Bacilos No Fermentadores

CCuurrssoo TTeerriiccoo yy PPrrccttiiccoo

13 al 17 de Septiembre de 2010

Servicio Bacteriologa Especial Departamento Bacteriologa

Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS -Dr. Carlos G. Malbrn

Buenos Aires, Argentina

IIDDEENNTTIIFFIICCAACCIINN DDEE BBAACCIILLOOSS GGRRAAMM NNEEGGAATTIIVVOOSS

NNOO FFEERRMMEENNTTAADDOORREESS

Directora: Raquel Callejo

Coordinadora: Mnica Prieto

Docentes: Raquel Callejo Mnica Prieto Florencia Rocca

Lucia Cipolla Lorena Aguerre Claudia Martnez

Colaboracin tcnica: Gastn DAngiolo

Asistencia informtica: Claudia Martnez

Lugar: Servicio Bacteriologa Especial Departamento Bacteriologa

Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI) ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

NDICE GENERAL

Introduccin .................................................................................................................................... 1-2 Bioseguridad .................................................................................................................................. 3-4 Revisin de los principales cambios taxonmicos .......................................................................... 5-7 Cambios recientes de la nomenclatura ........................................................................................ 8-13 Ubicacin taxonmica de los gneros de importancia mdica.................................................... 14-15

Medios de cultivo. Protocolos de preparacin cido sulfhdrico. Produccin en acetato de plomo ................................................................... 16 Agar almidn ............................................................................................................................ 16 Agar Mac Conkey ..................................................................................................................... 17 Agar SS .................................................................................................................................... 17 Cetrimide agar ........................................................................................................................... 18 Citrato de Simmons agar .......................................................................................................... 18 Coloracin de flagelos ............................................................................................................... 18 Coloracin de flagelos (adaptado) ............................................................................................. 19 Decarboxilacin. Mtodo MOELLER ....................................................................................... 19 Diferenciacin de cocos y cocobacilos (adaptado) .................................................................... 19 DNAsa agar .............................................................................................................................. 20 Escala nefelomtrica de Mac Farland........................................................................................ 20 Esculina .................................................................................................................................... 21 Estras de carbohidratos al 10% ............................................................................................... 21 Flexirrubina ................................................................................................................................ 22 FLN medio (Fluorescencia, Lactosa, Nitrato) ............................................................................ 22 Gelatina .................................................................................................................................... 23 Hidratos de carbono .................................................................................................................. 23 Indol .......................................................................................................................................... 24 Medio base ALP (Aerbico Baja Peptona para bacilos no fermentadores) ............................... 24 Medio acetamida........................................................................................................................ 25 Medio de asimilacin ................................................................................................................. 25 MN (Motilidad - Nitrato).............................................................................................................. 25 OF medio basal.......................................................................................................................... 26 ONPG -galactosidasa (orto-nitro-fenil -D-galactopiransido)................................................. 26 Oxidasa...................................................................................................................................... 27 Pseudomonas F agar (King B)................................................................................................... 27 Pseudomonas P agar (King A) .................................................................................................. 27 Reduccin de nitrato. Caldo nitrato ........................................................................................... 28 Reduccin de nitrito. Caldo nitrito .............................................................................................. 28 TSI (agar hierro tres azucares) .................................................................................................. 29 Urea de Christensen ................................................................................................................. 29

Esquemas y tablas de identificacin Algoritmo inicial de identificacin............................................................................................... 30 Tabla 1. Shewanella spp. .......................................................................................................... 31 Tabla 2. Colonias pigmentadas en rosa ................................................................................... 31

Esquema de identificacin grupo glucosa positiva Grupo glucosa positiva .............................................................................................................. 32

Esquema de identificacin grupo glucosa negativa Grupo oxidasa negativa............................................................................................................. 34

Servicio Bacteriologa Especial Departamento de Bacteriologa INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

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Grupos Grupo fluorescente .................................................................................................................... 35 Grupo 1...................................................................................................................................... 35 Grupo 2...................................................................................................................................... 36 Grupo 3...................................................................................................................................... 37 Grupo 4...................................................................................................................................... 38 Grupo 5...................................................................................................................................... 38 Grupo 6...................................................................................................................................... 39 Grupo 7...................................................................................................................................... 39 Grupo 8...................................................................................................................................... 40 Grupo 9...................................................................................................................................... 40 Grupo 10.................................................................................................................................... 41 Grupo11..................................................................................................................................... 42 Grupo 12.................................................................................................................................... 43 Grupo 13.................................................................................................................................... 43 Grupo 14.................................................................................................................................... 43 Grupo 15.................................................................................................................................... 44 Grupo 16.................................................................................................................................... 44 Grupo 17.................................................................................................................................... 45 Grupo 18.................................................................................................................................... 46 Grupo 19.................................................................................................................................... 46 Grupo 20.................................................................................................................................... 46 Grupo 21.................................................................................................................................... 47 Grupo 22.................................................................................................................................... 48 Grupo 23.................................................................................................................................... 49

Tablas adicionales Complejo Burkholderia cepacia ................................................................................................. 50 Gnero Neisseria....................................................................................................................... 51 Diferenciacin de Neisseria spp. de Gneros relacionados: Prueba sub CIM........................... 52 Cocoides, oxidasa positiva, asacarolticos ................................................................................ 52

Esquema simplificado ..............................................................................................................53-62

Procedimientos generales para la conservacin de BNF......................................................63-64


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INTRODUCCIN

Generalidades. Importancia clnica

Los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF) constituye un grupo heterogneo de microorganismos que se consideran generalmente patgenos oportunistas y que en la actualidad han cobrado relevancia por su incidencia en las infecciones hospitalarias. Son bacterias no esporuladas, aerobias estrictas que, o bien no utilizan los carbohidratos como fuente de energa, o los degradan a travs de vas metablicas diferentes a la fermentacin.

Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado su ubicuidad, pueden sobrevivir en el ambiente hospitalario en: agua destilada, soluciones salinas, tubuladuras, superficies hmedas, humidificadores, incubadoras, nebulizadores, catteres, soluciones desinfectantes y en superficies inertes, constituyendo reservorios de potenciales infecciones. Algunas especies psicrfilas pueden contaminar sangre de banco y hemoderivados.

A continuacin se resumen brevemente la importancia clnica de algunos de los gneros y especies de BGNNF que son ms frecuentemente aislados.

P. aeruginosa representa un problema importante de salud, especialmente cuando se trata de pacientes con cncer o quemados. Una vez que se establece la infeccin, P. aeruginosa produce una serie de compuestos txicos que causan no slo dao tisular extenso, sino adicionalmente interfieren con el funcionamiento del sistema inmune. Entre las protenas que intervienen en la infeccin de P. aeruginosa se encuentran toxinas, como las exotoxinas A y S, as como enzimas hidrolticas que degradan las membranas y el tejido conectivo de diversos rganos. Esta situacin se ve agravada por la dificultad para tratar las infecciones por P. aeruginosa, ya que esta bacteria presenta una alta resistencia natural a distintos antimicrobianos y desinfectantes.

Existe un grupo poblacional especialmente vulnerable a las infecciones por P. aeruginosa formado por enfermos con fibrosis qustica. Este microorganismo coloniza el tracto respiratorio de estos pacientes, y a medida que progresa la infeccin se seleccionan variedades mucoides que producen grandes cantidades del exopolisacrido alginato. Una vez que se establece la infeccin por cepas mucoides, los pacientes se encuentran en la etapa terminal de la enfermedad. Esto se debe a que stas no pueden ser eliminadas por el sistema inmune y, hasta el momento, no existe un tratamiento efectivo contra las mismas.

P. aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con mltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresin de distintos genes en respuesta a cambios en el medio ambiente. Uno de estos sistemas regulatorios no responde directamente a las condiciones medio ambientales, sino a modificaciones en la poblacin bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresin gentica en funcin de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cundo se ha llegado a una masa crtica de bacterias por lo que se ha denominado sensor de qurum. El mecanismo mediante el cual se regula la expresin gentica en altas densidades celulares se basa en la produccin baja y constante por cada clula de un compuesto difusible, llamado autoinductor. Cuando el nmero de clulas llega a cierto umbral en el que la concentracin del autoinductor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez cambia el patrn de expresin gnica.

P. aeruginosa contiene ms de un sistema sensor de qurum y produce mltiples autoinductores.

Cuando P. aeruginosa se adhiere a una superficie, las clulas se diferencian para formar microcolonias cubiertas por una matriz extracelular que eventualmente llegan a constituir una pelcula. Las bacterias que forman biofilms tienen un metabolismo diferente al de las clulas que crecen en medios lquidos, una de las diferencias ms aparentes, es la sensibilidad disminuida a los antibiticos y a otros agentes txicos, incluyendo algunos elementos de la respuesta inmune. El anlisis microscpico de los pulmones de pacientes con fibrosis qustica muestra que, P. aeruginosa tambin se encuentra dentro de este tipo de estructuras.


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Acinetobacter baumannii ha sido causa, en los ltimos aos de brotes de infeccin nosocomial en numerosos hospitales, afectando fundamentalmente unidades de cuidados intensivos. El perfil tpico es el de pacientes con enfermedades crnicas de base que han sido tratadas previamente con antibiticos de amplio espectro, o bien han sido sometidos a tcnicas de intubacin orotraqueal. Aunque se lo asociado a infecciones a distintos niveles, como endocarditis, meningitis, bacteriemias, infecciones de heridas quirrgicas o urinarias, A. baumannii desempea un papel preponderante en las infecciones respiratorias, fundamentalmente neumonas, siendo responsable de una elevada morbi-mortalidad, as como de un significativo incremento del perodo de hospitalizacin de los enfermos.

Su verdadera importancia radica en la capacidad para adquirir rpidamente resistencia a antimicrobianos de amplio espectro y ser responsable de innumerables brotes de infecciones nosocomiales, fundamentalmente neumonas, en unidades de cuidados intensivos (UCI). El origen de los brotes se debe a la gran capacidad de este microorganismo de colonizar piel, vas respiratorias y tubo digestivo. Los pacientes procedentes de UCI constituyen un foco de propagacin de estos microorganismos en plantas mdicas y quirrgicas.

La dificultad para el control de las infecciones por A. baumannii radica en su gran capacidad para fijarse y sobrevivir durante largos perodos de tiempo en superficies secas. Se han aislado de respaldos de camas, mesas, aparatos de electrocardiograma, tomas de oxgeno e incluso almohadas, pero el mecanismo de transmisin ms importante son las manos del personal sanitario.

En los ltimos aos se ha observado un incremento importante en la prevalencia de Stenotrophomonas maltophilia en materiales clnicos. Este microorganismo es frecuentemente aislado como patgeno intrahospitalario, as como tambin en pacientes con fibrosis qustica, quemados, pacientes inmunosuprimidos o con SIDA. Aunque raramente se asocia con shock sptico, S. maltophilia generalmente produce bacteriemia persistente y est frecuentemente asociado a infecciones del tracto respiratorio o asociadas a catteres.

S. maltophilia ha sido aislado de un 10% de pacientes con fibrosis qustica en USA y de un 25% de pacientes en Europa. Los estudios epidemiolgicos sugieren que a diferencia de las infecciones del complejo Burkholderia cenocepacia y de Pseudomonas aeruginosa, el aislamiento de S. maltophilia en pacientes fibroqusticos no es de tan mal pronstico como el aislamiento de los anteriores, sin embargo, la mayor dificultad radica en la resistencia natural de este microorganismos a los -lactmicos y aminoglucsidos y el rpido desarrollo de resistencia a las fluoroquinolonas. El problema es similar para la erradicacin de S. maltophilia cuando se aisla de sitios normalmente estriles.

Burkholderia pseudomallei produce un cuadro clnico especfico llamado de melioidosis, es agente de bioterrorismo categora B y es endmico de ciertas zonas tropicales. La mayora de las infecciones por B. pseudomallei son asintomticas. La enfermedad sintomtica puede ser localizada o septicmica. El foco de infeccin incluye pulmn, piel y tracto genitourinario. Aunque la infeccin puede ocurrir en personas sanas, B. pseudomallei es un patgeno oportunista. Los factores de riesgo incluyen diabetes, falla renal crnica y alcoholismo entre otros.

Burkholderia pseudomallei es endmica del sudoeste asitico (Vietnam, Laos, Tailandia, Malasia), y el norte de Australia. Adems se han observado casos en el Pacfico Sur, India, Africa y en el Este Medio. En muchos de estos pases, Burkholderia pseudomallei es tan prevalente, que es un contaminante comn de los cultivos de laboratorio.

Adems, se han informado casos espordicos de melioidosis en Mxico, Panam, Ecuador, Hait, Per, Brasil y Guyana.

La ruta primaria de infeccin es la inoculacin, sin embargo, la infeccin podra ocurrir a travs de la inhalacin, aspiracin e ingestin. Los reservorios ambientales son el agua superficial y el suelo. El perodo medio de incubacin de melioidosis es de 9 das (rango: 1 - 21 das), aunque la reactivacin de la forma asintomtica previa puede ocurrir despus de meses o aos.

Se han informado dos accidentes de laboratorio de melioidosis; uno asociado con una exposicin masiva al aerosol y a la piel y el segundo como resultado de un aerosol creado durante la sonicacin a frasco abierto de un cultivo que se presume era B. cepacia. Las recomendaciones para B. pseudomallei, para todas las actividades en las que se utilizan fluidos, tejidos y cultivos corporales infecciosos o potencialmente infecciosos, se recomiendan las prcticas, el equipo de contencin y las instalaciones del Nivel de Bioseguridad 2.


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BIOSEGURIDAD

Es el conjunto de normas que estn diseadas para la proteccin del individuo, la comunidad y el medio ambiente del contacto accidental con agentes que son potencialmente nocivos.

Contencin

Mtodos seguros para el manejo de materiales infecciosos dentro del laboratorio donde son manipulados y/o conservados, previniendo impactos nocivos y asegurando que, el desarrollo o producto final de dichos procedimientos, no atenten contra la salud del personal.

Contencin primaria

Proteccin personal y del medio ambiente inmediato expuesto a agentes infecciosos, provista mediante el conocimiento de los principios de la bioseguridad

Universalidad: deben aplicarse todas las precauciones y normas del laboratorio ya que, todo microorganismo puede ser potencialmente patgeno.

Barreras: elementos que protegen al trabajador de la transmisin de infecciones.

Medidas de eliminacin: normas correctas de descarte de elementos de riesgo patolgico, protegiendo al personal y al medio ambiente.

Contencin secundaria

Proteccin del medio ambiente externo al laboratorio de la exposicin a materiales infecciosos, logrado a travs de la combinacin del diseo de la instalacin y prcticas operativas.

Medidas de Precaucin

Lavado de manos: es el medio ms importante de evitar la diseminacin de infecciones. El personal debe lavarse las manos antes de iniciar cualquier prctica de laboratorio, an si ha usado guantes, despus de atender a un paciente, de haber tocado excretas o secreciones, despus de sacarse los guantes y antes de salir del laboratorio. En el caso de tratar con microorganismos particularmente virulentos o epidemiolgicamente importantes, el lavado de manos debe hacerse con antispticos, adems de agua y jabn. Sin embargo, estos antispticos no deben usarse como sustituto de un adecuado lavado de manos sino como un complemento.

Guantes: en general hay tres razones distintas para usar guantes: 1. Reducen la posibilidad que el personal se infecte con microorganismos con los que va a trabajar. 2. Protegen las manos contra cualquier accidente que pueda producirse al manipular reactivos qumicos. 3. Reducen la posibilidad que el personal sea colonizado por microorganismos y luego transmita a otros pacientes, aunque este riesgo puede evitarse con un adecuado lavado de manos.

Respiradores: deben tener filtro y cubrir la boca y la nariz; en general se recomienda su uso para prevenir transmisin de infecciones a travs del aire. Los respiradores protegen al trabajador de la inhalacin de:

1. Aerosoles de partculas grandes (gotas), que se transmiten por contacto cercano. 2. Aerosoles de partculas pequeas (ncleo de gotas) que permanecen suspendidas en el aire y por lo

tanto, se desplazan a travs de distancias mayores. Tambin previenen la transmisin de ciertas infecciones que se diseminan por contacto directo con las membranas mucosas, el uso correcto de respiradores evita el contacto con boca y nariz, ya que, antes de ser retirado se debe proceder al lavado de manos.

3. Evita la inhalacin de aerosoles que pueden producirse por la manipulacin de microorganismos.

Batas, guardapolvos (vestimenta especial): se recomiendan para evitar mancharse la ropa y asegurar no transmitir posibles infecciones a la vestimenta de uso corriente. Usar vestimenta especial, limpia, recin lavada o descartable, de mangas largas. No se debe usar el guardapolvo fuera del laboratorio.

Calzado: debe ser ergonmico, cerrado e impermeable. Los mismos no deben usarse fuera del rea de trabajo, desinfectndose posteriormente mediante procedimientos adecuados.

Gafas de seguridad: deben proteger los ojos contra salpicaduras.


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Las ansas de platino deben terminar en un anillo completamente cerrado y la longitud del mango no pasar de 6 cm. Cuando el material infeccioso pueda salpicar al flamearlo en el mechero, se deber utilizar un microincinerador. Otra posibilidad es emplear asas descartables. Para manipular lquidos infecciosos usar pipetas automticas o neumticas, en ningn caso pipetear con la boca. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales de material infeccioso, deben ser notificadas inmediatamente al jefe del laboratorio y se proceder a su desinfeccin con los equipos destinados para tal fin. No comer, beber o fumar, no aplicar cosmticos o manipular lentes de contacto en lugares donde se pueda estar expuesto a sangre u otros materiales potencialmente infecciosos.

Nivel de Bioseguridad Grupo de riesgo Prctica Barreras Primarias

Barreras Secundarias

BSL1 GR1 No causan enfermedad en adultos sanos

Prcticas normales No se requieren Ventilacin

BSL2 GR2 Asociados con riesgo de enfermedad por auto-inoculacin, ingestin, exposicin de membranas mucosas

Descontaminacin de residuos. Supervisin mdica. Precaucin en manejo de instrumental

Equipos de proteccin personal. Contenedores adecuados para cada tipo de residuos

Autoclaves

BSL3 GR3 Agentes exticos con potencial transmisin por aerosoles. Riesgo de enfermedad con consecuencias serias o letales

Descontaminacin de todos los residuos. Descontaminacin del rea Descontaminacin de ropa previo su lavado

Equipos de proteccin personal. Proteccin espiratoria Proteccin para manipular objetos contaminantes

Ventilacin sin recirculacin Recintos con presin negativa

BSL4 GR4 Agentes exticos que implica alto riesgo de enfermedad y muerte, transmitido por aerosoles. Agente de riesgo de transmisin desconocido

Cambio de ropa y ducha al finalizar la prctica Descontaminacin de todo el material tras su uso

Todos los procedimientos de bioseguridad y equipos de proteccin personal para todo el cuerpo

Inyeccin de aire con presin positiva rea de intervencin aislada


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REVISIN DE LOS PRINCIPALES CAMBIOS TAXONMICOS

La divisin o phylum Proteobacteria se divide en cinco clases: Alfaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gamaproteobacteria, Deltaproteobacteria y Epsilonproteobacteria.

A excepcin del phylum Proteobacteria que no cumple con las reglas del Cdigo de Nomenclatura, todas las restantes fueron validadas en noviembre del 2005.

Estas clases se definieron en base a los estudios filogenticos de las secuencias del GEN 16S rARN. La clase Alfaproteobacteria incluye bacterias con secuencias del 16S rARN relacionadas con miembros del orden Caulobacterales, la clase Betaproteobacteria rene bacterias con 16S rARN relacionados con el orden Burkholderiales. De la misma manera, la clase Gamaproteobacteria est relacionada con microorganismos del orden Pseudomonadales, la clase Deltaproteobacteria con el orden Myxococcales y la clase Epsilonproteobacteria con el orden Campylobacterales.

El gnero Pseudomonas fue descripto por primera vez en 1894 y desde entonces ha estado sujeto a continuas revisiones y reclasificaciones.

En 1973, Palleroni y col. (Int. J. Syst. Bacteriol., 23: 333-339), definieron mediante hibridacin ADN-ADN, cinco grupos de homologa de rARN dentro del gnero Pseudomonas. Posteriormente y de manera progresiva, el gnero Pseudomonas se limit a las especies del grupo de homologa que comprenda la especie tipo del gnero: P. aeruginosa.

Las continuas revisiones del gnero promovi la creacin de nuevos gneros.

a. Las especies del grupo II de homologa rARN se clasifican actualmente en los gneros Burkholderia, Pandoraea, Ralstonia , Cupriavidus y Lautropia, cuya nica especie es L. mirabilis. Las especies que haban sido clasificadas dentro del gnero Ralstonia fueron reorganizadas en el ao 2004 por Vandamme y col. (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54: 2285-2289), en dos linajes genticos:

- Linaje Ralstonia eutropha: bacilos mviles que no oxidan glucosa, sensibles al colistin. Reclasificados al gnero Cupriavidus. C. gilardii, C. pauculus, C. respiraculi (aislados en humanos).

- Linaje Ralstonia pickettii: bacilos mviles, activos frente a los carbohidratos, resistentes al colistin. Mantenidos en el gnero Ralstonia. R. pickettii, R. mannitolytica, R. insidiosa (aislados en humanos)

b. Las especies del grupo III comprende en la actualidad los gneros Acidovorax, Comamonas y Delftia.

c. Las especies del grupo IV se reclasificaron en el gnero Brevundimonas.

d. La nica especie del grupo V ha sido inicialmente clasificada como Xanthomonas y actualmente reclasificada como Stenotrophomonas maltophilia.

e. El gnero Chryseomonas que inclua Chryseomonas luteola (Pseudomonas luteola) y el gnero Flavimonas (propuesto para reclasificar Pseudomonas oryzihabitans), son sinnimos heterotpicos de Pseudomonas por lo tanto, en la actualidad, se consideran estas especies como pertenecientes al gnero Pseudomonas.

Grupo de homologa

rARN Nomenclatura anterior Nomenclatura actual

I Pseudomonas Pseudomonas

II Pseudomonas Burkholderia, Ralstonia, Wautersia

III Pseudomonas Comamonas, Acidovorax, Delftia

IV Pseudomonas Brevundimonas

V Pseudomonas Stenotrophomonas


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El grupo de homologa rARN I que actualmente incluye la familia Pseudomonadaceae y el gnero Pseudomonas, puede clasificarse desde el punto de vista fenotpico en cuatro grupos:

a. Grupo fluorescente

b. Grupo stutzeri

c. Grupo alcaligenes

d. Grupo pigmentado amarillo

Grupo Especies Marcador fenotpico

Grupo fluorescente

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas putida

Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas veronii

Pseudomonas monteilii

Produccin de fluorescena

Grupo stutzeri

Pseudomonas stutzeri

Pseudomonas mendocina

CDC grupo Vb-3

Produccin de gas a partir de nitrato

Grupo alcaligenes

Pseudomonas alcaligenes

P. pseudoalcaligenes

Pseudomonas CDC grupo 1

Inactividad frente a los hidratos de carbono

Grupo pigmentado amarillo Pseudomonas luteola

Pseudomonas oryzihabitans Produccin de pigmento insoluble amarillo

1. El grupo de homologa II incluye a la familia Burkholderiaceae que comprende en la actualidad los gneros: Burkholderia, Lautropia, Pandoraea, Ralstonia, Cupriavidus.

2. El grupo de homologa III comprende los gneros Comamonas, Delftia y Acidovorax que pertenecen actualmente a la familia Comamonadaceae.

3. La familia Caulobacteraceae incluye el gnero Brevundimonas y corresponde al grupo de homologa IV.

4. En el grupo V, la familia Xanthomonadaceae incluye los gneros Stenotrophomonas y Xanthomonas.

En el ao 1997, se describi la especie Stenotrophomonas africana como un patgeno oportunista en humanos (Drancourt y col. (Int. J. Syst. Bacteriol., 47: 160-163). Sin embargo, en el 2004, Coenye y col (Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 54: 1235-1237) demostraron que S. africana es un sinnimo de S. maltophilia. Por lo tanto, hasta el momento, la nica especie con significacin clnica de la familia Xanthomonadaceae, sigue siendo S. maltophilia

Con respecto al resto de los gneros de importancia clnica incluidos en este manual, son un grupo muy heterogneo de microorganismo que comparten el rasgo fenotpico de no fermentar la glucosa y desarrollar mejor en condiciones aerbicas que en anaerobiosis, de hecho, muchas cepas no desarrollan en ausencia de oxgeno.

El gnero Acinetobacter fue considerado como un representante de la familia Neisseriaceae durante muchos aos. Actualmente, pertenece a la familia Moraxellaceae que adems comprende los gneros Moraxella y Psychrobacter. Estudios de hibridacin ADN-ADN han definido 25 genoespecies dentro de este gnero. Slo 10 especies han sido nombradas, y slo se han descrito pruebas fenotpicas diferenciales para 19 genoespecies. Debido a la dificultad que representa la identificacin de los miembros de este gnero en los laboratorios de microbiologa clnica, se propone una clasificacin meramente pragmtica en este manual, considerando que la mayora de las cepas que oxidan glucosa y no producen beta hemlisis corresponden a A. baumannii.


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La mayora de los aislamientos inertes frente a la glucosa y no hemolticos son A. lwoffii y la mayora de las cepas hemolticas A. haemolyticus.

En 1986, se demostr por medio de estudios genotpicos (hibridacin ARNr-ADN) y fenotpicos (auxonogramas), que los gneros Bordetella y Alcaligenes estn filogenticamente relacionados, por lo tanto se defini una nueva familia para agruparlos, la familia Alcaligenaceae. Posteriormente, la comparacin de las secuencias del 16S ARNr permiti consolidar la validez de esta familia que comprende adems, los siguientes gneros de importancia clnica: Achromobacter, Advenella, Kerstersia y Oligella.

La clasificacin del gnero Flavobacterium en la primera edicin del Manual Bergeys, se basaba en criterios fenotpicos que ya no son utilizados en taxonoma. Por lo tanto, este gnero ha sufrido numerosas reorganizaciones durante los ltimos aos.

1. En 1994, Flavobacterium balustinum, Flavobacterium gleum, Flavobacterium indologenes, Flavobacterium indoltheticum, Flavobacterium meningosepticum y Flavobacterium scophthalmum se clasificaron dentro de un nuevo gnero: Chryseobacterium, siendo C. gleum la especie tipo.

2. En el 2005, se demostr que Chryseobacterium meningosepticum representaba un taxn genticamente distinto y se cre un nuevo gnero Elizabethkingia.

3. Flavobacterium breve fue reclasificado como Empedobacter brevis, Flavobacterium odoratum como Myroides odoratus / odoratimimus y Weeksella zoohelcum fue reclasificada como Bergeyella zoohelcum, por lo tanto Weeksella virosa permanece como la nica especie dentro del gnero Weeksella.

4. En la actualidad, la familia Flavobacteriaceae est constituida por los siguientes gneros de importancia clnica: Bergeyella, Capnocytophaga, Chryseobacterium, Elizabethkingia, Empedobacter, Flavobacterium, Myroides y Weeksella.

El resto de los BGNNF de importancia clnica pertenecen a las siguientes familias:

FAMILIA GNEROS Y ESPECIES

Alteromonadaceae

Shewanella putrefaciens

Shewanella algae

Alishewanella fetalis

Halomonadaceae Halomonas vetusta

Methylobacteriaceae Methylobacterium spp.

Roseomonas spp.

Rhizobiaceae Rhizobium

Brucellaceae Brucella spp.

Ochrobactrum spp.

Sphingobacteriaceae Sphingobacterium

Pedobacter


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CAMBIOS RECIENTES DE LA NOMENCLATURA

NOMENCLATURA ACTUAL NOMENCLATURA/S ANTERIORES REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Acinetobacter beijerinckii Especie nueva NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 118-124.

Acinetobacter berenziniae Especie genmica 10 NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 896-903.

Acinetobacter guillouiae Especie genmica 11 NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 896-903.

Acinetobacter gyllenbergii Especie nueva NEMEC (A.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 118-124.

Achromobacter denitrificans

Alcaligenes xylosoxidans subespecie denitrificans

Alcaligenes denitrificans subespecie denitrificans

YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.]

Achromobacter insolitus Especie nueva COENYE (T.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1819-1824.

Achromobacter piechaudii Alcaligenes piechaudii YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.]

Achromobacter spanius Especie nueva COENYE (T.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1819-1824.

Achromobacter xylosoxidans subespecie xylosoxidans

Alcaligenes xylosoxidans subespecie xylosoxidans

Alcaligenes denitrificans subespecie xylosoxidans

YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1998, 42: 429-438.]

Acidovorax delafieldii Pseudomonas delafieldii WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398.

Acidovorax facilis Pseudomonas facillis WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398.

Acidovorax temperans Especie nueva WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1990, 40: 384-398.

Advenella incenata Gnero y especie nuevos COENYE (T) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 251-256


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Alishewanella fetalis Gnero y especie nuevos

FONNESBECH VOGEL (B.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1133-1142

Alkanindiges hongkongensis Gnero y especie nuevo WOO (PC) y col. Sist. Appl. Microbiol. 2005, 28: 316-322

Aun no validado

Balneatrix alpica Gnero y especie nuevos [DAUGA (C.) y col. Res. Microbiol., 1993, 144: 35-46.

VALIDATION LIST N 46. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 624-625.

Bergeyella zoohelcum Weeksella zoohelcum VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831.

Brevundimonas diminuta Pseudomonas diminuta SEGERS (P.) y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 499-510.

Brevundimonas vesicularis Pseudomonas vesicularis SEGERS (P.) y col., Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 499-510.

Bordetella petrii Especie nueva

Von WINTZINGERODE (f) y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 1257-1265.

Burkholderia ambifaria Burkholderia cepacia genomoespecie VII

COENYE (T.) y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 1481-1490.

Burkholderia anthina Burkholderia cepacia genomoespecie VIII

[VANDAMME (P.) y col. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2002, 33: 143-149.]

VALIDATION LIST N 87. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1437-1438

Burkholderia arboris VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590

Burkholderia cenocepacia Burkholderia cepacia genomoespecie III [VANDAMME (P.) y col. Res. Microbiol., 2003, 154: 91-96.]


Burkholderia cepacia Pseudomonas cepacia YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.]


Burkholderia contaminans VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 102-111.

Burkholderia diffusa VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590


11


Burkholderia dolosa Burkholderia cepacia genomoespecie VI

VERMIS (K.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 689-691

Burkholderia gladioli Pseudomonas gladioli [YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.]

VALIDATION LIST N 45. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 398-399

Burkholderia lata VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 102-111.

Burkholderia latens VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590

Burkholderia mallei Pseudomonas mallei [YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.]


Burkholderia metallica VANLAERE ( y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590

Burkholderia multivorans Burkholderia cepacia genomoespecie II

VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 1188-1200.

Burkholderia pseudomallei Pseudomonas mallei [YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1992, 36: 1251-1275.]


Burkholderia pyrrocinia Pseudomonas pyrrocinia [STORMS (V.) y col. Syst. Appl. Microbiol., 2004, 27: 517-526.]

Burkholderia stabilis Burkholderia cepacia genomoespecie IV

[VANDAMME (P.) y col. J. Clin. Microbiol., 2000, 38: 1042-1047.]


Burkholderia seminalis VANLAERE (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2008, 58: 1580-1590

Burkholderia ubonensis YABUUCHI (E) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 1415-1417.


Burkholderia vietnamiensis Burkholderia cepacia genomoespecie V GILLIS (M.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1995, 45: 274-289.

Chryseobacterium anthrophi

KAMPFER (P) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2009, 59: 2421-2428.

Chryseobacterium gleum Flavobacterium gleum VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831


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Chryseobacterium hominis CDC grupo llh y llc VANEECHOUTTE (M) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2007, 57: 2623-2628.

Chryseobacterium indologenes Flavobacterium indologenes VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831

Chryseobacterium treverense

YASSIN y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2010, 60: 1993-1998

Comamonas terrigena Pseudomonas terrigena DE VOS (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1985, 35: 443-453

Comamonas testosteroni Pseudomonas testosteroni WILLEMS (A.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1991, 41: 427-444

Cupriavidus gilardii (1) Ralstonia gilardii

Wautersia gilardii

VANDAMME (P.) y col., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289

Cupriavidus pauculus (1) CDC IV C-2

Ralstonia paucula

Wautersia paucula

VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289

Cupriavidus respiraculi (1) Ralstonia respiraculi

Wautersia respiraculi

VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289

Delftia acidovorans Pseudomonas acidovorans

Comamonas acidovorans

TAMAOKA (J.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37: 52-59.

Elizabethkingia meningoseptica Flavobacterium meningosepticum

Chryseobacterium meningosepticum

KIM (K.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 1287-1293.

Empedobacter brevis Flavobacterium brevis VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44: 827-831

Halomonas venusta Alcaligenes venustus DOBSON (S.J.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 550-558

Herbaspirillum especie 3 CDC grupo EF-1 BALDANI (J.I.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 802-810

Inquilinus limosus Gnero y especie nuevos COENYE (T.) y col. J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2062-2069

VALIDATION LIST N 87. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1437-1438.


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Kerstersia gyiorum Gnero y Especie nuevos COENYE (T) y col .Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1825

Laribacter hongkongensis Gnero y especie nuevos [YUEN (K.Y.) y col. J. Clin. Microbiol., 2001, 39: 4227-4232.]


Lautropia mirabilis Gnero y especie nuevos GERNER-SMIDT (P.) y col. Microbiology, 1994, 140: 1787-1797


Massilia timonae Gnero y especie nuevos LA SCOLA (B.) y col. J. Clin. Microbiol., 1998, 36: 2847-2852

VALIDATION LIST N 73. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50: 423424

Myroides odoratus Flavobacterium odoratum VANCANNEYT (M.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 926-932.

Neisseria animaloris CDC grupo EF 4a VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1801-1805

Neisseria bacilliformis Especie nueva HAN (X Y), J. Clin. Microbiol. 2006, 44: 474 - 479

VALIDATION LIST N 110. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 14591460

Neisseria zoodegmatis CDC grupo EF 4b VANDAMME (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1801-1805

Ochrobactrum anthropi CDC grupo Vd HOLMES (B.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38: 406-416.

Paracoccus yeei CDC grupo EO-2 [DANESHVAR (M.I.) y col. J. Clin. Microbiol., 2003, 41: 1289-1294.]

VALIDATION LIST N 92. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 935-937.

Pseudochobactrum asacharolyticum Gnero y especie nueva KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1823-1829.

Pseudochobactrum sacharolyticum Gnero y especie nueva KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 1823-1829.

Pseudomonas luteola Pseudomonas luteola

Chryseomonas luteola

ANZAI (Y.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 249-251

Pseudomonas oryzihabitans Pseudomonas oryzihabitans

Flavimonas oryzihabitans

ANZAI (Y.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1997, 47: 249-251

Psychrobacter phenylpyruvicus Moraxella phenylpyruvica BOWMAN (J.P.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 841-848


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Ralstonia insidiosa Genero y especie nueva

COENYE (T) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1075-1080. VANEECHOUTTE (M.), y col.. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 317-327.

Ralstonia mannitolytica Ralstonia pickettii biovar 3 thomasi DE BAERE (T.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001, 51: 547-558

Ralstonia pickettii Pseudomonas pickettii

Burkholderia pickettii

[YABUUCHI (E) y col. Microbiol. Immunol., 1995, 39: 897-904.]


Rhizobium radiobacter Agrobacterium radiobacter Incluye tambin

Agrobacterium tumefaciens

YOUNG (J.M.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2001, 51: 89-103

Shewanella putrefaciens Pseudomonas putrefaciens MACDONELL (M.T.) y col. Syst. Appl. Microbiol., 1985, 6: 171-182


Sphingobacterium mizutaii Flavobacterium mizutaii HOLMES (B.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1988, 38: 348-353

Sphingobacterium multivorum Flavobacterium multivorum YABUUCHI (E.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33: 580-598

Sphingobacterium spiritivorum Flavobacterium spiritivorum YABUUCHI (E.) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33: 580-598


Sphingobacterium thalpophilum Flavobacterium thalpophilum TAKEUCHI (M.) y col. J. Gen. Appl. Microbiol., 1992, 38:465-482

VALIDATION LIST N 47. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 864-865

Sphingomonas paucimobilis Pseudomonas paucimobilis YABUUCHI (E.) y col. Microbiol. Immunol. 1990, 34: 99-119


Stenotrophomonas maltophilia Pseudomonas maltophilia

Xanthomonas maltophilia

PALLERONI (NJ) y col. Int. J. Syst. Bacteriol., 1993, 43: 606-609

Wautersiella falsenii Gnero y especie nuevos KMPFER (P.) y col. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56: 2323-2329.

Weeksella virosa CDC grupo IIf HOLMES (B.) y col. Syst. Appl. Microbiol., 1986, 8: 185-190

VALIDATION LIST N 23. Int. J. Syst. Bacteriol., 1987, 37:179-180

(1) Segn Vandamme y Coenye (Taxonomy of the genus Cupriavidus: a tale of lost and found. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 2285-2289), el gnero Cupriavidus es un sinnimo del gnero Wautersia y ha sido descripto con anterioridad por lo tanto, de acuerdo a la normativa taxonmica, todas las cepas del gnero Wautersia, deberan ser reclasificadas como Cupriavidus


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UBICACIN TAXONMICA DE LOS GNEROS DE IMPORTANCIA MEDICA

Divisin "Bacteroidetes" Clase Flavobacteria

Orden "Flavobacteriales" Familia Flavobacteriaceae

Gnero Aequorivita - Algibacter - Aquimarina - Arenibacter - Bergeyella - Bizionia Capnocytophaga - Cellulophaga - Chryseobacterium - Cloacibacterium - Coenonia Costertonia - Croceibacter - Dokdonia - Donghaeana - Elizabethkingia - Empedobacter Epilithonimonas - Flaviramulus - Flavobacterium - Formosa - Gaetbulibacter Gaetbulimicrobium - Gelidibacter - Gillisia - Gilvibacter - Gramella - Kaistella - Kordia Krokinobacter - Lacinutrix - Leeuwenhoekiella - Lutibacter - Maribacter - Mariniflexile Marixanthomonas - Mesonia - Muricauda - Myroides - Nonlabens - Olleya Ornithobacterium - Persicivirga - Pibocella - Polaribacter - Psychroflexus Psychroserpens - Riemerella - Robiginitalea - Salegentibacter - Sandarakinotalea Sediminibacter - Sediminicola - Sejongia - Stanierella - Stenothermobacter Subsaxibacter - Subsaximicrobium - Tenacibaculum - Ulvibacter - Vitellibacter Wautersiella - Weeksella - Winogradskyella - Yeosuana - Zhouia

Clase "Sphingobacteria" Orden "Sphingobacteriales"

Familia Sphingobacteriaceae Gnero Olivibacter - Pedobacter - Sphingobacterium

Divisin "Proteobacteria" Clase Alfaproteobacteria

Orden Caulobacterales Familia Caulobacteraceae

Gnero Asticcacaulis - Brevundimonas - Caulobacter - Phenylobacterium

Orden Rhizobiales Familia Bartonellaceae

Gnero Bartonella - Grahamella - Rochalimaea Familia Brucellaceae

Gnero Brucella - Crabtreella - Mycoplana - Ochrobactrum - Pseudochrobactrum Famla Methylobacteriaceae

Gnero Meganema - Methylobacterium - Microvirga - Protomonas Familia Rhizobiaceae

Gnero Agrobacterium - Allorhizobium - Carbophilus - Chelatobacter - Ensifer - Kaistia Rhizobium - Sinorhizobium

Orden Rhodobacterales Familia Rhodobacteraceae

Gnero Ahrensia - Albidovulum - Amaricoccus - Antarctobacter - Catellibacterium Citreicella - Citreimonas - Dinoroseobacter - Donghicola - Gemmobacter Jannaschia - Ketogulonicigenium - Leisingera - Loktanella - Maribius - Marinovum Methylarcula - Nereida - Nesiotobacter - Oceanibulbus - Oceanicola Octadecabacter - Palleronia - Pannonibacter - Paracoccus - Pelagibaca Phaeobacter - Pseudovibrio - Rhodobaca - Rhodobacter - Rhodothalassium Rhodovulum - Roseibacterium - Roseibium - Roseicyclus - Roseinatronobacter Roseisalinus - Roseivivax - Roseobacter - Roseovarius - Rubellimicrobium Rubrimonas - Ruegeria - Sagittula - Salipiger - Shimia - Silicibacter - Staleya Stappia - Sulfitobacter - Thalassobacter - Thalassobius - Thioclava - Thiosphaera Woodsholea - Yangia

Orden Rhodospirillales Familia Rhodospirillaceae

Gnero Azospirillum - Conglomeromonas - Defluviicoccus - Inquilinus - Magnetospirillum Phaeospirillum - Rhodocista - Rhodospira - Rhodospirillum - Rhodovibrio Roseospira - Skermanella - Thalassospira - Tistrella

Orden Sphingomonadales Familia Sphingomonadaceae

Gnero Blastomonas - Erythromonas - Novosphingobium - Rhizomonas (nombre rechazado) Sandaracinobacter - Sandarakinorhabdus - Sphingobium - Sphingomonas Sphingopyxis - Sphingosinicella - Zymomonas


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Clase Betaproteobacteria Orden Burkholderiales

Familia Alcaligenaceae Gnero Achromobacter - Advenella - Alcaligenes - Azohydromonas - Bordetella

Brackiella - Castellaniella - Derxia - Kerstersia - Oligella - Pelistega Pigmentiphaga - Pusillimonas - Sutterella - Taylorella - Tetrathiobacter

Familia Burkholderiaceae Gnero Burkholderia - Chitinimonas - Cupriavidus - Lautropia - Limnobacter - Pandoraea

Paucimonas - Polynucleobacter - Ralstonia - Thermothrix - Wautersia Familia Comamonadaceae

Gnero Acidovorax - Alicycliphilus - Brachymonas - Caenibacterium - Caldimonas Comamonas - Curvibacter - Delftia - Diaphorobacter - Giesbergeria Hydrogenophaga - Hylemonella - Lampropedia - Macromonas - Malikia - Ottowia Pelomonas - Polaromonas - Ramlibacter - Rhodoferax - Schlegelella - Simplicispira Variovorax - Xenophilus

Familia Oxalobacteraceae Gnero Collimonas - Duganella - Herbaspirillum - Herminiimonas - Janthinobacterium

Massilia - Naxibacter - Oxalicibacterium - Oxalobacter - Telluria

Orden Neisseriales Familia Neisseriaceae

Gnero Alysiella - Aquaspirillum - Aquitalea - Bergeriella - Chitinibacter Chromobacterium - Conchiformibius - Deefgea - Eikenella - Formivibrio Iodobacter - Kingella - Laribacter - Microvirgula - Morococcus - Neisseria Prolinoborus - Silvimonas - Simonsiella - Uruburuella - Vitreoscilla - Vogesella

Clase Gamaproteobacteria Orden Alteromonadales

Familia Alteromonadaceae Gnero Aestuariibacter - Agarivorans - Alishewanella - Alteromonas - Glaciecola

Marinimicrobium - Marinobacter - Marinobacterium - Microbulbifer Saccharophagus - Salinimonas

Familia Shewanellaceae Gnero Shewanella

Orden Oceanospirillales Familia Halomonadaceae

Gnero Carnimonas - Chromohalobacter - Cobetia - Deleya - Halomonas - Halovibrio Salicola - Volcaniella - Zymobacter

Familia Oceanospirillaceae Gnero Balneatrix - Marinomonas - Marinospirillum - Neptunomonas - Nitrincola

Oceanobacter - Oceanospirillum - Oleispira - Pseudospirillum - Reinekea Thalassolituus

Orden Pseudomonadales Familia Moraxellaceae

Gnero Acinetobacter - Alkanindiges - Branhamella - Enhydrobacter - Moraxella Psychrobacter

Familia Pseudomonadaceae Gnero Azomonas - Azomonotrichon - Azorhizophilus Azotobacter - Cellvibrio

Chryseomonas - Flavimonas - Mesophilobacter - Pseudomonas - Rhizobacter Rugamonas - Serpens

Orden Xanthomonadales Familia Xanthomonadaceae

Gnero Aquimonas - Dokdonella - Dyella - Frateuria - Fulvimonas - Hydrocarboniphaga Ignatzschineria - Luteibacter - Luteimonas - Lysobacter - Nevskia Pseudoxanthomonas - Rhodanobacter - Silanimonas - Stenotrophomonas Thermomonas - Xanthomonas - Xylella

MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo PPrroottooccoollooss ddee pprreeppaarraacciinn


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MEDIOS DE CULTIVO Y PROTOCOLOS DE PREPARACIN cido sulfhdrico. Produccin en acetato de plomo a) Siembra en medios lquidos de cultivo Fundamentos de la prueba: Algunos microorganismos producen la enzima cistenasa que es capaz de liberar cido sulfhdrico a partir del azufre del aminocido cistena. Para la determinacin de cido sulfhdrico se pueden utilizar medios de cultivo ricos en aminocidos que contengan azufre, tales como el caldo nutritivo o el caldo tripticasa de soja, entre otros. El cido sulfhdrico puede evidenciarse en medios lquidos o slidos con la utilizacin de tiras impregnadas en acetato de plomo. El sulfhdrico reacciona con el plomo y se observa ennegrecimiento en la tira de papel. Este mtodo posee alta sensibilidad y detecta trazas de sulfhdrico que no pueden ser detectadas en el medio TSI.

Ingredientes: (Caldo tripticasa de soja) Peptona tripticasa....................................................... 5.0 g Peptona de soja ......................................................... 3.0 g Cloruro de sodio......................................................... 5.0 g Fosfato de potasio...................................................... 2.5 g Glucosa ...................................................................... 2.5 g Agua destilada .........................................................1000 ml

Preparacin del medio: Mezclar los ingredientes y calentar hasta fundir el agar. Ajustar pH 7.3. Distribuir 4-5 ml en tubos con tapa a rosca. Autoclavar 121 C durante 15 minutos.

Reactivo: Se utiliza solucin acuosa de acetato de plomo Pb(CH3C00)2x3H20 saturada y caliente

Preparacin de las tiras: Cortar papel de filtro en tiras de aproximadamente 12 mm de ancho y 24 mm de largo. Sumergir las tiras en solucin de acetato de plomo caliente. Colocar las tiras, con pinzas, en placa de Petri de vidrio o en frasco de boca ancha con tapa a rosca. Dejar secar al aire o en estufa a 50 60 C. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Dejar enfriar y secar. Las tiras no utilizadas deben volverse a esterilizar cada tres semanas. Existen tiras comerciales.

Realizacin de la prueba: Sembrar los tubos de medio con un inculo denso del microorganismo. Suspender una tira de acetato de plomo estril por encima del nivel del caldo, de modo que quede sujeta por la tapa del tubo.

Lectura e interpretacin: Incubar a 35 C durante 12 horas a 6 das Reaccin positiva: la tira presenta coloracin negro-pardusca (puede tener cierto brillo) Reaccin negativa: la tira de papel no produce alteraciones ni coloraciones. Se puede producir un resultado positivo dentro de las 12 primeras horas. Algunas veces es necesaria una incubacin prolongada y antes de dar un resultado negativo deben transcurrir unos 7das, con lectura diaria y sin cambiar de tira

b) Siembra en medios de cultivo slidos Se utilizan medios que contengan aminocidos sulfurados. Los medios pueden estar preparados en tubo como el agar Kliger o el agar triple azcar hierro (TSI) o en placa como el agar sulfito de bismuto y el agar SS. El fundamento es el mismo en todos los casos, varan los indicadores del SH2. La descripcin de estos medios y la interpretacin de los resultados se describen en sus apartados correspondientes.

Agar almidn Fundamentos de la prueba: Este medio evala la capacidad de un microorganismo de hidrolizar almidn por accin enzimtica. Se utilizan placas con medio de cultivo que contiene almidn al 0,1%. Se utiliza como revelador lugol (solucin de yodo utilizada en la coloracin de Gram)

Ingredientes: Agar nutritivo (Triptena soya) .................................... 23.0 g Almidn de papa ........................................................ 10.0 g Agua destilada........................................................... 1000 ml

Preparacin del medio: Solucin A: en 500 ml de agua destilada disolver el agar por calentamiento Solucin B: disolver el almidn en 250 ml de agua destilada. Enfriar la solucin A a 60 C. Mezclar la solucin A y la solucin B y completar con el agua destilada restante. Ajustar pH a 7.2 7.5. Fraccionar en volmenes adecuados para plaquear. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Plaquear.

Realizacin de la prueba: Inocular la superficie del medio en spot o en lnea con la cepa a estudiar. Pueden ser probadas varias cepas en una placa. Incubar a 35 C durante 48 horas.

Lectura e interpretacin: Inundar la placa con lugol. La placa vira al color azul por la reaccin del lugol con el almidn. Una zona clara alrededor de la siembra indica que el microorganismo ha hidrolizado el almidn. Reaccin positiva: zona clara alrededor del cultivo

Control de calidad: Control positivo: Bacillus cereus ATCC 11778 Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853


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Agar Mac Conkey Fundamentos de la prueba: Este medio evala la capacidad de un microorganismo de desarrollar en concentraciones moderadas de sales biliares. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben considerablemente la flora gram positiva. La lactosa junto con el indicador de pH rojo neutro, sirven para la comprobacin de la degradacin de dicho azcar.

Ingredientes: Peptona.................................................................... 17.0 g Proteosa peptona....................................................... 3.0 g Lactosa..................................................................... 10.0 g Sales biliares N 3 ...................................................... 1.5 g Cloruro de sodio......................................................... 5.0 g Agar...........................................................................13.5 g Rojo neutro.................................................................0.03 g Cristal violeta............................................................0.001 g Agua destilada...........................................................1000 ml

Preparacin del medio: Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin. Ajustar el pH a 7.1. Fraccionar en volmenes apropiados para el preparado de placas. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Plaquear o conservar el medio a 4 C hasta su uso.

Realizacin de la prueba: Sembrar la placa con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C.

Lectura e interpretacin: Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa positiva son rojas con un halo turbio debido al descenso de pH provocado por los cidos biliares.

Control de calidad: Escherichia coli ATCC 25922 Color de las colonias y del medio: rojo Precipitado: positivo Salmonella typhimurium ATCC 13311 Color de las colonias: incoloro Color del medio: amarillo Precipitado: negativo

Agar SS

Fundamentos de la prueba: Este medio fue diseado para el aislamiento selectivo de Salmonella y Shigella. El verde brillante, la bilis de buey, la elevada concentracin de tiosulfato y citrato inhiben considerablemente muchos microorganismos. Con el tiosulfato y los iones de hierro se evidencia la formacin de sulfuro por el ennegrecimiento de las correspondientes colonias. La lactosa junto con el indicador de pH rojo neutro, sirven para la comprobacin de la degradacin de dicho azcar.

Ingredientes: Extracto de carne ....................................................... 5.0 g Proteosa peptona....................................................... 5.0 g Lactosa......................................................................10.0 g Sales biliares N 3 ...................................................... 8.5 g Citrato de sodio .......................................................... 8.5 g Tiosulfato de sodio ......................................................8.5 g Agar...........................................................................13.5 g Verde brillante .......................................................0.0003 g Rojo neutro..............................................................0.025 g Agua destilada..........................................................1000 ml

Preparacin del medio: Mezclar los ingredientes y calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.0. Fraccionar en volmenes apropiados para el preparado de placas. No esterilizar en autoclave. Plaquear o conservar el medio a 4 C hasta su uso.

Realizacin de la prueba: Sembrar la placa con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C

Lectura e interpretacin: Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Las colonias de microorganismos lactosa negativas son incoloras y las lactosa positiva son rosadas a rojas. Las colonias de microorganismos formadores de cido sulfhdrico presentan un centro negro.

Control de calidad: Escherichia coli ATCC 25922 Color de las colonias: rojo Centro negro de las colonias: negativo Viraje del medio: rojo / rosa + precipitado Salmonella typhimurium ATCC 13311 Color de las colonias: incoloras Centro negro de las colonias: positivo Viraje del medio: amarillo


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Cetrimide agar

Fundamentos de la prueba: Es un medio selectivo que contiene cetrimide, una sal de amonio cuaternaria (bromuro de hexadecil-trimetil-amonio), que acta como detergente catinico. Provoca la liberacin de nitrgeno y fsforo de clulas bacterianas inhibiendo el desarrollo de algunos organismos. Pseudomonas aeruginosa y algunos otros BGNNF pueden desarrollar en este medio.

Ingredientes: Peptona.....................................................................20.0 g Cloruro de magnesio .................................................. 1.4 g Sulfato de potasio......................................................10.0 g Cetrimide..................................................................... 0.3 g Agar...........................................................................13.6 g Glicerol ......................................................................10.0 ml Agua destilada.......................................................... 1000 ml

Preparacin del medio: Mezclar los ingredientes (sin agregar el glicerol) y calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.2. Agregar el glicerol una vez fundidos los ingredientes. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca, 3 4 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta.

Realizacin de la prueba: Inocular la estra con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C hasta 7 das.

Lectura e interpretacin: Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. Reaccin positiva: se observa desarrollo Reaccin negativa: no se observa desarrollo

Control de calidad: Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Citrato de Simmons agar

Fundamentos de la prueba: Las pruebas de asimilacin son indispensables para la identificacin a nivel de especie.

Ingredientes: Sulfato de magnesio..................................................... 0.2 g Fosfato cido de potasio .............................................. 1.0 g Fosfato dicido de amonio ........................................... 1.0 g Citrato de sodio ............................................................ 2.0 g Cloruro de sodio........................................................... 5.0 g Agar............................................................................. 15.0 g Azul de bromotimol...................................................... 0.08 g Agua destilada............................................................ 1000 ml

Preparacin del medio: Calentar los ingredientes hasta disolucin. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca, 3 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta.

Realizacin de la prueba: Inocular la estra con un cultivo de 18 24 horas. Incubar a 35 C hasta 7 das.

Lectura e interpretacin: Efectuar lectura luego de 18 24 horas de incubacin. La degradacin del citrato por los microorganismos da lugar a la alcalinizacin del medio de cultivo, lo que se manifiesta por un viraje a azul oscuro del indicador de pH azul de bromotimol. Reaccin positiva: medio azul (alcalinizado) Reaccin negativa: medio verde (sin cambio)

Control de calidad: Control positivo: Enterobacter cloacae ATCC 13047 Control negativo: Escherichia coli ATCC 25922

Coloracin de flagelos Limpieza del material: Limpiar los portaobjetos con detergente y esponja. Si los portaobjetos tienen bordes esmerilados, colocar en solucin sulfocrmica durante 2 das y lavar con abundante agua corriente; luego con agua destilada. Enjuagar los portaobjetos dos veces con alcohol y secar a la llama. Guardar. Antes de usar flamear en llama azul.

Preparacin de reactivos: SOLUCION A = Fucsina bsica 1.2 g / Etanol 95 C 100 ml SOLUCION B = Acido tnico 1.5 g / Cloruro de sodio 0.75 g / Agua destilada 100 ml

Preparacin de extendidos: Se parte de un cultivo en caldo triptena soya o caldo para flagelos, incubado a 35 C durante 24 horas. Agregar a 1 ml de cultivo, 0.05 ml de solucin de formaldehdo 37% y dejar 15 a 20 minutos. Realizar dos lavados con agua destilada. Centrifugar 10 minutos a 1600 g. Hacer con el sedimento una suspensin dbilmente opalescente. El extendido se hace sobre una superficie 20 x 30 mm, calculando que el volumen de colorante es de aproximadamente 0.004 ml. Secar el preparado a temperatura ambiente o en estufa de 35 C. Agregar el colorante y esperar 10 minutos. Se debe formar una pelcula uniforme sobre todo el extendido. Calcular el tiempo de coloracin para cada lote, cada vez que se utilice. En caso que la coloracin no resulte, repetir incubando el caldo a temperatura ambiente.


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Coloracin de flagelos (adaptado de Kodaka y col. J. Clin. Microbiol, 1982, 16: 948-952)

Preparacin de reactivos: SOLUCION A = Fenol (5%) 10.0 ml / Acido tnico 2.0 g Sulfato de aluminio y potasio (SC. saturada) 10.0 ml SOLUCION B = Cristal violeta 12.0 g / Etanol 100 ml Mezclar 10 volmenes de la solucin A con 1 volumen de la solucin B. Esta mezcla debe ser usada despus de 2 o 3 das. No filtrar, solo centrifugar o agitar. Se puede guardar a temperatura ambiente hasta un ao.

Realizacin de la prueba: A partir de un cultivo fresco, realizar una suspensin con turbidez menor al patrn 0.5 de la escala de Mac Farland en una solucin 30% de etanol en agua corriente. Flamear un cubreobjeto y colocar una gota de la suspensin bacteriana. La gota se disemina espontneamente y se deja secar. Este preparado se cubre con la mezcla colorante por 1 a 4 minutos, se lava con agua corriente y se deja secar en estufa de 30-35 C. El cubre se coloca sobre un portaobjeto con la cara coloreada hacia arriba. Observar al microscopio con el aumento 100X.

Decarboxilacin. Mtodo MOELLER

Fundamentos de la prueba: Las decarboxilasas son un grupo de enzimas capaces de actuar sobre los grupos carboxilo de los aminocidos, con formacin de aminas de reaccin alcalina. Cada decarboxilasa es especfica para un aminocido. Lisina, ornitina y arginina son los tres aminocidos habitualmente ensayados y producen cadeverina, putrescina y citrulina respectivamente.

Ingredientes: Peptona (Orthana) (Thiotone) ...................................... 5.0 g Extracto de carne ......................................................... 5.0 g Prpura de bromocresol..............................................0.01 g Rojo cresol ................................................................0.005 g Glucosa ........................................................................ 0.5 g Piridoxal ....................................................................0.005 g Agua destilada .......................................................... 1000 ml

Preparacin del medio: Calentar suavemente hasta disolucin si es necesario. Ajustar el pH a 6.0. Dividir el medio base en cuatro porciones iguales. Porcin 1: Agregar L-Arginina monoclorhidrato concentracin final 1% (A) Porcin 2: Agregar L-Lisina diclorhidrato concentracin final 1% (L) Porcin 3: Agregar L_Ornitina diclorhidrato concentracin final 1%(O) Porcin 4: sin agregado de aminocido (control de desarrollo C) Si se usan aminocidos D-L, la concentracin se duplica. El pH de la fraccin con ornitina se reajusta antes de la esterilizacin. Fraccionar en tubos 13/100 tapa rosca aproximadamente 2 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 10 minutos.

Realizacin de la prueba: Para microorganismos no fermentadores deben prepararse suspensiones muy densas de cultivos jvenes (no ms de 18 a 24 horas de incubacin). Despus de sembrados los tubos, agregar una capa de vaselina estril de 4 5 mm de espesor. Inocular los tubos por puncin a partir de cultivo de 24 horas. Incubar a 35 C durante 7 a 10 das, si fuera necesario.

Lectura e interpretacin: En ausencia de la enzima decarboxilasa se produce viraje del indicador al amarillo por fermentacin de la glucosa. Cuando la bacteria produce la enzima decarboxilasa se alcaliniza el medio, intensificndose el color prpura inicial. En el caso de los bacilos gram negativos no fermentadores (BGNNF), no se observar viraje al amarillo por fermentacin de la glucosa en las reacciones negativas. No se observar ningn viraje de color. Reaccin positiva para BGNNF: intensificacin del color prpura inicial. Reaccin negativa para BGNNF: medio sin cambio

Control de calidad: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Arginina deshidrolasa positiva Lisina decarboxilasa negativa Burkholderia cepacia ATCC 25416 Arginina deshidrolasa negativa Lisina decarboxilasa positiva

Diferenciacin de cocos y cocobacilos (adaptado de Catlin y col. J. Clin. Microbiol. 1975: 102-105)

Fundamentos de la prueba: En concentraciones sub-inhibitorias, los antibiticos que actan sobre la sntesis de la pared celular tienden a inhibir la formacin del septo en vez de actuar sobre la sntesis de los componentes laterales de la pared celular. Por lo tanto, las bacterias cuyas clulas normalmente se dividen en forma de cocobacilos, continuaran creciendo sin dividirse, formando as largos filamentos. Las especies de Neisseria retienen la forma cocoide al ser expuestas a bajas concentraciones de antibitico, sin embargo las especies de Acinetobacter y Moraxella producen bacilos largos y filamentosos.

Realizacin de la prueba: A partir de un cultivo fresco realizar una suspensin en solucin fisiolgica. Hisopar una placa con agar Mueller Hinton o agar sangre. Colocar un disco de penicilina o ampicilina. Incubar a 35 C toda la noche. Realizar una coloracin de Gram a partir del margen exterior del halo de inhibicin alrededor del disco. Observar presencia de filamentos.

Lectura e interpretacin: Presencia de filamentos o bacilos largos: forma cocobacilar (Moraxella spp., Acinetobacter spp.) Presencia de formas cocoides: Neisseria spp.


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DNAsa agar

Fundamentos de la prueba: Se utiliza esta prueba para detectar presencia de desoxirribonucleasa. Se fundamenta en la reaccin de DNAsa extracelular con medio conteniendo DNA. Los oligonucletidos liberados por hidrlisis son solubles en cido. Se revela la reaccin con agregado de cido clorhdrico, resultando positiva una zona clara alrededor del inculo. El azul de toluidina produce zonas mucho ms delineadas de actividad de DNAsa.

Ingredientes: Triptosa ....................................................................... 20.0 g Acido deoxirribonucleico ............................................... 2.0 g Cloruro de sodio............................................................ 5.0 g Agar............................................................................. 15.0 g Agua destilada ........................................................... 1000 ml

Preparacin del medio: Calentar suavemente hasta disolucin. Ajustar el pH a 7.3. Fraccionar en tubos 16/150 tapa a rosca, 15 20 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Distribuir en placas de Petri, dejar solidificar el medio y secar.

Realizacin de la prueba: Inocular la superficie del medio en spot o en lnea con la cepa a estudiar. Pueden ser probadas varias cepas en una placa. Incubar a 35 C durante 24 48 horas.

Lectura e interpretacin: Inundar la placa con cido clorhdrico. Una zona clara alrededor de la siembra indica una reaccin positiva. Tambin se puede utilizar azul de toluidina; observar durante 30 minutos a intervalos de 5 minutos. El azul de toluidina forma complejo con el DNA hidrolizado y produce zonas de color rosa brillante alrededor de las colonias sobre un fondo azul.

Puede incorporarse al medio 0.05g de verde de metilo. Seguir las indicaciones anteriores para la preparacin del medio y la realizacin de la prueba. Reaccin positiva: se observa zona clara que aparece alrededor de la siembra

Control de calidad: Control positivo: Serratia marcescens ATCC 8100 Staphylococcus aureus ATCC 25923

Escala nefelomtrica de Mac Farland

Tcnica de preparacin: Ordenar en gradilla 11 tubos del mismo tamao de los usados para la dilucin del material a comparar (vacunas, suspensiones bacterianas, etc.). Rotular desde 0.5 a 10

Agregar a cada tubo una dilucin de sulfato de bario anhidro al 1% y solucin fra de cido sulfrico 1% qumicamente puro (v/v), de acuerdo a lo indicado en la tabla. Sellar los tubos y guardar en heladera. Cada tubo posee diferente densidad, la cual corresponde aproximadamente a las suspensiones bacterianas sealadas. Para la comparacin, agitar bien el tubo correspondiente hasta obtener una suspensin homognea.

CONTENIDO (ml) TUBO N

BaCl2 (1%) H2SO4 (1%) SUSPENSION BACTERIANA / ml

CORRESPONDIENTE (108)

0.5 0.05 9.95 1.5

1 0.1 9.9 3

2 0.2 9.8 6

3 0.3 9.7 9

4 0.4 9.6 12

5 0.5 9.5 15

6 0.6 9.4 18

7 0.7 9.3 21

8 0.8 9.2 24

9 0.9 9.1 27

10 1.0 9.0 30


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Esculina

Fundamentos de la prueba: Determina la facultad de un microorganismo de hidrolizar el glucsido esculina en esculetina y glucosa a) En medio slido

Ingredientes: Agar nutritivo *............................................................ 40.0 g Esculina........................................................................ 1.0 g Citrato frrico................................................................ 0.5 g Agua destilada........................................................... 1000 ml * Utilizar agar triptena soya o similar

Preparacin del medio: Calentar hasta disolucin. Ajustar pH a 7.0. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca aproximadamente 3 ml por tubo. Autoclavar a 121C durante 15 minutos. Solidificar en pico de flauta

Realizacin de la prueba: Inocular por estriado. Incubar a 35 C durante 48 horas.

Lectura e interpretacin: Reaccin positiva: Desarrollo en la superficie y ennegrecimiento del medio Reaccin negativa: Desarrollo en la superficie sin ennegrecimiento del medio

Control de calidad: Control positivo: Enterococcus faecalis ATCC Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

b) En medio lquido

Ingredientes: Peptona...................................................................... 10.0 g Extracto de carne ......................................................... 3.0 g Cloruro de sodio........................................................... 5.0 g Esculina........................................................................ 3.0 g Citrato frrico................................................................ 0.5 g Agua destilada ...........................................................1000 ml

Preparacin del medio: Ajustar pH a 7.2 7.4. Fraccionar en tubos 13/100 tapa a rosca aproximadamente 3 ml por tubo. Autoclavar a 121 C durante 15 minutos.

Realizacin de la prueba: Inocular el caldo. Incubar a 35 C durante 48 horas o ms.

Lectura e interpretacin: Reaccin positiva: ennegrecimiento del medio Reaccin negativa: sin ennegrecimiento del medio

Control de calidad: Control positivo: Enterococcus faecalis ATCC 29212 Control negativo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Estras de carbohidratos al 10%

Ingredientes: Base caldo rojo de fenol............................................. 15.0 g Carbohidrato ............................................................... 100 g Agar............................................................................ 15.0 g Agua destilada .......................................................... 1000 ml

Preparacin del medio: Mezclar los ingredientes sin agregar el carbohidrato y calentar hasta disolucin del agar. Enfriar a 60 C y agregar el carbohidrato. Ajustar pH a 7.7 antes de autoclavar. Fraccionar aproximadamente 5 ml por tubo. Autoclavar a 121C durante 12 minutos. Solidificar en pico de flauta

Realizacin de la prueba: Inocular por estriado. Incubar a 35 C

Lectura e interpretacin: Reaccin positiva: viraje al amarillo Reaccin negativa: medio sin cambio rojo

Control de calidad: Control positivo para lactosa al 10%: Burkholderia cepacia ATCC 25416 Control negativo para lactosa al 10%: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Filancia. Prueba del hidrxido de potasio

Realizacin de la prueba: Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de hidrxido de potasio al 3%. Suspender una ansada de un cultivo joven a partir de medio slido. Mezclar bien y elevar el ansa para ver formacin de hilo viscoso.

Lectura e interpretacin: Reaccin positiva (formacin de hilo viscoso): bacteria gram negativa Reaccin negativa (sin formacin de hilo viscoso): bacteria gram positiva

Importante: Algunas cepas de Bacillus forman hilo, especialmente en cultivos viejos, los cuales pierden su gram-positividad por alteracin de la pared celular. Control de calidad: Control positivo: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Control negativo: Staphylococcus aureus ATCC 25923


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Flexirrubina

Fundamentos de la prueba: La flexirrubina es un pigmento amarillo insoluble producido por algunos microorganismos de la familia Flavobacteriaceae.

Realizacin de la prueba: Realizar siembra en agar cerebro corazn o tripticasa soya. Incubar 18 horas a 35 C.

Lectura e interpretacin: Inundar la placa con solucin de hidrxido de potasio al 10%. La presencia de flexirrubina se pone en evidencia por el desarrollo de un color naranja fuerte

FLN medio (Fluorescencia, Lactosa, Nitrato)

Fundamentos de la prueba: El medio est formulado para detectar la capacidad de producir fluorescena, la acidificacin a partir de lactosa y la reduccin de nitrato o nitrito a nitrgeno gas.

La fluorescena es un pigmento orgnico luminiscente, el cual al ser excitado con luz ultravioleta emite una fluorescencia verde-amarillenta.

La fluorescencia de colonias no puede detectarse en los medios comunes de aislamiento. Deben emplearse medios con sales catinicas como sulfato de magnesio, que actan como

activadores o coactivadores para intensificar la luminiscencia. La reduccin de nitrato a gas nitrgeno corresponde a la siguiente ecuacin qumica: 2 NO3 - + 10 e - + 12 H + N2 + 6 H2O En esta reaccin de reduccin, cinco electrones son aceptados por el radical nitrato, lo cual da como resultado la formacin de gas nitrgeno y seis molculas de agua. Este proceso se conoce como denitrificacin y es muy til para diferenciar especies de Pseudomonas (muchas cepas son positivas) de otros bacilos no fermentadores. El agregado de lactosa y rojo de fenol permite detectar la formacin de cido a partir de la utilizacin de lactosa, til para identificar el grupo de bacilos gram negativos no fermentadores lactosa positiva fuerte (va oxidativa).

Ingredientes: Proteosa peptona N 3 ............................................. 10.0 g Lactosa .................................................................... 20.0 g Agar ......................................................................... 15.0 g Nitrato de potasio sodio........................................... 2.0 g Nitrito de potasio sodio ........................................... 0.5 g Sulfato de magnesio x 7 H2O .................................... 1.5 g Fosfato cido de potasio ............................................ 1.5 g Glucosa ..................................................................... 0.5 g Acetato de sodio x 3 H2O ........................................... 0.5 g Rojo de fenol ............................................................0.02 g Agua destilada..........................................................1000 ml

Preparacin del medio: Disolver las sales por separado para evitar la precipitacin de las mismas. Antes de adicionar el agar, ajustar pH 7.8. Distribuir en tubos medianos (16/150) con tapa a rosca (aproximadamente 7 ml por tubo). Autoclavar a 121 C durante 15 minutos. Solidificar mitad en puncin y mitad estriado.

Lectura e interpretacin: Examinar el tubo sembrado con fuente de luz ultravioleta para detectar fluorescencia.

Fluorescencia positiva: brillo amarillo-verdoso. Acido de lactosa positivo: pico de flauta amarillo. Denitrificacin positiva: burbujas la en profundidad del medio por produccin de gas nitrgeno

Control de calidad: Florescencia positiva y denitrificacin positiva: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Fluorescencia y denitrificacin negativa, lactosa positiva: Burkholderia cepacia ATCC 25416


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Gelatina

Fundamentos de la prueba: Se detecta produccin de enzimas proteolticas, que hidrolizan gelatina (gelatinasa).

a) Mtodo de KOHN

Ingredientes: Gelatina..................................................................... 200.0 g Carbn ........................................................................ 30.0 g Agua corriente............................................................ 1000 ml

Preparacin del medio: Suspender la gelatina en agua corriente. Disolver por calentamiento a bao mara a 100 C. Agregar el carbn en polvo cuando la gelatina est bien disuelta. Enfriar suavemente antes de volcar la preparacin en un cristalizador grande (para obtener 0.5 cm de espesor), previamente lubricado con vaselina lquida estril o recubierto con papel apergaminado. Enfriar rpidamente para evitar que precipiten las partculas de carbn. Cubrir con una solucin de formol al 15% durante 1 hora. Volcar el formol y despegar el disco de gelatina del fondo del cristalizador y cortar en trozos pequeos. Agregar nuevamente formol al 15% y dejar durante 24 horas. Envolver los trozos de gelatina en bolsitas de gasa y lavar con agua corriente durante 24 horas, dejando que fluya constantemente un chorro suave de agua. Fraccionar los trozos de gelatina en tubos 25/150 de boca ancha con tapa a rosca, llenando solamente un tercio del volumen y los dos tercios restantes cubiertos con agua destilada estril. Esterilizar por vapor fluente (100 C), durante 2 das, 1 hora cada vez, o tres das durante 30 minutos.

Realizacin de la prueba: Inocular un caldo nutritivo (o caldo Tarozzi), de modo que resulte una suspensin densa. Agregar un trocito de gelatina. Incubar a 35 C durante 2 3 semanas

Lectura e interpretacin: Observar los tubos diariamente Reaccin positiva: por licuacin de gelatina, se liberan partculas de carbn al medio lquido.

b) Mtodo de FRAIZER

Ingredientes: Caldo infusin cerebro corazn.................................. 70.0 g Gelatina...................................................................... 8.0 g Agar............................................................................ 30.0 g Agua destilada............................................................ 1000 ml

Bacilos No Fermentadores

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