1

MIKROBIOLOGIAKO PRAKTIKAK (GIZA ELIKADURA ETA DIETETIKA) 31. taldea

ASTELEHENA

ASTEARTEA

ASTEAZKENA

Osteguna OSTIRALA

Ildoango ereinketa: trebaketa

Montaia hezea Saccharomyces cerevisiae Zintzilikaturiko tanta E. coli Onddo firukarien azterketa mikroskopikoa

Tindaketa negatiboa Klebsiella pneumoniae Esporen tindaketa Bacillus megaterium Albert tindaketa Lactobacillus sp.

Praktiketako azterketa

Lagin problemaren ildoango ereinketa: - McConkey agarra - Manitol agarra Lagin problemaren GRAM tindaketa

Berrereinketa McConkey kutxatiletan:

- Kolonia Laktosa +/- - GRAM tindaketa

Berrereinketa TSA kutxatiletan: - Kolonia Laktosa + - Kolonia Laktosa - Manitoleko koloniekin: - GRAM tindaketa - Katalasaren froga - Koagulasaren froga

Kolonia Laktosa + eta - : - froga biokimikoak - Oxidasaren froga

Froga biokimikoen irakurketa

Ingurugiroko mikroorganismoen ereinketa TSA kutxatiletan

Kutxatilen azterketa eta kolonien Gram tindaketa

Lagin batetako bideragarrien zenbaketa: ereinketa kutxatiletan

Kontaketa

2

HAZKUNTZA-MEDIOEN PRESTAKETA

Hazkuntza-medioak: laborategian mikroorganismoak hazteko erabili daiteken edozein sustantzia (solido edo likidoa) da;

Hazkuntza-medioaren konposaketan substratu natural bat (odol plasma edo esnea adibidez) edota gatz eta sustantzia kimikoen kontzentrazio ezagunak parte har dezakete. Jatorriaren arabera hazkuntza-medioak talde desberdinetan sailka daitezke:

- Konplexua: honen konposaketan digeritutako konposatuak, landare edo animali ehunen estraktuak, kaseina... auki daitezke. Mikroorganismoak hazteko beharrezko dituzten elementu guztiak egongo dira, nahiz eta konposaketa eta kontzentrazio zehatzak ez ezagutu.

- Definitua: kontzentrazio ezagunean aurkitzen diren sustantzia kimiko puruez osatutako hazkuntza-medioa. Hazkuntzarako beharrezko diren konposatu guztiak egongo dira, hauek desberdinak izan daitezkeelarik mikroorganismoaren behar nutrizional konkretuen arabera. Guztiek eskaintzen dute ura, energi iturria (adibidez karbohidratoak eta gatz ezorganikoak), konposatu nitrogenatuak eta hazkuntzarako beste faktore batzuk.

Hazkuntza-medioa solidoa bada, solidifikatzaile bezala agarra erabiltzen da (nahiz eta beste batzuk ere erabil daitezken agarra ez denean egokia, adibidez, mikroorganismoak agarra erabiltzeko ahalmena duenean).

Ezin formula daiteke mikroorganismo guztien hazkuntza baimen dezakeen hazkunza-medioa. Hala ere, Mueller-Hinton agarra bezalako hazkuntza-medio konplexuetan bakterio askok hazteko gaitasuna dute eta horregatik sarritan erabiltzen dira.

Mikroorganismoen isolatzea eta identifikaziorako hazkuntza-medio hautakorrak edota bereizgarriak erabiltzen dira.

Medio hautakorren konposaketan parte hartzen duten konposaturen bat edo gehiago zenbait mikroorganismoren hazkuntza inhibitzeko ahalmena izango dute, eta ondorioz, mikroorganismo edo mikroorganismo-talde konkretuen hazkuntza soilik gertatuko da. Hauen artean ditugu: MacConkey agarra, Manitol agarra eta beste asko.

Hazkuntza-medioetan hazi ondoren mikroorganismoen itxuraren arabera (kolonien tamaina, kolorea, distira, ertzaren izaera...) espezie ezberdinak daudela antzeman dezakegu. Hala ere, mikroorganismo askoren koloniak ezin dira bereiztu. Hazkuntza-medio bereizgarrietan ordea, nahiz eta koloniaren itxura berdintsua izan, kolonien arteko bereizketa lortuko dugu. Medio bereizgarri hauetan, hazkuntzan zehar, erreakzioren batek koloniaren kolorea edo beste ezaugarriren bat aldarazi dezake erreakzio positiboa eta negatiboa duten koloniak bereiztuko ditugularik.

3

Hazkuntza-medio solidoen prestaketa

Medio deshidratatu batetatik abiatuz prozedura orokora honako hau litzateke:

- Medio deshidratatua pisatu

- Ur destilatua gehitu

- Nahasketa irakin

- Autoklabatu

- Ontzietan banandu

Agarra duen hazkuntza-medioa Petri kutxatiletan prestatu nahi badugu, prozedura aipaturikoa litzateke. Medioa saiodietan nahi dugunean, nahasketa irakin eta autoklabatu baino lehen saiodietan banatuko dugu.

Agarra ez duten medioek normalki ez dute irekin beharrik.

4

MIKROORGANISMOEN HAZKUNTZA

Laborategian mikroorganismo baten azterketarako, beharrezkoa izaten da gehienetan mikroorganismoa kopuru handitan lortzea, hau da, mikroorganismoaren hazkuntza hazkuntza-medioan lortzea. Behin hazkuntza-medio egokia aukeratu ondoren, mikroorganismoa bertan ereingo dugu. Honetarako, inokulazioa egiten denean, teknika aseptikoa erabili behar da, era horretan kutsadurak ekidingo direlarik. Erabili beharreko tresna guztiak aldez aurretik esterilizatu egin behar dira eta prozesu osoa suaren ondoan egin behar da. Mikroorganismoen transferentzia ereintza-euskarri bati loturiko platino edo kromo-nikelezko alanbre batekin egin daiteke. Alanbre honek diametro txikiko kiribila izango du muturrean. Ereinketa ziztadaren bidez egiten bada, ordea, kiribilik ez da egongo eta ereintza-euskarriaren alanbrea zuzena izango da.

Ereintza

Ereintza, saiodietan edo Petri kutxatiletan egin daiteke. Saiodien kasuan hazkuntza-medio solido edo likidoa erabil daiteke. Solidoa deneko kasuan, lortu nahi dugun helburuaren arabera, ziztadaren bidezko ereintza edo azalekoa erabiliko da. Azken kasu honetan agar inklinatua duten saiodiak erabiltzen dira.

- Ereintza-euskarria suaren gainean ia bertikalki jarri behar da gori-gori jarri arte, honela bere luzera osoa esterilizaturik geratuko delarik. Esterilitate baldintzak ez galtzeko beti suaren ondoan egin beharko dugu lan. Saiodi batean mikroorganismoen kultiboa izango dugu, hau ezkerreko eskuarekin hartu, eskuineko eskuko atzamar txikiarekin tapoia kendu eta suaren ondoan mantendu behar da. Saiodiaren ahoa suaren gainetik pasatu, esterilizatutako ereintza-euskarria saiodian sartu eta segundo batzuk, beirarekin kontaktuan dagoela, hozten utziko da. Behin hotz dagoenean, inokulua hartuko dugu, euskarria saioditik atera eta berriro ere saiodiaren ahoa sutik pasatu eta itxi egingo dugu. Inokulatu nahi dugun saiodia hartu, ireki, ahoa sutatik pasatu eta zelulak dituen ereintza-euskarria saiodiaren hondoraino sartu behar da. Ondoren, euskarria ateratzen gaudenean sigi-saga egingo dugu hazkuntza-medioaren azalean. Amaitzeko, hodiaren ahoa sutatik pasatu eta tapatu egingo dugu. Ereintza-euskarria ere sutatik pasatu behar da bertan dauden mikroorganismoak hiltzeko.

Ereintza Petri kutxatilan egitean pausu berdinak jarraitu behar dira. Kutxatilak suaren ondoan ireki beharko dira esterilitatea mantentzeko. Hazkuntza-medioa likidoa denean inokulua (euskarrian dauden zelulak) medioan murgildu beharko da.

5

6

Ereintza egiteko beste modu batzuk:

1. Ziztadaren bidezko ereintza. Zenbait teknika diagnostikotan erabiltzen da. Euskarriaren alanbrea zuzena izango da eta medioa ziztatzeko erabiliko da.

2. Kutxatiletan ildoango ereintza. Hazkuntza-medio likido zein solido batetatik abiatuz inokulua euskarrirekin hartu eta Petri kutxatilak sigi-saga eginez inokulatuko ditugu.. Ereinketa honetatik abiatuz murrizketa bidezko ereintza egin daiteke. Kasu honetan asmoa kolonia isolatuak lortzea litzateke. Horretarako, inokulua kutxatilaren alde batetan ereingo dugu ildoango ereinketaren bidez. Ondoren euskarria esterilizatu eta aurrez egindako marren zati batetan egongo diren mikroorganismoak sakabanatuko ditugu azalera handiago batetan. Euskarriaren esterilizazioa eta sakabanaketa prozesu hau beste pare bat aldiz errepikatuko da, azkenez, murrizketaren ondorioz kolonia isolatuak lortuko direlarik.

3. Hedadura bidezko ereintza. Kasu honetan mikroorganismoak likidoan suspendituta egongo dira eta Petri kutxatilen gainazal osoa inokulatuko dugu likido horrekin. Pipeta esterilak erabili behar dira, hauen bidez, mikroorganismoak dituen likidoaren bolumen jakina (0.1-0.2ml) hartu ahal izateko. Hartutako bolumena kutxatilako agarraren gainean kokatuko dugu. Inokulua beirazko euskarri batekin heda daiteke (Drigalski euskarriarekin). Beirazko euskarria esterilizatzeko alkoholarekin busti eta euskarria sugarretik igaroko dugu alkohola erre dadin (esterilitatea ziurtatzeko hiru aldiz erreko dugu). Ereintza metodo honek lagineko mikroorganismo bizien kopurua ezagutzeko balio du (kolonia formatzaileen unitateak edo ufc).

4. Sakonerako ereintza. Laginaren bolumen jakin bat (mililitro bat adibidez) agarra duen eta baina solidifikatu gabeko Hazkuntza-medioarekin (demagun 15 mililitro) nahastuko dugu (agar duen hazkuntza-medioa autoklabean esterilizatu ondoren tenperatura horretan likido egoeran aurkituko dugu. Tenperatura jaistean agarra solidifikatu egingo da). Nahasketa irabiatu eta Petri kutxatila esteriletara botako dugu. Ondoren mahai gainean zortzi itsurako mugimenduak egingo ditugu apur batez (nahastu eta kutxatila osoan heda dadin). Agarra solidifikatzean mikroorganismoak agarraren barruan hasi eta kolonien kontaketa egin ahal izango da.

5. Esekiduraren bidezko ereintza, ingurune likido batetik beste ingurune likido batetara.

Inkubazioa

Hazkuntza-medioak, aztertzen ari garen mikroorganismoaren tenperatura optimoan inkubatu behar dira hazkuntza egokia lortu ahal izateko. Petri kutxatilak inkubatzean alderantzizko posizioan jarri behar dira, horrela kondentsaziorik ez baita gertatuko goialdean eta kondentsazioko tantak ez dira hazkuntza-medioaren gainean eroriko. Tenperaturaz aparte, mikroorganismoen oxigeno beharra kontutan hartu behar da. Mikroorganismoa anaerobio bada, esterila den parafinarekin estali daiteke.

7

MlKROORGANISMOAK INGURUGIROAN

Laborategia, beste edozein girotan bezala, mikroorganismo askorekin kolonizatuta dago. Mikroorganismo hauek airean edo gainazaletan itsatsiak egon daitezke. Mikrobiologoek, kontutan hartu behar dute ingurugiroko kutsadura lanerako erabiltzen dituzten materialak kutsatu ez daitezen. Lehenengo praktikan, gure lan postuan dauden ingurugiroko baldintzak aztertuko ditugu.

Materiala:

6. TSA edo CPA agar elikagarria duten Petri kutxatilak 7. Hisopo edo torunda

Prozedura:

1. Bi kutxatila erabiliko ditugu:

1. Bata mahaiaren gainean zabalik utziko dugu 30 minutuz. Ondoren kutxatila itxi eta berogailuan inkubatuko dugu. Airean mikroorganismoak dauden detektatzeko erabiliko dugu proba hau.

2. Torunda bat mahaiaren gainazaletik igaroko dugu (100 cm2 inguru) eta bigarren kutxatila hedaduraz inokulatzeko erabiliko dugu (kontuz ibili agarraren hausketa ekiditeko).

2. Kutxatilak 37°C-tan 18-24 orduz inkubatuko ditugu

3. Plakak aztertu eta kolonien tamaina, itxura eta kolorea deskribatu. Lortutako kolonia kopurua UFC edo Kolonia Eratzaileen Unitateen Kopuru dela esango dugu.

4. Kolonia batzuen GRAM tindaketa egin morfologia aztertzeko.

8

MIKROORGANISMOEN ISOLAKETA ETA IDENTIFIKAZIOA LAGIN LIKIDO BATETATIK ABIATUZ

Ingurugirotik hartutako lagin gehienek, mikroorganismoen populazio mistoak dituzte. Lagin horietan dauden mikroorganismoen ezaugarri espezifikoak aztertu baino lehen, beharrezkoa da, populazio misto horietan dauden espeziek kultibo puruan isolatzea. Behin mikroorganismoak isolatuta daudenean, zenbait proba biokimikoren bidez identifikatuko ditugu.

Horretarako gure kasuan beharrezkoa den materiala hurrengoa da:

- MacConkey eta Manitol agarra hazkuntza-medio hautakorrak dituzten plakak. - Agar elikagarri ez selektiboa (TSA edo CPA) dituzten plakak. - Kultibo mistoa duen lagin problema.

Jarraitu beharreko metodoa:

Murrizketa bidezko ereintzaren bidez hazkuntza-medio hautakorra duten kutxatilak inokulatu. McConkey agarra eta Manitol-gatz agarra inokulatuko ditugu (hazkuntza-medio hauei buruz informazio gehiago beherago).

Kutxatilak tenperatura egokian inkubatu 24 orduz.

Lehen ereintza honetan mikroorganismo mota desberdinen isolatze egokia ez bada lortzen, ildoango ereintza erabiliz berrereintzak egin beharko dira hazkuntza-medio selektiboetan isolatze egokia lortu arte.

Gram tindaketaren bidez, kolonien morfologia zelularra aztertuko dugu. Kolonia konkretua zelula bakarretik eratorria izanik, morfologia bakar bat eta Gram tindaketa mota bakarra azalduko du.

Kolonia konkretua aztertu ondoren hazkuntza-medio ez selektiboa duen kutxatilan ereingo dugu. Era honetan, ondoren egingo diren probetan erabiliko ditugun mikroorganismoak ez dira medio hautakorretik eratorriak izango (medio hautakorretatik abiatutako zelulak maiz proba biokimikoetan interferentziak ematen dituzte).

Lagin probleman dauden bakteria mota ezberdinak isolatu eta medio ez-hautakorrean hazi ondoren, identifikaziorako beharrezkoak diren froga biokimikoen bateriak egingo dira. Zein proba egingo den erabakitzeko dagokion eskema jarraitu.

9

Honako proba biokimiko hauek egin ditzakegu:

Katalasaren proba. Karbohidratoen metabolismo oxidatzaile aerobioan amaierako produktuetariko bat ur oxigenatua da (H2O2). Produktu hau toxikoa izanik, mikroorganismoek konposatu hau suntsitzeko metodoak dituzte, hauen artean katalasa entzimaren ekintza dagoelarik. Katalasak honako erreakzioa burutuz ur oxigenatua suntsitu egingo du:

H2O2 ---------> H2O + 1/2 O2

Katalasa mikroorganismo aerobio eta aukerazko anaerobioetan egoten da, eta ez dugu aurkituko aerotoleratzaileetan (azido laktikoaren bakterioak) eta anaerobioetan.

Proba hau egiteko, porta baten gainean eta ur tantarik gabe, aztertu nahi ditugun mikroorganismoak jarriko ditugu (ereintza-euskarria erabiliko dugu Petri kutxatilatik portara mikroorganismoen transferentzia egiteko). Ondoren ur oxigenatuaren diluzioa gehituko dugu mikroorganismoen gainean. Burbuilak azalduko balira adierazitako erreakzioa ematen dela esango genuke, hots, mikroorganismoak katalasa entzima daukala.

Oxidasaren proba. Arnasketa kate aerobioan c zitokromoa duten mikroorganismoak identifikatzeko erabiltzen da (enterobakterioek ez dute, eta Pseudomonas-ek bai).

Proba hau egiteko jadanik prestatuta dauden erreaktibo komertzialak erabiliko ditugu. Ereintza-euskarriarekin mikroorganismoen kolonia bat hartuko dugu eta erreaktiboak dituen tiratxoaren gainean jarriko ditugu (urik gabe). Paperaren kolorea zuria izatetik urdina izatera igarotzen bada proba positiboa dela esango dugu (mikroorganismoa oxidasa positiboa dela).

Koagulasaren proba. Odolean fibrinogenoa dago, eta mikroorganismo batzuk fibrinogenoa polimerizatu eta fibrina sortzen duten entzimak dituzte. Proba honetan entzima hori duten mikroorganismoak identifikatuko ditugu. Proba komertziala izango da, eta kontrol positiboa eta negatiboa izango ditu. Koagulasa entzima birulentzia faktorea da mikroorganismoetan.

Proba honetan latex bolatxoak izango ditugu fibrinogenoarekin estalita. Mikroorganismoa hazkuntza-medio solidotik ereintza euskarriarekin hartu eta dagokion tanpoiaren tanta batetan suspendituko dugu. Ondoren latex bolatxoen tanta bat gehituko ditugu. Mikroorganismoa eta bolatxoak nahastu eta minutu pare batez mugitu egingo ditugu. Mikroorganismoaren paretan koagulasa entzima egonik latex bolatxoak bildu egingo dira eta pikorrak azalduko dira.

IMViC. Lau proba biokimikoz osoturiko proba da eta enterobakterioen desberdintzapenerako erabiltzen da. Probak honako hauek dira:

Indolaren proba (I). Proba hau egiteko behar den hazkuntza-medio likidoa (salda) saiodian izango dugu. Medio inokulatu eta berogailuan inkubatuko dugu 37°C-tan 24 orduz. Ondoren Kovacs erreaktiboa gehituko dugu kontu handiz hazkuntza-medioaren gainean kokatuko delarik erreaktiboa (erreaktiboa oliotsua baita). Interfasean eraztun gorria eratzen bada mikroorganismoak medioan dagoen triptofanoaren degradazioz indola ekoiztu duela adieraziko du. Kolore aldaketarik ez bada ematen proba negatiboa izango da.

Metilo gorriaren proba (M). Saiodian MR-VP salda (Metilo gorria-Voges-Proskauer salda) izango dugu. Indolarekin bezala inokulatu, inkubatu eta irakurketa egiteko MR erreaktiboa gehituko dugu. Erreakzio gorria izanik proba positiboa izango da. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango.

Voges-Proskauer proba (V). Saiodian MR-VP salda izango dugu (Metilo gorriaren proban ere medio berdina da). Inkubazioaren ondoren VP1 eta VP2 Erreaktiboak gehituko dira eta proba positiboa izanik kolore gorria emango du. Negatiboan ez da kolore aldaketarik emango

10

Metilo gorriaren proban eta Vogues-Proskauer-en proban enterobakterioak burutu dezakeen hartzidura mota aztertzen da. Hartzidura bi motatakoa izan daiteke: hartzidura azido-mistoa edo hartzidura butilenglikolikoa. Lehen kasuan azidoen ekoizpen garrantzitsua gertatzen da eta ondorioz Metilo gorriaren proba positiboa irteten da (azidotasun aldaketa bortitza detektatzen da). Hartzidura butilenglikolikoan ez da azidoen ekoizpen garrantzitsurik ematen eta besteak beste, azetoina ekoizten da. Voges-Proskauer-en proban erreaktiboak gehitzean azetoinaren presentzia detektatuko dugu. Metilo gorriaren proba eta Voges-Proskauer proba ezin dira biak batera positibo izan.

Zitratoaren proba (C). Saiodian zitratoa duen medioa solidoa daukagu. Jatorriz medioa orlegia da eta inokulazioaren eta inkubazioaren ondoren mikroorganismoak zitratoa erabiltzeko gaitasuna badu kolore aldaketa emango da (medioa urdina bilakatuko da).

Urearen proba. Salda honetako hazkuntza-medioak urea izango du (NH2-CO-NH2). Mikroorganismoak urea erabiltzeko gaitasuna izanik, amonioa askatuko da eta ondorioz pH aldaketa emango da (pH-a gehitu egingo da nabarmenki). pH aldaketaren ondorioz medioaren kolore aldaketa gertatuko da (gorria bilakatzen bada proba positiboa izango da).

KIA (Kligler’s Iron Agar) multi-proba hazkuntza-medioa. Saiodian izango dugun medio solidoa izango da. Medioa ziztadaz inokulatu eta ondoren sigi-saga egingo dugu medioaren azalean. Medio honek zenbait gauza jakiteko erabili daiteke. Besteak beste, medioan sulfato ferrosoa, glukosa kontzentrazio baxuan, laktosa kontzentrazio handitan eta pH indikatzailea daude.

Mikroorganismoak sulfatoa elektroi hartzaile bezala erabiltzeko gai bada arnasketa anaerobioaren bidez, sulfidrikoa ekoiztuko da, eta medioan burdin ferroso ioia dagoenez, FeS eratuko da. Sulfuro ferrosoa eratu eta prezipitatzean prezipitatu beltza ikus daiteke.

Mikroorganismoaren metabolismo hartzitzailearen ondorioz CO2 ekoizten bada, medioa ziztatutako lekuan burbuilak agertuko dira. Batzutan, gasaren produkzioaren ondorioz medioak gora egin edo apurtu egin daiteke.

Mikroorganismoak glukosa erabiltzeko ahalmena badu baina laktosa erabiltzekoa ez, hartzidura egitean azido kopuru txikia eratuko da. Azidoaren ekoizpenak medioaren kolore aldaketa erakarriko du saiodiaren hondoan (gorritik horira), baina azalean oxigenoaren presentziaren ondorioz eta medioan dagoen peptonaren erabileraren ondorioz amonioa ekoiztu eta pH-a altuagoa izango da, kolore aldaketarik ez delarik emango. Kasu honetan, laburbilduz, hondoa horia izango da eta gainazala gorria.

Mikroorganismoak bai glukosa eta bai laktosa erabiltzeko gai bada, hartziduraren ondorioz azido asko ekoiztuko dira eta amonioaren ekoizpenak ezingo du medio osoaren azidifikatzea ekidin. Ondorioz medio bere osotasunean gorritik horira pasatuko da.

Proba biokimikoen bateria komertziala. Plastikozko tiratxo batetan hodi eta kupula anitz izango ditugu. Hodi bakoitzean deshidrataturik dagoen substratua dago, eta proba honetan mikroorganismoak substratu desberdinak erabiltzeko ahalmena aztertuko dugu. Mikroorganismoa dagokion tanpoian suspenditu eta hodi eta kupula horiek fabrikatzaileak adierazten duen eran inokulatuko ditugu. Inkubazio aldia (24 ordu) igaro ondoren kolore aldaketak emango dira. Aldaketa horiek proba positiboa den edo ez adieraziko dute. Kasuren batzutan erreaktiboak erabili beharko ditugu erreakzioaren emaitza ezagutzeko.

Aurreko proba biokimiko guztien emaitzak oinarritzat hartuz mikroorganismoen identifikazioa lortu ahal izango dugu.

11

McConkey Agarra

Hazkuntza-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.

Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

- Gatz biliarrak eta kristal-bioleta: bakterio Gram positiboen hazkuntza) eta zenbait Gram negatibo sentikorrena) inhibitzen du. Ondorioz, Gram negatiboak hasiko dira.

- Laktosa eta Glukosa 10:1 proportzioan. Mikroorganismo gehienek glukosa erabiltzeko gaitasuna dute, eta gutxi batzuk laktosa ere erabili dezakete. Mikroorganismoek glukosa soilik erabiltzen badute glukosaren hartzidura egitean konposagai azido gutxi ekoiztuko dituzte. Aldiz, glukosa eta laktosa erabiltzen badute, hartziduran konposatu azido asko ekoiztuko dituzte.

pH indikatzailea. Koloniak azido asko ekoizten badituzte kolore gorria izango dute (hots, laktosa erabiltzen dutenean). Ekoiztutako azido kopurua txikia denean koloniak zuriak izango dira.

Manitol-gatz agarra

Hazkuntza-medio hautakorra eta bereizgarria da. Petri kutxatiletan izango dugu.

Medioaren konposagaien artean honako hauek ditugu:

Kloruro sodikoaren kontzentrazio altua (7.5%). Gatz kontzentrazio altua jasan dezaketen mikroorganismoak soilik haziko dira.

Manitola. Manitolaren hartzidura ematen bada azidoak ekoiztuko dira kopuru handitan.

pH indikatzailea. Medioa berez gorrizka da, eta manitol positiboak diren kolonien inguruan halo horia ikusi ahal izango dugu (azidoen ekoizpenaren ondorioz)

12

13

Escherichia Hafnia

Shigella Serratia

Salmonella Proteus vulgaris

Arizona Proteus mirabilis

Indola + -/+ - - - -/+ - - - - + - + + +

Metilo Gorria + + + + + - - - +/- -/+ + + + + +

Voges-Proskauer - - - - - + + + +/- + -/+ -/+ - - -

Simmons zitratoa - - d + + + + + +/- + d + - + +

H2S - - + + +/- - - - - - + + - - -

Ureasa - - - - dw +w +w - - dw + + + + -

Mugikortasuna +/- - + + + - + + + + + + + + +

Glukosatik CO2 + - + + + + + + + +/- +/- + d -/+ -

Laktosa + - - d d + + + -/+ -/+ - - - - -

Enterobacter aerogenes Providencia

Enterobacter cloacae Proteus retgeri

Klebsiella Proteus morganii

Citrobacter

+ >%90 positiboak +/- gehienak positibo, baina <%90

- >%90 negatiboak -/+ gehienak negatiboo, baina <%90

d: positibo berantiarra (3-5 egun)

w: erreakzio ahula

14

Proba biokimikoen emaitzak

Proba Emaitza positiboa

C zitokromo oxidasa Kolore urdina

Katalasa Burbuilen agerpena (02 ekoizpena)

Indolaren ekoizpena Eraztun gorria

Metilo Gorria - RM (Hartzidura azido-mistoa) Kolore gorria

Voges-Proskauer (hartzidura butilenglikolikoa) Kolore gorria

Manitol-Gatz agarra

Gatz kontzentrazioa altua jasan

Manitolaren hartzidura

Hazkuntza

Kolore horia

KIA (Kligler’s Iron Agar)

Glukosaren hartzidura

Lactosaren hartzidura

Gas ekoizpena

H2S ekoizpena

Hondo horia

Superfizie horia

Burbuilak edo agarraren apurketa

Kolore beltza duen prezipitatua

MIKROORGANISMOEN BEHAKETA.

Mikroskopioaren erabilera.

1. Objektiboak, okularrak eta kondentsadorea garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu handiarekin garbitu.

2. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da. Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa erabiliko dugu.

3. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez litzateke beharrezko izan beharko).

4. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko olioa beharrezkoa da, era horretan difrakzio arazoak ekiditen baitira. Fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili

5. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko, diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu

6. Behaketa guztiak amaitu ondoren eta mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri.

7. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argi-iturria itzalita mantendu.

15

Tindaketen prestaketa.

Mikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauek portatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatan bakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasu guztietan portan oso garbi egon beharko dira.

Bakterio hedapenaren prestaketa

1. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren erdian.

2. Suaren gainean euskarria bertikalki jarriz esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan.

3. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera, hodia sutatik pasatu eta hodia itxi.

4. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz.

5. Euskarria esterilizatu.

6. Prestaketa lehortu arte itxaron.

7. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan geratzea lortuko dugu. Azken hau lortzeko alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili daitezke, baina beroa da erabiliena.

16

MIKROORGANISMOEN BEHAKETA.

Mikroskopioaren erabilera.

8. Objektiboak, okularrak eta kondentsadorea garbiak daudela ziurtatu. Ez baleude kontu handiarekin garbitu.

9. Lagina 10X objektiboarekin fokatu. Fokatzeko hasieran torloju makrometrikoa erabiltzen da. Fokatze finagoa lortzeko torloju mikrometrikoa erabiliko dugu.

10. Ondoren, 40X objektiboa jarri eta fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili (makrometrikoa ez litzateke beharrezko izan beharko).

11. Laginaren gainean olio tanta bat jarri eta 100X objektibora pasatu. Objektibo hau erabiltzeko olioa beharrezkoa da, era horretan difrakzio arazoak ekiditen baitira. Fokatzeko torloju mikrometrikoa erabili

12. Beharrezkoa izanik, argi kopurua kontrolatzeko, diafragmaren bidez argiaren sarrera kontrolatu

13. Behaketa guztiak amaitu ondoren eta mikroskopioa gorde aurretik objektiboak garbitu egin beharko dira (batez ere 100X objektiboa olioa kentzeko). Bukatzerakoan estalkia jarri.

14. Mikroskopioa erabiltzen ez den bitartean argi-iturria itzalita mantendu.

Tindaketen prestaketa.

Mikroskopioarekin mikroorganismoak behatzeko, hauek portatan jarri beharko ditugu. Horretarako portatan bakterioen hedapena prestatu beharko dira. Kasu guztietan portan oso garbi egon beharko dira.

Bakterio hedapenaren prestaketa

8. Ereintza-euskarriarekin ur tanta bat jarri portaren erdian.

9. Suaren gainean euskarria bertikalki jarriz esterilizatu gori jarri arte bere luzera osoan.

10. Bakterioen kultiboa duen hodia hartu, suaren ondoan ireki eta sutatik pasa, tapoia sutatik gertu mantenduz. Esterilizatutako euskarria hodian sartu, hoztu beirarekin kontaktuan eta zelula kantitate txiki bat hartu. Euskarria hoditik atera, hodia sutatik pasatu eta hodia itxi.

11. Euskarriarekin hartutako zelulak portan dagoen ur tantan suspenditu eta ondoren hedatu portaren azalera zehar kapa fin eta homogeneo bat lortuz.

12. Euskarria esterilizatu.

13. Prestaketa lehortu arte itxaron.

14. Zelulak portaren azalean finkatzeko, porta bi aldiz sutatik pasatu. Honela bakteriak portan geratzea lortuko dugu. Azken hau lortzeko alkohola eta zenbait konposatu kimiko ere erabili daitezke, baina beroa da erabiliena.

Medio likido batetik abiatzen bagara, pauso berdinak jarraitu behar dira, baina ur tantarik ez dugu behar izango (mikroorganismoen esekidura jadanik badaukagulako).

17

18

19

A. BEHAKETA FRESKUAN.

Muntai hezea

Legamia, onddo eta algak behatzeko erabiltzen den prestaketa mota. Bakterio biziak ikusteko ere erabili daiteke.

Mikroorganismoaren tanta bat portan jartzen da eta estalkirekin estali (aire burbuilak ekidin beharko dira). Ondoren mikroskopioan behatzen da.

Zintzilikaturiko Tanta

Hazkuntza-medio likido batetan hazten ari diren mikroorganismoak ikusteko erabiliko dugu teknika hau.

1. Estalki baten lau izkinetan baselina pixka bat jarriko dugu.

2. Ereintza-euskarriarekin kultiboaren tanta bat hartuko dugu eta estalkiaren erdian jarriko dugu.

3. Estalkiari buelta eman eta induzturiko porta baten alde sakonaren gainean kokatuko dugu laginaren tanta.

Behaketarako, mikroskopioaren xlO objektiboarekin tantaren ertza fokatuko dugu (ertza itsura ondulatudun lerro bat bezala ikusiko da). Ondoren x40 objektiboa jarri, berriz ere ertza fokatu, eta azkenez xlOO objektiboa jarriko dugu (olioarekin). Tantaren ertzean bakterioak ikusiko ditugu. Bakterio hauek, baldin eta flageloak badituzte mugitzen ikusiko ditugu.

Esperimentu honetan, behaketa mikroskopikoa egitean, bakterioak ez daudenez tindatuta, behaketa zaila izango da. Behar beharrezkoa izango da kondentsadoretik sartzen zaigun argi kopurua oso ondo kontrolatzea mikroorganismoak ikusi ahal izateko.

Baselina

Mikroorganismoaren tanta

20

B. TINDAKETA BEREIZGARRIAK

Tindaketa bereizgarriak bakterioak sailkatzeko edo bereizteko erabili daitezke bakterioek tindatzeko orduan erakusten dituzten propietateen arabera.

GRAM tindaketa

Bakterioen azterketarako erabiltzen den tindaketa bereizgarri garrantzitsuena da.

Tindaketa honek bakterioak bi taldetan banatzen ditu, bakterioen pareta zelularraren ezaugarrien arabera: GRAM positiboak eta GRAM negatiboak.

Tindaketa egiteko mikroorganismoaren hedapen bat egingo da porta batetan, suarekin finkatu, eta ondoren tindaketa.

1. Lagina kristal bioleta koloratzaile basikoarekin estali (minutu bat) 2. Urarekin garbitu 3. Lugolarekin estali (minutu bat). Lugola, iodoa duen finkatzailea da (Kristal bioletaren finkapena

baimentzen du). 4. Urarekin garbitu 5. Alkohol-azetonarekin dekoloratu (30 segundo). Gram negatiboetan, pausu honek kristal bioleta

kendu egingo du. Gram positiboetan ez da dekolorazioa emango. 6. Urarekin garbitu 7. Safraninarekin edo fuksinarekin tindatu (1 minutu). Kontraste tindaketa da hau. Gram negatiboek

kolore arrosa hartuko dute, eta Gram positiboek kristal bioleta dutenez, azken koloratzaile hau ez da antzemango.

8. Urarekin garbitu 9. Sikatu 10. Behaketa mikroskopikoa. Beraz, kolore urdinak direnak GRAM positibok direla esango dugu, eta kolore arrosadunak GRAM negatiboak, eta normalki tindaketaren emaitza paretaren izaerarekin erlaziona dezakegu. Dena den, GRAM positibo edo negatiboak izateak tindaketa baten ondorioz lortzen dugun kolorea adierazten du (urdina edo arrosa), eta ez derrigorrez pareta zelularraren izaera. Hala ere, mikroorganismo askorentzat, eta batez ere guretzat garrantzitsuak izan daitezkeen mikroorganismo askorentzat, tindaketaren emaitza eta paretaren izaera erlazionatzea posible da.

21

GRAM TINDAKETA

22

C. TINDAKETA SELEKTIBOA

Kapsularen tindaketa

Bakteria asko lodiera desberdina izan dezakeen kapsula batez inguraturik daude; kapsula hauek zelula baino intentsitate txikiagoarekin tindatzen dira, eta ondorioz, tindaketa arruntekin ez dira nabarmentzen. Kapsula hauek behatzeko tindaketa mota egokia tindaketa negatiboa da. Tindaketa honetan koloratzaile azidoak erabiltzen dira (koloratzaile azidoetan kolorea gatzaren ioi negatiboan oinarrituta dago, eta zelula gehienak kanpoaldean karga negatiboa dutenez, ez dute koloratzailea hartzen eta koloratzailea zelula inguratzen dagoen likidoan geratuko da).

Portaren izkina batetan tinta txinatarra edo negrosina tanta bat jartzen dugu. Ereintza euskarriarekin mikroorganismoen kopuru txiki bat hartuko dugu eta koloratzailearen tantan suspendituko ditugu. Ondoren, beste porta baten ertzarekin eta koloratzailearen tantatik hasita frotis bat egiten da portaren luzeran zehar. Era honetan koloratzailearen kapa fin bat lortzen da, kapa fin horretan mikroorganismoak egongo direlarik. Lagina airean lehortzen usten da, eta ondoren mikroskopioan behatzen da. Bakterioak dauden lekuan kolore argia izango dugu (koloratzailerik gabe).

Tindaketa mota hau bakterioen morfologia ikusteko ere erabili daiteke.

Endosporen tindaketa

Bacillus eta Clostridium generoetako espezieek ingurune baldintzekiko oso erresistenteak diren egiturak eratzen dituzte: endosporak. Endosporak, zelula begetatiboak ez bezala, denbora epe luzetan baldintza desfaboragarrietan iraun dezakete. Egitura hauek, tindatzaileekiko ere erresistentzia erakusten dute, tindaketa mota gehienetan ez direlarik koloreztatzen. Hala ere, tindatu ondoren, koloratzailea kentzea oso zaila da. Endosporak tindatzeko tindatzaile kontzentratuak berotan erabiltzen dira.

Endosporen tindaketa: Wirtz metodoa

Endospora asko dituen bakterio kultibo zahar baten tanta bat portan jarri eta lehortzen utzi (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium). Beroarekin finkatu. Malakita berdearekin estali eta berotu lurrina irten arte. Horrela mantendu hiru minutuz. Urarekin garbitu eta kontrastea lortzeko fuksina koloratzailea gehituko diogu minutu batez. Esporak kolore berdea hartuko dute eta zelulek arrosa.

23

Gorputz metakromatikoen tindaketa

Bakterio batzuk polifosfatoz osoturiko pikorrak dituzte (gorputz metakromatikoak edo bolutina pikorrak). Pikor hauek koloratzaile basikoekin tindatu eta koloratzailearen argi xurgapenaren ezaugarriak alda ditzakete (horregatik deritze metakromatikoak). Egitura hauek lehenengo aldiz Spirillum volutans espezien aurkitu ziren (horregatik bolutina pikorrak izena); Lactobacillus generoan ere agertzen den egitura da (jogurta egiteko Lactobacillus vulgaricus eta Streptococcus thermophilus erabiltzen dira)

Egitura zelular gehienak koloratzaile basikoekin tindatzen dira hauen inguruko pH-a puntu isoelektrikoaren gainetik dagoenean (5 baino handiagoa). Bolutina osagai azidoez osatua dagoenez, koloratzaile basikoekin tindatu ahal izateko medioaren azidotasuna jaitsi egin beharko da bolutina pikorren eta koloratzaile basikoaren arteko afinitatea lortzeko (pH <4).

Albert tindaketa

1. Lactobacillus kultiboaren (jogurta) hedapena portan egin eta airean lehortu.

2. Albert tindatzailearekin 5 minutuz estali.

3. Tindatzailea kendu, lugola gehitu minutu batez, urarekin garbitu, lehortu eta 100X objektiboarekin mikroskopioan behatu.

Gorputz metakromatikoak orlegi-urdin kolorez tindaturik ikusten dira, bakterioaren gainontzeko zatiak orlegi argiak. Lactobacillus zelulen barruan puntutxoen segida bat bezala azalduko dira gorputz metakromatikoak.

D. ONDDO FIRUKARIEN BEHAKETA

Praktika hau egiteko onddo harikaren kultiboak izango ditugu abiapuntu. Prozedura: - Onddo harikara hazkuntza medioan jadanik hazita izango dugu. - Kultiboaren azala zinta itsaskor garden baten zatitxoarekin ukituko dugu. - Porta baten gainean Laktofenol urdinaren tanta bat jarriko dugu. - Zinta itsaskorra laktofenolaren gainean kokatu - Mikroskopioan behatu. Asmoa onddoen egiturak ikustea. Ikasi egin beharko dugu bereizten mizelioa, esporak, eta esporangio mota ezberdinak.

24

ESEKIDURA BATETAKO MIKROORGANISMO-KONTZENTRAZIOAREN KALKULOA

Praktika honen helburua esekidura batetako mikroorganismoen kontzentrazioa kalkulatzea da. Materialak: - 0.9 ml diluitzaile duten saiodiak (diluitzailea: peptona soluzioa edo ur destilatu esterila) - TSA medio solidoa duten Petri kutxatilak - 100 eta 10 µl-tako pipetak - Escherichia coli esekidura - Bacillus subtilis esekidura Prozedura (irudia ikusi): 1. Esekiduraren diluzioak egin:

Egin beharreko diluzioak: 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5 eta 10-6. 2. Mikrotantaren teknikaren bidez agar plakak erein.

- Bi Petri kutxatila izango ditugu. Bakoitza bederatzi zatitan zatitu. Guztira 18 karratu lortuko dira.

- Diluzio bakoitzetik 10 µl soluzio hartu hiru aldiz eta hiru karratu inokulatu. Tanta kontu handiz kokatuko dugu karratuaren erdian Petri kutxatila posizio horizontalean daukagula. Guztira 18 karratu inokulatuko ditugu (6 diluzio bider 3 karratu diluzio bakoitzeko).

3. Kutxatilak 37°C-tan 24 orduz inkubatu. 4. Inkubazioaren ondoren, diluzioaren arabera honako egoeratan aurki gaitezke:

- Hazkuntza asko izan eta koloniarik ez bereiztea. - Kolonia kopuru kontagarria edukitzea - Diluzio oso altua izatea, eta ondorioz koloniarik ez haztea Kolonia kopuru kontagarria eman duen diluzioaren 3 karratuak kontatuko ditugu eta datu horietan oinarrituz mikroorganismoen esekiduraren dentsitatea kalkulatuko dugu (ikusi irudiaren azpian egindako kalkuluak).

Kalkuluen ondoren lortzen dugun zenbakia (demagun 3,4.107 lortu dugula) unitate egokiekin adierazi beharko dugu: ufc/ml (kolonia-formatzaileen kopurua mililitroko). Kolonia-formatzaileen kopurua eta esekidurako mikroorganismoen kopurua ez dira gauza berdina. Esekiduran egon daitezke mikroorganismoak gerta daiteke ez haztea medioan. Arrazoia hauetariko bateren bat izan daiteke: - Esperimentuan erabilitako hazkuntza-medioa ez da egokia mikroorganismoaren hazkuntza lortzeko. - Inkubazio baldintzak ez dira egokiak (denbora, tenperatura, oxigeno kontzentrazioa…) - Mikroorganismoak kaltetuta edo hilda daude laginean Oharra: Mikrotantaren teknika erabili beharrean, normalean ereintzak Petri kutxatila osoan egiten dira. Kasu honetan, diluzio bakoitzeko 100µl-tako lagina erabiliko da ereintzak egiterakoan. Petri kutxatila bakoitzean 100 µl-tako lagina inokulatuko da (lagina L formako euskarri batekin sakabanatu egingo da medioaren azalera guztian), eta inkubazioaren ondoren kontaketak eta kalkuluak egingo dira lagin problemako mikroorganismo-kontzentrazioa ezagutzeko.

25

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 Hasierako bolumena 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 Diluzioa 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1. tanta + + + 12 2 0 2. tanta + + + 11 2 0 3. tanta + + + 13 1 0 Positiboa: ez dira kolonia isolatuak nabaritzen Zenbakia: kolonia kopurua diluzio horretan adierazten du

Kasu honetan 10-4 diluzioa aukeratuko dugu lagin problemako kontzentrazioa kalkulatzeko (10-5 diluzioan kolonia kopurua txikiegia da eta estatistikoki kalkulua ez da egokia; diluzio baxuagoetan koloniarik ez denez desberdintzen ezin dugu kalkulurik egin). Lagin problemako kontzentrazioa

((12+11+13)/3 )*(1/10-4)*(1000/10) ufc/ml ((12+11+13)/3 ): hiru ereintzen batezbesteko aritmetikoa (1/10-4): kalkuluak egiteko erabili dugun diluzioa (1000/10): 10 µl erabili dugunez, kalkulua mililitroko egiteko korrekzioa

Lagin problema