1. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONGLIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DEBIOREMEDIACIGuillem Llorens BlanchDirectora: Montserrat Sarr AdroguerTutors: Eduard Borrs CampsCarlos Esteban Rodrguez-RodrguezProjecte final de carreraCincies Ambientals

2. No tots els sls poden produr qualsevol cosa Virgilio, Gergiques 3. ResumEls fongs de podridura blanca (WRF de lingls: White-rot fungi) sn de gran intersen lmbit de la bioremediaci per la seva capacitat de degradar la lignina. La lacasa, undels enzims extracellulars que aquests fongs excreten per degradar la lignina, pot serutilitzada per degradar els contaminants presents en una matriu donada. Trametesversicolor ha estat estudiat per la seva capacitat de produr aquest enzim en residusagrcoles com a substrats. Un primer triatge basat en la producci de CO2, la mesura delactivitat lacasa i la quantificaci de lergosterol han perms seleccionar els substratson es donava un major poder oxidatiu dels cultius inoculats amb T.versicolor. Elsposteriors experiments de colonitzaci de sls, on es monitoritzava lactivitat lacasa ilergosterol, han mostrat que T.versicolor s capa de colonitzar sls i que t una majoractivitat lacasa en condicions no estrils. Tamb sha provat, mitjanant el test ND24,que T.versicolor es capa de degradar un contaminant emergent, el naprox, en slsestrils i no estrils esmenats amb residus agrcoles.Paraules clau: Trametes versicolor, sls, ND24, ergosterol, lacasaResumenLos hongos de podredumbre blanca (WRF del ingls: White-rot fungi) son de graninters en el campo de la bioremediacin por su capacidad de degradar la lignina. Lalacasa, una de las enzimas extracelulares que estos hongos excretan para degradar lalignina, puede ser utilizada para degradar los contaminantes presentes en una matrizdada. Trametes versicolor ha sido estudiado por su capacidad de producir esta enzimaen residuos agrcolas como substratos. Una primera criba basada en la produccin deCO2, la medida de la actividad lacasa i la cuantificacin del ergosterol han permitidoseleccionar los substratos donde se daba un mayor poder oxidativo de los cultivosinoculados con T.versicolor. Los posteriores experimentos de colonizacin de suelos,donde se monitorizaba la actividad lacasa y el ergosterol, han mostrado que T.versicolores capaz de colonizar suelos i que tiene una mayor actividad lacasa en condiciones noestriles. Tambin se ha probado, mediante el ensayo ND24, que T.versicolor es capazde degradar un contaminante emergente, el naproxeno, en suelos estriles i no estrilesenmendados con residuos agrcolas.Palabras clave: Trametes versicolor, suelos, ND24, ergosterol, lacasaAbstractWhite rot fungi (WRF) are of great interest in the field of bioremediation for theirability to degrade lignin. Laccase, an extracellular enzyme excreted by these fungi todegrade lignin, can be used to degrade the pollutants presents in a given matrix.Trametes versicolor has been studied for its ability to produce this enzyme inagriculture residues as substrates. An initial sorting based on the CO2 production, themeasurement of laccase activity and the quantification of ergosterol have allowed toselect the substrates which gave the crops inoculated whit T.versicolor a higheroxidative power. Subsequent experiments of colonization of soils, where laccaseactivity and ergosterol were monitored, shown that T.versicolor is able to colonize soils,whit a higher laccase activity in non-sterile conditions. Also, with the ND24 test, hasbeen shown that T.versicolor is capable to degrade an emerging pollutant (naproxen) insterile and non-sterile soils amended with agricultural residues.Keywords: Trametes versicolor, soils, ND24, ergosterol, laccasai 4. AgramentsEn primer lloc agrair a les doctores Montserrat Sarr Adroguer, Teresa Vicent Huguet iGlria Caminal Saperas el seu temps i dedicaci i per haver fet possible aquest projecte.Aix mateix, agrair a en Eduard Borrs Camps i en Carlos Esteban Rodrguez-Rodrguez el seu tracte, dedicaci, comprensi, pacincia i esfor, ja que sense ellsaquest projecte no seria el que s.Per ltim, agrair a totes les persones del grup de recerca i dels diferents laboratoris deldepartament dEnginyeria Qumica de la UAB per tota la collaboraci rebuda.ii 5. NDEXResumi1. INTRODUCCI 11.1. Bioremediaci 2 1.1.1. Micoremediaci 4 1.1.1.1. Els fongs ligninoltics5 1.1.1.2. Trametes versicolor6 1.1.1.3. Monitoritzaci de processos de micoremediaci7 1.1.2. Valoritzaci de residus lignocellulsics82. OBJECTIUS112.1. Objectiu general 122.2. Objectius parcials 123. MATERIALS I MTODES133.1. Soca del fong143.2. Productes qumics143.3. Sl i substrats143.4. Procediments experimentals 14 3.4.1. Condicions de cultiu en els substrats 14 3.4.2. Colonitzaci del sl153.5. Mtodes analtics15 3.5.1. Determinaci de la humitat15 3.5.2. Composici elemental dels substrats 15 3.5.3. Determinaci de la capacitat de camp15 3.5.4. Determinaci del pHaquos i del pHKCl16 3.5.5. Quantificaci de lergosterol 16 3.5.6. Degradaci del Naprox (ND24) 16iii 6. 3.5.7. Quantificaci del Naprox 17 3.5.8. Mesures de CO217 3.5.9. Determinaci del CO217 3.5.10. Activitat lacasa 184. RESULTATS I DISCUSI 194.1. Caracteritzaci dels substrats 204.2. Mesures de CO2 214.3. Colonitzaci dels substrats24 4.3.1. Seguiment ergosterol24 4.3.2. Producci lacasa254.4. Colonitzaci del sl estril 27 4.4.1. Seguiment ergosterol27 4.4.2. Producci lacasa294.5. Colonitzaci del sl no estril30 4.5.1. Seguiment ergosterol31 4.5.2. Producci lacasa324.6. Capacitat de degradaci del fong en medi slid 335. CONCLUSIONS356. BIBLIOGRAFIA 37 iv 7. INTRODUCCI 8. INTRODUCCI1. INTRODUCCI1.1. Bioremediaci El progrs tecnolgic que la humanitat ha viscut des de laparici de les primeresindustries ha comportat incontables millores en el nostre estil de vida, per tamb haprovocat que les societats shagin dafrontar a riscos i problemtiques que fins llavorsno existien. La contaminaci qumica del medi ambient s un dels exemples que msatenci ha rebut en els ltims anys. Aquesta contaminaci, que pot afectar qualsevolcompartiment ambiental, ha estat provocada, principalement, per processos que hanmobilitzat substncies ja existents (petroli i metalls pesants, entre daltres) cap a medisque no els sn propis i que no els poden immobilitzar i per processos que han introdut,tant de forma accidental com voluntaria, productes qumics de nova sntesi, tals comcombustibles, plaguicides, frmacs i detergents, entre daltres. El dest ambiental dels diferents contaminants que ens poguem imaginar est lligatals processos fsics, qumics i biolgics del compartiment ambiental on aquest es situi.Mentre que el primer procs provoca, majoritariament, el canvi destat fsic delcontaminant o el moviment daquest cap a altres compartiments, els processos qumics ibiolgics sn capaos de transformar el contaminant en altres substncies. Tamb caldestacar que aquests processos de degradaci de contaminants es poden donar en elsdiferents compartiements ambientals: a latmosfera, laigua i el sl. A partir de la decada dels 80 es va comenar a desenvolupar una nova tecnologiabasada en la capacitat dels microorganismes per degradar un ampli rang de compostosqumics, la bioremediaci. Aquesta, que va neixer com una branca de la biotecnologia,preten trobar soluci als actuals problemes de contaminaci a travs dels processosmetablics dels organismes. s important remarcar que la bioremediaci neix dunanecesitat: descontaminar zones, emplaaments i materials que anteriorment no tenien unvalor econmic per que ara interesa recuperar. Tot i que existeixen altres processos fsics i qumics que permeten el tractament dematerials i substncies contaminades amb un menor temps doperaci, aquests podencomportar la generaci de subproductes i residus que cal tractar i que, per tant, noeliminen tot el problema. En canvi, la bioremediaci permet tractar els mateixosmaterials i substncies duna forma sostenible i amb un cost econmic menor.2 9. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBREDIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACICom succeeix en altres tcniques, la bioremediaci es pot trobar limitada perdiversos factors, i ser aconsellable detectar-los i tindrels en consideraci abansdiniciar el procs (Solanas, 2007): - El tipus de contaminan a tractar influeix en el grau de bioremediaci, donatque no totes les estructures qumiques sn iguals. Els productes biognics(com les protenes i els lpids) sn els que assoleixen un major grau debiodegradabilitat, seguits dels hidrocarburs, i per ltim els xenobitics (oproductes de nova sntesi). - El metabolisme aerbic o anaerbic dels microorganismes determinar,fortament, les condicions de treball. Pels microorganismes aerbics caldraassegurar laportaci idonea doxigen i pels anaerbics es tindra dassegurarla presncia de lacceptor delectrons especfic. - Els parametres especfics del sl, com el pH, el grau dhumitat i la capacitatdintercanvi catinic (CIC) entra daltres, poden determinar el grau debioremediaci assolit, ja que cada microorganisme t els seus rangs ptims iaquests poden no coincidir amb els del material a tractar. - Els requeriments nutricionals dels microorganismes, per exemple una fontde nitrogen i de fosfor i una font de carboni fcilment assimilable, quepermeti el cometabolisme amb el contaminant. Caldra aportar al mediaquests nutrients en una proporci equivalent al rendiment de lorganismeper permetre lactivitat metablica en aquest medi.Relacionat amb la descontaminaci de sls, no existeix una nica tcnica debioremediaci. Les diferents tcniques que es poden aplicar depenen de lestrategia detractament que es vulgui desenvolupar i del lloc o sl en qesti.! Bioremediaci intrnseca: es limita a un seguiment de la descontaminacique es dna de forma natural com a conseqncia de lactivitat metablicadels microorganismes que hi han, de forma natural i espontnia, en el sl.! Bioestimulaci: consisteix en afavorir el creixement i lactivitat metablicade les poblacions microbianes que, de forma natural, es troben en el sl atractar. Per tant, el que es busca s augmentar la taxa de degradacimitjanant el control dels parmetres fisicoqumics del sl, tals comloxigen dissolt i la disponibilitat de nutrients. 3 10. INTRODUCCI! Bioaugmentaci: es basa en linoculaci al sl de microorganismes quepreviament sha demostrat la seva capacitat per degradar els contaminantspresents en el sl. Aquesta tcnica sutilitza quan les poblacionsmicrobianes presents en el sl no poden degradar els contaminants i per tantno s factible portar a terme una bioestimulaci. En aquest cas, cal tindrepresent que els microorganismes que sinocularan shan fet crixer encondicions controlades en un laboratori i, un cop inoculats, es trobaran enun escenari de competncia amb els microorganismes autctons, els qualsestan ms ben adaptats al medi en qesti.Pel que fa a lemplaament, la bioremediaci pot ser in situ o ex situ.! Bioremediaci in situ: quan es porta a terme en el mateix emplaament,sense moviment de grans masses de sl. En aquest cas, els inculs i tots elsagents bioestimulants shauran de fer arribar fins a les zones del slafectades. Aix pot ser un inconvenient, a ms a ms de no poder-secontrolar tots els factos ambientals necessaris, per t un cost econmicinferior a la bioremediaci ex situ.! Bioremediaci ex situ: quan es porta a terme en un altre emplaament, enuna instalaci especfica o s mouen grans masses de sl. Hi han trestipologies diferents: - Landfarming: es diposita el sl a tractar sobre un sl no contaminat i es llaura. - Biopila esttica: es construeix una pila de sl i es subministren els inculs, bioestimulants, aigua i aire a travs duna xarxa de tubs. - Biopila dinmica: es construeix una pila de sl i es subministren els inculs, bioestimulants i aigua, i periodicament es renova la pila.1.1.1. MicoremediaciEls fongs sn un grup heterogeni de microorganismes eucariotes repartits per tot elmedi ambient, degut a que poden sobreviure en gairab tots els habitats. Gran part delsfongs estan constituts per unes estructures anomenades micellis, que es divideixen enmicellis vegetatius (encarregats del transport i absorci de nutrients) i micellisreproductors (creixen cap a la superfcie del medi i formen les estructures4 11. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIreproductives) (Singh, 2006). En condicions ptimes, els micellis reproductors donenlloc a espores, la germinaci de les quals dna lloc a unes noves estructures anomenadeshifes. Les hifes sn estructures cilndriques constitudes per un conjunt succesiu decllules amb una paret cellular formada per quitina. La majoria de les hifes dels fongssn septades, per poden presentar porus que permetin el pas del citoplasma i elsorganuls i la migraci dels nuclis cap a diferents parts del micelli (Singh, 2006). La hifaformada per lespora (hifa mare) es comenara a ramificar quan les condicions del medisiguin favorables, donant lloc a noves hifes ramificades. Els agregats daquestes noveshifes sn el que es coneix per micelli. s ben conegut que els fongs i les bacteries poden degradar una ampli ventall dematerials i compostos (Singh, 2006), per, a diferncia dels bacteris, aquests podentolerar unes concentracions elevades de contaminants. Aquest fet explica, en part,lextensa utilitzaci dels fongs en estudis de bioremediaci (Evans i Hedger, 2001).1.1.1.1. Els fongs ligninoltics Els processos de degradaci de materials ligninoltics sn, encara, relativamentdesconeguts. Alguns bacteris sn capaos de solubilitzar la lignina per no tots la podendegradar. En canvi, bona part dels fongs basidiomicets es troben, de forma natural,descomposant fusta (fongs de podridura blanca) (Harvey i Thurston, 2001). Els enzims que possibiliten la descomposici de la fusta tamb poden actuar en ladegradaci de contaminants orgnics persistents (Singh, 2006). Els fongs ligninolticssn basidiomicets que poden mineralitzar i despolimeritzar la lignina en condicionsaerobies grcies al seu sistema enzimtic extracellular. Aquest sistema enzimtic s elprincipal mitja pel qual els fongs poden degradar macromolcules insolubles enmolcules ms petites i solubles que poden ser facilment assimilables (Wallenstein iWeintraub, 2008). Els fongs de podridura blanca poden produir diversos enzims extracellulars quepoden modificar la lignina i una de les seves principals caracterstiques es que no snespecfics per un substrat concret, cosa que permet la seva aplicaci en la degradaci decontaminants en una matriu donada. Els enzims modificadors de lignina snoxidoreductases, els quals poden ser peroxidases (mangans peroxidasa i ligninperoxidasa) i fenoloxidases (lacasa).5 12. INTRODUCCI Mangans peroxidasa: (MnP) s un enzim extracellular secretat per una part dels fongs de podridura blanca. s una glicoprotena glicosilada que susa del H2O2 per oxidar el Mn2 a Mn3-quelat. Les seves espectatives en bioremediaci recauen en el fet de poder actuar com un oxidant no especfic (i difs) en substrats fenlics (Harvey i Thurston, 2001). Lignin peroxidasa: (LiP) va ser la primera peroxidasa en ser associada a la deslignificaci de la fusta pel fong Phanerochaete chrysosporium per Kirk i Yang (1979). La LiP catalitza loxidaci dels compostos no fenlics segrestan un electr de les cadenes laterals de la lignina per formar radicals lliures. La MnP i la LiP estan involucrades en el procs de degradaci de la lignina (Katagiri, Tsutsumi i Nishida, 1995), la MnP allibera fragments de lignina que, posteriorment, seran modificats per la LiP (Webster i Weber, 2007) per donar lloc a molecules solubles. Lacasa: (Lac) s lenzim extracellular ms exts entre els fongs de podridura blanca. La lacasa forma part del grup anomenat blue multicopper oxidases, cada molcula cont quatre toms de coure distributs en diferents llocs denlla, i t lhabilitat de redur loxigen a aigua (Harvey i Thurston, 2001). Les lacases poden oxidar cids fenlics i metoxifenlics, els quals tamb poden ser descarboxilats. A diferncia de les peroxidases, la lacasa (una fenoloxidasa) s inespecfica pel substrat i la seva acci no es veu alterada pel monxid de carboni.1.1.1.2. Trametes versicolor El fong Trametes versicolor (Coriolus versicolor), anomenat colloquialment percua de gall dindi, s un basidiomicet saprfit que s habitual trobar en soquesdarbres morts, provocant lanomenada podridura blanca. Tant els micellis com elbasidiocarp sn resistents a la dessecaci i aquest ltim, que pot formar un ventall defins a 10 cm de dimetre, presenta una superfcie velluda, de diverses tonalitats, capade retindre laigua de pluja (veure figura 1.1) (Webster i Weber, 2007). El seu sistema enzimtic s capa de produr els enzims lignina peroxidasa,mangans peroxidasa i lacasa. Degut a aix T. versicolor a estat ampliament estudiat pertractar, entre daltres, aiges residuals amb tints textils, frmacs o disruptors endocrins,materials contaminats per policlor fenols (PCPs) i en la deslignificaci i decoloraci dela cellulosa (Rodrguez Couto i Toca Herrera, 2006).6 13. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBREDIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACI a)c) b)Figura 1.1. Trametes versicolor: a) secci vertical a travs dun basidiocarp, b) en estat natural i c) grup dhifes (Font Webster i Weber, 2007)1.1.1.3. Monitoritzaci de processos de micoremediaci Com sha mencionat anteriorment, el sistema enzimtic extracellular dels fongs depodridura blanca pot degradar xenobitics. Degut a aix, aquests fongs shan estudiatampliament, monitoritzant aquells processos propis del fong per tal davaluar el seucomportament, entre daltres, en una matriu contaminatada.A) Loxidaci de substrats per part de la lacasa sembla ser poc especfica. Ladiferncia de potencial redox que sestableix entre el substrat i els coures situatsen el centre actiu de la molcula sn el que determinen si el substrat ser oxidato no (Harvey i Thurston, 2001). La mesura de lactivitat de la lacasa pot oferiruna idea de com dadequat s un substrat per un fong determinat. Per tant, lamonitoritzaci daquest parametre al llarg del temps permetr valorar elpotencial doxidaci del sistema fong-substrat.B) Elsfongsiels bacteris snelsmicroorganismes predominantsdel sl(Bth, 2001), per tot i ocupar nnxolsecolgics diferents, pot resultardifcilquantificar i diferenciar quanta biomassapertany a cadascun. Lergosterol, un delsprincipals esterols que formen la membranaFigura 1.2. Esquema de la situaci de lergosterol a lhifa dels fongscellular dels fongs filamentosos (Zhao, Lin iBrookes, 2004), sha utilitzat com a mesura de la biomassa daquests en sls7 14. INTRODUCCI (Seitz et al. -1977-, Lee et al. -1980- i Matcham et al. -1985). En aquests treballs, i posteriors, es tenen en compte dos factors per tal de considerar lergosterol com un indicador de la biomassa de fong viu en una matriu: s un esterol que no es troba en animals (Webster i Weber, 2007), plantes vasculars ni altres microbis, a excepci dalgunes microalgues verdes (Davis i Lamar, 1992), i s un compost relativament inestable (Mille-Lindblom et al., 2004) i, per tant, poc temps desprs de la mort del fong aquest es degrada amb certa rapidesa. En lactualitat, lutilitzaci de lergosterol com a indicador de la biomassa dels fongs vius al sl est sent posada en dubte. El treball de Mille-Lindblom et al. (2004) suggereix que lergosterol pot persistir en el medi llargs perodes de temps desprs de la mort del fong, amb un temps de semivida que pot oscillar entre els 85 i 151 dies, i que, per tant, no tot lergosterol quantificat podria ser atribut a fong viu. No obstant, lergosterol s un bon indicador de biomassa viable del fong i es per aquest motiu que gran part dels treballs realitzats en el camp de la micoremediaci es fa servir.C) El test de degradaci del Naprox (ND24) s una mesura absoluta de biodegradaci, complementaria als altres procediments exposats, basada en la capacitat de T. versicolor per degradar, en una matriu slida, una petita concentraci daquest compost (Rodrguez-Rodrguez et al., 2010). El Naprox s un antiinflamatori molt exts en lactualitat, ja que es pot adquirir en qualsevol farmacia sense prescripci medica. La seva degradaci pot estar catalitzada per la lacasa i el citocrom P450 en T. versicolor (Marco-Urrea et al., 2010). Tot i que la degradaci dels frmacs i dels productes personals de neteja (PPCP Pharmaceutical and Personal Care Products) no sn lobjectiu del present treball, i les determinacions dergosterol i dactivitat de la lacasa estan ampliament acceptades per verificar lactivitat del fong, aquest test ofereix loportunitat daportar informaci complementaria sobre lestat fisiologic del fong i la seva capacitat degradativa.1.1.2. Valoritzaci de residus lignocellulsicsLes societats humanes produeixen residus slids com a resultat de les sevesactivitats, tant econmiques com destil de vida. A mesura que les poblacions humaneshan anat creixent, leliminaci i tractament daquests residus ha estat un gran repte per ales propies societats que els generavan. Cal tindre present que els residus slids no sn8 15. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBREDIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIquelcom homogeni i fcilment classificable, ja que estan formats per una enormevarietat de materials i la seva procedncia s igualment variada. Aquest fet provoca queshagin desenvolupat diferents alternatives per tal de tractar, valoritzar i reutilitzar elsresidus en funci de la seva composici.La valoritzaci dels residus s un conjunt de mtodes, relativament simples ieconmics, que permeten obtenir productes que es poden aplicar en una enorme varietatde camps. Segons la Ley 10/1998, del 21 de abril, de Residuos, la valoritzaci de residus esdefineix com tot procediment que permeti laprofitament dels recursos continguts en elsresidus sense posar en perill la salut humana i sense utilitzar mtodes que puguin causarperjudicis al medi ambient.Segons dades del Instituto Nacional de Estadstica (INE) durant lany 2007 es vangenerar, a lEstat Espanyol, 2.284.052 tonelades de materials assimilables a residusagropecuaris. Per residu agrcola senten aquell subproducte de rebuig obtingut encultius llenyosos i vegetals i de restes de poda i neteja de zones forestals.Els residus agricoles han estat ampliament utilitzats en estudis anteriors com asubstrat en el tractament de matrius slides contaminades amb xenobitics amb fongsde podridura blanca. A la taula 1.1. es mostra un recull dalguns daquests estudis delsltims 15 anys. Tal i com es pot observar, shan utilitzat, preferentment, residusagrcoles no procesats.En el present treball shan utilitzat residus agrcoles com a substrat lignocellulsicpel creixement de fongs ligninoltics per al seu eventual us en bioremediaci de slscontaminats.En el cas que ens concerneix, es van utilitzar dos tipologies de residus agrcolesdiferents: residus tractats i residus no tractats. Els residus agrcoles tractats sn elssubproductes no comercialitzables per humans que han sofert algun procs industrialper obtenir un producte final estable i comercialitzable. Aquests es caracteritzen per serun producte heterogeni i per un grau dhumitat baix. Per la seva part, els residusagrcoles no tractats, que tamb sn subproductes no comercialitzables per humans, escaracteritzen per ser un material relativament homogeni per amb un elevat graudhumitat. 9 16. INTRODUCCI10 17. OBJECTIUS 18. OBJECTIUS2. OBJECTIUS2.1 Objectiu generalDesenvolupar lestrategia de colonitzaci dun sl per T.versicolor mitjanantladdici de substrats lignocellulsics.2.2 Objectius parcials- Caracteritzar els substrats lignocellulsics- Avaluar la capacitat de colonitzaci dels substrats pel fong T.versicolor considerant la producci de dixid de carboni, lacasa i ergosterol- Estimar la capacitat de T.versicolor per colonitzar sl estril i no estril- Valorar la capacitat degradativa de T.versicolor en sl12 19. MATERIALS I MTODES 20. MATERIALS I MTODES3. MATERIALS I MTODES3.1. Soca del fong La soca de T.versicolor ATCC 42530 va ser adquirida a la American Type CultureCollection i mantinguda per subcultius cada 30 dies en placa dagar al 2% en pesdextracte de malta (pH 4.5) a 25C. La suspensi micelial de T.versicolor es vapreparar segons el procediment descrit per Borrs (2007).3.2. Productes qumics El naprox ((S)-(+)-methoxy-!-methyl-2-naphthalene acetic acid, 98%) ilergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3"-ol, >95%) van ser adquirits a Sigma-Aldrich Co(St. Louis, MO).3.3. Sl i substrats El sl utilitzat procedeix dun horitz A dun sl agrcola de Prades (Catalunya),tamisat a 5 mm i emmagatzemat a 4C a la foscor. Les principals caracterstiquesfsiques daquest sl sn: pHaquos 5.1, pHKCl 4.5, 2% de materia orgnica, 77.35% desorra, 2.10% de llim, 10.55% dargila, Corg 1.28%, 0.12% Ntot i 12.1% de capacitat deretenci daigua (tots els percentatges referits a pes). Com a substrats es van utilitzar quatre residus agrcoles i tres pinsos per conill.Com a substrats agrcoles es va fer servir panotxa de blat de moro Pn , serradures Se , pellofes darrs Ar i palla Pa . Les tres tipologies de pinsos per conillutilitzades foren Praga C1 (preparat a base de palla), Pinso Suprem C2 i PinsoFigueres C3 (tots dos pinsos estan destinats a lengreix dels animals).3.4. Procediments experimentals3.4.1. Condicions de cultiu en els substrats Es van preparar dos grups de tubs de pyrex (100 x 24 mm), el primer grup amb 3 gen pes sec (PS) de cada substrat, per triplicat, per les proves dactivitat lacasa iergosterol i el segon amb 0.5 gPS de cada substrat, per triplicat, per a les proves ND24.Tots els tubs van ser autoclavats dos cop abans de ser inoculats. Posteriorment, es vaprocedir, en condicions estrils, a humitejar els substrats amb aigua destillada estrilfins assolir el 60% dhumitat i a linoculaci de 1 mL de soluci micellial deT.versicolor. Els cultius van ser incubats a 25C fins al moment de la seva utilitzaci.14 21. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACITot el contingut de cada mostra va ser sacrificat en el moment de realitzaci de lesproves.3.4.2. Colonitzaci del sl Es van utilitzar cultius de 7 dies, preparats segons el procediment expossat alapartat 3.4.1., als quals sels va addicionar sl estril per al primer experiment decolonitzaci i sl no estril per al segon experiment de colonitzaci. Es van afegir 9 g desl per al primer grup de tubs (proves dactivitat lacasa i ergosterol) i pel segon grup detubs 1.5 g de sl (prova ND24) i es va realitzar lassaig per triplicat. Treballant encondicions esterils, es va adicionar el sl, es va homogenetzar la mostra i es va afegiraigua fins assolir un 60% dhumitat. Els cultius van ser incubats a 25C fins al momentde realitzar les proves corresponents, on es va sacrificar el total de cada mostra.3.5.Mtodes analtics3.5.1. Determinaci de la humitat La determinaci de lhumitat inicial del sl es va fer pessant un volum homogeni desl en un vas de precipitats i deixant-lo secar a 105C durant 24 h. Es va calcular com ladiferncia entre el pes inicial i el pes sec de sl i es va expressar com percentatgedhumitat.3.5.2. Composici elemental dels substrats La determinaci de la composici elemental dels diferents substrats es va realitzaral Servei dAnlisi Qumica (SAQ) de la Universitat Autonoma de Barcelona(Bellaterra). La composici elemental es determinara per combusti dels substrats a1200C en atmosfera doxigen i posterior quantificaci per cromatografia de gasos delcarboni, nitrogen i hidrogen. Per la seva part, el sofre es va determinar utilitzant unanalitzador elemental CHNS Eurovector 3011. Els resultats es van expressar com apercentatge de massa.3.5.3. Determinaci de les capacitats de camp La determinaci de la capacitat de camp dels diferents substrats i del sl es varealitzar per triplicat omplint cilindres oberts pels dos extrems (un dels extrems recobertamb paper de filtre per evitar possibles perdues de material) fins a una tercera part delseu volum amb els substrats. Es van dipositar en una safata amb aigua, la qual cobrialalada dels substrats sense superar-la, durant 2 h. Posteriorment, es van deixar secar15 22. MATERIALS I MTODESper capilaritat sobre paper de filtre durant 30 min, per extreure lexcs daigua, i, acontinuaci, es van secar a 105C durant 24 h. La quantificaci de la capacitat de campdels substrats es va fer per diferncia entre el pes humit i el pes sec final i es vaexpressar com a grams daigua per gram de substrat sec.3.5.4. Determinaci del pHaquos i del pHKCl Per mesurar el pHaquos i pHKCl es van dissoldre 5 g de cada substrat en 25 mL desoluci, aigua destillada i KCl respectivament, i es van agitar durant 15 min a 120 rpm.Transcorregut aquest temps, es van deixar reposar durant 1 h i es va realitzar la mesuradel pH del sobrenedant. Les mesures de pHaquos i pHKCl de la barreja de sl ms substrates van realitzar de la mateixa forma per dissolent 10 g de la barreja en 25mL de cadasoluci.3.5.5. Quantificaci de lergosterol Lergosterol va ser extret dels cultius amb substrat o amb subtrat i slhomogenetzats, tal i com sha descrit anteriorment (Rodrguez-Rodrguez et al., 2010).De forma resumida, entre 0.5 i 0.8 g de cada mostra es van extreure amb una solucid1 mL de ciclohex i 3 mL de KOH-metanol (10% m/v) durant 90 min a 70C (es vaaplicar sonicaci durant el primers 15 min, J.P. Selecta, Barcelona). Posteriorment es vaafegir 1 mL daigua destillada i 2 mL de ciclohex i la mescla va ser vortejada icentrifugada a 3500 rpm durant 5 min (Heraeus Pico21 Centrifuge, Thermo ElectronCorporation, USA). Es va recuperar la fase orgnica i la fase aquosa va ser rentada, doscops, amb 2 mL de ciclohex. La fase orgnica es va possar sota un corrent gasos de N2per tal devaporar-la i el residu es va redissoldre en 1 mL de metanol durant 15 min a40C. Lanlisi es va portar a terme en un HPLC (Dionex 3000 Ultimate, Sunnyvale,CA) equipat amb un detector UV a 282 nm, utilitzant una columna de fase inversaGrace Smart RP18 (250 x 4 mm, mida de particula 5 !m, Deerfield, IL). Leluent erametanol amb un cabal d1mLmin-1. El temps de retenci per lergosterol sdaproximadament 6.8 min. El contingut dergosterol va ser expressat com amilligrams per gram de pes slid sec (mggPS-1).3.5.6. Degradaci del Naprox (ND24) Es va utilitzar una prova basada en la degradaci del naprox en 24 hores (ND24),definida per Rodrguez-Rodrguez et al. (2010), com a indicador de la capacitatdegradativa del fong en sls esmenats amb diferents substrats. Per triplicat, es van16 23. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBREDIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIutilitzar cultius de 11 i 20 dies per al sl estril i cultius de 10 i 13 dies per al sl noestril, amb un contingut total, en pes sec, de 2 g, als quals sels va addicionar unasoluci de naprox per obtenir una concentraci final aproximada de 0.01 mggPS-1. Ams, es van utilitzar cultius previament autoclavats, com a controls inactivats per calor acada temps de mostreig, per triplicat. Desprs de 24 h, el contingut total dels cultius esva liofilitzar (liofilitzador Virtis Sentry, Gardiner, NY) i, posteriorment, sotmesos a unaextracci lquida per Soxhlet (Buchi 811, Sussa) utilitzant metanol com a solvent i ambels segents parmetres doperaci: fase 1: 2 h i 20 cicles a nivell 14 de temperatura,fase 2: 10 min, nivell 14 i inert gas (N2) i fase 3: 30 min, nivell 5 i inert gas (N2). Elvolum de mostreig es va ajustar a 10 mL i es van preparar alquotes de 1.5 mL que vanser centrifugades (Heraeus Pico21 Centrifuge, Thermo Electron Corporation, USA) a10000 rpm durant 5 min; el sobrenedant va ser transferit a vials amber per HPLC per alposterior anlisi. Lextracci quantitativa del naprox va ser verificada previament peraquest mtode (>95%).3.5.7. Quantificaci del NaproxEls anlisis de naprox es van realitzar per HPLC (Dionex 3000 Ultimate,Sunnyvale, CA) equipat amb un detector UV a 230 nm. La separaci cromatogrfica esva portar a terme mitjanant linjecci de 20 !L de les mostres en una columna GraceSmart RP18 (250 x 4 mm, mida de particula 5 !m, Deerfield, IL) i una fase mobil al65% dcid actic 6.9 mmol L-1 i el 35% dacetonitril, bombejats isocrticament a1mLmin-1 (Stafiej et al., 2007). El temps de retenci va ser aproximadament de 14.1min.3.5.8. Mesures de CO2Es van preparar ampolles tipus wheaton de 160 mL, tancades hermticament ambsptum teflonat, amb 3 gPS de cada tipus de substrat i per valor dhumitat desitjat, pertriplicat. Totes les ampolles van ser autoclavades dos cop abans de ser inoculades.Posteriorment, es va procedir, en condicions estrils, a humitejar els substrats amb aiguadestillada estril fins assolir els valors dhumitat desitjats i a linoculaci de 1 mL desoluci micellial de T.versicolor. Els cultius van ser incubats, en el transcur de la prova,a 25C. 17 24. MATERIALS I MTODES3.5.9. Determinaci del CO2 Els anlisis de CO2 es van realitzar utilitzant un cromatograf de gasos HP5890equipat amb un detector FID. La separaci cromatogrfica es va fer mitjanantlinjecci de 100 !L de les mostres en una columna Porapac (3000 mm) a 70C i ambheli com a gas portador. El temps de retenci va ser aproximadament de 1.8 min.3.5.10. Activitat Lacasa Lenzim lacasa es va extreure dacord amb el mtode modificat de Lang et al.(1998): es van adicionar 30 mL de tamp dacetat de sodi (0.16M, pH 5) a 3 g demostra homogenetzada i es van agitar durant 30 min a 4C. Es van pendre 1.5 mL delsextractes i es van centrifugats a 15 000 g durant 15 min (Beckman J2-21M/ECentrifuge, Espanya) i, a continuaci, sanalitza el sobrenedant. Lactivitat enzimticaes va mesurar mitjanant el primer pas del mtode per a la determinaci del mangansperoxidasa (Wariishi et al., 1992) utilitzant 2,6-dimetoxifenol (DMP) com a substrat.Lactivitat lacasa sexpressada com unitats dactivitat per gram de pes slid sec(UAgPS-1); una unitat dactivitat es defineix com un micromol de DMP oxidat perminut (molmin-1).18 25. RESULTATS I DISCUSI 26. RESULTATS I DISCUSI4. RESULTATS I DISCUSI En aquest apartat es presenten i discuteixen els resultats obtinguts en el transcurs deles proves realitzades. Els experiments realitzats es van dividir en tres fases, dacordamb els objectius parcials descrits a lapartat 2. La primera fase es planteja com lacaracteritzaci de tots els substrats a emprear i la selecci dels substrats ms adients perla producci enzimtica i creixement de T.versicolor, en base a la composici elementaldels substrats, la producci de CO2 del fong al colonitzar-los i la mesura de lactivitatlacasa i de la biomassa (desenvolupat en els subapartas 4.1. i 4.2.). Un cop es vanescollir els substrats ms adients, es va iniciar la segona fase experimental, que pretenavaluar la capacitat del fong per colonitzar sls esmenats amb els substrats seleccionatsen lanterior fase (subapartats 4.4. i 4.5.). Lltima fase (exposada al subapartat 4.6.) esva plantejar per tal davaluar la capacitat degradativa dun compost qumic especfic perT.versicolor en sl.4.1.Caracteritzaci dels substrats A la taula 4.1. es presenten les principals propietats fisicoqumiques dels diferentssubstrats utilitzats. Cal fixar-se que els substrats C1, C2 i C3 presenten una capacitat decamp i uns valors de pHaquos i pHKCl fora similars, per les relacions C/N snsensiblement diferents, especialment entre C1 i els altres dos. Tamb cal destacar lasemblana entre Pa i els substrats C2 i C3 pel que fa a les capacitats de camp i amb C1pel que fa a la capacitat de camp i la relaci C/N. Taula 4.1. Caracteritzaci fisicoqumica dels diferents substrats utilitzats Capacitat de campCHN O SC/NSubstrat pHaquos pHKCl(gH2Og subs-1)(%m) (%m) (%m) (%m) (%m) (m/m)C1 3,1341,51 5,891,0351,6 < 1%40,155,655,66C2 3,3340,65 6,103,4649,8 < 1%11,755,355,15C3 3,3739,93 6,212,5051,4 < 1%15,985,315,13Pn 1,0345,15 6,480,5747,8 < 1%79,673,993,44Pa 3,6642,69 5,990,8350,5 < 1%51,39Se2,340,80 5,380,3353,5 < 1% 121,323,963,47Ar7,246,60 6,110,0447,2 < 1% 1075,32 5,334,79 Segons estudis anteriors del grup de recerca en qu senmarca el treball, el pHptim per la producci de lacasa de T.versicolor en medi lquid es situa al voltant de 4.5(Lorenzo et al., 2002). Donat aix, i considerant un rang de tolerncia de pH de 4 5.5,s desperar que els diferents substrats siguin aptes per a la producci de lacasa.20 27. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACI Altrament, les relacions C/N queden dintre del rang ptim descrit per molts autorsper a la producci de lacasa, situat entre 15:1 i el 30:1. Tal i com es pot apreciar a lataula 4.1. el substrat C3 s lnic que es troba dintre daquest rang, per els susbtrats C1i C2 hi estan bastant prxims. Tot i que les diferncies en el percentatge de carbonientre els substrats sn relativament altes (rang del 6.67% entre el valor ms baix C3 i el valor ms alt Ar) i les diferncies en quan a percentatge de nitrogen sn menyssignificatives (rang del 3.42% entre el valor ms baix Ar i el valor ms alt C2) saquest ltim component el que pot fer que un substrat sigui ms idoni per T.versicolor,ja que al ser el component minoritari actuar com a factor limitant en el creixement delfong i, possiblement, estimular la producci denzims ligninoltics. Per la seva part, la capacitat de camp mxima es dna pel substrat Ar, per s forasimilar pels substrats C1, C2, C3 i Pa i s ms baixa en els substrats Se i Pn. Lacapacitat de camp sha dentendre com una mesura de la porositat aparent de cadasubstrat i, per tant, de la capacitat de cadascun per retindre aigua per capillaritat. Caltindre present que el fong necessita de la presncia daigua en el medi per tamb enprodueix en la respiraci. Per tant, caldra selecionar aquells substrats que permetin unabona disponibilitat daigua al fong per evitant que es doni un excs daigua que puguiafavorir altres organismes que entrin en competncia amb T.versicolor (Baldrin, 2004)4.2. Mesures de CO2 La producci de CO2 per T.versicolor es deu al consum del substrat. Com qualsevolaltre organisme que realitza la respiraci aerbica, el fong oxida la materia orgnicaconsumint oxigen i produn, entre daltres, aigua i dioxid de carboni. Tal i com es pot apreciar a la figura 4.1. la producci de CO2 per cada substrat sdiferent, per es poden agrupar en dos grups en funci de la tendencia observada i delsrangs de concentraci de CO2. Per una part, hi ha el grup format pels substrats C2 i C3 (figura 4.1. a i b,respectivament). Aquests presenten un mxim de la concentraci de CO2 unes 40 unitatssuperior a la dels altres substrats. Tot i que la fase de latncia s similar als altressubstrats, es dna durant les 24 h posteriors a linoculaci de T.versicolor, la fase decreixement s ms prolongada i la producci de CO2 no sestabilitza, aproximadament,fins el dia 6-8, amb un valor de 46.9% CO2 per C2 i C3 (60% dhumitat en tots doscasos). Posteriorment, sobserva un augment de la concentraci el dia 13, assolint-se21 28. RESULTATS I DISCUSIvalors mxims de CO2 del 82.2% (80% dhumitat) per C2 i del 84.6% (60% dhumitat)per C3.a) b)c) d)e) f)Figura 4.1. Acumulaci del CO2 al llarg del tempspels diferents substrats: a) C2, b) C3, c) C1, d) Pa,e) Pn, f) Se i g) Ar. Concentraci expresada com apercentatge respecte el volum total daire. Grausdhumitats: 80%,60%, 40% i20%. Les barres derror representen lerrorestndard.22 29. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACI Per altra part, cal considerar un altre grup format pels substrats C1, Pa, Pn, Se i Ar(figura 4.1. c, d, e, f i g, respectivament) on tamb sobserva una fase de latncia durantles primeres 24 hores, per entre els dies 1 i 5 es dna una fase de creixementexponencial, assolint una concentraci mxima de CO2 del 37.7% pel substrat C1 ambuna humitat del 60%. Tamb cal tindre present les diferncies que es donen per cada grau dhumitat isubstrat. Mentres que per Pa, Pn, Se i Ar no hi ha una diferncia acusada en laproducci de CO2 pels diferents nivells dhumitat, per C1, C2 i C3 cada grau dhumitatpresenta unes diferncies no menyspreables quant a tendncia i a concentraci de CO2.En general, a major contingut dhumitat es detecta una major concentraci de CO2 i, pertant, es pot supossar un major creixement del fong. Aquest fet es pot explicar per un diferent comportament dels substrats vers lahumitat. Els substrats C1, C2 i C3 presenten una porositat aparent major (augment delvolum a lincrementar-se la humitat, donant lloc a materials ms voluminosos iesponjosos) a la dels substrats Pa, Pn, Se i Ar. Altrament, els substrats C1, C2 i C3 abaixos nivells dhumitat presenten uns valors mxims en les concentracions de CO2relativament properes a les dels altres substrats. Donat els valors presentats, aquesta prova es va poder utilitzar per realitzar unprimer triatge dels substrats en funci del CO2 produt, assumint que aquest estrelacionat amb la capacitat de T.versicolor per assimilar cada substrat. Es va decidir noutilitzar en els segents experiments els substrats Se i Ar perqu donavan una menorconcentraci de CO2, per sota del 20% en gran part dels punts de mostreig, durant lafase de manteniment del fong. Altrament, es va decidir treballar amb una humitat al60% perqu amb aquesta sobtenien unes elevades concentracions de CO2 i perqu unmenor contingut en aigua disminueix les possibilitats que el cultiu sigui contaminat peraltres microorganismes, tals com bacteries; s a dir, a menor quantitat daigua majorefecte selectiu pel creixement del fong vers altres organismes.4.3.Colonitzaci dels substrats A la segona part de la primera fase experimental es va estudiar el comportament delfong sobre els substrats seleccionats anteriorment en condicions estrils. Per una part, esva monitoritzar el creixement del fong mitjanant el seguiment de la biomassa viable de23 30. RESULTATS I DISCUSIfong en els substrats a travs de la quantificaci de lergosterol. Per altra part, es va ferun seguiment del seu sistema enzimtic extracellular a partir del seguiment delactivitat lacasa.4.3.1. Seguiment ergosterol A la figura 4.2. es representen els valors dergosterol obtinguts en T.versicolorinoculat sobre substrat estril. Tal i com es pot observar, hi ha una gran variabilitat alllarg del temps i entre els diferents substrats, per es poden apreciar unes certestendncies entre grups de substrats. Figura 4.2. Seguiment de la concentraci dergosterol en cultius de T.versicolor en 3 g dels substrats: C1, C2, C3 , Pni Pa . El dia 0 el valor dergosterol s teric, considerant que 1 mL de soluci micellial t una concentraci de biomassa de 0.05 g. Les barres derror representen lerror estndard. Els substrats C2 i C3 segueixen una mateixa tendncia. En la primera mostra,desprs de tres dies des de linoculaci, sobserva un nivell elevat dergosterol de 0.130mggPS-1 i 0.196 mggPS-1, respectivament, per que disminueix en la segent mostraper tornar a augmentar continuant amb una tendncia linial a partir del dia 7 des delinoculaci sense que sobservi una estabilitzaci al final de lexperiment. Els nivellsassolits el dia 17 sn de 0.332 mggPS-1 i 0.254 mggPS-1, respectivament.24 31. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIPer altra part, el substrat C1 es detecta un nivell dergosterol a la primera mostra de0.116 mggPS-1, molt similar a lobtingut amb el substrat C2, per a diferncia delsubstrat C1 el nivell dergosterol disminueix lentament fins el final de lexperiment.Finalment, pels substrats Pn i Pa es detecten nivells dergosterol molt baixos(0.062 mggPS-1 i 0.019 mggPS-1,respectivament, el dia 3) amb molt poca variaci alllarg del temps.Visualment es va comprovar que els substrats C2 i C3 eren els que experimentavenun major creixement del fong, seguits del substrat C1. Per tots tres el creixement va serfora homogeni entre els diferents cultius al llarg de lexperiment. El substrat Papresentava un creixement fora ms baix que els anteriors per es va poder observar elcreixement del fong des del primer dia. En canvi, el susbtrat Pn va presentar,visualment, un creixement molt baix i no va ser fins al dia 5 que es van comenar aapreciar els primers indicis de creixement en alguns dels cultius.Amb les mesures de lacumulaci del CO2 shavia observat que els substrats C2 iC3 eren els que presentaven una major concentraci de CO2, seguits per C1, i que Pa iPn eren els substrats amb una menor concentraci i amb uns valors similars. Amb elseguiment de lergosterol sha observat la mateixa tendncia, C2 i C3 sn els substratsque presenten una major biomassa viable de fong, seguits per C1 amb una concentracidergosterol fora inferior respecte els anteriors. Finalment, Pa i Pn sn amb els quesha obtingut una menor concentraci dergosterol, que a anat decreixent al llarg deltemps.4.3.2. Producci lacasaEn aquest primer experiment de colonitzaci en condicions estrils, lactivitat de lalacasa va ser utilitzada, juntament amb lergosterol presentat anteriorment, com unsegon mtode per seleccionar els substrats ms adients pel creixement de T.versicolor.Com es pot observar a la figura 4.3.b el substrat C2 s el que presenta una majoractivitat lacasa, aproximadament un ordre de magnitud superior als altres substrats,assolint un mxim de 12.21 UAgPS-1 el dia 10. Per aquest substrat es dna un augmentde lactivitat lacasa sostingut i practicament linial fins el valor mxim. A partir daquestcomena a descendir fins el dia 14 (2.066 UAgPS-1), on experimenta un nou ascens(6.080 UAgPS-1). Donat aix, es pot considerar que T.versicolor no comena a excretar25 32. RESULTATS I DISCUSIla lacasa fins el dia 3. Posteriorment, a partir del dia 10, sobserva un decreixement enlactivitat que es podria atribuir a la desactivaci del sistema enzimtic. a)b) Figura 4.3. Seguiment de lactivitat lacasa en cultius de T.versicolor. a) : C1 , C3, Pn i Pa i b) C2 . Lactivitat lacasa est expressada com a unitat dactivitat (UA) per gram de matriu slida en pes sec. Les barres derror representen lerror estndard. Els substrats C1 i C3 (figura 4.3.a) sn els segents en presentar una major activitatlacasa, dintre del mateix rang i amb unes tendencies diferents, assolint uns mxims de1.113UAgPS-1 i 1.371 UAgPS-1 els dies 7 i 12, respectivament. Pel substrat C1lexcreci de la lacasa sobserva a partir del dia 5 i continua fins el dia 7, moment en elqual assoleix el valor mxim. A partir daqu, comena a disminuir fins el dia 14, on esmante gaireb constant fins el dia 16. El substrat C3 presenta un comportament msoscillant, amb un creixement important entre els dies 2 i 3 seguit dun interval dedescens fins el dia 10. Posteriorment assoleix el seu mxim, per disminueixbruscament entre els dies 14 i 16, assolint un valor (0.334 UAgPS-1) proper al delsubstrat C1 en el mateix temps (0.301 UAgPS-1). Els substrats Pa i Pn sn els que assoleixen uns valors ms baixos, amb unsmxims de 0.273 UAgPS-1 i 0.068 UAgPS-1, respectivament, el dia 7. En tots dossubstrats no es detecta lacasa fins el dia 7, aix com els nivells detectats a partir del dia10 sn menyspreables. En base els resultats obtinguts en la quantificaci dergosterol i lactivitat lacasasobre substrats es va decidir no utilitzar les substrats Pa i Pn en els posteriorsexperiments. Per una part, sn els substrats que presenten una menor biomassa viable defong en el transcurs de les proves realitzades i s necessari que al treballar amb sl, en elmoment de laddici daquest, el fong estigui en unes ptimes condicions per tal que26 33. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIpugui afrontar les noves condicions de lambient i colonitzar-lo amb xit mantenint lacapacitat degradativa. Per altra part, tamb han estat eliminats perqu sn els substratson la lacasa ha estat fora ms baixa, ja que s del nostre inters mximitzar laproducci de lacasa per a futurs treballs de tractament de sls contaminats, ja que shademostrat que aquesta, entre daltres sistemes enzimtics que hi poden intervenir, estimplicada en la degradaci de diversos pollutants.4.4. Colonitzaci del sl estril A la segona fase experimental es va estudiar el comportament de T.versicolor sobresl estril esmenat amb els substrats previament seleccionats. En aquest experiment esvan fer servir cultius de T.versicolor precrescuts en substrats estrils als quals sels vaaddicionar sl estril en el moment diniciar els experiments. Com en lapartat 4.3. shamonitoritzat lergosterol i la lacasa per avaluar lestat de T.versicolor. Altrament, a lataula 4.2. es presenten els pHs de les matrius utilitzades en aquesta fase experimental.En general es pot observar que laddici de sl als substrats fa disminur el pH daquestslleugerament (excepte el pHaquos del sl esmenat amb C1), per els valors de pHcontinuent quedant dintre del rang ptim definit anteriorment. Taula 4.2. Valors dels pHs del sl esmenat amb substrats MesclapHaquospHKClSl + C1 5,815,47Sl + C2 5,265,01Sl + C3 5,214,914.4.1. Seguiment ergosterol En aquest cas (figura 4.4.), els valors inicials dergosterol (dia 0) disminueixenbruscament fins al dia 4 com a conseqncia daddici del sl estril (dia 0) en elscultius de 7 dies dantigitat. Sobserva una fase de latncia, deguda al procs daddicii homogenitzaci de la matriu substrat-sl, que pels substrats C2 i C3 dura fins al dia 4 iper C1 sallarga fins el dia 6. Com en la colonitzaci sobre substrats, les tendncies delergosterol sn oscillants per segueixen una tendncia comuna.27 34. RESULTATS I DISCUSI Figura 4.4. Seguiment de la concentraci dergosterol en cultius de T.versicolor en matrius de sl estril esmenades amb els substrats C1 , C2i C3. Les barres derror representen lerror estndard. El substrat C2 experimenta un ascens des del dia 4 fins el 8 de 0.234 mggPS-1dergosterol, moment en el qual incrementa lentament i assoleix el seu mxim el dia 13(0.275 mggPS-1). A partir daqu, es dna un descens situant-sha, finalment, a 0.165mggPS-1 el dia 18. En termes generals, el substrat C2 s el que presenta una majorconcentraci dergosterol per gram de matriu seca entre els dies 4 i 13, per el dia 18 espot considerar que saquipara a C3. Anteriorment, en lexperiment amb noms substrats(figura 4.2.), el C2 presentava una menor concentraci dergosterol respecte C3 aexcepci dels dies 7 (on tots dos sigualaven), 14 i 17. Altrament, el comportament delergosterol de C2 en la colonitzaci de substrats no s tant oscillant com en aquestexperiment i es pot observar un increment sostingut des del dia 5. El substrat C3 s el que presenta una major concentraci dergosterol el dia 0(0.134 mggPS-1) per s el que t un major descens al dia 4 (0.003 mggPS-1).Posteriorment i fins el dia 8 hi ha un ascens que es veu afectat el dia 11 per un lleugerdescens de 0.051 mggPS-1, per tenint en compte lerror associat a la mesura es potconsiderar que aquest es va mantindre practicament constant. El dia 13 assoleix el seumxim dergosterol (0.229 mggPS-1), a partir del qual descendeix fins el dia 18 amb unvalor final de 0.177 mggPS-1. En lanterior experiment de colonitzaci de substrats, C3era el substrat que presentava, de forma general, una major concentraci dergosterolper gram, de pes sec, de matriu slida, per a diferncia de C2 aquest si que segueix uncomportament similar en tots dos experiments: presenta un descens important abans28 35. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIdassolir el mxim dergosterol per, tot seguit, tornar a disminur i mantindres ms omenys estable al voltant dun cert valor. Comportaments similars shan observat durantla colonitzaci de llots de depuradores en sistemes de fase slida similars (Rodrguez-Rodrguez et al., 2010).El substrat C1 s el que presenta una menor concentraci dergosterol en tots elsdies de mesura. A diferncia dels altres dos substrats, i com ja sha comentat, s el quepresenta una fase de latncia ms llarga, fins el dia 6. A partir daqu segueix unatendencia similar a la del substrat C3 retrasada dos dies, assolint un mxim de 0.086mggPS-1 el dia 15, a partir del qual descendeix fins una concentraci final de 0.043mggPS-1 dergosterol. A diferncia del subapartat 4.3.1. on C1 disminua gradualmentdes del valor mxim inicial, aqu presenta un seguit doscillacions per els valors snmolts prxims als de la colonitzaci de substrats.4.4.2. Producci lacasaCom en lexperiment anterior sha mesurat lactivitat lacasa per avaluar el sistemaenzimtic de T.versicolor per en aquest cas en matrius de sl-substrat en condicionsestrils. A la figura 4.5. es presenten els resultats obtinguts referents a la producci delacasa en sl estril.Figura 4.5. Seguiment de lactivitat lacasa en cultius de T.versicoloren matrius de sl estril esmenades amb els substrats C1 , C2i C3 . Les barres derror representen lerror estndard.Tal i com succea en al subapartat 4.3.2. (figura 4.3.), el substrat C2 s el quepresenta una major activitat lacasa, assolint un mxim de 2.553 UAgPS-1 el dia 8 per a29 36. RESULTATS I DISCUSIdiferncia de lexperiment de colonitzaci de substrats, en aquest presenta una activitatde lacasa inferior (4.8 vegades inferior, entre els mxims de cada prova). Entre el dia 0 i8 es detecta el nivell ms elevat, a partir del qual comena a disminur. Des del dia 0fins el dia 13 la tendncia de C2 en sl estril s similar a la tendncia que presentava ala figura 4.3. des del dia 3 fins el 16. Per en la figura 4.5. es pot observar que a partirdel dia 13 continua descendint, assolint un valor final de 0.332 UAgPS-1 el dia 20, moltprxim al de C3 al mateix dia. El substrat C3 presenta una activitat lacasa superior a la de C2 el dia 0 (0.906UAgPS-1), per a partir daqu la seva activitat s menor. C3 assoleix nivells de 1.380UAgPS-1 els dies 6 i 8. Finalment, lactivitat lacasa acaba decreixent fins a 0.348UAgPS-1 el dia 20. Tot i que la seva tendncia en la colonitzaci de substrats s msoscillant que en la colonitzaci de sl estril, sassoleixen valors mxims molt propers. Per la seva part, el substrat C1 s el que presenta una menor activitat de lacasa en lacolonitzaci de sl estril. Aquest substrat s el primer de tots tres en assolir el seumxim dactivitat, el dia 4 amb un valor de 0.400 UAgPS-1. A partir del dia 6 i fins eldia 13 es mante constant al voltant dun interval de 0.200 0.018 UAgPS-1 i assoleixun valor final de 0.128 UAgPS-1 el dia 20. En lanterior experiment de colonitzaci desubstrats, C1 havia obtingut valors dactivitat ms elevats i una tendencia decreixentms lenta que en sl estril, sense observar-se que la mesura sestabilitzes al voltant decap valor. En general, sobserva que hi ha poder oxidatiu de tots els cultius (amb totes lesmesclas de sl-substrat estudiades) en el transcurs de tot el perode destudi.4.5.Colonitzaci del sl no estril Fins aquest moment tots els experiments estavan dirigits a buscar i triar elssubstrats que potenciaven el creixement del T.versicolor en diferents matrius encondicions estrils. A la segona part daquesta fase experimental es busca avaluar elcomportament del fong en condicions no estrils, ms prximes a la realitat dun procsde bioremediaci. A escala pilot es pot treballar en condicions desterilitat per a laprctica s impossible, donat els alts costos que comportarien i que farien inviablequalsevol procs de micoremediaci. s per aquest motiu que sha optat per repetirlexperiment exposat a lapartat 4.4. per treballant amb un sl no estril. El fet derealitzar el mateix procs experimental permet un alt grau de comparaci entre resultats.30 37. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACI4.5.1. Seguiment ergosterolEl seguiment de lergosterol en sl no estril es pot observar a la figura 4.6. Tal icom a succet amb les anteriors proves, el susbtrat C1 es el que presenta una menorconcentraci dergosterol en el transcurs de tot lexperiment i els resultats obtinguts ensl no estril es corresponen amb la tendncia observada en sl estril (figura 4.4.) desdel dia 0 fins el 11. Parteix dun valor inicial (dia 0) de 0.026 mggPS-1 a partir del qualva ascendint gradualment fins assolir un valor final i mxim de 0.105 mggPS-1 el dia13. Figura 4.6. Concentraci dergosterol en cultius de T.versicolor en matrius de sl no estril esmenades amb els substrats C1 , C2 i C3 . Les barres derror representen lerror estndard.Els substrats C2 i C3 tamb presenten una tendncia conjunta molt similar alobservada en sl estril per amb uns valors de concentraci dergosterol superiors.Com al subapartat 4.4.1 (figura 4.4) C3 s el que presenta una major concentraci el dia0, amb un valor de 0.391 mggPS-1 seguit per C2 amb 0.341 mggPS-1. PosteriormentC3 disminueix lleugerament el dia 6 (0.292 mggPS-1) per tornar a creixer el dia 10, finsassolir el seu mxim de 0.481 mggPS-1 el dia 13. En canvi, C2 augmenta des del dia 0fins el 10, quan assoleix el seu mxim de 0.486 mggPS-1, moment en el qual disminurafins assolir un valor final de 0.321 mggPS-1 el dia 13.Com ja sha expossat, les tendncies en la concentraci dergosterol de tots tressubstrats s molt similar en sl estril i no estril, per els seus valors, tant mxims commnims, sn fora ms elevats en sl no estril. En canvi, en la colonitzaci de substratsshavien observat unes tendncies ms irregulars, oscillants, en el transcurs de les31 38. RESULTATS I DISCUSIproves, per amb uns valors mxims superiors que en sl estril i inferiors als obtingutsen sl no estril. Altrament, els valors mxims obtinguts en substrats es donen a tempsms llunyans, el dia 17 pels substrats C2 i C3. El substrat C1 s el que presenta uncomportament ms diferent respecte lexperiment de colonitzaci de substrats i els decolonitzaci de sls, estrils i no estrils. En el primer cas presentava un valor mxim eldia 3 a partir del qual disminua i en les colonitzacions de sl, en canvi, presentava elsvalors ms baixos en els primers temps, a partir dels quals creixia, assolint valors finalssuperiors als inicials.4.5.2. Producci lacasa A la figura 4.7. es presenten les dades obtingudes en la mesura de lactivitat lacasaen sl no estril esmenat amb els substrats C1, C2 i C3 al llarg de 13 dies amb 4 puntsde mostreig.Figura 4.7. Activitat lacasa en cultius de T.versicolor en matrius de sl no estril esmenadesamb els substrats C1 , C2i C3 . Les barres derror representen lerrorestndard. Tal i com es pot apreciar, els resultats obtinguts per C2 i C3 sn fora superiors alsobtinguts en sl esteril. Tots dos substrats experimenten un fort creixement de lactivitatlacasa durant els primers dies, partint duns valors inicials (dia 0) de 1.243 UAgPS-1 ide 0.732 UAgPS-1, per C2 i C3 respectivament. C2 assoleix el seu mxim el dia 6(9.376 UAgPS-1) a partir del qual descendeix gradualment fins assolir un valor final de1.655 UAgPS-1 el dia 13. El susbtrat C3 experimenta un ascens de lactivitat lacasa finsel dia 10, moment en el qual assoleix un mxim de 12.554 UAgPS-1, per al dia 13descendeix bruscament fins un valor final de 3.550 UAgPS-1. En lanterior experiment32 39. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIshavia observat que lactivitat lacasa de C2 era superior a la de C3 en gran part delspunts de mostreig, per en sl no estril es pot observar que C3 s el que assoleix unmxim ms elevat, tot i que inicialment i durant els 6 primers dies s C2 el que presentauna major activitat. Tal i com ha succet en els posteriors experiments, C1 s el que presenta una menoractivitat lacasa respecte C2 i C3 i sobserva que els valors i tendncia que pren en slestril i no estril sn fora similars. Els nivells de lacasa detectats sn menyspreables alllarg de tot lexperiment amb valors inferiors a 1 UAgPS-1. Per tant els nivellsenzimtics detectats per C1 sn molt inferiors als altres. Lactivitat lacasa en tots tresexperiments s la que presenta unes majors variacions si es compar amb els resultats delergosterol. A grans trets es podria dir que el substrat C2 s el que dna una majoractivitat en els primers temps de les proves i que, per tant, afavoreix que el fong excretilenzim. C3 segueix una tendncia parallela a la de C2 normalment inferior, excepte perla colonitzaci de sl no estril. En canvi, C1 s el que presenta una menor activitatlacasa i uns mxims ms inferiors de forma general en tots tres experiments. Sha demostrat que la interacci entre microorganismes i T.versicolor en sl noestril provocava un augment de lactivitat lacasa. Els fongs de podridura blanca, en elmedi natural, tenen de competir amb altres organismes per tal de colonitzar el medi iobtenir els recursos necessaris. Aquest tipus de fongs susen dels substratsligninocellulsics i del seu sistema enzimtic extracellular per tal de prevenir i ferdecreixer les poblacions microbianes presents en els sls. Per tant, laugment delexcrecci de la lacasa s una resposta a les interaccions de T.versicolor amb altresmicroorganismes, tot i que no sha pogut determinar si aquesta actua com un inhibidorde la resta de microorganismes (Baldrin, 2004). Els resultats obtinguts en sl estril i noestril corroboren aquest fet, amb uns valors de lactivitat lacasa un ordre de magnitudsuperior en sls no estril que en sls estrils.4.6. Capacitat de degradaci del fong en medi slid Com a mesura de la capacitat degradativa de T.versicolor en sl estril i no estriles va optar per utilitzar el test ND24 definit per Rodrguez-Rodrguez (2010), basat enla degradaci del naprox inoculat en cultius daquest fong durant 24 h, utilitzant cultiusinactivats per calor com a blanc. La figura 4.8. mostra els resultats obtinguts en la provadel ND24 per T.versicolor en sl estril i no estril.33 40. RESULTATS I DISCUSILa degradaci del naprox per T.versicolor en sl estril (figura 4.8.a) mostra queel substrat C1 s el que presenta un major percentatge de degradaci, assolint uns valorsdel 46.7% el dia 11 i del 48.3% el dia 20. C2 presenta el seu mxim de degradaci el dia11, amb un 24.4%, el qual disminueix fins el 11.9% el dia 20. En canvi, C3 t unpercentatge de degradaci ms baix el dia 11 (11.5%) i ms alt el dia 20, amb un valordel 21.4%. a)b) Figura 4.8. Degradaci del naprox (ND24) per T.versicolor en cultis amb a) sl estril i b) sl no estril, esmenats amb els substrats C1 , C2 i C3. Les barres derror representen la desviaci estndard. La degradaci est expresada com a percentatge respecte cultius inactivats per calor.La degradaci en sl no estril (figura 4.8.b) s sensiblement inferior que en slestril. C1 torna a ser el substrat amb una major degradaci, amb un 20.9% el dia 10 iun 28.2% el dia 13. C2 presenta una degradaci del 6.9% el dia 10 i del 25.1% el dia 13.Finalment, C3 dna uns valors de degradaci del 5.1% el dia 10 i del 9.9% el dia 13.Com en el cas anterior, i considerant el percentatge acumulat de degradaci del naprox,amb C1 es presenta una major degradaci, seguit de C2 i C3, respectivament.Amb els anteriors mtodes es podia pensar que els substrats C2 i C3 eren els msidonis per al creixement i maximitzaci de la producci de lacasa per T.versicolor, peramb aquest test es pot provar que el substrat C1 s ms indicat per al seu possible s entractaments de micoremediaci. Per cal tindre present que la degradaci avaluada ambaquest mtode s per un compost especfic i que, per tant, el comportament deT.versicolor davant daltres contaminants pot donar lloc a resultats diferents dels aquexposats.34 41. CONCLUSIONS 42. CONCLUSIONS5. CONCLUSIONS Sha avaluat la possibilitat de fer creixer el fong Trametes versicolor sobresubstrats ligninocellulsics i sha pogut determinar que els substrats C1, C2 i C3 snels millors pel creixement de T.versicolor, tant en termes de producci de CO2, com debiomassa i de producci lacasa. Empreant un substrat precolonitzat sha estudiat la capacitat del fong per colonitzarsls en condicions estrils. Els resultats evidencien que T.versicolor s capa decolonitzar el sl estril a partir de substrats precolonitzats, amb els tres substratsempreats i dacord amb lexpressi enzimtica de lacasa i les unitats de biomassa. Igualment, T.versicolor ha estat capa de colonitzar el sl no estril a partir delssubstrats C1, C2 i C3 precolonitzats, obtenint uns valors de biomassa digual magnitudque en sl estril. La mesura de lenzim extracellular lacasa s un indicador dactivitat metablicadel fong i que en molts casos sassocia a la capacitat de degradaci de compostosrecalcitrants i la interacci amb altres microorganismes. La producci de lacasa encondicions no estrils s major que en condicions estrils pels 3 substrats estudiats enexperiments de colonitzaci de sls. Finalment, la capacitat degradativa del fong en sls precolonitzats sha avaluatmitjanant una novedosa tcnica que consisteix en avaluar la degradaci del naprox enun perode de 24 h i sha comprovat que T.versicolor es capa de degradar-lo en els tressubstrats, tant en condicions estrils com no estrils, tot i que les expresions de lacasa ibiomassa eren ms baixes a la dels altres substrats. Els millors percentatges sobtenenamb el substrat C1. Malgrat estar descrit que T.versicolor no s un fong tipicament empreat perbioremediaci de sls per la seva dificultat en creixer-hi, amb aquest treball sevidenciaque empreant un substrat ligninocellulsic adequat T.versicolor pot colonitzar el sl imantenir la capacitat degradativa, equiparable a la que tindria per aiges residuals.36 43. BIBLIOGRAFIA 44. BIBLIOGRAFIA6. BIBLIOGRAFIA14Bth, E. (2001) Estimation of fungal growth rates in soil using C-acetateincorporation into ergosterol. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 33, pp. 2011-2018Bth, E., i Anderson T.-H. (2003) Comparison of soil fungal/bacterial ratios in a pHgradient using physiological and PLFA-based techniques. Soil Biology &Biochemistry, Vol. 35, pp. 955-963Baldrin, P. (2004) Increase of laccase activity during interspecific interactions ofwhite-rot fungi. Microbiology Ecology, Vol. 50, pp. 245-253Ballaminut, N., i Matheus D.R. (2007) Characterization of fungal inoculum used insoil bioremediation. Brazilian Journal of Microbiology, Vol. 38, pp. 248-252.Childress, A.M., et al. (1998) Formulation of filamentous fungi for bioremediation.Biotechnology Techniques, Vol. 12, No. 3, pp. 211-214.Davis, M.W., i Lamar, R.T. (1992) Evaluation of methods to extract ergosterol forquantitation of soil fungal biomass. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 24, No. 3,pp.189-198.Ford, C.I., et al. (2007) Fungal inoculum properties: extracellular enzyme expressionand pentachlorophenol removal by new zealand trametes species in contaminated fieldsoils. Journal of Environmental Quality, Vol. 36, pp. 1749-1759.Gadd, G. M. (2001) Fungi in Bioremediation. Capitols: Degradation of plant cellpolymers (Evans i Hedger, pp. 1-20) i The biochemistry of ligninolytic fungi (Harvey iThurston, pp. 27-44). Cambridge University PressGassara, F. et al. (2010) Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolyticenzymes by Phanerocheate chrysosporium. Biochemical Engineering Journal (pendentde publicaci)Hgberg, M.N. (2006) Discrepancies between ergosterol and the phospholipid fattyacid 18:2!6,9 as biomarkers for fungi in boreal forest soils. Soil Biology &Biochemistry, Vol. 38, pp. 3431-3435.Jing, D., et al. (2007) Optimization of laccase production from trametes versicolor bysolid fermentation. Canadian Journal of Microbiology, Vol. 53, No. 2, pp 245-251.38 45. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBREDIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIKurt, S., i Buyukalaca, S. (2010) Yield performances and changes in enzyme activitesof pleurotus spp. cultivated on different agricultural wastes. Bioresource Technology,Vol. 101, pp. 3164-3169.Lestan, D. et al. (1996) Biological potential of fungal inocula for bioaugmentation ofcontaminated soils. Journal of Industrial Microbiology, Vol. 16, pp. 286-294Lorenzo, M. et al. (2002) Improving laccase production by employing differentlignocellulosic wastes in submerged cultures of trametes versicolor. BioresourceTechnology.Lorenzo, M., et al. (2002) Improving laccase production by employing differentlignocellulosic wastes in submerged cultures of trametes versicolor. BioresourceTechnology, Vol. 82, pp. 109-113.Meidute, S., et al. (2008) Antagonistic and synergistic effects of fungal and bacterialgrowth in soil after adding different carbon and nitrogen sources. Soil Biology &Biochemistry, Vol. 40, pp. 2334-2343.Mille-Lindblom, C., et al. (2004) Ergosterol as a mesure of living fungal biomass:persistance in environmental samples after fungal death. Journal of MicrobiologicalMethods, Vol. 59, pp. 253-262.Montgomery, H.J., et al. (2000) Determination of soil fungal biomass from soilergosterol analyses. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 32, pp. 1207-1217.Morgan, P., et al. (1993) Growth and biodegradation by white-rot fungi inoculated intosoil. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 25, No. 2, pp. 279-287.Nobuyuki, K., et al. (1995) Correlation of Brightening with Cumulative EnzymeActivity Related to Lignin Biodegradation during Biobleaching of Kraft Pulp by WhiteRot Fungi in the Solid-State Fermentation System. Applied and EnvironmentalMicrobiology, Vol. 61, No. 2, pp 617-622.Novotny, C. et al. (1999) Extracellular oxidative enzyme production and PAH removalin soil by exploratory mycelium of white rot fungi. Biodegradation, Vol. 10, pp. 159-168Olsson, P.A. (1999) Signature fatty acids provide tools for determination of thedistribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiology Ecology,Vol. 29, pp. 303-310. 39 46. BIBLIOGRAFIAPant, D., i Adholeya, A. (2007) Enhanced production of ligninolytic enzymes anddecolorization of molasses distillery wastewater by fungi under solid state fermentation.Biodegradation, Vol. 18, pp. 647-659.Pietikinen, J., et al. (2005) Comparison of temperature effects on soil respiration andbacterial and fungal growth rates. FEMS Microbiology Ecology, Vol. 52, pp. 49-58.Rodrguez Couto, S., et al. (2001) Strategies for improving ligninolytic enzymeactivities in semi-solid-state bioreactors. Process Biochemistry, Vol. 36, pp. 995-999.Rodrguez Couto, S., et al. (2003) Investigation of several bioreactor configurationsfor laccase production by trametes versicolor operating in solid-state conditions.Biochemical Engineering Journal, Vol. 15, pp. 21-26.Rodrguez Couto, S., i Sanromn, M.A. (2005) Application of solid-state fermentationto ligninolytic enzyme production. Biochemical Engineering Journal, Vol. 22, pp. 211-219.Rodrguez Couto, S., i Toca-Herrera, J.L., (2006) Industrial and biotechnologicalapplications of laccases: a review. Biotechnology Advances, Vol. 24, pp. 500-513.Rodrguez Couto, S., i Toca-Herrera, J.L., (2007) Laccase production at reactorscale by filamentous fungi. Biotechnology Advances, Vol. 25, pp. 558-569.Rodrguez-Rodrguez, C. E. et al. (2010) Naproxen degradation test to monitorTrametes versicolor activity in solid-state bioremediation processes. Journal ofHazardous Materials (pendent de publicaci)Ruzicka, S., et al. (2000) The utility of ergosterol as a bioindicator of fungi intemperate soils. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 32, pp 989-1005.Schmidt, K.R., et al. (2005) Fungal inocolum properties and its effect on growth andenzyme activity of trametes versicolor in soil. Biotechnol. Prog., Vol. 21, pp. 377-385.Singh, H. (2006) Mycoremediation, Fungal Bioremediation. Wiley, pp. 2-4, 16-20Solanas, A. (2007) La Bioremediaci. Treballs de la SCB, Vol. 58, pp. 187-202Stahl, P.D., and Parkin, T.B. (1996) Relationship of soil ergoesterol concentrationand fungal biomass. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 28, No.7, pp. 847-855.Vares, T., et al. (1995) Lignin peroxidases, manganese peroxidases, and otherligninolytic enzymes produced by phlebia radiata during solid-state fermentation of40 47. AVALUACI DEL CREIXEMENT DEL FONG LIGNINOLTIC TRAMETES VERSICOLOR SOBRE DIFERENTS SUPORTS SLIDS PER A LAPLICACI EN TRACTMENTS DE BIOREMEDIACIwheat straw. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 61, No. 10, pp. 3515-3520.Wallenstein, M.D., i Weintraub, M.N. (2008) Emerging tools for measuring andmodeling the in situ activity of soil extracellular enzymes. Soil Biology & Biochemistry,Vol. 40, pp. 2098-2106.Walter, M., et al. (2005) Field-scale bioremediation of pentachlorophenol by Trametesversicolor. International Biodeterioration & biodegradation, Vol. 56, pp. 51-57.Webster, J., i Weber, R. W. S., (2007) Introduction to Fungi. Cambridge UniversityPress, third edition, pp. 499, 560-562West, A.W., et al. (1987) Use of ergosterol, diaminopimelic acid and glucosaminecontents of soils to monitor changes in microbial populations. Soil Biology &Biochemistry, Vol. 19, No. 5, pp. 607-612.Zafar, S.I., et al. (1996) Influence of nutrient amendment on the biodegradation ofwheat straw during solid state fermentation with trametes versicolor. InternationalBiodeterioration & Biodegradation, pp. 83-87.Zhao, X.R., et al. (2005) Does soil ergosterol concentration provide a reliable estimateof soil fungal biomass?. Soil Biology & Biochemistry, Vol. 37, pp. 311-317.41