AVANCES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA...
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AVANCES EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA
FUSARIOSIS DEL MAÍZ EN SINALOA
Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza
Superficie total de cultivos
1, 400, 000 Ha Producción de maíz:
• 500-600,000 Ha • 13, 000 MDP
29, 000 Ha en pérdidas (costo ~780 MDP)
Importancia del maíz en Sinaloa
Fusariosis del maíz en Sinaloa (2009)
Pudrición del tallo y raíz
Pudrición en nodos e internodos de la raíz Macroconidio
Microconidio
Figueroa-López
Fusarium verticillioides
Rizósfera
• ~4,000 especies de bacterias por gr de suelo
• Solo podemos cultivar 1-5% de los microorganismos (MOs)
• La planta afecta distribución y abundancia de los MOs del suelo
• Entender las interacciones MOs-planta nos ayudaría a desarrollar estrategias de control biológico
La salud de la raíz de una planta se debe, en parte, a la capacidad de asociarse con los microorganismos adecuados en el suelo
(Munkvold y Desjardins, 1997)
Residuos infestados
(micelio o conidiosporas)
Acarreo por
viento o lluvia
Daño
por insectos
Semilla
contaminada
9
Uso de Bacterias Promotoras del Crecimiento
Vegetal (BPCV) como antagonistas a Fusarium
Las BPCV son usadas en biocontrol de patógenos
Alternativa amigable para el ambiente
Pueden tener muchos efectos benéficos en plantas
Bacillus spp. ha sido ampliamente estudiado
•Potente antagonista diversos patógenos
•Capaz de producir compuestos antifúngicos
(Pereira et al., 2007; Singh et al., 2008; Mendes et al., 2011)
10
Mejora
nutricional
Producción de
Fitohormonas
Biocontrol de
patógenos
Sideróforos
Fosfatos
Fijación de
nitrógeno
Citocininas
Auxinas
Giberelinas
Antibióticos
Enzimas
hidrolíticas
Ácido
cianhídrico
Promoción del crecimiento
vegetal
Efecto de las BPCVs sobre las plantas 10
Objetivo general del trabajo
Desarrollar un producto agrobiológico en base a microorganismos de la
rizósfera del maíz nativos de Sinaloa para el biocontrol de Fusarium
verticillioides
Estrategia General del Proyecto Colección de 11,520 bacterias nativas de
Sinaloa mantenida a -70°C
Pruebas en medio sólido (42 antagonistas) y
hemólisis (14 antagonistas)
Ensayos en planta para seleccionar los 3
mejores antagonistas para pruebas de campo
Ensayos masivos en líquido para seleccionar
622 potenciales antagonistas a Fv
Pruebas de validación en campo con las tres
bacterias antagonistas
Caldo Dextrosa y Papa
Aislados bacterianos Toma del aislado bacteriano
Inoculación con el aislado bacteriano
Inoculación con Fusarium verticillioides
Bioensayo Incubar en agitación
Pruebas de antagonismo en medio líquido
Cuantificación de biomasa fúngica
Tres lavados con buffer PBS
Agregar WGA Tres lavados con buffer PBS
Incubar 4ºC toda la noche
Pruebas de antagonismo en medio líquido
Placa óptica 96 pozos Incubar en agitación
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B C D E F G H
Formato 12 x 8 = 96 pozos
Celda con probable antagonista
WGA ALEXA FLUOR 488nm (Wheat Germ Agglutinin Alexa Flúor 488 nm)
Fuente:Maldonado-Mendoza
Pruebas de antagonismo en medio líquido
Cuantificación de biomasa fúngica
Fusarium
Posible antagonista
Fusarium
Posible antagonista
A. Antagonista controlando el crecimiento de Fusarium
B. Fusarium crece ya que no hay efecto antagonista
Celda de 2 ml del formato de 96 pozos con 500 µL de caldo Papa Dextrosa con Fusarium y los aislados
Se incubó 25°C, 250 rpm 30 h
Fusarium
Posible antagonista
236
FORL
236 FORL
Fuente: Maldonado-Mendoza
Pruebas de antagonismo en medio líquido
Cuantificación de biomasa fúngica
20
α-hemólisis = Parcial β-hemólisis = Total γ-hemólisis = No hemólisis
Tipo de hemólisis
Pruebas de hemólisis
Pruebas de hemólisis como factor de selección
50 µL sobrenadante
β
β γ
γ
37ºC – 24hr
Aislados Identificados Molecularmente
% INHIBICIÓN LIQUIDO % INHIBICIÓN SOLIDO HEMÓLISIS
2 Bacillus megaterium 88 66 α
3 Pseudomonas putida 84 67 α
4 Bacillus megaterium 89 71 γ
5 Bacillus megaterium 91 66 α
7 Bacillus megaterium 74 71 α
8 Paenibacillus polymyxa 62 85 γ
9 Bacillus cereus 62 70 γ
12 Bacillus megaterium 84 56 α
13 Bacillus subtilis 86 63 α
22 Bacillus sp. 74 68 γ
23 Bacillus megaterium 64 63 γ
24 Bacillus cereus 72 73 γ
25 Bacillus cereus 93 52 γ
35 Bacillus subtilis 76 73 γ
Características de los 14 mejores antagonistas seleccionados para evaluar en planta
A B
C D
b
b
abab ab
ab
bb
ab
a
abab
ab
ab
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35
Ro
ot
volu
me
(cm
3)
a a
ab ab
b
ab
ab ab
ab
bab ab
b
ab
0
20
40
60
80
100
120
CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B23 B24 B25 B35
Seve
rity
(%
)
a
ab ab ab
b
abab
ab ab abab
abab
bb
0
20
40
60
80
100
120
CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35
Seve
rity
(%
)
cc
b
c
a
bc
d
d
bc
c
bc bcbc
b
a
0
0,5
1
1,5
2
2,5
CTL B2 Ps3 B4 B5 B7 Pa8 B9 B12 B13 B22 B23 B24 B25 B35
Ro
ot
volu
me
(cm
3)
Tres antagonistas seleccionados para pruebas en campo por disminuir la severidad de la fusariosis en plántulas de maíz
Híbrido Cebú
Híbrido Garañón
Características de antagonismo y de promoción del crecimiento vegetal de los aislados
No. Aislado Fosfato Auxina Quitinasa Sideróforos Proteasa Glucanasa
B2 Bacillus megaterium - - - - - +
Ps3 Pseudomonas putida - - - + - +
B4 Bacillus sp. + - - + + +
B5 Bacillus sp. + - - + + +
B7 Bacillus megaterium - - - + + +
Pa8 Paenibacillus polymyxa + + - - - +
B9 Bacillus cereus - - - - - +
B12 Bacillus subtilis + - - + + -
B13 Bacillus aquimaris + - + + - +
B22 Bacillus megaterium - - - + + +
B23 Bacillus sp. + - + - - -
B24 Bacillus cereus - - + + + +
B25 Bacillus cereus - - + + + +
B35 Bacillus sp. - - - - - +
Compatibilidad entre aislados
4 5 8 9 22 23 24 25 35
4
5
8
9
22
23
24
25
35
COMPATIBLES
NO COMPATIBLES
24
Fecha de siembra: Primer experimento: ciclo Otoño-Invierno 2011-2012 Segundo experimento: ciclo Otoño-Invierno 2012-2013 Diseño Experimental: Bloques completamente al azar con tres repeticiones. Anova, Tukey P<0.05
TRATAMIENTOS
1 AISLADO A
2 AISLADO B
3 AISLADO C
4 A+B
5 A+C
6 B+C
7 A+B+C
8 CONTROL ABSOLUTO
9 CONTROL DE PATOGENICIDAD ( + Fusarium)
10 CONTROL INOCULANTE BIOLÓGICO COMERCIAL
11 CONTROL CON LB
Establecimiento del experimento en campo
2 11 3 6 9 5 10 7 1 4 8
1 5 8 7 10 11 3 4 9 2 6
11 4 9 2 1 7 6 8 5 10 3
BLOQUES
Variables a medir:
Altura Grosor de tallo Altura de la primera mazorca Incidencia y severidad de pudrición de tallo Incidencia y severidad de pudrición de mazorca
Rendimiento de grano Humedad de grano Comprobación de
esterilidad de semillas de maíz con identificación morfológica y molecular de hongos asociados a granos de maíz
Evaluación de fumonisinas presentes en granos de maíz
26
Establecimiento del experimento en campo
Propagación del inóculo de Fv en maíz picado
Toma de muestras y marca del terreno experimental
Las bacterias antagonistas afectan la incidencia
y severidad de pudrición en mazorca
Tratamiento Variables
% Incidencia de
pudrición en
mazorca
% de Severidad
de pudrición en
mazorca
1 AISLADO A 6.0c 4.5c
2 AISLADO B 4.7c 3.8c
3 AISLADO C 44.6b 15.2b
4 A+B 44.6b 3.8c
5 A+C 44.6b 3.6c
6 B+C 69.2ª 13.8b
7 A+B+C 8.6c 3.8c
8 CONTROL ABSOLUTO 77.0a 15.4b
9 CONTROL (+ Fusarium) 80.2a 34.7ª
10 CONTROL CON LB 58.6a 18.3b
11 CONTROL COMERCIAL 72.9a 18.3b
TRATAMIENTOS Rendimiento de grano
(t ha-1)
1 AISLADO A 11.00a
2 AISLADO B 11.22a
3 AISLADO C 9.66ab
4 A+B 10.51a
5 A+C 9.59ab
6 B+C 9.59ab
7 A+B+C 11.34a
8 CONTROL ABSOLUTO 9.45ab
9 CONTROL DE PATOGENICIDAD (+ Fv) 7.10b
10 CONTROL CON LB 9.04ab
11 CONTROL COMERCIAL 9.54ab
Los antagonistas mejoran el rendimiento del grano (159 dds)
Ciclo O-I de 2012. Letras iguales en las columnas no presentan diferencias
significativas (Tukey, α= 0.05).
Segundo experimento en campo El Realito resultados parciales (2012-2013)
Tratamiento Variables
% Incidencia de pudrición en tallo Nivel de severidad
de pudrición en
tallo a 159 DDS
(escala de 0 a 5) 41 dds 98 dds
1 Control absoluto híbrido Garañón 85.0c 85.0c 2.5c
2 Control de patogenicidad híbrido
Garañón
85.0c 55.0b 2.5c
3 Híbrido Garañón + Aislado (aplicado a
semilla)
10.0a 0.0a 0.0a
4 Híbrido Garañón + Aislado (aplicado a
semilla y tallo)
20.0b 10.0a 1.0b
5 Control absoluto híbrido Dekalb 2038 70.0c 60.0bc 2.5c
6 Control de patogenicidad híbrido
Dekalb 2038
85.0c 70.0c 2.5c
7 Híbrido Dekalb 2038 + Aislado (aplicado
a semilla)
25.0bc 10.0a 1.0b
8 Híbrido Dekalb 2038 + Aislado (aplicado
a semilla y tallo)
10.0a 10.0a 1.0b
Letras iguales en las columnas no presentan diferencias significativas (Tukey, α= 0.05)
Segundo Experimento en campo NO infestado de Fusarium ciclo 2012-2013
•Cosecha realizada en junio 2013 • Helada en enero 2013 •No incidencia, no severidad en raíz y tallo •Daño por cogollero •Probable incidencia en mazorca (Campo La Esmeralda. Productor: Reynaldo Valencia)
Bacillus cereus disminuye la incidencia y severidad de pudrición en mazorca (187 dds)
Tratamiento
Variables
% incidencia en
pudrición de
mazorca
% severidad en
pudrición de
mazorca
1 Control absoluto híbrido Cebú 87.1ab 76.2a
2 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 69.2c 34.1c
3 Híbrido Cebú + aislado bacteriano (aplicado a semilla y tallo) 74.3b 28.3d
4 Control absoluto híbrido Garañón 94.4a 62.7bc
5 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 88.3a 34.2c
6 Híbrido Garañón + aislado bacteriano (aplicado a semilla y
tallo)
71.1bc 37.5c
7 Control absoluto híbrido Gorila 92.3a 68.2b
8 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla) 74.5b 33.0c
9 Híbrido Gorila + aislado bacteriano (aplicado a semilla y
tallo)
78.4b 31.2c
Estandarización de la producción del inóculo en fermentadores de 3 L
Laboratorio de Bioenergéticos
Dra. Claudia Castro Martínez M.C. Juan Carlos Martínez Álvarez
Formulación en polvo a base de esporas de Bacillus
spp. nativos de Sinaloa para el control de Fv en maíz
Establecer y optimizar la producción de esporas de Bacillus sp.
Generar una formulación en polvo a base de esporas de Bacillus sp.
Evaluar in vitro el efecto de la formulación en:
a) control F. verticillioides b) eficiencia en el recubrimiento de las semillas de maíz c) viabilidad y vida de anaquel de las esporas de Bacillus spp. d) germinación de las semillas de maíz
Evaluar el efecto de la formulación en el control de F. verticillioides en maíz
Tesis doctoral MC Juan Carlos Martínez Álvarez
Factores con efectos principales
Diseño Plackett-Burman
Zona de optimización
(ascenso más pronunciado)
Optimización DCC
Selección y optimización de nutrientes del
medio de cultivo por MSR
Estandarización de la
concentración
del inóculo
Producción de esporas (UFC/mL) de
aislados de Bacillus
MEDIO DO 24h DO 48h DO 72h UFC/mL 24h UFC/ml 72h
1X107 1X108
DSM 0.786 0.859 0.867 1.2± 0.16 1.2± 0.14
Medio 1 DSM+ AM 0.656 0.694 0.453 1.1± 0.12 3.3± 0.21
Medio 2 DSM+ AP 1.117 1.31 1.401 2.8± 0.1 2.1± 0.24
Medio 3 DSM+ CSL 1.926 1.658 1.465 3.5± 0.8 2.1± 0.08
Medio 4 DSM+ EC 1.278 1.829 1.546 -- --
Medio 5 DSM+ GLUC 0.993 0.971 0.928 0.1± 0 1.9± 0.04
Medio 6 DSM+ MAL 1.048 0.954 0.878 1.3± 0.16 2.3± 0.37
Medio 7 DSM+ SAC 0.756 0.983 0.916 8.2± 0.2 0.8± 0.12
MEDIO A B C D E F G
1 1 1 1 -1 1 -1 -1
2 -1 1 1 1 -1 1 -1
3 -1 -1 1 1 1 -1 1
4 1 -1 -1 1 1 1 -1
5 -1 1 -1 -1 1 1 1
6 1 -1 1 -1 -1 1 1
7 1 1 -1 1 -1 -1 1
8 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
Letra Componente -1 1
A PEPTONA (g/L) 2.5 7.5
B EXTRACTO DE LEVADURA (g/L) 1.5 4.5
C KCl 10% (mL/L) 5 15
D MgSO4 1.2% (mL/L) 5 15
E MnCl2 10 mM (mL/L) 0.5 1.5
F FeSO4 1 mM (mL/L) 0.5 1.5
G Ca(NO3)2 0.5M (mL/L) 1 3
Diseño factorial fraccionado (Plackett-Burman) para evaluar los 7
componentes del medio de cultivo DSM y poder identificar aquellos con
mayor influencia en la producción de esporas.
MEDIO DO 24h DO 48h DO 72h UFC/ml 72h (1X109)
1 1.410 2.025 1.816 1.33
2 (EL) 1.683 1.459 1.426 5.13
3 1.171 0.982 0.881 1.10
4 (Mg) 1.557 1.710 1.562 5.60
5 1.778 1.585 1.501 0.30
6 1.975 1.663 1.727 0.43
7 1.755 1.944 1.861 2.00
8 1.068 1.058 0.906 2.90
Después de aplicar el método Plackett-Burman se obtiene producción de esporas hasta de 5.6 x 10 9 UFC/ml
El estudio de la diversidad de las bacterias cultivables en la rizósfera del maíz nos ayuda a entender porque una planta se enferma
• Se secuenciaron 10,000 aislados y se seleccionaron 7,000 secuencias para agruparlas por similitud en 185 OTUs
• El análisis de rarefacción nos indicó que el esfuerzo de muestreo para entender la diversidad total de la muestra debe ser mayor
Composición de las poblaciones de bacterias cultivables de la rizósfera
del maíz
Phyla
Firmicutes
Proteobacteria
Location Infection
1 B. subtilis 0.0001 0.0031 all five SYM
2 B. cereus 0.0001 0.0001 all five SYM
5 B. megaterium 0.0001 all five
6 Bacillus sp. 0.0001 all five
7 B. cereus 0.0001 0.0002 all five SYM
8 B. subtilis 0.0001 all five
12 B. subtilis 0.0001 all five
13 B. endophyticus 0.0001 all five
17 B. thuringiensis 0.0001 0.02 all five ASY
18 B. subtilus 0.0001 all five
19 B. firmus 0.0001 all five
21 B. megaterium 0.0001 all five
22 E. cloacae 0.0001 0.001 I, II, III SYM
36 P.putida 0.0049 0.0038 all five ASY
82 Pantoea sp. 0.0001 0.0001 I, V SYM
94 L. sphaericus 0.0001 0.0001 all five SYM
95 B. megaterium 0.0001 all five
114 Arthrobacter sp. 0.0001 II, IV, V
117 B. niacini 0.0001 all five
128 B. megaterium 0.0001 I, II, IV, V
169 Acinetobacter sp. 0.0016 I, V
179 B. luciferensis 0.0439 all five
239 S. maltophila 0.0015 I, II, III
375 L. sphaericus 0.0039 I, V
383 P. fluorescens 0.0001 0.0001 III, IV, V ASY
388 B. aquimaris 0.027 III, IV, V
422 Paenibacillus sp. 0.0237 I, II, III, IV
Related to infectionOTU OTUs present at sitesOrganismPr > Chisq
SANA ENFERMA
Poblaciones específicas de Bacillus y Pseudomonas de la rizósfera del maíz son modificadas con la aparición de síntomas de fusariosis
OTUs associated only with asymptomatic
plant rhizospheres OTU number Putative species Sample point
34 B. cereus I
37 P. putida I
39 P. putida I
46 P. putida I
50 P. putida I
52 Bacillus sp. I
54 B. subtilis I
75 P. putida I
79 B. subtilis I
84 B. pumilus I
313 Enterobacter sp. I
321 B. pumilus I
325 B. pumilus I
331 B. pumilus I
335 Enterobacter sp. I
453 Paenibacillus sp. I
495 B. thuringiensis I
505 B. megaterium I
251 B. pumilus II
600 Pseudomonas sp. III
607 B. cereus III
195 B. cereus IV
167 A. calcoaceticus V
381 B. thuringiensis V
151 Bacillus sp. III / V
162 B. cereus II / III / V
197 B. catenulatus I /IV
254 Bacillus sp. I / II
260 B. cereus I / II
324 B. pumilus I / III
336 B. pumilus I / III
372 B. subtilis I / V
423 B. aquimaris II / IV
464 B. subtilis II / III
494 Bacillus sp. I / II
510 B. megaterium I / II
OTUs associated only with symptomatic plant
rhizospheres OTU number Putative species Sample point
104 C. sakazakii I
577 B. megaterium I
282 P. mendocina II
642 B. amyloliquefaciens III
650 Aeromonas media III
661 P. fluorescens III
662 B. megaterium III
433 B. subtilis IV
568 B. aquimaris IV
575 B. aquimaris IV
392 L. sphaericus V
393 L. sphaericus V
409 B. subtilis V
123 B. subtilis II / III
124 B. subtilis I / II
127 B. subtilis I / II
168 P. putida II / V
175 Bacillus sp. I / V
183 B. cereus I / V
190 B. cereus I / V
216 Enterobacter sp. I / II
220 B. subtilis II / IV
224 B. cereus II / IV
240 S. maltophila I / III
243 S. canadense II / III
274 Brevibacillus sp. II / IV
281 Paenibacillus sp. II / III / IV
288 Bacillus sp. II / IV
289 Rhizobium sp. II / III
398 Bacillus sp. I / V
401 B. thuringiensis IV / V
411 Bacillus sp. IV / V
441 Terribacillus sp. I / IV
469 B. thuringiensis I / III
490 B. subtilis I / III
592 Bacillus sp. III / IV
593 B. megaterium III / IV
523 Bacillus sp. I / V
Existen poblaciones principalmente de Bacillus y Pseudomonas que están asociadas exclusivamente con la condición sintomática o asintomática en presencia de Fv
¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN! [email protected]
Alejandro Figueroa
Damián Cordero
Glenda Lizárraga Karla Leyva
Dr. Nacho