BiomedicinaDisciplina: Biotecnologia e Biologia Molecular

Introdução a Biologia Molecular

Nucleotídeos e Ácidos Nucleicos

• Os ácidos nucléicos são substâncias orgânicas chamadas de polímeros e que são formadas por monômeros conhecidos como nucleotídeos,

• Os ácidos nucléicos: São responsáveis pelo armazenamento das informações genéticas, participam das reações de oxido-redução, transferência de energia, sinalização intracelular, reações biossintéticas além de funções estruturais e catalíticas nas células;

• DNA - Ácido desoxirribonucleico: armazenador da informação genética na maioria dos seres vivos;

• RNA - Ácido ribonucleico: armazenador da informação genética em alguns vírus, importante na transmissão da informação.

Ácidos Nucléicos

Os nucleotídeos são formados por:

1. Grupo fosfato (P)

2. Pentose: Desoxirribose (DNA) e ribose (RNA)

3. Base nitrogenada: moléculas planas, aromáticas e heterocíclicas derivadas de uma purina ou pirimidina

Estrutura

P

Pentose

Base

C5H10O5 C5H10O4

Pentose

Estrutura• Os nucleotídeos contêm, mais comumente, de um a três fosfatos na posição C5’;

• São ânions e estão quase sempre associados ao íon Mg2+ nas células;

• Participam de reações metabólicas quando estão livres (ex: ATP, ADP, AMP);

Estrutura

Purinas (anel duplo) Pirimidinas (anel simples)

Bases nitrogenadas

Estrutura

Formas tautoméricas das bases

nitrogenadasDeslocamento

de prótons, mudanças

nas posições dos

hidrogênios

Deslocamento

de prótons

Nomenclatura

H H

Desoxiadenosina

5’ monofosfato

A, dA, dAMP

Desoxiguanosina

5’ monofosfato

G, dG, dGMP

Desoxitimidina

5’ monofosfato

T, dT, dTMP

Desoxicitidina

5’ monofosfato

C, dC, dCMP

Uridina

5’ monofosfato

U, UMP

H

• Ligação entre nucleotídeos ocorre sempre no sentido 5’-3’

• Glicosídica: Açúcar + base

• Fosfodiéster: Fosfato + açúcar da próxima base

• Covalentes: Fosfato+Fosfato+Fosfato

• Ligações entre nucleotídeos por pontes de hidrogênio (ligação entre as bases nitrogenadas):

A=T

G≡C

Erwin Chargaff (1950)

Razão 1:1 (equimolaridade)

• O conteúdo de adenina é igual ao de timina

• O conteúdo de citosina é igual ao de guanina

A=T A+G ou T+C

C=G T+C A+G

James Watson & Francis Crick; Rosalind Franklin (1953)

• Estudos de difração de raios-x

• DNA como sendo uma molécula longa e fina

• Possui dois filamentos associados entre si

• Molécula helicoidal

Histórico

Fotografia de difração de raio-x de uma

fibra de DNA orientada verticalmente

Nível de organização do DNA

Estrutura tridimensional do DNA

• Polaridade 5’ 3’ pH 7,0

• Duas fitas independentes, dupla hélice antiparalelas;

• Há o pareamento de bases complementares.

• As bases hidrofóbicas (em vermelho) ocupam o centro da hélice e as cadeias de açúcar-fosfato estão na periferia (em azul);

• A superfície da dupla hélice forma dois sulcos de largura diferente: a cavidade, maior e a menor;

• O “empilhamento” das bases (base stacking) é mantido por interações eletrônicas (forças de Van der Waals, dipolo-dipolo);

• Estabilização da estrutura tridimensional.

• Duplicação semiconservativa

DNA

DNA

As moléculas de DNA apresentam grande flexibilidade de

conformação

Forma A (DNA-A): Ocorre em estado de desidratação parcial

do DNA.

Forma B (DNA-B): Estrutura mais estável e comum. Ocorre

em condições fisiológicas.

Forma Z (DNA-Z): modificadas por metilação. Tem possível

papel na regulação da transcrição.

DNA-A

DNA-B

DNA-Z

DNA Direção Pares de

bases/ volta

Diâmetro Conformação

açucar

A Direita 11 2,3 nm C-3’ endo

B Direita 10 1,9 nm C-3’ endo

Z Esquerda 12 1,8 nm C-2’ endo (pir)

C3’ endo (pur)

Sequências de estruturas não usuais do DNA.

As curvaturas da fita podem ser importantes na ligação de algumas proteínas no DNA.

• Palíndromo: repetições invertidas da sequência de bases com simetria dupla ocorrendo

nas duas fitas do DNA.

DNA

Em forma de grampo: envolve uma fita Em forma de cruz: envolve as duas fitas

Estruturas não Usuais no DNA

DNA

DNAPareamento tipo não-Watson-Crick – Pareamento Hoogsteen

Estrutura Terciária

• Super enrolamento com a participação de proteínas;

• O DNA é flexível;

• Em células procariontes o DNA é circular e esta presente no nucleoide.

DNA

• A Separação das fitas de DNA ocorre pela destruição das ligações de hidrogênio se:

• O pH de uma solução de DNA for alterado

• A solução for aquecida (temperatura de fusão)

• Desnaturação: perda da estrutura helicoidal do DNA

• Renaturação: refazer a dupla hélice com as fitas complementares de DNA

DNA

As moléculas de RNA são geralmente formadas por uma cadeia única, que se enrola sobre si mesma.

• Polímero de ribonucleosídeos 5’monofosfatos

• Ligações 3’,5’-fosfodiéster linear de fita simples, RNA de fita dupla pode estar presente em genomas virais

• Podem apresentar uma estrutura secundária e terciária que envolve o pareamento de bases intramoleculares, empilhamento de bases e pontes de hidrogênio entre diferentes parte da molécula

TIPO DE RNA

• RNA mensageiro mRNA

• RNA ribossômico rRNA

• RNA transportador tRNA

RNA

RNA intrônico anti-senso

snRNA: pequenos RNAs nucleares

miRNA: micro RNA

snoRNA: pequenos RNA nucleolares

• RNA mensageiro (RNAm): atua transferindo a informação contida no DNA para a síntese de proteínas nos ribossomos.

• RNA transportador (RNAt): possuem o formato de trevo e atuam no transporte de aminoácidos aos ribossomos para a síntese proteica.

• RNA ribossômico (RNAr): faz parte da composição dos ribossomos (50% da massa) proporciona suporte molecular para a síntese de polipeptídeos.

RNA

RNA

Estrutura primária

Estrutura secundária

Estrutura terciária

DNA RNA

Pentose Desoxirribose Ribose

Purinas Adenina e Guanina Adenina e Guanina

Pirimidinas Citosina e Timina Citosina e Uracila

Filamento Duplo helicoidal Simples

Cadeias

Longas com milhares de nucleotídeos e

quantidades iguais de purinas e pirimidinas

Curtas com algumas centenas de

nucleotídeos, a quantidade

Enzima hidrolítica Desoxirribonuclease DNAase Ribonuclease RNAase

Origem Replicação Transcrição

Forma Uma forma básica Três formas básicas

Função Informações genéticas Síntese de proteínas

Localização Núcleo, mitocôndria, cloroplastos e

citoplasma de procariontes

Núcleo, citoplasma

Resistência Resistente a hidrólise e estável Menos resistente, pouco estável

Vida útil Permanente Temporário

REVISÃO

Procariontes Eucariontes

Localização Disperso no citoplasma

Núcleo e em pequenas

quantidades em mitocôndrias

e cloroplastos

Organização Só uma molécula de DNA,

forma nucleoide

cromatina (cromossomos)

nuclear

Forma Circular Linear

Histonas Ausentes Presentes

Transcrição Simples direta a transcrição

não esta fisicamente separada

da tradução

Complexa, a transcrição

(núcleo) esta fisicamente

separada da tradução proteica

(citoplasma)

Diferença dos ácidos nucléicos em células procariontes e eucariontes

REVISÃO

No laboratório, ácidos nucleicos podem ser cortados em sequências especificas por enzimas de restrição;

Os fragmentos de ácidos nucleicos podem ser separados por tamanho usando eletroforese;

O DNA pode hibridizar com sondas marcadas que são empregadas na detecção de sequências específicas do DNA importantes na expressão de determinadas proteínas;

Algumas técnicas moleculares incluem:

• Extração de DNA

• PCR

• Desenho de primers

• Sondas específicas para DNA ou RNA

• Hibridização de ácidos nucléicos

Aplicações

Exercícios

1. A sequencia de nucleotídeos de uma dupla hélice de DNA é: 5’- GGATTTTTGTCCACAATCA-3’ Qual a

sequencia de fita complementar?

2. No DNA de certas células bacterianas, 13% dos nucleotídeos são adenina. Qual é a porcentagem dos outros

nucleotídeos?

3. As duas fitas de DNA de dupla hélice podem ser separadas pelo aquecimento. Se você aumentar a

temperatura de uma solução contendo uma das seguintes moléculas de DNA, em que ordem você espera que

elas se separem? Explique sua resposta.

a. 5’-GCGGGCCAGCCCGAGTGGGTAGCCCAGG-3’

3’-CGCCCGGTCGGGCTCACCCATCGGGTCC-5’

b. 5’-ATTATAAAATATTTAGATACTATATTTACAA-3’

3’-TAATATTTTATAAATCTATGATATAAATGTT-5’

c. 5’-AGAGCTAGATCGAT-3’

3’-TCTCGATCTAGCTA-5’

4. Aponte as semelhanças e as diferenças entre as estruturas das formas A, B e Z do DNA.

5. Quais são as diferenças estruturais entre DNA e RNA?

Bibliografia

Bibliografia Básica:

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Biologia Molecular da Célula.

4ª ed. Artmed, Porto Alegre, RS, 2004. Cap.II.

MALECINSKI, G. M. Fundamentos de Biologia Molecular. 4ª. ed. Rio de Janeiro, RJ, Guanabara Koogan, 2005.

VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. Porto Alegre, RS, Artmed, 2014.

ZAHA, A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, L. M. P. Biologia molecular básica. 5. ed. Porto Alegre: Artmed,

2014.

Bibliografia Complementar:

ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKIN, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P.

Fundamentos da Biologia Celular. 3ª ed. Porto Alegre, RS, Artmed, 2011.

SNUSTAD, D.P.; SIMMONS, M.J. Fundamentos de Genética. 4ª. ed. Rio de Janeiro, RJ, Guanabara Koogan, 2008.

ULRICH, H.; COLLI, W.; HO, P.L.; FARIA, M.; TRUJILLO, C.A. Bases Moleculares da Biotecnologia. 1.ª ed. São

Paulo, SP, Roca, 2008.

VOET, D., VOET, J.G. Bioquímica. 3ª ed. Porto Alegre, RS, Artmed, 2006.

Respostas

1. 5’-TGATTGTGGACAAAAATCC-3’

2. O DNA é constituído por quatro nucleotídeos (100=13% A+X%T+Y%G+Z%C). A pareia com T e tem equimolaridade, portanto 74%[100%(13%+13%)] para G e C, os quais também pareiam suas bases em proporções equimolares. Assim, y=z=74/2=37.

3. C, B, A. A estabilidade da hélice depende das pontes de hidrogênio. O par AT contribui com duas pontes de hidrogênio e o par CG com três. Assim, a hélice C. (contendo um total de 34 pontes de hidrogênio) se separa a uma temperatura mais baixa, a hélice B. (65 pontes de hidrogênio) é a próxima a ser separada e a hélice A. (78 pontes de hidrogênio) é a mais estável em função do seu conteúdo CG.

4. Semelhanças: A e B tem a mesma direção (direita), Diferenças pares de base por volta: A(11), B(10), Z(12); diâmetro da hélice: A(2,3nm), B(1,9nm), Z(1,8nm); Z gira para a esquerda.

5. Tabela de revisão DNA x RNA

Exercícios