

4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes

temperaturas: 4°, 25°, 37° y 45° durante 24 hrs.

5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en el

cuadro de reporte.

6. Para el llenado siga el método de las cuatro cruces. Comparando simultáneamente

los cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigne valores de 1-4 cruces

según la turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.

22

Cuestionario. 1. Con respecto a los microorganismos, diga qué son las temperaturas cardinales.

2. Determine las condiciones óptimas de crecimiento para las diferentes cepas

empleadas con respecto a cada factor valorado.

3. Explique a que se deben las diferencias de crecimiento, si las hay, para los

microorganismos sembrados bajo las variantes de cada factor.

pH % Sacarosa % NaCl Temperatura en°C

2 5 7 12 2.5 5.5 10 20 0.85 5 7 10

CEPA

Incubar a 37°C / 24 hrs. Incubar por 24 hrs. a 4 25 37 45

23

CUADRO DE REPORTE

Microorganismo

TEMPERATURA 4°C 25°C 37°C 45°C

1

2

3

4

Microorganismo

DIFERENTES pH 4 5 7 12

1

2

3

4

Microorganismo

% NaCl 0.85 5.0 7.0 10.0

1

2

3

4

Microorganismo

% SACAROSA 2.5 5.5 10 20

1

2

3

4

24

PRACTICA No. 9 EFECTO DE LOS AGENTES QUÍMICOS SOBRE

EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Introducción

Para el control del crecimiento microbiano o la eliminación total de las poblaciones

microbianas podemos emplear sustancias químicas conocidas como desinfectantes o

antisépticos, que actúan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:

• Ruptura de pared.

• Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma.

• Alterando la permeabilidad.

• Inactivando enzimas.

• Desnaturalizando proteínas.

• Disminuyendo la tensión superficial.

Entre los agentes químicos empleados tenemos: ácidos, bases, jabones,

detergentes, alcoholes, metales pesados y colorantes. Él terminó desinfectante está

restringido a las sustancias que son aplicadas sobre superficies. La acción

desinfectante se ve aumentada por la temperatura y la concentración.

Objetivo

1. Observar el efecto de diversos agentes químicos sobre el crecimiento de los

microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.

Material

• Placas con agar nutritivo.

• Hisopos estériles.

• Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:

a) Agentes surfactantes: benzal, jabón, detergente y sales biliares.

b) Metales pesados: merthiolate.

c) Desinfectantes: Cloro, yodo.

d) Colorantes: cristal violeta, safranina.

25

e) Antibioticos.

• Pinzas.

• Cepas las que proporcione el profesor

Desarrollo:

1. Sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando hisopos

estériles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en la siguiente

forma:

2. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente discos de

papel filtro impregnados con el agente químico a probar. La distancia entre cada

disco no debe ser menor a 2 cm.

3. Incubar todas las placas a 37°C durante 18-24 horas.

4. Hacer lectura midiendo en mm el diámetro de los halos de inhibición alrededor

de los discos de papel filtro impregnados con el agente químico.

Crecimiento microbiano Papel filtro

impregnado con agente Químico

Halo de inhibición del crecimiento bacteriano

26

Informe: Llenar el cuadro registrando los resultados de cada cepa.

Cuestionario 1. Menciona la diferencia entre desinfectante y esterilizar

2. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes

agentes químicos. Explique a que crees que se deban las diferencias si las hay.

3. Menciona el mecanismo de inhibición de algún agente químico sobre el crecimiento

de un microorganismo.

Cepa:

Agente químico Tamaño de halo de inhibición Respuesta Sensible (S) ó Resistente (R)

27

PRACTICA NO. 10 (SEMINARIO)

CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

El crecimiento microbiano se denota como un crecimiento poblacional y no como

un crecimiento individual.

El crecimiento microbiano se limita por:

• Escasez de fuentes de energía

• Acumulación de productos tóxicos

• Disminución de espacio

• Disminución de oxigeno

Dando como resultado un grafico con cuatro fases: A) fase de Latencia, B) fase

Logaritmica, C) fase Estacionaria, D) fase de Muerte.

Logaritmo del no. De bacterias

tiempo

A

B

C

D

28

PRACTICA NO. 11 TECNICAS PARA RECUENTO DE BACTERIAS

Introducción. Si se pretende conocer el número total de microorganismos presentes en una

muestra líquida o sólida, es recomendable que se encuentren ésta última en forma

líquida y homogenizada, además de utilizar un método apropiado. Es importante

señalar que el número no guarda relación con el tipo de microorganismos patógenos,

por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo debe considerarse

como un indicador de las características higiénicas de la muestra.

Además dependiendo de las características del medio utilizado y de las

condiciones de incubación, los microorganismos analizados serán miembros de

poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos

aerobios o aerotolerantes aunque en ciertas situaciones puede ser de interés hacer

recuentos anaerobios totales.

Objetivo:

1. Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema

utilizando el método de diluciones y vertido en placa.

Material:

• Muestra de agua o de alimento.

• Mechero bunsen

• 3 Matraces conteniendo 500 ml de agar nutritivo estéril cada uno

• 30 Pipetas de 10 ml ó puntas azules estériles y micropipeta con capacidad de

1000 µl.

• 20 Tubos conteniendo 9 ml de solución salida isotónica estéril (diluyente)

• 30 Cajas petri estériles desechables.

• Benzal

• Algodón

• Marcador de tinta permanente

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Desarrollo 1. Colectar 100 ml de muestra en un frasco estéril.

2. Limpiar el área de trabajo con benzal y algodón

3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 ml de solución salina estéril

(diluyente) y numerarlos.

4. Tomar 1 ml de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo

que contenga 9 ml de diluyente, así se obtiene una dilución 10-1, homogenizar el

contenido.

5. Transferir 1 ml a un tubo de dilución que contenga 9 ml de diluyente, agitarlo

vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilución 10-2.

6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 ml de la

muestra a otro tubo con 9 ml de diluyente para obtener las diluciones 10-3, 10-4,

10-5, 10-6 como se indica en el esquema.

7. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por

separado a una caja petri estéril vacía.

8. Adicionar inmediatamente en las cajas petri de 10 a 15 ml de agar nutritivo

mezclando el inóculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la

derecha, a la izquierda y de arriba abajo.

9. Dejar gelificar las placas.

10. Rotular las placas indicando la dilución que contienen y el tipo de muestra, incluir

su nombre así como la fecha de ingreso y de salida del material.

11. Colocar las placas en la estufa bacteriológica y dejarlas durante 24 horas a 37°

C.

12. Limpiar nuevamente el área de trabajo con benzal y algodón.

13. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, hacer el recuento de las unidades

formadoras de colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar

los resultados.

14. Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilución que presente

entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC).

15. Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilución para obtener el No. de

bacterias/ ml presentes en la muestra.

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16. Colocar el material “sucio” en el cuarto de lavado.

|

Método de Diluciones y vertido en placa

Informe del aislamiento de microorganismos

1. Número de colonias encontradas en las placas sembradas en las diluciones:

10-1____________ 10 –2____________ 10 –3_____________

10 –4____________ 10 –5 ____________ 10 –6_____________

2. No. de bacterias/ ml presentes en la muestra:_________________

Cuestionario: 1. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de vertido en placa?

2. ¿Qué ventajas e inconvenientes presenta este método?

3. Escriba 3 ejemplos donde se aplique este procedimiento.

4. ¿Qué es una unidad formadora de colonias (UFC)?

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PRACTICA No. 12 TECNICAS DE TINCIÓN DIFERENCIALES

Introducción Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se

observan al microscopio. Cuando los organismos son teñidos antes de observarlos,

aumenta en gran medida el contraste de las células y su medio. Antes de teñir es

necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de células que cubre un

área de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y fijado por calor o

químicamente con alcohol. Así los frotes no fijados son lavados en el proceso de

tinción.

Existen varias técnicas de tinción ocupadas en Microbiología, por ejemplo:

• Tinción simple o directa.

• Tinción diferencial.

• Tinción de estructuras.

• Tinción negativa.

• Tinción de material de reserva, etc.

La tinción más empleada en microbiología es la de Gram, que es una tinción diferencial. Los microorganismos difieren entre sí desde el punto de vista químico y

físico por lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones

diferenciales ocupan dos colorantes, uno primario y otro de contraste o secundario.

Para la tinción de Gram el colorante primario es cristal violeta mientras la safranina

corresponde al de contraste. La tinción de Gram clasifica a los microorganismos según

su capacidad de retener el colorante primario (Gram positivas) o el colorante de

contraste (Gram negativas). Objetivo:

1. Aprender el fundamento y la técnica de la Tinción de Gram para determinar la

morfología microscópica de diferentes cepas.

Material:

• Mechero.

• Asas bacteriológicas.

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• Placas sembradas con diferentes microorganismos.

• Portaobjetos.

• Colorantes de Gram.

• Microscopios.

Desarrollo. Técnica de Tinción de Gram 1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriológica

una pequeña muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua

sobre un portaobjetos. Extender esta suspensión y dejar secar.

2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.

3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante

y lavar con chorro suave de agua corriente.

4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar.

5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar.

6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar.

7. Dejar secar al aire.

8. Observar el frote con objetivo de inmersión.

9. Determinar la morfología microscópica y la respuesta a la Tinción de Gram de cada

cepa empleada

Cuestionario 1. ¿Qué importancia tiene la tinción de Gram?

2. ¿Cómo explicas la tinción de Gram?

3. Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram positivas y 4 de Gram negativas.

4. ¿Por qué es importante fijar el frote?

5. Definir un colorante y las partes que lo conforman.

6. Dibuja tus observaciones

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PRACTICA No. 13 (SEMINARIO)

TECNICAS DE TINCION PARA ESTRUCTURAS BACTERIANAS

TINCIÓN ESTRUCTURALES A - TINCIÓN DE ESPORAS Fundamento. Sólo algunos géneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y

Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endósporas. Su

enorme

importancia se debe a su resistencia al calor. Mientras que calentando a 80º durante 10 min

(pasteurización) mueren todas las bacterias y las propias formas vegetativas de las

formadoras de esporas, las endósporas termorresistentes soportan en algunos casos

incluso

la cocción durante horas.

La esporulación se inicia en el interior de la bacteria con una concentración de material

proteico (la espora contiene casi toda la materia seca de la célula materna, pero en 1/10 de

su

volumen). Se forma una doble capa envolvente que representa el 50 % de peso y volumen

en

la espora madura.

La esporulación se produce cuando las condiciones ambientales son desfavorables

(agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos,

etc.),

formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de

esporogénesis,

la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior.

Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma

vegetativa.

La capacidad de germinar perdura durante años.

En general las esporas, se tiñen muy dificilmente, requiriendo determinados colorantes muy

concentrados así como la presencia de calor que facilite su penetración; pero, ahora bien,

una

vez teñidas es muy difícil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder

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demostrar la presencia de éstas.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1. Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

2. Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

Las endósporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua , y

sí

lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

Procedimiento Se emplearán cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las

esporas.

1. Preparar frotis bacteriano de Bacillus sp. 2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no

sobresalga del portaobjetos.

3. Teñir con verde de malaquita cubriendo el porta durante 2 min

4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta

que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la

preparación del fuego. Añadir más colorante y repetir la operación 4 veces.

5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante. 5 - MICROSCOPÍA . TINCIONES BACTERIANAS 65

6. Teñir con safranina 2-3 min y lavar con agua corriente. Secar la preparación.

7. Observar la preparación al microscopio con objetivo de inmersión.

8. Dibujar y anotar la disposición y la morfología de las endósporas.

9. Clasificar el tipo de endósporas según la fig.5.8

Fig. 5.8

Interpretación de los resultados La posición y la morfología de la endóspora en el interior de la bacteria constituyen un

carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.

Las tres bacterias de la fig. 5.8 difieren en la disposición y morfología de las endósporas.

B. sphaericus posee una endóspora esférica con localización terminal y deformante de la

célula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. B.thuringiensis

tiene localizada la endóspora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo que provoca

un

abombamiento característico denominado huso. B.subtilis forma una espora cilíndrica

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subterminal no deformante.

Por ultimo, entre de las tinciones estructurales podríamos encontrar la tinción de

cápsulas, importantisimo para observar el factor de virulencia bacteriana, bien por los

metodos de Hiss, Anthony o Burry-tinta china; la tinción de corpúsculos metacromáticos

por el método de Loeffer; la tinción de flagelos, observando los mismos de las bacterias

identificadas como móviles.

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Practica 14 PRUEBAS BIOQUIMICAS

Introducción El aislamiento de bacterias de productos biológicos es un procedimiento de rutina

en un laboratorio clínico, que tiene como finalidad encontrar al agente causal de algún

cuadro infeccioso. El éxito del aislamiento de bacterias depende en un principio de la

correcta toma de la muestra, que deberá ser representativa del estudio deseado

(exudado faringeo, coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado otico,

hemocultivo, cultivo de liquido cefalorraquideo, etc), el siguiente paso es la selección de

los medios de cultivo adecuados, que deberán ser selectivos diferenciales y/o

enriquecidos dependiendo de los microorganismos buscados.

Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para

la identificación de los microorganismos son las pruebas metabólicas o pruebas

bioquímicas, las cuales se basan en la determinación de enzimas, productos finales del

metabolismo, etc. Dichas pruebas son características de cada genero y especie, para

esto se siembra a los microorganismos en medios que contienen un sustrato especifico,

un indicador de pH, y los nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas

ocasiones es necesario agregar algunos reactivos al medio donde se ha desarrollado el

microorganismo para visualizar la reacción bioquímica). Objetivos:

• Conocer el fundamento de las pruebas metabólicas

Material

• Tubos con agar TSI

• Tubos con agar LIA

• Tubos con agar MIO

• Tubos con agar Citrato

• Tubos con agar Urea

• Reactivos para la prueba de Catalasa

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• Reactivos para la prueba de Oxidasa

• Colorantes de Gram

• Portaobjetos

• Asa bacteriológica

• Mechero

• Microscopios

• Cepa: la proporcionada por el profesor

Desarrollo: Pruebas metabólicas Al término de la incubación pasar a la identificación de bacterias de interés médico,

para lo cual se utilizarán las pruebas metabólicas o bioquímicas, de la siguiente

manera:

• Realizar tinción de Gram.

• Con la ayuda de un aplicador estéril tomar una colonia de interés y colocarla en un

portaobjetos con una gota de peróxido de hidrogeno al 10% (prueba de catalasa.

• De igual forma hacer prueba de oxidasa

• Con el asa bacteriológica estéril en punta tomar una colonia y depositarla en el tubo

con agar TSI.

• Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las bioquímicas.

Poner atención a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos.

• Rotular e incubar a 37°C por 18-24 hrs.

• Leer e interpretar las pruebas bioquímicas para la lectura de producción de indol

agregar una gota de reactivo de Kovac’s, (apóyese en la siguiente Tabla para la

identificación de enterobacterias)

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Reacciones Bioquímicas de la familia Enterobacteriaceae

TSI Urea Indol MR VP Citrato Movilidad Descarboxilasas

Sup Fondo Gas H2S L A O

Shigella K A - -- - + ó - + - - - - - ó (+) - ó + Escherichia A A + - - + + - - + + ó - + ó - + ó - Salmonella (general) K A + 2-4+ - - + - + + + + + Salmonella typhi K A - 1+ - - + - - + + + - Arizona K ó A A + 2-4+ - - + + + + + + + Citrobacter freundii K ó A A + 2-4+ + - + + + + - + - ó + Citrobacter diversus K A + - + + + + + + - + + ó - Klebsiella A A + - + - ó + - ó + + + - + - - Enterobacter cloacae A A + - + - - + + + - + + Enterobacter aerogenes A A + - - - - + + + + - + Hafniae K A + - - - - + + ó - + + - + Enterobacter agglomerans A A - ó + - - ó s - - + ó - + ó - + - - - Serratia marcescens A A - ó w - - ó s - - + + ó - + + - + Serratia liquefaciens A A + - - ó s - - + ó - + + + - + Serratia rubideae A A - - - ó s - - + + ó - + + - - Proteus vulgaris K A + 2-4+ + + + - + + - - - Proteus mirabilis K A + 4+ + - + - + ó - + - - + Proteus morganii K A + - - + + - + ó - + - - + Proteus rettgeri K A - ó w - + + + - - + - - - Providencia K A - ó + - - + + - + + - - - Edwardsiella K A + 3+ - + + - - + + - + Yersinia enterocolitica A A - - + + + - +- - - - +

s = superficie, (+) = positivo tardío, + = positivo, w = positivo débil, K = alcalino, A = ácido

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Cuestionario 1. ¿Qué pruebas se pueden realizar en un TSI?

2. ¿Qué lectura da el medio LIA cuando es lisina positiva?

3. ¿Por qué se puede determinar la movilidad de una bacteria en el medio MIO?

4. ¿Como interpreta el vire del citrato?

5. ¿A partir de que compuesto se obtiene el indol?

6. ¿Cual es el fundamento de la prueba de urea?

7. ¿Que indica una prueba de catalasa positiva?

8. ¿Cuál es el fundamento de la prueba de oxidasa?

9. Llena el siguiente cuadro.

Prueba bioquímica

Indicador Fuente de carbono

Pruebas a realizar

Todas las posibles lecturas

Dibujo del medio sin inocular

TSI

LIA

MIO

Citrato

Urea

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10.- Anotar los resultados de la cepa de trabajo en la siguiente tabla

11.- Con base a los resultados menciona la cepa de trabajo

Prueba bioquímica

Lectura Dibujo Interpretación

TSI

LIA

MIO

Citrato

Urea

Catalasa

Oxidasa

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Práctica No. 15

MORFOLOGÍA DE HONGOS Introducción. La mayoría de los que deben relacionarse con la rama micológica, a

menudo se sienten confundidos y desalentados en sus tentativas para estudiar los

hongos debido a la gran variación en el aspecto macroscópico de las colonias, a la

multiplicidad de las estructuras microscópicas y a la nomenclatura poco conocida.

Sin embargo, estas dificultades son más psicológicas que reales y cuando

se llegan a dominar unos cuantos conceptos básicos basados en las morfologías

macroscópica y microscópica, la identificación de los hongos resulta más fácil y

rápida que en otras bacterias ordinarias.

Los hongos emiten una o más prolongaciones tubulares llamadas tubos

germinales o también llamadas hifas, que se alargan por el crecimiento de su

extremo distal. La hifa puede dividirse por formación de paredes transversales a

intervalos regulares.

Las hifas divididas por tabiques se denominan hifas tabicadas, sin embargo

algunos hongos no desarrollan tabicaciones en las hifas y se denominan no

tabicadas o cenocíticas.

Finalmente, el conjunto de hifas desarrollan lo que se conoce como micelio,

la diferenciación de los hongos se basa principalmente en su aspecto colonial y

morfología microscópica.

l.- La morfología colonial se basa en los siguientes parámetros:

- Aspecto

- Consistencia.

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- Pigmentación de la colonia.

- Difusión de pigmento al medio.

- Luz reflejada.

- Luz transmitida.

- Bordes.

ll.- Morfología microscópica ( referente al micelio )

- Tabicado o septado.

- Cenocítico.

- Hialino.

- Pigmentado ( fugilaginoso, carotenoide )

- Macrosifonado

- Microsifonado.

Objetivo. El alumno será capaz de diferenciar las colonias de los hongos y los

diversos tipos de estructuras básicas, como por ejemplo, el micelio por medio de

técnicas de observación en fresco o directa y algunas preparaciones facilitadas

por el profesor, valorando estos parámetros como fundamentales en la

identificación de los hongos.

Técnicas a emplear. A).- Técnica de resiembra en tubo.

1.- Con el asa micológica en ángulo de 90º tomar un pequeño fragmento de loas

colonias con morfología diferente y depositarlo en un tubo con medio inclinado

PDA o SDA.

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2.- Incubar a 28º C

3.- Observar cada 40 horas el desarrollo de las colonias.

B).- Técnica de observación microscópica en fresco.

1.- Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodón

lactofenol.

2.- Con el asa micológica tomar un pequeño fragmento de la colonia y colocarlo

sobre el porta objetos.

3.- Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de

hongos con esporulación abundante).

4.- Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de disección o bien

con la misma asa micológica.

5.- Colocar sobre la preparación un cubre objeto evitando formar burbujas de aire.

6.- Observar al microscopio a seco débil y seco fuerte, nunca usar aceite de

inmersión.

Material a emplear. 1.- Colonias de hongos proporcionadas por el profesor.

2.- Tubos con medio PDA o SDA.

3.- Colorante azul de algodón.

4.- Preparaciones fijas proporcionadas por el profesor.

5.- Porta y cubre objetos.

Desarrollo de la práctica. 1.- Escoger diferentes tipos de colonias y resembrarlas en tubos con medio PDA o

SDA.

2.-Observar comparativamente las características macroscópicas de las colonias

desarrolladas.

3.- Hacer preparaciones en fresco con azul de algodón lactofenol de las colonias

aisladas resultando de la práctica anterior.

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4.- Observar comparativamente el micelio de las muestras aisladas con las

preparaciones fijas proporcionadas por el profesor.

Dibujos: a.- Hifa.

b.- Micelio.

c.- Micelio macrosifonado septado.

d.- Micelio macrosifonado cenocítico.

e.- Micelio septado fugilaginoso.

f.- Micelio microsifonado.