Aspectos técnicos para establecer el límite de la detección mediante amplificación por

PCR

Martha Graciela Rocha MuniveCentro Nacional de Investigación y

capacitación ambiental Instituto Nacional de Ecología

Necesidad de un muestreo específicamente diseñado para detectar OGMs

Protocolos existentes:

USDA: “Sampling and testing recommendations for the detection of Cry9c protein in hybrid seed corn”

Normas internacionales como ISO542 o ISO6644

Normas del ISTA (International Seed Testing Association)

Los anteriores asumen homogeneidad de las muestras. “Kernel lot distribution assessment (KeLDA)”

Fases en la detección

Manejo de la muestra

HomogeneizaciónToma de muestras en el campo Toma de

submuestra*

Extracción de ADN

Toma de submuestra *

DETECCIÓN Amplificación por PCR

LABORATORIO

*Estas deben ser representativas de todo el lote

“Polymerase Chain Reaction” o PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)

Es una técnica que permite obtener fragmentos de ADN in vitro, a partir de un molde o patrón conocido (en este caso una secuenciainsertada en un OGM)

Monitoreo y detección de OGMs

Posibles errores en las diferentes fases del muestreo

Tamaños de muestra pequeñosFalta de homogeneización de la muestraExtracción Sub-muestra analítica

Homogeneización de la muestra

Si se analizan granos para poder analizar al mismo tiempo el mayor número de individuos posibles, estos deben molerse y homogeneizarse.

Harina

Homogeneización de la muestra, toma de la submuestra

Realizar extracción de ADN por duplicadoHarina

Usando la aproximación normal a la distribución binomial, se pueden asignar probabilidades de acuerdo al número de partículas que se tienen

Ejemplo:

Si el contenido de OGM del campo es del 0.01%, la probabilidad de que 2g contengan 0.01% ± 0.005, es de p=0.943

1 g contiene 73,000partículas

Para 200mg, p=0.4543

Para 100mg, p=0.3308

Fase de sub-muestreo de ADN para la reacción de PCR

PCRReacción PCR

ADN moldeiniciadorTaq polimerasadNTPMgCl2

Una reacción típica de PCR emplea 100ng de ADN, que corresponden a 37,000 copias del genoma del maíz

•Si la concentración es 0.1% (1/1000), hay 37 copias de genoma GM•Si la concentración es 0.01% (1/10000), hay 3.7 copias de genoma GM

Importancia del número de copias del genoma!!!

Criterios para la evaluación de métodos

PrecisiónExactitudCongruencia – repetibilidad :

independiente del métodointra - laboratoriointer - laboratorio

SensibilidadLímite de detección (LOD)Límite de cuantificación (LOQ)

EspecificidadAplicabilidad

MatrizConcentraciones

Sensibilidad

El número de moléculas que se requieren para que el método detecte al analito

Se espera que las pruebas de detección deOGMs sean altamente sensibles

Límite de detección

La concentración mínima a la cual se puede determinar el analito de manera confiable.

Generalmente se expresa como la concentración del analito a la cual el método lo puede detectar en un 95% de los casos.

Límite de cuantificación

Es la mínima cantidad o concentración de analito que se puede cuantificar con precisión y exactitud, de manera reproducible de acuerdo a una validación intra o inter-laboratorio.

Límites reconocidos

Límite de detección— 0.01%

Límite de cuantificación—0.1% usando PCR en tiempo real

Recientemente se reportan valores de LOD de hasta 0.0025%.

Determinación empírica del límite de detección

0 de 10----------0.0012

6 de 10--++-++++-0.0025

9 de 10+++++++-++0.005

10 de 10++++++++++0.01

10 de 10++++++++++0.02

Frecuencia Detectada10987654321

Resultado% OGM

Las muestras deben analizarse como muestras ciegas

Determinación empírica del límite de detección

0 0.01% 0.005% 1 2 3 4 5

Controls Samples

1 0.02%2 0.01%3 0.005%4 0.0025%5 0.00125%

Las muestras deben analizarse junto con las concentraciones al LOD

0% 0.1% 0.01% 0.01% #1 #2 #3

0% 0.1% 0.01% 0.01% #1 #2 #3

35S

NOS

Otras fases críticas en la eficiencia del método

Extracción ADN

Rendimiento de extracciónPureza del ADNCalidad para amplificaciónAusencia de inhibidores de PCR

Otras fases críticas en la eficiencia del método

Optimización de la reacción de amplificación

Selección de iniciadores óptimosCondiciones de amplificación más eficientesUso de controles adecuadosUso de enzimas de alta eficiencia de amplificación

Conociendo el LOD se puede planear el muestreo mas apropiado

Un LOD de la PCR permite emplear muestras grandes, de hasta 10,000 granosSe pueden hacer agrupamientos de las muestrasSuponer una frecuencia de 0.1% de OGM en la parcela (1/1000)Tamaño de muestra = 1000 granos37% probabilidad de no encontrar el positivo (falsos negativos)Tamaño de muestra = 10,000 granos99.99% probabilidad de detectar el OGM.

Como asegurar la certeza de los resultados:

Obtener muestras representativas del lugar donde se requiere hacer la detección

Obtener muestras representativas y homogeneas del material para realizar la extracción de ADN

Optimizar los métodos de extracción de ADN

Obtener el número suficiente de copias de ADN para poner a la reacción de amplificación

Optimizar los protocolos de amplificación por PCR

Establecer y optimizar los límites de la detección

Fases en la detección

Manejo de la muestra

HomogeneizaciónToma de muestras en el campo Toma de

submuestra*

Extracción de ADN

Toma de submuestra *

DETECCIÓN Amplificación por PCR

LABORATORIO

*Estas deben ser representativas de todo el lote

Regresemos al muestreo en campo…

Una vez establecido el LOD, se requiere determinar el “umbral de tolerancia” para la presencia en el campo:

Si se puede detectar 1/10,000 podemos tener un umbral de 0.01%

Un umbral más conservador 1/1000, permite minimizar costos y esfuerzo de colecta, permite cuantificar con precisión