1.2.4 – Autofagia La autofagia es un mecanismo bastante conservado en las células eucariotas para la degradación de proteínas y estructuras celulares. La autofagia está implicada en varios procesos fisiológicos el desarrollo de la semilla, germinación, fotomorfogénesis, maduración y reparación de cloroplastos, nutrición mineral, respuesta a hormonas, resistencia a patógenos y varios tipos de PCD. Se han propuesto dos clases de autofagia: la microautofagia, que consiste en la invaginación del tonoplasto incluyendo pequeñas fracciones del citoplasma; y la macroautofagia, que involucra vesículas provenientes, presumiblemente, del Retículo Endoplásmico o del Aparato de Golgi que rodean una fracción de citoplasma, pudiendo contener orgánulos completos, y los transporta a la Vacuola Central para ser degradados. Recientemente se ha descripto un tercer tipo de autofagia denominada “autofagia mediada por chaperonas” pero su presencia en las células vegetales aún no ha sido determinada (Rabinowitz & White, 2010). Las vesículas de la macroautofagia provenientes del retículo o del Golgi, se denominan fagóforos y luego, cuando encierran una porción de citoplasma formando una vesícula de dos membranas constituyen los autofagosomas. El autofagosoma transporta su contenido hasta la vacuola central para volcar su contenido en ella mediante la fusión de la membrana externa del autofagosoma con al tonoplasto. La vesícula remanente, de una membrana, se denomina cuerpo autofágico que por acción de lipasas y proteasas es degradada dentro de la Vacuola Central. Este esquema general o canónico de la autofagia fue Capítulo I – Introducción General 28 Tesis Doctoral – Lic. Cristian A. Carrión descripto en detalles en las células de levaduras (Saccaromyses cerevisae). En plantas se han hallado estructuras semejantes, observadas mediante microscopía de transmisión y de fluorescencia que sugieren la existencia de un mecanismo de autofagia (Moriyasu & Klionsky, 2004). En levaduras se han encontrado alrededor de 31 genes involucrados directamente en la autofagia, de los cuales 24 ortólogos de estos genes también se hallaron en Arabidopsis thaliana. Esta lista incluye al regulador negativo de la autofagia TOR (del ingles, Target of Rapamycin), los componentes del complejo quinasa ATG1-ATG13 (del ingles, AUTOPHAGY), parte del complejo VPS34-PI3K (involucrados en la incorporación del autofagosoma a la vacuola central), la cascada de transducción de ATG8-ATG12, ATG9, y varias subunidades del sistema de reconocimiento VTI1 v-SNARE. En las plantas, el mecanismo adoptó mayor complejidad y eso lo demuestran las enormes familias de genes que codifican para varias de las proteínas involucradas en la autofagia. Por ejemplo, la familia de genes de ATG8 posee al menos nueve miembros activos o isoformas, los cuales poseen modificaciones que indicarían la interacción con diferentes factores (Yoshimoto et al., 2004). En plantas, se han encontrado isoformas estructuralmente distintas de los genes de autofagia de animales y levaduras que sugieren la existencia de vías autofágicas específicas de plantas (Suttangkakul et al., 2011). Recientemente, la noción de autofagia ha cambiado desde un concepto restringido a la degradación en masa e inespecífica de los componentes celulares a una definición más amplia y compleja que describe a la autofagia como un mecanismo flexible y multifuncional. Esta interpretación de la autofagia se refleja en el estudios de recientes mecanismos de degradación como la mitofagia, pexofagia, ribofagia y clorofagia (Li & Vierstra, 2012; Liu & Bassham, 2012)

Las células, bajo ciertas situaciones fisiológicas y ambientales requieren la degradación parcial o total de sus componentes. Este proceso necesita de una compleja coordinación que incluye la integración de señales y el reclutamiento de numerosos componentes celulares. La autofagia, inicialmente interpretada como un mecanismo inespecífico de degradación en masa, se considera

actualmente como un proceso multifacético y dinámico de degradación organizada de la célula (Li & Vierstra, 2012).

La enzima Ribulosa-1,5-bisfosfato Carboxilasa/Oxigenasa (Rubisco) es la proteína más abundante en las plantas e incluso podría ser considerada también como la proteína más abundante del planeta.

2.5.1- Microscopía de Fluorescencia y Confocal La microscopía de fluorescencia permite visualizar moléculas fluorescentes, denominadas fluoróforos, propias del tejido como la clorofila y exógenas como la Rodamina, Fluoresceína

En plantas, el mecanismo de la autofagia está menos estudiado que en levaduras o animales, aunque está claro que posee algunas diferencias debido esencialmente a la presencia de la pared celular, la vacuola central y los cloroplastos en células vegetales.

Funciones de la Autofagia. La expresión de los genes del sistema de autofagia ocurre de manera ubicua a lo largo de todo el ciclo biológico y en todos los órganos de Arabidopsis, indicando que esta vía no está restringida a una etapa o tejido de la planta (Thompson et al., 2005). Análisis genéticos, observaciones microscópicas y tratamientos farmacológicos le atribuyen a la autofagia una participación central en diversos procesos fisiológicos, como la formación y degradación de vesículas de almacenamiento durante la germinación de semillas, biogénesis de la vacuola central, removilización de nutrientes durante la senescencia y estrés, procesos apoptóticos en la morfogénesis del xilema y en la respuesta hipersensible a patógenos (citas en: Moriyasu & Klionsky, 2004)

En general, se podría decir que el mecanismo de autofagia está presente en aquellos procesos que implican el movimiento en vesículas de componentes celulares hacia la vacuola central para su degradación o reciclado (Huang & Klionsky, 2002).