AVANCES GENÉTICOS EN EL DIAGNÓSTICO DE RETARDO MENTAL Y TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA

Unidad de Genética y Unidad de Neuropediatría

Dolores Miramar y Lorena Monge Galindo

GENÉTICA RM-TEA

El retraso mental (RM) y el trastorno del espectro autista (TEA) son

motivos frecuentes de consulta en Neuropediatría.

Se estima que existe una prevalencia en la población de RM entre 1-

10% y entre el 50-80% quedan sin diagnostico etiológico.

Diagnóstico etiológico en TEA <10%.

Prevalencia TEA “criptogénico” 3-6/1.000

Eirís-Puñal J, Gómez-Lado C, Castro-Gago M. ¿Hasta dónde con los estudios genéticos en neurología pediátrica? Rev Neurol 2008; 47: S65-73

Rauch A, Hoyer J, Guth S, Zweier C, Kraus C, Becker C, et al. Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental

retardation. Am J Med Genet A 2006; 140: 2063-74.Muhle R, Trentacoste SV, Rapin I. The genetics of autism. Pediatrics 2004; 113: 472-86.

ESTRATEGIA DIAGNÓSTICA INICIAL RM-TEA

Hª Clínica – Exploración – Fenotipo

característicos de síndrome concreto

Hª Clínica – Exploración – Fenotipo

inespecíficos

- EEG

- PEAT- PES 208*(estudio neurometabólico avanzado)

- CARIOTIPO +/- FRAXA +/- DELECCIONES SUBTELOMÉRICAS

Desde Sept 2009 Array-CGH

Prueba diagnósticaespecífica

Sangre:glucosa,urea, creatinina, ác.úrico, iones, colesterol,triglicéridos, albúmina, perfil hepático, eq. ácido-base, amonio, láctico, Aminoácidos,homocisteína, β-hidroxibutirato, acetoacetato,AGL, AGCML,cobre-ceruloplasmina,CDT.

Orina:ácidos orgánicos y mucopolisacáridos

*

GENÉTICA RM-TEA

Anomalías detectadas por citogenética convencional son

responsables de aprox 10% RM leve y 40% RM grave

La aparación de nuevas técnicas moleculares (como arrayCGH)

está aumentando el % de RM y TEA atribuido a causas genéticas, al

ser capaces de detectar alteraciones cromosómicas “crípticas”

Tasa diagnóstica del array-CGH para RM se encontraría en torno al

20%, una posible duplicación de la tasa previa a la aplicación de esta

técnica.

Shevell M, Ashwal S, Donley D, Flint J, Gingold M, Hirtz D, et al. Practice parameter: evaluation of the child with global developmental delay. Report of the Quality. Standards Subcommittee of the

American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology 2003; 60: 367-80.

Moeschler JB. Medical genetics diagnostic evaluation of the child with global developmental delay or intellectual disability. Curr Opin Neurol 2008; 21: 117-22.

Stankiewicz P, Beaudet AL. Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation. Curr Opin Genet Dev 2007; 17: 182-92.

GENÉTICA RM-TEA

• Scherer et al. Nature genetics. 2007. 39; S7-S15.

GENÉTICA RM-TEA

• Es un formato experimental

• Basado en la síntesis o fijación de sondas, para el análisis de genes, proteínas, tejidos, metabolitos..

• Sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, sílice..)

¿Qúe es un microarray?

GENÉTICA RM-TEA

¿Cómo funciona un microarray?

• Nivel de hibridación entre la sonda específia (probe) y la molécula diana (target)

• Se cuantifica generalmente mediante fluorescencia

• Se analiza mediante análisis de imagen y algoritmos estadísticos.

GENÉTICA RM-TEA

• aCGH (array Comparative Genomic Hybridization) o cariotipo molecular analiza variaciones genómicas del número de copia de la totalidad del genoma a alta resolución.

• Las sondas depositadas sobre el cristal son fragmentos de ADN humano de distinto origen:

- fragmentos clonados (BACs)

- obtenidos por síntesis química: oligonucleótidos (25-85pb).

• La resolución viene dada en función del tamaño de la sonda y de la distancia entre ellas.

• El uso de oligonucleótidos en comparación con BACs permite:

- examinar aberraciones cromosómicas por debajo del tamaño del BAC

- mayor resolución

- mejor relación señal-ruido

GENÉTICA RM-TEA

HibridaciónMezcla

Control marcado

Cy3

Muestra marcada

Cy5

DigestiónMuestra

Control

ESQUEMA DE LA TECNICA CGH ARRAY

GENÉTICA RM-TEA

• El análisis de realiza mediante un software específico. Cuantifica el cambio en la señal de intensidad de cada sonda y obtenemos un valor relativo de cambio de intensidad de señal en escala 2-logarítmica: (log2ratio), en números que oscilan normalmente entre -4 y 4.

GENÉTICA RM-TEA

VentajasAutomatizado, robusto, reproducibleNo requiere cultivo celular1 microgramo ADN/ensayoPermite analizar todo el genomaMayor resolucion

LimitacionesReordenamientos

balanceados: Translocaciones recíprocas e inversiones

Sólo detecta alteraciones del número de copia relativas al número de copia global (no poliploidías)

Son caros y detectan alteraciones de significado incierto (CNVs)

No detecta mosaicismos por debajo del 20%.

Ventajas y limitaciones del uso del aCGH

GENÉTICA RM-TEA

Cariotipo > 10Mb

CGH > 2 Mb

FISH (interfase) 20 kb (sonda específica)

FISH (metafase) 100 kb (sonda específica)

aCGH (BACs) 100 kb. Resolución del array según nº y distribución de los BACs

aCGH (oligonucleótidos) 0.06 kb. Resolución del array según nº y distribución de los oligonucleótidos

GENÉTICA RM-TEA

Una alteración detectada por CGH array se debe validar mediante otros análisis genéticos:

FISH

MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification)

Estudio de microsatélites

En todos los casos se analizan las muestras parentales para determinar si la alteración encontrada es de novo o heredada y ofrecer asesoramiento genético a la familia.

El análisis en muestras parentales tambien sirve para determinar la patogenicidad de la alteración encontrada

GENÉTICA RM-TEA

• Center for Information Biology Gene Expression Database (CIBEX) http://cibex.nig.ac.jp/index.jsp

• Coriell Cell Repositories NIGMS Human Genetic Cell Repository http://locus.umdnj.edu/nigms/

• Database of Chromosomal Imbalance and Phenotypes in Humans• using Ensembl Resources (DECIPHER)• http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/• Database of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/• Ensembl http://www.ensembl.org• Gene Expression Omnibus (GEO) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/• Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) Database

http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/• Human Segmental Duplication Database http://projects.tcag.ca/humandup/• Human Structural Variation Database

http://humanparalogy.gs.washington.edu/structuralvariation/• NCBI Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/• Segmental Duplication Database http://humanparalogy.gs.washington.edu• UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/

Bases de datos

GENÉTICA RM-TEA

Se realizó array-CGH en la consulta de Neuropediatría en:

Desde Septiembre 2009 a Febrero 2010: 104 extraccionesHasta el momento resultado en 92 casos:

Clínica RPM-RM y/o Autismo+

Fenotipo peculiar(no sind característico)

62 normales19 alterados11 dudosos

20.65% alterados

CASOS CLÍNICOS

CASO 1

Controlado en la consulta desde 2002, a los 2 años por retraso psicomotor y microcefalia.

Prematuro de 34 sem y CIR 1165g. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos

Inicio marcha a los 2 añosPeso<P3, Talla P10, PC<P3

Fenotipo peculiarRM (Educación especial) y TDAH sintomático (tto metilfenidato).

PES 208 + EEG + PEAT+ FO+ RM

CASO 1

Cariotipo+FRAXA+ deleciones subteloméricasArray CGH (17/11/2010) a los 8 años de edad: Deleción 1q21.1Validación: MLPA de microdeleciones. Estudio padres: NORMAL

ESTUDIO GENETICO

arr1q21.1(144,940,640-146,290,972)x1. Monosomía segmentaria de 1.35Mb localizada en el brazo largo del cromosoma 1. Altera la dosis de más de una decena de genes, algunos de ellos descritos en OMIM. Esta deleción ha sido descrita anteriormente como causa de patología. La microdeleción de 1q21.1 se caracteriza por presentar un fenotipo variable, incluyendo retraso mental de leve a moderado, microcefalia, anomalías cardiacas y cataratas. Esta microdeleción, también se ha reportado asociada a esquizofrenia.

CASO 1

FOTO NIÑO

CASO 1

FOTO NIÑO

CASO 2

Controlado desde los 6 meses (2000) por retraso psicomotor

Prematuro de 37 sem y CIR 1750. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos

Ingresado en neonatal por CIR, tapón meconial, criptorquidia bilat, CIA y fenotipo con retromicrognatia e hipertrofia gingival.

A los 8 meses ingresó en UCIP por shock séptico.

En marzo de 01 presentó una convulsión en el contexto de un proceso febril.

CASO 2

ACTUALMENTE (11 años):Pobre contacto social, sin lenguaje expresivo y con escasa comprensión. Come todo triturado. Mantiene sedestación, no bipedestación.

Fenotipo: boca en carpa, pequeña, y pelo claro rizado. Desviación cubital de 2º y 4º dedos de la mano, con pobre manipulación.Frecuentes estereotipias de manos y cefálicas.

FENOTIPO PECULIAR(microcefalia)

PCI HIPOTÓNICARETRASO MENTALRASGOS AUTISTAS

CASO 2

FOTO NIÑO

CASO 2

FOTO NIÑO

CASO 2

FOTO NIÑO

CASO 2: EX. COMPLEMENTARIOS

PES 208 + Serologías TORCH+EEG + FO+ RM (adelgazamiento CC)

ENG/EMG

CASO 2: ESTUDIO GENETICO

Cariotipo: AMPLIFICACION SRY (+)FRAXAPrader Willi-Angelman (2004)+ SteinertDelecciones subteloméricas (Abril 2009)

BIOPSIA MUSCULAR: DNA mitocondrial/cadena resp

Array CGH (Noviembre 2009):Disomía segmentaria del segmento distal del Xq + Nulisomía segmentaria de 40 Mb en Yq

CASO 2: ESTUDIO GENETICO

arr Xq27.3q28(142,643,856-154,582,614)x2; arr Yq11.221-q12(17,057,224-57,432,779)x0

El cariotipo molecular del paciente revela una duplicación segmentaria de cerca de 12Mb de la porción distal del brazo largo del cromosoma X en la región q27.3-q28. Afecta cerca de un centenar de genes, un buen número de los cuales, como MECP2, L1CAM, FLNA o GDI1, han sido descritos en la literatura como causantes de retraso mental ligado al cromosoma X. La deleción de 40,3Mb causa una nulisomía para una gran parte del brazo largo cromosoma Y, con punto de fractura a nivel de q11.2-q12, afectando un gran número de genes.

CASO 2: ESTUDIO GENETICO

Paciente 3342222

SONDA

Tel Cr q/Yq

Tel Cr Xq /Yq

Tel Cr Xq /Yq

Fórmula cromosómica: 46, XY, dup(X)(Xq27.3-q28); del(Y)(Yq11.2-q12)+t(Xq;Yq) “de novo”.

PR

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Paciente 3342222

SONDA

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Paciente 3342222

SONDA

Tel Cr q/Yq

Tel Cr Xq /Yq

Tel Cr Xq /Yq

Fórmula cromosómica: 46, XY, dup(X)(Xq27.3-q28); del(Y)(Yq11.2-q12)+t(Xq;Yq) “de novo”.

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CASO 3

Controlada desde los 12 meses (2002) por retraso psicomotor

Prematura de 35 sem, 2ª gemela. CIR 1750. Apgar 9/10 Padres sanos no consanguíneos

Actualmente (10 años):

FENOTIPO PECULIAR(microcefalia)

RETRASO MENTALRETRASO PONDEROESTATURAL mantenido

CIA pendiente de IQ

PES 203 + EEG + TAC

CASO 3

Cariotipo+FRAXA+ delecciones subteloméricasArray CGH (Octubre 2009) a los 8 años de edad:

arr 17p11.2(16,698,089-20,160,197)x3. Duplicación intersticial de 3,46Mb de material procedente del brazo corto del cromosoma 17. Se corresponde con la duplicación recíproca del síndrome de Smith-Magenis, causante de un cuadro de genes contiguos denominado síndrome de Potocki-Lupski (PTLS - OMIM #610883).

Los pacientes con esta duplicación a menudo presentan un tono muscular pobre, dificultad para alimentarse, y un retraso en el desarrollo tanto motor como psicológico durante la infancia. Además, pueden presentar características de comportamiento similares a las personas autistas o con trastornos del espectro autista, pueden tener defectos cardiacos y apneas en el sueño. Los rasgos dismórficos son compartidos entre los pacientes pero no son especialmente destacables por lo que pueden pasar desapercibidos.

CASO 3

Validado mediante MLPA DE MICRODELECIONES

NORMALIZACION BASICA MICRODELECIONES 1 (P245)

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Estudio en los padres: NORMAL. Alteración “de novo”

CASO 3

FOTO NIÑA

CASO 3

FOTO NIÑA

CASO 3

FOTO NIÑA

CASO 3

FOTO NIÑA

CASO 4

Controlado desde los 13 meses (2007) por retraso psicomotor

Parto a las 39 sem y PRN 3040. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneosProcedente de Rumania de donde adjuntan

TAC: Discreta dilatación de VVLL y III V.

FOTO TAC FOTO TAC

CASO 4

FENOTIPO PECULIAR(microcefalia)

TRASTORMO ESPECTRO AUTISTAESTRABISMO

Actualmente (5 años):

FOTO NIÑO FOTO

NIÑO

CASO 4

PES 208 + EEG + PEAT

FOTO NIÑO

FOTO NIÑO

CASO 4

Cariotipo. Array CGH (Agosto 2010) a los 4 años de edad: Deleción 17p11.2 - síndrome de Smith-Magenis (OMIM 182290)

arr17p11.2(16,947,482-20,160,197)x1. Deleción intersticial de 3.2Mb en la banda17p11.2, coincidente con la deleción típica causante del síndrome de Smith-Magenis.Altera la dosis de unos cuantos genes de OMIM, entre ellos RAI1 (OMIM 607642).

Esta deleción se ha descrito previamente en asociación a retraso mental, problemas de comportamiento, anomalías craneofaciales y esqueléticas, retraso del desarrollo y del habla y alteraciones del sueño

CASO 4

NORMALIZACION BASICA MICRODELECIONES 1 (P245)

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Validación mediante MLPA de microdeleciones:

Estudio en los padres: NORMAL. Alteración “de novo”

CASO 5

Controlada desde los 9 meses (2010) por retraso psicomotor

Parto a las 42 sem y PRN 3200 Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneosAmniocentesis normal

FENOTIPO PECULIAR(Macrocefalia)

RETRASO MENTALESTRABISMO

CASO 5

RM craneal y medular

FOTO TAC FOTO TAC

CASO 5

FOTO TAC

FOTO TAC

CASO 5

Cariotipo y FRAXA normales

MLPA de Deleciones subtelomericas, MLPA de microdeleciones y MLPA región 22q13:

Deleción en 22q13, compatible con el síndrome de Phelan McDermid.

Muestras parentales NORMALES

MLPA deleciones subtelomericas: delecion en 22q MLPA de microdeleciones: delecion en 22q13

MLPA de region 22q13: delecion en 22q13 que incluye a los genes GTSE1, ALG12, MLC1, PLXNB2, SBF1, ECGF1, CPT1B, MAPK8IP2, ARSA, SHANK3, ACR y RABL2B. Probablemente hasta 22qter.

NORMALIZACIÓN BÁSICA 850 VS. 141 © 3508955TEL 069

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NORMALIZACIÓN BÁSICA 850 VS. 141 © 3508955

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9

3p2

1

CASO 5

Array CGH (febrero 2011) a los 22 meses:

Deleción en 22q13, compatible con el síndrome de Phelan McDermid

arr 22q13.31q13.33(44,840,049-49,566,016)x1. Monosomía segmentaria de 4.7Mb en el brazo largo del cromosoma 22, afectando a las bandas q13.31-q13.33, que altera la dosis de más de cincuenta genes RefSeq, algunos de ellos descritos en OMIM dada su asociación a patología. Esta deleción, solapa con una región de reordenamiento recurrente, previamente reportada en la literatura como síndrome de microdeleción 22q13, o Phelan-McDermid syndrome, el cual se caracteriza por la presencia de un retraso global del desarrollo, retraso severo o ausencia del lenguaje e hipotonia. El gen SHANK se considera el principal responsable de las características fenotípicas del síndrome, especialmente los síntomas neurológicos.

Las proteínas codificadas SHANK juegan un rol importante en la maduración y estabilización de la sinapsis entre neuronas en el cerebro: proveen el soporte estructural para el ensamblaje de los receptores de glutamato con el aparato de señalización intracelular y el citoesqueleto en la densidad postsináptica.

CASO 5P

RO

BA

ND

OP

AD

RE

S

CASO 6

Controlada desde los 8 meses (2000) por RETRASO PSICOMOTOR y MACROCEFALIADiscreta dilatación de astas anteriores en EcoTF

Parto a término 39 sem y Peso 3.230g. Apgar 10/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos

ACTUALMENTE (7 años):

FENOTIPO PECULIAR(Macrocefalia)

RETRASO MENTALTDAH (tto metilfenidato)

CASO 6

FOTO NIÑA

CASO 6

FOTO NIÑA

CASO 6: EX. COMPLEMENTARIOS

PES 208 + EEG + PEAT

Cariotipo + FRAXA + Steinert

RM cerebral: discreto aumento VVLL (>Izq) +

hiperintensidad periV predominio posterior.

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS

Cariotipo + FRAXA + Steinert

Subteloméricas (mayo 2010): Trisomía de la región subtelomérica 1q

NORMALIZACIÓN BÁSICA 850 VS. 141 © 3376974TEL069

0

0.5

1

1.5

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10q

11q

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17q

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2p

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18p

19p

20p

Xq

(P

AR

1)

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS

Array CGH (abril 2010), a los 6,5 años:arr1q42.2q44(229,505,714-247,164,526)x3. Trisomía de 17.66Mb de material procedente del extremo más distal del brazo largo del cromosoma 1. Altera la dosis de más de cincuenta genes, muchos de ellos implicados en patología. Se han descrito con anterioridad casos en la literatura con ganancias de material que afectan regiones de tamaño parecido al identificado en esta paciente y existen manifestaciones fenotípicas comunes a ellos.

arr7p22.3(141,377-323,057)x1. Monosomía segmentaria de 182Kb en el brazo corto del cromosoma 7.

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS

Estudio FISH con sondas XCP Cr1 y XCP Cr7P

RO

BA

ND

O

CASO 6

FOTO TAC

CASO 6

FOTO TAC

CASO 7

Controlada desde los 14 meses (1999), derivada por Maxilofacial por por RETRASO PSICOMOTOR + LABIO LEPORINO

Parto a término 33 sem y Peso 2450g Apgar 9/9. No IOT Padres sanos no consanguíneos.

Amniocentesis 2 días antes del parto al observarse labio leporino

2002 Educación especial

2004 Tricotilomanía y tricobezoar

2004 Episodios de mirada fija 8-10 seg EEG PO Temporo-rolándica bilateral (>Izq) Tto Oxcarbacepina

CASO 7

FENOTIPO PECULIARRETRASO MENTAL

TRAST COMPORTAMENTAL (tto risperidona)

FOTO NIÑA

CASO 7

PES 208 + PEAT + FO

Cariotipo + Subteloméricas

TAC y RM craneal

FOTO NIÑA

CASO 7

Cariotipo + deleciones Subteloméricas: normalesArray CGH (2010), a los 13 años:

arr7q33q36.1(136,934,609-150,618,500)x1. Monosomía segmentaria de 13.7Mb en el brazo largo del cromosoma 7, afectando a las bandas cromosómicas q33-q36.1.Altera la dosis de más de un centenar de genes RefSeq, muchos de ellos implicados en patología según OMIM.

Recientemente, se ha descrito una deleción coincidente con la identificada en este caso, aunque de menor tamaño (12Mb), en una mujer adulta con retraso mental, trastorno del espectro autista y amenorrea primaria

COMENTARIOS

Rapidez con la que aparecen nuevas técnicas principalmente en el campo de la genética.

Importancia del asesoramiento genético a la familia y asesoramiento genético reproductivo, con posibilidad de diagnóstico prenatal o preimplantacional.

La técnica aCGH es muy útil para el diagnóstico genético de pacientes con retraso psicomotor y/o trastorno del espectro autista.

Nuestra experiencia nos demuestra que no existe una única técnica que permita el análisis genético en estos casos. Todas las técnicas empleadas tienen sus ventajas y limitaciones.

Importante adaptarse a los continuos avances y proceso de continua revisión y actualización de conocimientos.

Importancia del seguimiento evolutivo de nuestros pacientes, revisión de los casos ante los datos evolutivos que presentan y las nuevas técnicas disponibles.