Automatizacion hematologia

7/24/2019 Automatizacion hematologia

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HEMATOLOGIA Volumen 9 - Nº 1, 20054

REVISIÓN

HEMATOLOGIA, Vol. 9 Nº 1: 4-16Enero-Abril, 2005

Automatización en hematología

Nilda E. Fink

Cátedra de Hematología, Departamento de Ciencias Biológicas,Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.

47 y 115, 1990 La Plata, Argentina. E-mail: [email protected]

Fecha de recepción: 1/3/05Fecha de aceptación: 20/4/05

RESUMEN

Gran parte de la práctica del laboratorio hematológicose relaciona con observaciones que incluyen la identifi-cación de tipos de células y la interpretación de la com-posición de las poblaciones celulares sanguíneas. Esta re-visión describe la metodología empleada en los instru-mentos automatizados para el estudio hematológico con-vencional, incluyendo la medición de Hb, recuento deglóbulos rojos e índices eritrocitarios, el recuento deplaquetas, el recuento total y diferencial de glóbulosblancos y reticulocitos. Se describen las diversas tecno-logías utilizadas para realizar las mediciones, ejempli-ficando su uso en los contadores hematológicos automa-tizados modernos disponibles comercialmente.

Palabras claves: Automatización, Hematología, Siste-mas analíticos, Tecnología

Muchas de las mediciones en el campo de laHematología conciernen a variables continuas. Algu-nos ejemplos de este tipo de variables son la medi-ción de concentraciones de hemoglobina (Hb) en lasangre y el hierro, así como su capacidad total deunión en suero. Por otra parte, gran parte de la prác-tica de la Hematología se relaciona con observacio-nes que incluyen la identificación de tipos de células

y la interpretación de la composición de las poblacio-nes celulares sanguíneas1. Los temas centrales que seabordarán a continuación se centrarán principalmentesobre estas determinaciones discontinuas.

En relación con el recuento de células sanguíneas,los métodos manuales son la base de algunos méto-dos de referencia en el laboratorio hematológico, a losque aún es necesario recurrir cuando hay discrepan-cia con los métodos automatizados. Suelen tambiénser métodos de rutina en laboratorios pequeños dealgunos países, pero dada la enorme cantidad de in-formación disponible sobre los mismos2, en este tra-

bajo sólo nos referiremos a los métodos automatiza-dos.

FUNDAMENTOS TECNOLÓGICOS Y SISTEMASANALÍTICOS EN EL RECUENTO AUTOMATIZADODE CÉLULAS SANGUÍNEAS

A continuación trataremos sobre la metodologíaempleada en los instrumentos automatizados para elestudio hematológico convencional, incluyendo elrecuento de plaquetas y el recuento diferencial deglóbulos blancos. El recuento de reticulocitos tambiénserá considerado porque en la actualidad puede rea-lizarse tanto en contadores automatizados que inclu-yen el recuento en forma directa, o mediante un pro-cedimiento especial previo en otros tipos de contado-

res (semiautomatizados).En primer lugar, se describirán las diversas tec-

nologías utilizadas para realizar las mediciones,ejemplificando su uso en los contadores hema-tológicos automatizados disponibles comercialmen-te. Alguno de estos ejemplos han sido tomados delos fabricantes que abarcan los principales segmen-tos del mercado de laboratorio clínico, dato obteni-do a partir de la estadística de los participantes enprogramas de evaluación externa de calidad (PEEC).Los fabricantes por lo general ofrecen un ampliorango de instrumentos, pero las descripciones serán

limitadas, por razones de espacio, a los modelosmás difundidos (Tabla 1).

La mayoría de estos instrumentos son totalmenteautomatizados, es decir las mediciones se realizan apartir de sangre entera sin necesidad de que el ope-rador la diluya en forma manual. En efecto, con el finde garantizar un manejo seguro, la mayoría de losinstrumentos cuenta con dispositivos que atraviesanla tapa del tubo de colecta de sangre, de modo queel operador no tiene que quitarla. También es comúnque los instrumentos mezclen las muestras de san-gre antes de que las mismas sean incluídas en el aná-lisis. Un esquema que resume las distintas etapas deestos sistemas se presenta en la Fig. 13.



5 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA

Los contadores de sangre automatizados, comocualquier otro instrumental de laboratorio, deben sermanejados de manera apropiada. Esto requiere quesean totalmente calibrados y que el desempeño seamonitoreado tanto por el control de calidad interno

como por los PEEC. Por último, debido a que el mer-cado evoluciona muy rápido, es necesario entendercómo se evalúan los nuevos instrumentos o, al me-

nos, entender críticamente las evaluaciones empren-didas por otros usuarios. Este aspecto no será trata-do en esta revisión, pero el lector puede remitirse MAFernández Alberti y col4.

El desarrollo automatizado del recuento y la me-

dición del tamaño de las células sanguíneas parte detécnicas de recuento simple, que fueron descriptas enla segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas

TABLA 1Algunas características de autoanalizadotes hematológicos modernos*

Tipo Fabricante Instrumento Año de Instalados alaparición en US 2000 en US

Recuento diferencial Abbott Cell-Dyn 1200 1999 110de leucocitos de Cell-Dyn 1700 y 1700CS 1995 28002-3 regiones ABX Micros 60 1998 81

Bayer ADVIA 60 1999 50BD Bio-sciences QBS Star 1999 NdBeckman-Coulter Coulter Ac-T series 1996 500

Coulter Ac-T diff y diff 2 1999 800Coulter Onyx/Onyx AL 1994 1300

Roche KX21 1999 100K-4500 1995 nd

De alto volumen Abbott Cell-Dyn 3200 1997 >700Cell-Dyn 3700 1999 >300Cell-Dyn 4000 1997 >350

ABX Pentra 60c+ 2000 0Pentra 120 Retic 1999 18Bayer ADVIA 120 1998 500Beckman-Coulter Coulter GEN-S 1996 >1100

Coulter HmX 1999 >100Coulter STKS 1989 >2600Coulter MAXM 1991 >2100

Sysmex Sysmex SF3000-Alpha 3000 1996 100Sysmex SF3000-Alpha 1997 ndSysmex SE9500/SE 1994 350Sysmex SE9500 Alpha 2 nd ndSysmex SE9500R/SE 1997 350Sysmex XE2180/XL 2000 nd

* College of American Pathology (13, 15)

Fig. 1: Diagrama funcional simplificado de un sistema multiparamétrico de recuentos celulares.




durante mucho tiempo. Estas eran muy inexactas y,hasta la década de 1950, se habían hecho pocos avan-

ces tecnológicos5.Se hicieron intentos iniciales y complejos para

automatizar el recuento de células en cámaras cuen-taglóbulos, pero aún con técnicas que fueron perfec-cionadas, todavía era difícil automatizar la diluciónde la sangre y la carga de la cámara. También resul-taba imposible contar las células con exactitud me-diante los métodos de estudio de las propiedadeseléctricas u ópticas de las células en suspensión.

Para permitir que el recuento celular fuera auto-matizado, tuvieron que diseñarse métodos de dilu-ción de la sangre e ingresar cantidades relativamen-te pequeñas de células dentro y fuera de una zonaconocida como zona sensora. Así, las células podíanser contadas con exactitud a medida que pasaban através de esa zona sensible, siempre y cuando la mis-ma fuera lo suficientemente pequeña como para ha-cer factible el recuento2, 6.

Los primeros contadores hematológicos fueronsemiautomatizados; esto era así porque la prepara-ción de una dilución adecuada era una operaciónmanual y el instrumento entonces, aspiraba la dilu-ción ya preparada. Sin embargo, a fines de la décadadel 60 se dispuso de instrumentos totalmente auto-matizados, que aspiraban muestras de sangre enteray llevaban a cabo los pasos necesarios para diluir yaislar las células a ser contadas. Nos ocuparemos enel presente trabajo sólo de los instrumentos totalmen-te automatizados. Los instrumentos semiautoma-tizados, si bien se fabrican todavía, se utilizan casicon exclusividad en laboratorios pequeños porque lapreparación de diluciones manuales a partir de unagran cantidad de muestras sanguíneas, demandamucho tiempo además de ser poco precisa.

Los primeros contadores fueron descriptos por

Coulter7

y Crosland-Taylor8

, quienes adoptaron dife-rentes enfoques para limitar el volumen en la zonasensora y realizar el recuento (Tabla 2).

En el instrumento descripto por Coulter7, las cé-lulas son conducidas a través de un estrecho orificio,detectándose los cambios de impedancia (Fig. 2).

La impedancia es efectivamente medida en lazona sensora situada entre los electrodos colocadosa ambos lados del orificio. Así, las células funcionan

como aislantes frente a los diluyentes salinos, demodo que la impedancia aumenta transitoriamentea medida que las células pasan a través de la zonasensora. Los cambios de impedancia transitorios pro-ducen impulsos eléctricos que pueden ser contados.Estos instrumentos han sido llamados contadores deapertura-impedancia.

El instrumento descripto por Crosland-Taylor8

se basaba en hacer que las células pasen a travésde un delgado haz de luz. La zona sensora estabarestringida parcialmente por la estrechez del hazde luz y por el pasaje de células en una corriente

de líquido muy delgada. A medida que las célulaspasan a través de la zona sensora, interceptan elhaz de luz que se dispersa, pudiendo ser colecta-

TABLA 2Recuento de células sanguíneas en los primeros instrumentos

Características Apertura-impedancia Dispersión de luz

Descripción del prototipo Coulter, 1956 Crosland-Taylor, 1953

Ingreso de las células a la zona Pasaje a través de un orificio estrecho Pasaje por una corriente estrecha porsensora flujo hidrodinámicoDefinición de la zona sensora Medición de impedancia a través del Haz de luz que atraviesa la corriente

orificio de célulasImpulsos usados para contar las Cambios en la impedancia contados Cambios en la salida de un fotómetro,células que atraviesan la zona electrónicamente contados electrónicamentesensora

Fig. 2: Contadores de apertura-impedancia. La impedancia se mide en-tre un electrodo negativo dentro del tubo con orificio y el electrodo po-sitivo en la dilución de las células de la sangre. El área delimitada porlínea de puntos muestra la zona sensora por donde pasan las células. !:

resistividad del electrolito, !m: resistividad del electrolito modificada porla partícula.




da por un sistema óptico adecuado y medida porun fotómetro (Fig. 3).

Los aumentos transitorios en la luz dispersadacrean impulsos desde el fotómetro, que luego puedenser contados electrónicamente, por ello estos sistemasson llamados contadores de dispersión de luz.

Los impulsos contados en los primeros instrumen-tos de apertura-impedancia y de dispersión de luztambién se utilizaron para determinar el tamaño ce-lular, dado que el tamaño del impulso es aproxima-damente proporcional al tamaño de la célula. Por lotanto, el tamaño del impulso puede usarse para dis-criminar entre la célula de interés y otras células, res-tos o ruido electrónico. Este proceso lleva a la defini-ción de un umbral (Fig. 4).

Además de las diferentes tecnologías de detección,había importantes diferencias en cómo las células in-gresan a la zona sensible en los dos tipos de instru-mentos. Debido a que la geometría tiene que ser per-fecta, en los sistemas de dispersión de luz, las célu-

las tienen que estar en una corriente muy estrechaque interactúe perfectamente con el haz de luz. Esacorriente se logra por una técnica donde se empleaun flujo laminar envolvente.

El flujo del líquido se ajusta a través de un capi-lar delgado para crear un efecto de enfoque hidro-dinámico que fuerza a la suspensión celular a perma-necer en la corriente estrecha a medida que pasa porel centro de la zona sensible.

Aunque este sistema fue descripto originalmentepara sistemas de dispersión de luz, también se pue-de aplicar a los sistemas de apertura-impedancia y

tiene particular valor al potenciar la capacidad de lossistemas de apertura-impedancia para medir el tama-ño celular, así como para mejorar el recuento celular.

Las mejoras en la capacidad de medir el tamaño tam- bién significa que es más fácil discriminar entre di-ferentes tipos de células, por ejemplo las plaquetasgrandes pueden ser discriminadas más fácilmente delos eritrocitos pequeños.

En la práctica, para hacer el recuento celular tan-to los sistemas de apertura-impedancia como los dedispersión de luz son adecuados para contar eritro-citos, plaquetas o leucocitos totales. Sin embargo, esnecesario tener en cuenta cuáles son los requerimien-tos básicos para un recuento exacto de cualquier tipode célula5:

- La sangre entera debe ser homogeneizada, medi-da y diluida con exactitud.

- Debe pasarse un volumen conocido de esa dilu-ción a través de la zona sensora.

- Las células de interés deben contarse una vez ysólo una vez y ninguna otra célula, resto celularo ruido electrónico debe contribuir al recuento.

El primer requisito es fácil de alcanzar, procuran-

do que la sangre esté bien mezclada antes del análi-sis. En la actualidad, la mayoría de los instrumentoshacen esto en forma automática y luego hacen lasdiluciones con exactitud, generalmente por medio desistemas basados en jeringas calibradas.

El segundo requerimiento es más difícil de lograren un instrumento automatizado. La mayoría de losfabricantes han elegido medir los recuentos por uni-dad de tiempo en lugar de la unidad de volumen dedilución. Por lo tanto, tales sistemas tienen que sercalibrados para convertir los recuentos por unidad detiempo a recuentos por unidad de volumen.

El tercer requerimiento es de dificultad interme-dia. Puede parecer excesivo afirmar que las célulasdeben ser contadas una vez, pero el problema es que

Fig. 3: Contadores por dispersión de luz. La luz de la fuente láser se di-rige hacia un foco y luego se dispersa. Una barrera impide la llegada deluz al fotodetector. Cuando una célula entra en el foco, dispersa la luz,que así pasa por fuera de la barrera, e impacta en el detector.

Fig. 4: Diagrama de volúmenes en el recuento de plaquetas. Sirve paradiscriminar plaquetas pequeñas de ruido (A), plaquetas grandes de gló-bulos rojos pequeños (B). C representa el área bajo la curva usada parala estimación teórica del número de plaquetas.




en el recuento pueden subestimarse si van a travésde la zona sensora, casi al mismo tiempo, que otracélula. Este problema, que se denomina coincidencia(Fig. 5), surge del tiempo muerto en la electrónicadel instrumento y por lo general puede ser corregi-do con un algoritmo matemático adecuado, cons-truido dentro del microprocesador del contadorhematológico.

Decir que las células deben contarse sólo una vezparece igualmente excesivo, pero el problema es que

en los contadores de apertura-impedancia simple sin

flujo laminar, las células podrían recircular dentro delorificio.

Esas células recirculantes pueden hacer una con-tribución mínima al recuento aún cuando ellas tien-den a producir impulsos más pequeños que las célu-

las que pasan a través del orificio. Sin embargo, loseritrocitos que recirculan en esta forma causan seña-les en el rango de plaquetas y dificultan los recuen-tos de plaquetas, a menos que haya sistemas de flu-

jo de barrido ubicados en la parte posterior del orifi-cio que prevengan la recirculación

MÉTODOLOGÍA EMPLEADA EN LASDETERMINACIONES DE UN ESTUDIOSANGUÍNEO BÁSICO (HEMOGRAMA)

Concentración de HbEs él método más uniforme en todos los instru-

mentos y presenta dos opciones de uso común (Ta- bla 3).

La primera es convertir la hemoglobina encianmetahemoglobina (HiCN) y luego medir laabsorbancia alrededor de 540 nm. En la práctica, sinembargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos dis-ponibles en el mercado es tan corto que puede im-pedir que la conversión total se produzca por com-pleto y que los derivados intermedios sean medidos.

La conversión a HiCN requiere el uso de un reactivo

Fig. 5. Relación entre el recuento celular y la concentración de células. A concentraciones a ltas comienza a producirse un plateau como conse-cuencia del fenómeno de coincidencia.

TABLA 3Fundamento de varias determinaciones hematológicas en autoanalizadores de uso frecuente.

InstrumentosAnalito Abbott Bayer Beckman Sysmex

Coulter

Hemoglobina:

- Método automatizado HiCN HiCN con Hb HiCN LSS-meta-Hbcelular directa

- Método de detección Absorción a 546 nm Absorción a 546 nm Absorción a 525 nm Absorción a 555 nmLeucocitos totales Dispersión óptica/ Citometría de flujo Impedancia Corriente directa

fluorescenciaLeucocitos: diferencial Dispersión óptica/ Peroxidasa y Tecnología VCS de Corriente directa y

fluoresencia densidad nuclear Coulter 3-D frecuencia de radioLeucocitos: linealidad 0-250 1-99,9 0-99,99 0-99,9(109/L)Plaquetas Recuento inmuno- Optico Umbral fijo de Impedancia

plaquetario de óptica/ impedanciaimpedancia

Plaquetas: discriminación Recuento inmuno- Indices óptico y Exactitud de Umbrales no fijoscon eventos no plaquetarios plaquetario de óptica/ refractario que umbrales fijos en que permiten la

impedancia permiten la la detección por discriminacióndiscriminación parámetro único

Plaquetas: linealidad (109/L) 0-2000 0,005-3000 0-999 0-999




tipo Drabkin, que contiene cianuro de potasio yferrocianuro de potasio, por lo tanto el efluente resi-dual del instrumento puede no cumplir con losestándares ambientales en algunos países. Los méto-dos alternativos -libres de cianuro- para la medición

de la Hb, que usan laurilsulfato de sodio (LSS), hansido introducidos en algunos instrumentos. Los resul-tados parecen compararse bien con los métodos deHiCN9. Estos métodos no cianamidas, además de sermás seguros, son también promisorios en cuanto afuturas mejoras en la calibración y validación de nue-vas mediciones de Hb. El método de LSS introduci-do por Sysmex, parece ser de iguales característicasa las del método de referencia y es un avance signi-ficativo para bajar la turbidez y permitir un rápidoanálisis automatizado10.

Eritrocitos

Por lo general, el recuento de eritrocitos se reali-za sobre diluciones de sangre entera con un umbraladecuado para discriminar entre grandes plaquetasy pequeños eritrocitos (Fig. 4). Muchos sistemas notienen un umbral superior para discriminar grandeseritrocitos de pequeños leucocitos, pero los númerosrelativos de los dos tipos de células indican que estono suele ser un problema.

Indices eritrocitariosAunque todos los contadores hematológicos au-

tomatizados miden el volumen corpuscular medio(VCM), hay otros factores importantes que afectan lasmediciones, según sean hechas por los instrumentosde apertura-impedancia o por los de dispersión deluz. Debido a que ninguna tecnología es perfecta,varios fabricantes han intentado resolver los proble-mas, pero lo han hecho, con frecuencia, en diferenteforma.

La dificultad fundamental, que ya ha sido men-

cionada, es que el impulso producido por cualquiercélula es sólo una aproximación proporcional al vo-lumen de la célula. Los impulsos aberrantes, que norepresentan verdaderamente el tamaño de la célula,pueden ocurrir en cualquier contador, pero con fre-cuencia estos impulsos tienen una característica in-usual que les permite ser identificados por circuitoselectrónicos adecuados y procesados de modo que noafecten la magnitud del impulso promedio que seutiliza como medición de VCM. En los contadores deapertura-impedancia sin flujo laminar, hay una nece-sidad adicional de tratar los impulsos, ya que en ta-

les instrumentos las células que pasan cerca del bor-de del orificio deben ser ignoradas porque producenimpulsos más grandes que las células que pasan en

el centro del orificio. Afortunadamente, esas célulastienen un tiempo de pasaje más largo a través delorificio, debido a que el flujo es más lento en el bor-de. Los impulsos que ellas producen son por lo tan-to tan largos que deben y pueden ser procesados. Dos

células que atraviesan juntas también producen unpulso sobredimensionado, pero de igual modo es tanlargo, que puede ser procesado.

En relación a los eritrocitos, el aspecto más serio,de corrección más dificultosa, es que el VCM tiendea ser subestimado cuando la concentración de Hbcorpuscular media (CHCM) real, medida manual-mente, es reducida. Los fabricantes han adoptadodiferentes técnicas para obviar el problema. Estas hanservido para reducir la magnitud del efecto aunqueen ninguna instancia ha sido eliminado totalmente.Debido a que los índices eritrocitarios se relacionanentre sí de acuerdo con lo siguiente:

VCM

HCMCHCM "

Puede observarse que un VCM subestimado cau-sará una CHCM sobrestimada. Por esto, con los mo-dernos contadores sanguíneos, rara vez se observa quela CHCM descienda marcadamente en la deficienciade hierro severa, como sucede cuando las medicionesde Hb y hematocrito son hechas en forma manual y

la CHCM se calcula usando la fórmula:

docentrifugaoHematocrit

aHemoglobinCHCM "

Con los sistemas de apertura-impedancia hay unaexplicación simple para la subestimación del VCM,cuando la CHCM es baja y está relacionado con elhecho de que la CHCM determina la viscosidad in-terna del eritrocito y, como consecuencia, a su forma,cuando pasa a través del orificio del contador. Las

fuerzas de corte del fluido en el orificio son tales queel eritrocito adopta una forma de cigarro, pero cuan-do la viscosidad interna se reduce, la forma del eri-trocito se vuelve similar a un cigarro más largo ydelgado y crea un impulso más pequeño de lo quedebiera (subestimación del volumen). Esto es cono-cido como el efecto del factor forma5.

A excepción de los equipos de Bayer, todos losdemás calculan los índices en función de la medicióndel tamaño celular de las células por apertura-impe-dancia luego de diluirlas en un medio isotónico. Conel fin de minimizar estos efectos, hay sistemas de dis-

persión de luz en los que se trata el eritrocito paraque tome la forma esférica y las células son fijadasantes de su entrada a la zona sensora. Tal es el caso




de los equipos de Bayer que llevan a la esfericidadlas células con un volumen constante y luego midenel volumen celular a partir de la lectura mediante unsistema de dispersión de luz, donde la misma incidecon dos ángulos diferentes. Después, proceden a

transformar esas señales mediante un algoritmo es-pecial basado en la dispersión óptica de partículasesféricas dieléctricas10.

En estos casos suele aplicarse la teoría de Mie querelaciona la dispersión de luz con el volumen y elíndice de refracción interno11. El uso práctico de lateoría de Mie proviene de observar la dispersión deluz en cada célula individual, con un ángulo peque-ño (2º-3º) y uno grande (5º-15º). La dispersión con unángulo pequeño está afectada primariamente por elvolumen y la dispersión con un ángulo grande, porel índice de refracción interno, aunque cada uno estáafectado por ambos. Sin embargo, si ambos ángulosde dispersión son ploteados uno contra el otro, laposición de cualquier impulso puede ser derivadapara medir el volumen y la concentración de Hb dela célula. Promediando las mediciones sobre muchascélulas, se pueden derivar los valores medios queequivalen al VCM y la CHCM5.

Como mencionamos antes, los cambios de formade los eritrocios deformados anormalmente en losanalizadores por apertura-impedancia, afectan la es-timación del VCM, la CHCM y el hematocrito. La

introducción de la focalización hidrodinámica en losequipos de apertura-impedancia, tales como elSysmex SE9500, parece reducir el efecto del cambiode forma y de deformabilidad. En ese sentido, losequipos de Beckman Coulter, particularmente paraCHCM, parecen estar afectados por no poseer esaadaptación10.

Reticulocitos

Los recuentos de reticulocitos teñidos con varioscolorantes pueden realizarse en un instrumento au-

tomatizado, diseñado para ese propósito, tal como elSysmex R3000, o en un citómetro de flujo convencio-nal. Recientemente otros contadores hematológicoshan incorporado una opción de recuento de reti-culocitos, en los que éstos deben ser coloreados demodo independiente y luego son introducidos den-tro del contador para su análisis.

En el caso de mediciones hechas con colorantesfluorescentes, de acuerdo con la intensidad de fluo-rescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tressectores que representan estadios diferentes de ma-duración. El estadio más joven, muy fluorescente, es

un indicador temprano de recuperación, que apare-ce antes de un recuento de reticulocitos total eleva-do. Un alto recuento de elementos muy fluorescentes

es un indicador de recuperación medular después de,por ejemplo, un transplante de médula ósea (TMO)o de la administración de eritropoyetina exógena.

Actualmente, se pueden hacer los recuentos sinnecesidad de coloración manual, ya que están total-

mente automatizados. Sysmex fue el primero en in-troducir un colorante fluorescente (Automune-O)detectado por citometría de flujo, en tanto que otroscomo Beckman Coulter usan el nuevo azul demetileno. Este último método es menos preciso por-que es más dificultoso estandarizar la coloración yporque los cuerpos de Howell-Jolly pueden interfe-rir. Bayer usa la oxazina-750 en el canal de luz láserde helio-neón y esta determinación se integra con lasdeterminaciones del ancho de la distribución del vo-lumen eritrocitario (RDW) y el contenido de Hb, conlo cual se obtienen los índices celulares reticulo-citarios. Estos parámetros de inmadurez reticulo-citaria, que actualmente tienen un uso limitado, pue-den ser usados para estimar la reducción de la vidamedia eritrocitaria y mejorar el tratamiento de unavariedad de anemias, en la recuperación posquimio-terapia y en el TMO.

Plaquetas

Estas células pueden contarse sobre la misma di-lución de sangre entera usada para el recuento de

eritrocitos. Hay, por lo general, un umbral superiorpara eliminar pequeños eritrocitos y un umbral infe-rior para discriminar del ruido electrónico y los res-tos celulares (Fig. 4).

Estos umbrales simples son adecuados, siemprey cuando el instrumento tenga flujo laminar, y valetanto si se usa apertura-impedancia como dispersiónde luz para su detección. Sin embargo, si no se usaflujo laminar –opcional para los contadores de aper-tura-impedancia y obligatorio para contadores de dis-persión de luz– hay demasiado solapamiento entrelas señales de ruido o los residuos y la de los

eritrocitos pequeños para que el recuento sea efecti-vo, entre los umbrales inferior y superior.

Bajo estas circunstancias es necesario ajustar unacurva de distribución teórica al histograma de volu-men de plaquetas y extrapolar el recuento deplaquetas a partir del área bajo la distribución teóri-ca5 (Fig. 4, C).

Recientemente, se han ampliado los diferentes ti-pos de métodos empleados por los distintos fabrican-tes. Estos nuevos sistemas han sido importantes por-que se sabe que el recuento de plaquetas con un soloparámetro tal como la impedancia, tiene una tenden-

cia a sobreestimar el recuento verdadero de plaquetas,que es importante en las trombocitopatías y en elmanejo de pacientes trombocitopénicos.




Por otra parte, esto es importante en el caso detener que hacer recuentos elevados de plaquetas, enpacientes con trombocitosis y en el control de calidad.Una limitación actual es la imposibildad de distinguirplaquetas de fragmentos celulares y restos celulares.

Es importante también la capacidad de reconocerplaquetas de mayor tamaño, que suelen estar exclui-das de los algoritmos de recuentos de plaquetas. Losfabricantes trataron de resolver esto de diferentes for-mas (Tabla 3).

Algunos fabricantes resuelven esto con métodosópticos y por impedancia y si no hay concordanciatiene la alternativa de usar un método inmunológicoautomatizado con un anticuerpo monoclonal contrala glicopropteína gpIIIa, que es una gp presente sóloen plaquetas (Abbott). Otros usan un método de im-pedancia sin umbral fijo y los resultados correla-cionan bien con el método de referencia, pero conmenor frecuencia de alarmas con relación a otros con-tadores que tienen umbrales fijos (Sysmex).

También se desarrolló un sistema de medida bidimensional en el cual se mide tanto el volumencomo el índice de refracción de cada una de las célu-las (Bayer). Esto tiene una gran capacidad de discri-minación entre plaquetas, eritrocitos y partículas con-taminantes. Esta tecnología altamente novedosa es,a la vez, muy confiable. Además brinda otros pará-metros como el VPM, el ancho de la distribución del

volumen plaquetario (PDW), el plaquetocrito y elcomponente plaquetario medio (CPM), medicioneséstas cuyo valor clínico aún está en discusión10.

Recuento total y diferencial de glóbulos blancos

El examen mediante microscopía óptica de unfrotis teñido de sangre periférica para evaluar la mor-fología de eritrocitos y trombocitos (plaquetas) y lageneración del recuento diferencial de leucocitos aúnhoy resultan cruciales para el diagnóstico de enfer-medades hematológicas1. Estos procedimientos, ade-

más de la determinación de recuentos celulares en lasangre, tradicionalmente han sido las funciones prin-cipales de un laboratorio de Hematología. Sin embar-go, el recuento diferencial visual se reconoce comouna de las tareas de labor más intensa en el labora-torio. Para lograr buena ejecución se requiere un per-sonal bien preparado y muy motivado. A pesar de suhonroso papel en el diagnóstico de enfermedadeshematológicas, estas mediciones están plagadas deerrores. La confiabilidad del procedimiento debe su-pervisarse regularmente por encargados especializa-dos e intercambiando extendidos con otros laborato-

rios. Siempre que sea posible se recomienda que losprincipiantes muestren a los supervisores todas lasanomalías importantes, tales como leucocitosis pri-

maria o reactivas, trombocitopenia o cambios noto-rios en los eritrocitos. Una forma de estimular el in-terés y aumentar el conocimiento de los responsablesen la evaluación correcta de preparaciones sanguí-neas y frotis de médula ósea es la discusión periódi-

ca de extendidos de interés especial. Un análisis cui-dadoso de frotis sanguíneo es una herramienta muyútil para la evaluación clínica. Por otro lado, la triadade factores formada por la importancia, el gasto y elerror aleatorio llevó a los directores de laboratoriosy a los ingenieros industriales a la conclusión de quela automatización del recuento diferencial proporcio-naría información más exacta, además de reducir loscostos y los errores.

En relación al almacenamiento de muestras desangre para hacer los frotis preparados con sangreanticoagulada por EDTA, conservados durante nomás de 60 minutos a temperatura ambiente, mues-tran pocos cambios comparados con los que se pre-paran inmediatamente después de obtener la sangre.Se pueden discernir cambios tres horas después, y en-tre 6 y 8 horas posteriores a la extracción, los cam-

bios son notorios. Los leucocitos se vacuolan y mu-chos muestran cambios nucleares degenerativos,mientras que las concentraciones de leucocitos y deplaquetas disminuyen. Todo esto ocurre a mayor ve-locidad si la temperatura ambiente es más alta y seretrasa si la sangre se mantiene a 4ºC1.

Para el recuento diferencial visual de leucocitos,las células individuales se clasifican adecuadamentecuando se estudian en las etapas más maduras. Sinembargo, es difícil medirlas adecuadamente en frotissanguíneos debido a la gran variación en las fraccio-nes numéricas de poblaciones celulares. Los recuen-tos diferenciales visuales se realizan de modo rutina-rio en 100-200 células nucleadas. El coeficiente devariación al contar los leucocitos más frecuentes (esdecir, linfocitos y neutrófilos) puede ser mayor al25%, pero el de las células que ocurren en fraccionesnuméricas menores al 10% (es decir, eosinófilos y

monocitos) puede ser de hasta del 100%. La obten-ción de resultados exactos de células que se presen-tan en fracciones numéricas menores al 1% (es decir,eritrocitos nucleados o basófilos) es prácticamenteimposible ya que el total de células evaluadas es de100-200 (Tabla 4).

A pesar de estas limitaciones, el recuento diferen-cial visual constituye el estándar para comparar re-sultados obtenidos con analizadores hematológicosautomatizados. El papel del examen visual de frotissanguíneos sigue siendo importante en el laborato-rio clínico, ya que los analizadores hematológicos au-

tomáticos pueden rechazar un alto porcentaje demuestras consideradas como anormales que debenevaluarse visualmente1.




Los glóbulos blancos totales no pueden contarseen diluciones simples de sangre entera porque el nú-mero proporcionalmente elevado de eritrocitos losenmascararían. Deben agregarse, por lo tanto, reac-tivos adecuados para lisar los eritrocitos de modo quelos leucocitos remanentes puedan ser discriminadosde cualquier resto de eritrocitos. En los sistemas dedispersión de luz también puede ser necesario aña-dir compuestos para filtrar el resto, causante de in-terferencia óptica. Con los primeros sistemas, se usa-

ban agentes lít icos muy fuertes, que removían lamayoría del citoplasma del leucocito, de modo queen realidad lo que se evaluaba eran los núcleos. Más

recientemente, sin embargo, se utiliza una lisis mássuave para proteger tanto como sea posible la arqui-tectura celular, de modo que pueda ser usada como

base para el recuento diferencial de leucocitos5.En el caso del recuento diferencial, los prime-

ros sistemas se basaban en diferencias en el volu-men de leucocitos medido por apertura-impedan-cia 12. Sin embargo, tales sistemas no son los másadecuados para discriminar entre células mono ypolinucleares, particularmente entre linfocitos ygranulocitos. Los intentos para clasificar otros ti-pos celulares en tres poblaciones diferenciales son

menos satisfactorios.La dispersión de luz sola no es de valor para elrecuento diferencial de leucocitos. Resulta interesan-te que el índice de refracción interna de los leucocitos,que está determinado por sus gránulos, sea tan im-portante como el volumen, cuando se determina pordispersión de luz, el volumen aparente de leucocitos.De este modo, debido a sus gránulos, los neutrófilosaparecen más grandes que los eosinófilos aunquerealmente tienen el mismo volumen cuando son me-didos por apertura-impedancia13.

A pesar de la limitada utilidad de la dispersión de

luz sola para el recuento diferencial de leucocitos,puede usarse en conjunto con la absorción de luz,cuando se estudian los leucocitos teñidos en suspen-

sión. Los primeros trabajos fueron hechos conleucocitos teñidos por su actividad de peroxidasa ycuando la dispersión y la absorción de luz se midie-ron simultáneamente célula por célula se hizo posi-

ble discriminar con exactitud cuatro clases de leu-cocitos, es decir neutrófilos, linfocitos, monocitos yeosinófilos junto con una categoría conocida comocélulas grandes no coloreadas (Fig. 6).

Esta propuesta se describió como mediciónmultiparamétrica simultánea, es decir los dos pará-metros de dispersión y absorción resueltos en un úni-co canal. El término canal en este contexto, se referíaal sistema para dilución de sangre, lisante deeritrocitos, donde se hacía la reacción de peroxidasay luego se medía la dispersión y la absorción de luz.El empleo de un canal de peroxidasa hizo una contri-

bución mayor al recuento diferencial leucocitario, perono resultó adecuado para el recuento diferencial de

basófilos. Por lo tanto, los fabricantes tuvieron queagregar un canal adicional para contar estas células.Tales instrumentos multicanales de recuento diferen-cial de leucocitos han sido desarrollados y tienen ac-tualmente un uso difundido. Otro aspecto es que seincluyen parámetros como los blastos, eritrocitosnucleados y granulocitos inmaduros aunque todavíaexisten algunas discrepancias en la identificación delos polimorfonucleares (PMN) en bandas.

En paralelo con el desarrollo de los instrumen-tos multicanales, también ha habido una tendenciaa realizar más y más mediciones simultáneas, usan-

do con frecuencia un único canal. Por ejemplo, lossistemas de apertura-impedancia pueden ser me-

jorados para proporcionar información sobre la com-

Fig. 6: Recuento diferencial leucocitario, usando dispersión de luz (ver-tical) y tinción de peroxidasa (horizontal). Los basófilos se estiman in-dependientemente porque se superponen con los monocitos.

TABLA 4Error de muestreo y variabilidad estadística de recuentosporcentuales en los recuentos diferenciales proporcionales*

Nº total de Porcentaje observado de célulascélulas contadas 50 5 10 30

100 1-9* 4-16 21-39 40-60200 2-8 6-14 24-36 43-571000 3.6-6.4 9-11 27-33 47-53

10000 4.6- 5.4 9.4-10.6 29-31 49-51

* Rango 95%




posición interna de los leucocitos, mediante el uso deuna sonda electromagnética de alta frecuencia al mis-mo tiempo que se medía el volumen. Los sistemas dedispersión de luz también pueden ser enriquecidosexaminando la dispersión en diferentes ángulos. Final-

mente, ahora es posible combinar tanto la tecnologíade apertura-impedancia como la dispersión de luz, consus varios refinamientos, dentro de un canal único5.

A modo de resumen, en la Tabla 3 se indican lasdistintas características del recuento total de blancosy distintos aspectos del diferencial leucocitario, quetradicionalmente fue hecho en forma manual por re-visión microscópica de extendidos.

Las ventajas del método automatizado son:

- Disminución del error aleatorio por el gran núme-ro de células contadas.

- Disminución del tiempo de retorno por la veloci-dad con que el instrumento hace la cuantificación.

Para el recuento diferencial de leucocitos automá-tico, el análisis de imágenes tiene una aplicación muylimitada y de comercialización reducida. En principio,el análisis de imagen automatiza y reproduce el re-cuento diferencial visual. Los frotis sanguíneos se ana-lizan con óptica de alta velocidad en una plataformacontrolada por computadora. Se simulan los criteriosdel diferencial visual con algoritmos, enumerando las

subpoblaciones celulares en forma más reproducibley cuantitativa. Varios contadores de leucocitos por aná-lisis de imagen fueron producidos durante los años 70y al principio de los 80 (Lara de Corning MedicalInstruments, Hematrak de Geometric Data, Dic 4 deCoulter Electronics, ADC-500 de Abbott Diagnostics).Fueron desplazados del mercado por contadores másrápidos y completos1.

En los sistemas comerciales disponibles actualmen-te, se hacen recuentos de células sanguíneas automá-ticos incluyendo al menos un recuento diferencial de

blancos de cinco subclases. Estos analizadores usan

tecnología sofisticada y constituyen un equipamientode última generación que se integra a los laboratoriosde rutina. Las muestras sanguíneas son procesadas ensistemas de muestreo cerrados, usan sistemas automá-ticos de lectura para la identificación por código de

barras y tienen interfases con el sistema de informa-ción del laboratorio para introducir las pruebas reque-ridas, los datos identificatorios del paciente y la obten-ción de resultados. Procesan grandes cantidades demuestras (más de 100 por hora), se pueden seleccio-nar variantes que cubren un rango amplio de opcio-nes informatizadas como es el establecimiento de alar-

mas, acumulación de datos de control interno y pro-ducción de resultados gráficos de materiales de con-trol interno y de muestras de pacientes.

En relación con los aspectos tecnológicos, es im-portante conocer qué información brindan los dife-rentes sistemas y qué tecnología usan de acuerdocon los distintos métodos descriptos por los fabri-cantes. La capacidad y confiabilidad de los instru-

mentos para recuentos diferenciales evoluciona con-tinuamente.

Actualmente, luego de que se ha usado el recuen-to diferencial por más de 25 años, la confiabilidad yla exactitud del instrumental automatizado ha alcan-zado niveles muy altos. Por ello, donde se disponede los mismos no es conveniente reemplazarlos porel recuento manual basado en la revisión de solo 100células. Cada laboratorio debe establecer criteriospara revisar los extendidos, basado en las alarmas delinstrumento, pero por lo general la revisión está másrelacionada con la observación de la morfología deeritrocitos o de plaquetas que a un problema en elrecuento diferencial leucocitario.

Pero a pesar de estos avances, aún hay necesi-dad de examinar el extendido sanguíneo para deter-minar la naturaleza de un recuento anormal de po-

blaciones leucocitar ias y de la morfología deplaquetas y de eritrocitos. En 1994 se recomendó,luego de un estudio definitivo, no informar discri-minadamente los neutrófilos en banda de losneutrófilos totales y que era aconsejable usar el nú-mero absoluto de neutrófilos para detectar una in-

fección. Hay dos indicaciones para la revisión de unextendido en caso de recuentos leucocitarios norma-les, como el caso de un neonato con fiebre y pacien-tes con sospecha de fiebre tifoidea. La detección deun recuento alto de neutrófilos en banda, asociadoa un recuento de neutrófilos normal, tiene un valorclínico significativo14.

Una adición interesante a la artillería diagnósticade los nuevos contadores es la inclusión del dispositi-vo para hacer extendidos como el incluído en elCoulter GEN-S. El instrumento puede ser programa-do para producir extendidos centinela automáticamente

cuando aparece cualquier alarma para eritrocitos,plaquetas y glóbulos blancos con datos identificatoriosincluídos15. Otro dato interesante es la graficación deeritrocitos no lisados como en los Sysmex NE 8000 quepermite detectar células resistentes a la lisis como esel caso de las células en diana15.

Otra consecuencia del mejoramiento continuo delinstrumental es que se ha podido ampliar el uso delas alarmas. Por ejemplo si no hay células inmaduraso blastos, no hay necesidad de revisar el extendidopara buscar anormalidades en los neutrófilos a me-nos que el porcentaje de neutrófilos exceda el 90%.

Así, a comienzos de los años 90 en un centroasistencial de agudos se hacían 100 revisiones manua-les y esta cifra bajó a 13%14-16.




Células madres o troncales

La concentración de las células madres o troncales(stem cells) es alta en médula ósea, en tanto que ensangre periférica es baja y pueden ser recolectadas

después de tratar al paciente con quimioterapia se-guida de factores de crecimiento, para aumentar suconcentración.

Cuando se las recolecta por aféresis es necesariocuantificar la cantidad en sangre periférica. Esto sehace por inmunofluorescencia usando anticuerpomonoclonal anti-CD34 –FITC. Esta prueba requieretiempo y a veces no está disponible. Como estas cé-lulas (stem cells) contienen pocos lípidos y son resis-tentes a la lisis por detergentes, pueden ser medidasusando impedancia y radiofrecuencia tal como hasido desarrollado recientemente10. Esta prueba requie-

re poco tiempo comparado con las 2-3 h de lacitometría de flujo.

Ancho de la distribución del volumen y de laconcentración de hemoglobina eritrocitaria

Además de estimar VCM es posible producirhistogramas que muestren el ancho de la distribucióndel volumen de eritrocitos (RDW). Tales histogramasson útiles para medir la anisocitosis y para caracte-rizar situaciones en las que dos poblaciones eritro-citarias estén presentes, por ejemplo en la deficien-

cia de hierro que responde al tratamiento.Si se utiliza una dispersión de luz de ángulo

dual es posible medir la concentración de hemo-globina individual de un eritrocito y construirhistogramas que muestren el ancho de la distribu-ción de la concentración celular de hemoglobina(HDW).

Ancho de distribución del volumen plaquetario(PDW)

Este parámetro puede ser usado para determinar

el recuento de plaquetas así como para medir el vo-lumen medio de la plaqueta y la anisocitosis pla-quetaria. Así, los contadores hematológicos automa-tizados ofrecen un rango de los llamados nuevosparámetros, tales como anisocitosis eritrocitaria yplaquetaria, volumen medio de plaquetas y otrosmás que reflejan otras características de loseritrocitos, plaquetas y leucocitos. Desafortunada-mente, la mayoría de estos parámetros tienden a serespecíficos de un instrumento y la comparación delos parámetros del mismo nombre puede resultarpobre entre diferentes instrumentos, aún del mismo

fabricante. Es probable que por esta razón hayanencontrado poca aplicación en la hematologíadiagnóstica.

Se han publicado muchos estudios interesantesque muestran diferencias entre diversos trastornos,por ejemplo la anisocitosis plaquetaria en la trom-

bocitosis secundaria y la trombocitemia. Sin embar-go, estas diferencias con frecuencia no son suficien-

tes o no están suficientemente establecidas para con-vertirse en criterios firmes de diagnóstico, aunquepueden arrojar alguna luz interesante sobre la fisio-patología subyacente.

Sin embargo, los nuevos parámetros disponiblestienen un rol importante dentro del laboratorio, aúnsi no son informados, debido a que constituyen unaguía útil sobre cómo y cuando debe examinarse unextendido de sangre.

Alarmas e indicaciones para examinar un extendido

de sangreTodos los instrumentos producen alarmas dise-

ñadas para alertar al operador sobre circunstanciasen las cuales las mediciones pueden no serconfiables o en las que puede haber células anorma-les como los blastos o eritrocitos nucleados en san-gre periférica.

Las alarmas deben ser consideradas, en conjuntocon los nuevos parámetros, con todos los diagramasproducidos por el instrumento, con los últimos resul-tados del recuento sanguíneo, con cualquier cambio

de los resultados previos y los detalles clínicos, alconsiderar si un extendido de sangre debe ser exa-minado o no17.

En términos generales, se espera que los contado-res automatizados modernos de células sanguíneas

brinden los siguientes servicios:

- Identificar la muestra por código de barras- Homogeneizar la muestra- Perforar la tapa del tubo de colecta de sangre y

aspirar la muestra- Distribuir la muestra en canales para mediciones

separadas, es decir canales de:- Recuento y medición del tamaño de eritrocitos

y plaquetas- Recuento total y diferencial de leucocitos (pue-

de haber uno o más canales, dependiendo delinstrumento)

- Recuento de reticulocitos- Hemoglobinometría

- Dentro de cada canal, deben hacerse las dilucio-nes relevantes, agregar reactivos y esperar hastaque la dilución esté lista para la medición.

- Hacer las mediciones de cada uno de los canales

especificados arriba.- Alertar sobre cualquier anomalía y facilitar la vi-

sualización en forma adecuada por el operador




- Verificar el control de calidad usando controlesadecuados o valores medios del paciente

- Trasmitir los datos en línea al sistema de compu-tación del laboratorio

- Ser compatible con sistemas robotizados para la

automatización total del laboratorio.

Todos los instrumentos de última generación tie-nen buena conformidad con los requerimientos gene-rales listados arriba y tienen relativamente pocas ca-racterísticas distintivas.

Al seleccionar un contador uno puede requerirdesde un equipo que haga un bajo número de mues-tras por hora a un instrumento que resuelva un grannúmero en el mismo lapso. Los comentarios siguien-tes tienen que ver con los equipos que procesan ungran número de especímenes. Si se va a trabajar conuna población anormal de pacientes, el número dealarmas para el recuento manual es crítico si se quie-re reducir la intensa labor de revisión manual de ex-tendidos de sangre periférica. Hay equipos que tra-dicionalmente tienen muchas alarmas tanto para da-tos normales como anormales, en particular para re-cuentos plaquetarios y para leucocitos inmaduros.Para ello se introdujeron nuevas tecnologías y la po-sibilidad de contar con los cut off puestos por el usua-rio. Dependiendo de los equipos, la revisión de losextendidos es cada vez menos requerida.

También para reducir el trabajo, hay equi-pamientos que hacen marcado de extendidosautomáticamente. Por otra parte, los hay para elescaneo automático de extendidos, análisis de imá-genes y proyección en monitor a color y de alta reso-lución que hacen que la microscopía sea una activi-dad cada vez más lejana, en los laboratorios que po-seen esa tecnología.

Se le han agregado otras funciones a los contado-res automáticos como el estudio de antígenos de di-ferenciación en la superficie celular o marcadoreslinfocitarios o el análisis diferencial de células de

médula ósea. Es de remarcar que estos estudios con-viene hacerlos con un citómetro de flujo destinado atal fin, con personal especializado. De todas formassi se dispone de ese instrumental, esos estudios tie-nen un valor importante para el médico. Hay argu-mentos a favor de que agregar mucha informaciónconfunde al clínico y debe ser así ya que hayparámetros como el VCM y RDW que aún hoy resul-tan poco familiares.

A partir de los años 90, particularmente en Japón,se generaron sistemas de laboratorio de tercera gene-ración que estaban basados en dos conceptos claves

como la consolidación y la integración que permitieroncombinar distintas teconologías o estrategias analíti-cas e integrar instrumental con dispositivos pre y

postanalíticos, de modo de reducir complicacionescomo algunas relacionadas a la bioseguridad. Inicial-mente, la mayor parte (2/3) de los sistemas de labo-ratorio de tercera generación fue instalada en el la-

boratorio hematológico, con lo cual se vislumbra que

a futuro los mayores avances serán en esa dirección18.

ABSTRACT

Most of the practices in the laboratory of hematology are related with observations that includethe identification of cells and the interpretation of thecomposition of blood cell populations. In this work,the methodology used in automated instruments forthe conventional blood examination is reviewed,including the measurement of hemoglobin, erythrocyte

count and erithrocyte indexes, platelets count, totaland differential leukocyte count, and reticulocytes.Different technologies used for those measurementsare described, with examples of automatedhematology analyzers used, available in the market.

Key words: Automation, Hematology, Analyticalsystems, Technology

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Automatizacion hematologia

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