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Bacterias

Objetivos:

Despus de este laboratorio el estudiante podr:

1. Conocer que es un dominio y cmo se clasifican los organismos en cada Dominio.

2. Conocer las caractersticas que distinguen a las clulas procariotas de las

eucariotas.3. Conocer cules son las caractersticas principales de los organismos dentro del

Dominio Bacteria.

4. Identificar las formas principales de las bacterias.

5. Realizar prcticas aspticas bsicas para manejar cultivos de bacterias.6. Poder preparar una laminilla sencilla de una bacteria.

7. Conocer y realizar varios mtodos simples para hacer cultivos de bacterias.

8. Conocer algunos ejemplos acerca de la importancia econmica, ecolgica y

mdica que tienen las bacterias.

Introduccin:

Los organismos procariotas son por mucho los ms abundantes en la Tierra. Se pueden

encontrar en prcticamente todas partes, incluso en ambientes extremos qumicos, de

altas temperatura y de gran variabilidad en disponibilidad de oxgeno. Aunque quizs sereconozcan ms por incluir organismos patgenos causantes de enfermedades y desastres

agrcolas, la realidad es que obtenemos beneficios de muchos procariotas y su

importancia, mdica, ecolgica y econmica, es grande. Los organismos procariotasjuegan un papel vital en la productividad y el ciclo de sustancias esenciales para todas las

dems formas de vida; siendo las bacterias los nicos organismos capaces de fijar elnitrgeno atmosfrico. Entre los beneficios econmicos tenemos el uso de bacteriasacido-lcticas para fermentar o crecer cultivos de alimentos como por ejemplo yogurt,

queso y mantequilla. Algunos usos industriales son el uso de bacterias para la

produccin de etanol, para la aceleracin del proceso de compostaje y para la produccinde abono para la agricultura. Inclusive algunos procariotas pueden descomponer

contaminantes lo cual es til en la bioremediacin.

Los organismos procariotas estn clasificados dentro de dos dominios: Bacteria yArchaea. Los organismos eucariotas se clasifican dentro del dominio Eukarya. Los

organismos clasificados dentro del Dominio Archaea, antes se clasificaban junto a las

bacterias, pero difieren de las mismas en composicin de membranas, las secuencias deARN y ADN. Las archaebacterias es un grupo diverso de organismos que aunque tiene

organismos que crecen en ambientes no extremos incluye organismos metangenos y

extremfilos. Ejemplos de ambientes extremfilos donde viven archaebacterias son: altastemperaturas y alta salinidad

En este laboratorio estudiaremos organismos pertenecientes al Dominio Bacteria: las

bacterias y las cianobacterias o algas verde-azules. Repasando las caractersticas de las

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clulas procariotas tenemos que no poseen organelos rodeados por membranas y que el

material gentico se encuentra dentro de una molcula circular de ADN. Pueden, adems

tener pequeos anillos de ADN adicional, que se conocen como plsmidos.

Las bacterias y cianobacterias tienen la mayora una pared celular, pero su composicin

no es igual a la pared celular vegetal, ya que el componente principal de la pared enbacterias son peptidoglicanos, mientras el de las clulas vegetales es celulosa.

Muchas de las bacterias son organismos hetertrofos, lo cual quiere decir que consiguensu alimento de otros organismos. Algunas de las bacterias hetertrofas son parasticas,

por lo cual se conocen como bacterias patgenas; mientras que otras son saprofticas,

alimentndose de organismos muertos, causando la descomposicin de los mismos y as

permitiendo que los elementos puedan estar disponibles para ser usados como materiaprima por otros organismos. Algunas bacterias son auttrofas, o sea que producen su

propio alimento por medio de fotosntesis o quimiosntesis. Todos los organismos vivos

dependemos de las bacterias y cianobacterias fijadoras de nitrgeno, ya que ningn otro

organismo vivo tiene esta capacidad que libera el nitrgeno para que este pueda ser usadocomo materia prima para compuestos orgnicos. Es en este contexto que podemos

encontrar las micorizas que son bacterias fijadoras de nitrgeno viviendo en simbiosiscon plantas.

La forma de reproduccin ms comn es la fisin binaria. Existen otras formas de

reproduccin menos comunes, como sera la conjugacin por la se producerecombinacin gentica de todo o parte del material gentico de las clulas. En

condiciones adversas muchas bacterias pueden formar endosporas.

Antes de proceder a realizar los ejercicios se debe conocer que hay varias reglas y

procedimientos aspticos a seguir al trabajar con cultivos de bacterias:

Su instructor proveer e ilustrar las reglas y mtodos correctos para trabajar conbacterias.

Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que est

manejando bacterias.

Tenga precaucin al trabajar con los mecheros.

Limpie su mesa de trabajo, antes y despus de realizar los ejercicios, con un

desinfectante.

Lvese las manos bien, antes y despus del laboratorio.

Todo cultivo deber ser manejado con cuidado y deber ser tratado como posible

patgeno.

Ejercicio 1: Identificando bacterias.Debido al tamao pequeo de las bacterias y su similaridad en estructura celular, para

identificar bacterias se utilizan criterios diferentes que los usados en la identificacin de

organismos macroscpicos. Para identificar bacterias se usan diferencias en tincin,formas de crecimiento, nutricin y fisiologa. En este ejercicio se observarn e

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identificarn formas comunes de bacterias. Se practicar adems como realizar una

preparacin y tincin simple de una laminilla de bacterias.

1.a. Identificando morfologa individual de bacterias

Las bacterias se clasifican bajo tres formas bsicas: bacilos, cocos o espirilos. Los

bacilos tienen una forma ovalada y alargada formando bastoncillos. Los cocos tienen unaforma circular y los espirilos o vibrios parecen espirales o comas. Estos pueden estar

formando cadenas o grupos, aunque cada clula manteniendo su integridad.

Materiales

Microscopio compuesto

Laminillas preparadas de bacilos, cocos y espirilos

Aceite de inmersinPapel de lente

Procedimiento:

Consiga una laminilla preparada de bacterias. Tendr varias laminillas a observar debacterias mixtas o individuales de cocos, bacilos o espirilos. Monte la laminilla en su

microscopio a una baja magnificacin y observe.Qu puede distinguir? Qu implica esto acerca del tamao de las bacterias?

Cambie a una magnificacin mayor, usando el objetivo 40X y observe.

Qu formas puede observar?

Cambie ahora al objetivo 100X. Enfoque la laminilla usando solamente el botn de

ajuste fino o micromtrico. Mueva el objetivo fuera de la laminilla y coloque una gota deaceite de inmersin sobre la laminilla. Ponga el lente objetivo en posicin y enfoque otra

vez.

* Recuerde que al terminar de ver una laminilla con aceite de inmersin se debe limpiarla laminilla y el lente objetivo con papel de lente para remover los rastros del aceite. NO

use otro tipo de papel ya que rayara los lentes.

Puede observar alguna diferencia al usar el aceite de inmersin? Dibuje los tres tipos de

bacterias por su forma.

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1.b. Identificando formas de bacterias que ocurren en nuestras encas

Las partculas de alimento que se acumulan en las encas crean un ambiente ideal para el

crecimiento de las bacterias. La mezcla de material de los alimentos y las bacteriasforman lo que conocemos como placa dental. En este ejercicio se observar las formas

de las bacterias que forman parte de la placa dental

.Materiales

Microscopio compuesto

Aceite de inmersinPapel de lente

Laminillas y cubreobjetos

Palillos de dientes

Pinche de ropa de maderaMechero

Fsforos

Botella con gotero con tinte de Cristal violeta

Botella con gotero de agua destiladaBandeja para tensin

Botella con agua destiladaPapel secante o papel toalla.

Procedimiento

Usando un palillo de diente raspe el rea del diente cercana a la enca. Ponga en unalaminilla una gota de agua bien pequea. Coloque su muestra sobre la laminilla. Deje

que se seque la laminilla al aire. Usando un mechero y agarrando la laminilla por un

extremo con el pinche de ropa flamee la laminilla a un ngulo de 45 Esto lo debe hacerrpidamente y varias veces. La laminilla debe estar caliente, pero que la pueda tocar.

Con un gotero aplique 3-4 gotas de cristal violeta sobre la laminilla en la bandeja de

tincin y deje teir por 1 minuto. Lave con chorro suave de agua destilada hasta que lamayor parte del color se vaya de la laminilla. Seque gentilmente con papel secante

(Bilobous paper) o papel toalla. Observe bajo el microscopio. Para poder observar la

laminilla mejor deber usar el objetivo 100X y aceite de inmersin.Qu formas puede observar en la laminilla?

Las bacterias estn individuales o agregadas?

Se pueden observar todas las formas de las bacterias?

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Qu tipo de bacterias son las ms abundantes?

Ejercicio 2: Identificacin de formas de coloniasAunque usualmente para la clasificacin de las bacterias se deben realizar tinciones y

otras pruebas, observaciones de la morfologa de las colonias pueden ser tiles para la

identificacin preliminar de las especies. Una colonia se puede formar a partir de unasola bacteria y se compone de millones de clulas. Como regla general en estudios de

bacterias no se cuentan organismos individuales sino cantidad de colonias. Es importante

adems poder describir estas colonias. En este experimento observaremos placas con

algunas bacterias para ver las caractersticas que muestran las mismas en cuanto alcrecimiento de las colonias.

Para este ejercicio tendr disponible en el laboratorio varias placas Petri con diferentes

colonias de bacterias creciendo en cada placa. Busque una placa y sin abrirla observeusando el estereoscopio. Describa las colonias usando los siguientes criterios: forma,

color, apariencia, forma del borde y textura de la colonia. Compare con otras placasdisponibles.

Los criterios a seguir son los siguientes:

a. Forma de la colonia: puntiforme (a) (menos de 1mm de dimetro), redonda (b),irregular (c) o filamentosa (d).

b.

c. Margen de la colonia: entero (a), curveado (b), ondulado (c), lobulado (d) o

filamentoso (e). La diferencia entre curveado, ondulado o filamentoso estriba en

el tipo de curva en el borde. El lobulado es irregular, el curveado es regular y msapretado, mientras que el ondulado son curvas mas relajadas.

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d. Textura de la colonia: lisa (a), concntrica (b), arrugada (c) o con curvas o

contorno (d). La diferencia entre concntrica y con curvas es que el dimetro dela concntrica se va haciendo ms pequeo de forma regular a medida que se sube

en la colonia, mientras en la que tiene curvas el contorno es mas irregular.

e. Color de la colonia.

Porque no usamos cantidad de colonias como criterio?

Pudo hacer todas las observaciones de las colonias para todos los cultivos? Qu

problemas encontr?

Es este el mejor mtodo o el mtodo primordial para identificar las colonias? Explique.

Ejercicio 3. Bacterias en el medio ambiente.

Las bacterias se encuentran en una gran variedad de medios ambientes. En este ejercicio

compararemos diferentes medios para observar la presencia de bacterias en varios mediosde nuestro entorno.

Materiales:Platos Petri con agar

Papel de parafinaIsopos estriles de algodn

Lpiz de cera

Incubadora.

Procedimiento:

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1. Obtenga un plato petri de su instructor y escoja un lugar para muestrear. Algunos

ejemplos pueden ser estanques de agua, exposicin de la placa en algn lugar en

particular como por ejemplo ambiente areo o de tierra. Asegrese de que seescojan diferentes ambientes por mesa de laboratorio. Para transferir muestras

lquidas a su placa siga el siguiente procedimiento para hacer la siembra en la

placa. Con un isopo estril de algodn recoja parte de la muestra. Sin presionarfuertemente el la superficie del agar distribuya su muestra con movimientos de

izquierda a derecha sobre un tercio de la superficie del agar (1). Gire su placa y

empezando en parte del rea 1 haga lo mismo a la regin 2. Gire su placanuevamente y empezando en la regin 2 haga lo mismo en la regin 3. Este

mtodo le asegurara que las bacterias vayan reduciendo en densidad y para la

regin 3 pueda ver colonias aisladas.

2. Si la muestra proviene de algn lugar seco como por ejemplo tierra, tome un poco

de muestra y humedezca con agua hasta poder sacar parte del material diluido enel agua y siembre como se mostr anteriormente para una muestra lquida. Es

importante que no tome mucho particulado grande sino el que se encuentra

diluido en agua y que pudo tomar con el isopo.3. Si el lugar a muestrear es aire en algn lugar en especfico abra la placa en el

lugar deseado y exponga el agar por 10 a 15 minutos.

4. Luego de tomar la muestra cierre el plato con un pedazo de parafina, rotule y

coloque en incubadora boca abajo por 48 horas a 25 C. Saque de la incubadora yguarde en la nevera hasta la prxima reunin de laboratorio.

5. Observe las placas y compare con los dems ambientes muestreados por suscompaeros.

Observ diferencias entre los ambientes muestreados?

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Qu tipos de ambientes mostraron ms crecimientos de bacterias?

Ejercicio 4: Resistencia a antibiticos y antispticos

Aun cuando la mayora de las bacterias son beneficiosas y necesarias para mantener unambiente ptimo, un crecimiento descontrolado puede ser daino o destructivo para otras

especies. Algunas bacterias son patgenas, o sea causan enfermedades en plantas y

animales. Se han desarrollado agentes para controlar el crecimiento de las bacterias. Eneste ejercicio se usaran antibiticos, antispticos y desinfectantes para ver como estos

afectan el crecimiento de las bacterias. Un antibitico es un qumico producido por una

bacteria o un hongo que tiene el potencial de controlar el crecimiento de otra bacteria yhongo. Otros agentes que usamos para limpieza se usan para el control de bacterias.

Aquellos usados para controlar bacterias sobre tejidos vivos se conocen como

antispticos y los que se usan es objetos o superficies no vivas son los desinfectantes.

Para realizar este experimento se deben seguir los pasos de asepsia a continuacin para

evitar la contaminacin de nuestros cultivos.

1. Al abrir cultivos esto se debe hacer por la cantidad mnima de tiempo posible.

2. Las agujas de inocular se deben pasar por una llama y dejar enfriarbrevemente antes de introducirla en el cultivo de bacterias. Si utiliza hisopos

de algodn, no tiene que realizar este paso.3. Use el equipo de seguridad, bata y gafas de laboratorio siempre que estmanejando bacterias y mantenga los cultivos lejos de su cara.

4. No agite los tubos con cultivos de bacterias antes de abrir y mantenga los

mismos en una rejilla para sostenerlos mientras no lo estn usando.5. Lvese las manos con agua y jabn antes y despus de hacer el ejercicio.

6. Limpie su mesa de trabajo con un desinfectante antes y despus de los

ejercicios de este laboratorio.

Materiales

Plato Petri con agar

Isopos estriles de algodnParafina

Mechero con alcohol

Fsforos

Tubo Con cultivo en caldo de bacteriasDiscos estriles

Discos con antibiticos

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Lpiz de cera

Procedimiento:

1. Rotule en plato petri y divida en 4 cuadrantes el fondo de su plato con el lpiz decera. Rotule 1-4.

2. Prepare un sembrado en su plato como muestra la figura. Abra el tubo con el

cultivo y flamee levemente la abertura. Con isopo estril de algodn remueva unpoco del caldo. Flamee abertura del tubo y cierre. Abra su plato y sin presionar

fuertemente cubra toda la superficie del agar con movimientos de izquierda a

derecha, tomando el cuidado de llegar hasta los bordes del plato petri. Rote elplato 45 y haga lo mismo. Cierre su plato.

3. En el centro del cuadrante 1 coloque un disco estril. Porque se coloca un disco

estril?

4. En el centro del cuadrante 2 coloque un disco con antibitico provisto por suinstructor. Es importante anote el nombre del antibitico ya que puede variar por

mesa de laboratorio.

5. En el cuadrante 3 coloque un antisptico.6. En el cuadrante 4 coloque un desinfectante.

7. Selle su placa con parafina y coloque boca arriba en incubadora a 37 C. Observe

de 24-48 horas y transfiera a nevera.

8. En su prximo periodo de laboratorio examine su placa para ver si sustratamientos afectaron el crecimiento de las bacterias. Mida el dimetro (en

milmetros) de la zona de inhibicin de cada tratamiento (zona alrededor del disco

donde el crecimiento de las bacterias fue inhibido por el agente usado).9. Compare sus resultados con las dems placas hechas en el laboratorio.

Fue la zona de inhibicin igual para todos los tratamientos?

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Fueron los tratamientos con antibiticos ms efectivos que los antispticos odesinfectantes?

Basado en sus resultados, qu antisptico fue ms efectivo? Qu desinfectante?

El efecto de los agentes usados es el mismo para todo tipo de bacterias? Por qu?

Ejercicio 5. Efectividad en lavarse las manos para inhibir el crecimiento de las bacterias.

En este ejercicio compararemos el crecimiento de las bacterias con distintas maneras de

limpiarse las manos versus el no lavrselas.

Materiales

Plato Petri con agarPapel de parafina

JabnLpiz de ceraIncubadora

Procedimiento:1. Divida un el fondo de un plato petri en 4 partes y numere de la siguiente forma:

a. Manos sin lavar

b. Manos lavadas con aguac. Manos lavadas con agua y jabn

d. Manos lavadas con agua y jabn luego de 5 minutos

2. Con mucho cuidado levante un poco la placa (para evitar exponer la placa a las

bacterias del ambiente) y toque sin presionar fuertemente la placa con el dedo sin lavar.

3. Lave una mano con agua solamente y presione en otro cuadrante con un dedo hmedo4. Lave sus manos con agua y jabn y con un dedo hmedo presione sobre otro

cuadrante.

6. Espere 5 minutos y use ese mismo dedo para presionar el ltimo cuadrante.

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7. Cierre la tapa con papel de parafina, incube por 24 horas a 25C, y transfiera a nevera

hasta el siguiente periodo de laboratorio.

8. Analice el resultado y llene la siguiente tabla:

Cuadrante Cantidad de

colonias

Cantidad de

colonias diferentes

Apariencia de las

coloniasA

B

C

D

Pudo observar ms de un tipo de bacterias en la placa? Describa los diferentes tipos decrecimiento.

Qu cuadrante tuvo menos colonias y cual tuvo ms? Discuta sus resultados.

Se observaron diferencias notables entre el tratamiento C y D? Qu espera que pase sipasa ms tiempo?