Articulo Experimental

DETERMINACIÓN DE NIVELES DE CORTICOSTERONA PLASMÁTICA Y PILOSA EN RATAS WISTAR

ADOLESCENTES HACINADAS

Duván Fernando González Uarquin

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina

Bogotá D.C., Colombia

2014.

III

DETERMINACIÓN DE NIVELES DE CORTICOSTERONA

PLASMÁTICA Y PILOSA EN RATAS WISTAR ADOLESCENTES HACINADAS

Duván Fernando González Uarquin

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Neurociencias

Director:

Manuel Joaquín Rojas Barreto DMV. MSc.

Codirector:

Luis Fernando Cárdenas Parra, Psicólogo MSc PhD

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina

Bogotá D.C., Colombia

2014

V

"Una cosa es segura, cuanto más profundamente

confundido hayas estado en tu vida, más

abierta se vuelve tu mente a nuevas ideas"

Neil deGrasse Tyson.

VII

Agradecimientos

A mi familia y a Liliana.

A mi director de tesis, Manuel Rojas y mi codirector, Fernando Cárdenas

Al profesor Jerrold Meyer y a su laboratorio en la Universidad de

Massachusetts por enseñarme sobre este tópico de investigación, y por

brindarme la posibilidad de procesar y analizar las muestras.

A Marykate, Carly, Mike y a todo el equipo de softball “Owls” por

brindarme su confianza, respeto y amistad durante la estadía en Estados

Unidos.

Al equipo del laboratorio de Neurociencia y comportamiento de la

Universidad de los Andes, dónde desarrollé la fase experimental.

A los profesores que me apoyaron en el desarrollo de este trabajo.

A quienes han mostrado su interés por continuar trabajando en esta área del

conocimiento.

VIII

Resumen

En el presente trabajo se pretende determinar si hay cambios en la concentración de

corticosterona en plasma y pelo de ratas Wistar en etapa juvenil sometidas a

condiciones de hacinamiento como modelo de estrés crónico. Se utilizaron 18 ratas

Wistar machos de 38 días de edad, distribuidas en dos grupos, control y experimental.

Los sujetos experimentales se sometieron a un periodo de hacinamiento durante la

fase final de la etapa juvenil (27 días). Los sujetos hacinados presentaron disminución

significativa P<0,05 en el peso final promedio (266,5 ± 9,63g) respecto a los controles

(341,2 ± 23,52g), además presentaron aumento significativo P<0,05 en los niveles

promedio de corticosterona plasmática (470,16 ± 113,24 ng/ml) y pilosa (40,5 ±

9,75pg/mg) frente a los niveles hallados en los controles (232,6 ± 78,72 ng/ml y

19,67 ± 2,57 pg/mg en plasma y pelo respectivamente). Este estudio contribuye al

desarrollo científico en la búsqueda de métodos no invasivos para el monitoreo de la

corticosterona.

Palabras clave: corticosterona, estrés crónico, etapa juvenil, hacinamiento, pelo,

Wistar.

IX

DETERMINATION OF PLASMA AND HAIR CORTICOSTERONE

LEVELS IN OVERCROWDED ADOLESCENT RATS.

Abstract

For this study we determine whether exist changes in levels of plasma and hair

corticosterone of young Wistar rats under crowded conditions like chronic stress

model. 18 Wistar rats of 38 days old were divided in two groups, control and

overcrowding; the experimental subjects were exposed to an overcrowding

period during their youth (Post natal day 65). The overcrowded subjects showed

significant difference P<0, 05 for the final body weight average (266,5 ± 9.63g)

compared to control animals (23.52 ± 341,2g). Additionally, the overcrowded

group showed higher corticosterone plasma concentration (470, 16 ± 113.24 ng /

ml) and also hair corticosterone concentration (40, 5 ± 9.75 pg / mg) compared to

control subjects (232, 6 ± 78.72 ng / ml and 19.67 ± 2.57 pg/ml in plasma and

hair respectively). This work contributes to the search of noninvasive methods

and the monitoring of corticosterone levels.

Keywords: chronic stress, corticosterone, hair, overcrowding, Wistar, youth.

X

Contenido

Resumen ................................................................................................................. VIII

Abstract ..................................................................................................................... IX

Lista de Figuras ...................................................................................................... XIII

Lista de Tablas........................................................................................................ XIV

Lista de Abreviaturas .............................................................................................. XV

Capítulo 1

Introducción .......................................................................................................... 16

1.1. Problema Científico .............................................................................. 16

1.2. Justificación ........................................................................................... 17

Capítulo 2

Estado del Arte ...................................................................................................... 18

2.1. Estrés ..................................................................................................... 18

2.2. Clasificación del estrés: agudo y crónico .............................................. 19

2.3. Hacinamiento como modelo de estrés crónico ..................................... 23

2.4. Etapa juvenil y hacinamiento ................................................................ 23

2.5. Glucocorticoides y medición de estrés crónico..................................... 26

2.6. Glucocorticoides en pelo como indicadores fisiológicos de estrés crónico……………………………...……………………....………..26

2.7. Técnicas para cuantificación de Glucocorticoides en pelo ................... 29

XI

Capítulo 3

Objetivos ............................................................................................................... 31

3.1. Objetivo general .................................................................................... 31

3.2. Objetivos específicos ............................................................................ 31

Capítulo 4

Materiales y métodos ............................................................................................ 32

4.1.Animales y condiciones de alojamiento .............................................. 32

4.2.Muestras de sangre y análisis hormonal ................................................ 32

4.3. Muestras de pelo y análisis hormonal ................................................... 33

4.4. Punto final/Eutanasia ............................................................................ 34

4.5. Análisis estadístico ................................................................................ 34

4.6. Consideraciones éticas y disposiciones vigentes .................................. 34

Capítulo 5

Resultados ............................................................................................................. 36

5.1. El pelo de rata Wistar expresa corticosterona y el hacinamiento

durante el periodo juvenil causa incremento en los niveles de

corticosterona pilosa ........................................................................... 36

5.2. El hacinamiento de ratas Wistar durante su periodo juvenil causa

incremento en los niveles de corticosterona plasmática ...................... 37

5.3. No hay correlación entre los niveles plasmáticos y pilosos de

corticosterona en ratas jóvenes hacinadas

............................................................................................................ 38

XII

5.4. El hacinamiento causa diferencias significativas en la ganancia de

peso durante la etapa juvenil de ratas Wistar

.......................................................................................................... 39

5.5. El peso de los órganos analizados no está significativamente

correlacionado con el peso corporal tanto en sujetos controles

como en sujetos hacinados.

........................................................................................................ 40

5.6. Peso absoluto de pulmones y glándulas adrenales no varía entre ratas

Wistar jóvenes controles y hacinadas; sin embargo si se presenta

aumento significativo entre el peso del corazón y riñones de los

sujetos controles versus los sujetos hacinados.

............................................................................................................ 42

5.7. Peso relativo calculado a partir del peso de los órganos sobre el peso

corporal de ratas Wistar jóvenes en condiciones de hacinamiento.

............................................................................................................ 43

Discusión ............................................................................................................ 44

Capítulo 6

6.1. Conclusiones ......................................................................................... 48

6.2. Recomendaciones .................................................................................. 49

Bibliografía ................................................................................................................ 50

XIII

Lista de Figuras

Figura No. 1. Regulación del sistema hipotalámico-Pituitario-Adrenal. ......... 22

Figura No. 2. Principales momentos del desarrollo desde la gestación hasta

la edad adluta de la rata. ............................................................................. 24

Figura No. 3. Rutas de secreción de cortisol en el tallo del pelo ..................... 27

XIV

Lista de gráficas

Gráfica No. 1. Niveles de corticosterona pilosa . ............................................. 36

Gráfica No. 2. Niveles de corticosterona plasmática. ...................................... 37

Gráfica No. 3. Correlación entre niveles de corticosterona plasmática y

corticosterona pilosa. ................................................................................. 38

Gráfica No. 4. Promedio de ganancia de peso ................................................. 39

Gráfica No. 5. Correlación entre el peso de órganos y el peso corporal en

los sujetos controles. .................................................................................. 40

Gráfica No. 6. Correlación entre el peso de órganos y el peso corporal en

los sujetos hacinados.. ................................................................................ 41

Gráfica No. 7. Peso absoluto de organos. ........................................................ 42

Gráfica No. 8. Peso relativo de órganos ........................................................... 43

XV

Lista de Abreviaturas

°C Grados centígrados

µl Microlitro

ACTH Hormona adenocorticotropa

ANOVA Análisis de varianza

CA Cuerno de Amón

cm Centímetro

cm2 Centímetro cuadrado

CRF o CRH Hormona liberadora de corticotrofina

DE Desviación estándar

DPN Día posnatal

HPA Eje Hipotálamo – Hipófisis – Adrenal.

g Gramo

Gc Glucocorticoide

h Hora

Kg Kilogramo

m Metro

mg Miligramo

ml Mililitro

ng Nanogramo

NPV Núcleo paraventricular

pl Picolitro

RPM Revoluciones por minuto

SN Sistema nervioso

SNS Sistema nervioso simpático

16

Capítulo 1

Introducción

Constantemente los seres vivos son desafiados por factores que se asocian a variaciones del

equilibrio del organismo (Hogan et al., 2012), estos factores se denominan eventos estresantes, los

cuales desencadenan respuestas fisiológicas y comportamentales que pueden causar alteraciones en

el estado de salud y del bienestar del individuo. La activación del eje Hipotálamo-Hipófisis-Adrenal

es responsable de la secreción de glucocorticoides desde la corteza adrenal. En ratas el

glucocorticoide más importante es la corticosterona (Dallman et al., 2004), esta hormona es

responsable de la aparición de síntomas asociados al estrés crónico. En ratas jóvenes las condiciones

de alojamiento tienen impacto significativo en el desarrollo, la salud y el bienestar. El hacinamiento

es un evento estresante para el animal joven y se ha demostrado que promueve la aparición de

ansiedad, depresión, hipertensión, aumento de la capacidad de respuesta al estrés en la edad adulta

(Fournier et al., 2011) e influye en el funcionamiento del sistema cardiovascular (Puzserova et al.,

2010).

Actualmente se utilizan métodos para medir el estrés crónico que van desde los estudios relacionados

con comportamiento exploratorio, ansiedad y depresión, hasta la cuantificación de los niveles de

glucocorticoides en sangre, saliva, heces y orina (Stalder and Kirschbaum, 2012). Estas técnicas han

resultado útiles, sin embargo resultan en algún grado invasivos y suelen requerir mayor número de

muestras para evaluar estrés crónico. Una técnica nueva para el diagnóstico de estrés crónico parece

encontrarse en la determinación de la concentración de corticosterona en pelo. Investigadores han

encontrado que el folículo piloso, representa un eje periférico del eje Hipotálamo-pituitaria-adrenal

(Arck et al., 2006; Sharpley et al., 2012), lo que podría ser de valor diagnóstico y no invasivo en la

cuantificación de estrés crónico.

1.1. Problema de investigación

El rápido crecimiento de la población mundial podría implicar sobrepoblación y aumento de

animales para la producción de alimentos. Esto podría contribuir al estrés crónico. El hacinamiento

es una de las causas de estrés crónico y se caracteriza por la reducción del espacio vital mínimo del

individuo.

17

Hormonas como cortisol y corticosterona actúan como mensajeros químicos y a su vez como

indicadores del equilibrio fisiológico, es por esto que su cuantificación es una de las herramientas

más utilizadas en el diagnóstico del estrés (McCormick and Mathews, 2010). La importancia del

estudio en métodos no invasivos asociados a la cuantificación de estrés crónico radica en monitorear

y diagnosticar estados que desencadenen patologías relacionadas con el bienestar de humanos y

animales (Russell et al., 2012). La búsqueda de nuevos métodos y técnicas contribuye a la

generación de conocimiento científico, propendiendo por la mejora en la calidad de vida de los seres

vivos.

1.2. Justificación

Diversos estudios han planteado que el estrés por hacinamiento afecta seriamente a

los sujetos jóvenes, pues a medida que pasa el tiempo es frecuente la aparición de

dolencias corporales, hipertensión arterial, desórdenes metabólicos, disminución en

la respuesta inmune, propensión a las adicciones, ansiedad y depresión, entre otros

(Simeon et al., 2007).

La investigación sobre evaluación efectiva y no invasiva para la medición de

hormonas asociadas al estrés crónico en animales de laboratorio se está perfilando

como una nueva línea de conocimiento para el bienestar animal. Algunos grupos de

investigación están trabajando en métodos y estandarización de protocolos para el

monitoreo de corticoides en pelo. En este ámbito la literatura científica aún es

pobre, lo que denota la importancia de investigar en este campo. El desarrollo de

este estudio contribuye a demostrar que la corticosterona pilosa es un indicador de

estrés crónico, y aporta una herramienta en la evaluación del modelo de

hacinamiento durante la etapa juvenil de la rata Wistar.

18

Capítulo 2

Estado del Arte

2.1. Estrés

El término estrés fue formulado por primera vez por el endocrinólogo Hans Selye, quien desde 1936 lo

definió como la respuesta no específica del cuerpo a cualquier demanda de cambio. Actualmente el estrés

se puede definir como una reacción ante una condición que cause una perturbación real o percibida que

cause desequilibrio en el equilibrio del organismo o bien como una respuesta biológica provocada cuando

un individuo percibe una amenaza (modificado de Hogan et al., 2012). La "respuesta de estrés" es el

conjunto de cambios fisiológicos o comportamentales que se producen en respuesta al factor estresante

(Hogan et al., 2012). Los factores que causan estrés pueden ser factores físicos tales como la temperatura,

exposición a radiación ultravioleta (Hiramoto et al., 2009), (Skobowiat et al., 2011), o de comportamiento

(Russell et al., 2012) como el aislamiento, la confrontación, entre otros.

La respuesta del organismo al evento estresante varía de acuerdo al tipo de amenaza y al tiempo al que

esté sometido a la misma, pues algunas experiencias catalogadas como estrés pueden resultar placenteras

y positivas para el organismo, así, la magnitud de la respuesta al estrés y sus posteriores efectos

fisiológicos, dependen en gran medida de la percepción del individuo y su capacidad para adaptarse a las

situaciones planteadas por el medio (Kim and Diamond, 2002).

La respuesta del organismo al estrés se compone de tres fases: reacción, recuperación y adaptación (Oitzl

et al., 2010). Los procesos corporales que mantienen la homeostasis durante las tres fases de estrés se

denominan “alostasis” (McEwen, 2003). Inicialmente, los cambios fisiológicos inducidos por la respuesta

al estrés desempeñan una función adaptativa tratando de mantener la homeostasis a pesar del factor de

estrés, pero un sostenido aumento en la carga alostática se asocia con una serie de consecuencias

perjudiciales como la desensibilización del receptor de glucocorticoides, el daño tisular y la falla en la

regulación crónica del eje HPA (Russell et al., 2012) (McEwen, 2003). (Staufenbiel et al., 2012).

19

2.2. Clasificación del estrés: agudo y crónico.

Como se mencionó previamente, los estímulos precursores del estrés generan diversos tipos de respuestas

en el organismo, estas varían de acuerdo con la intensidad y la frecuencia del evento estresor. La primera

respuesta es inmediata, se inicia en cuestión de segundos a través de la activación del sistema nervioso

simpático (SNS) preparando el cuerpo para la supervivencia mediante la liberación de catecolaminas

como la epinefrina y norepinefrina (Gow et al., 2010). La segunda respuesta endocrina al estrés involucra

al eje HPA, es más lenta y resulta en la liberación de glucocorticoides, los cuales desempeñan un papel

fundamental en la adaptación de larga duración a los factores de estrés (McCormick and Mathews, 2010).

Comúnmente el estrés de corta duración se denomina estrés agudo o “eustrés” y el estrés de larga duración

es denominado estrés crónico o “distrés”.

Estrés agudo:

Considerado como estrés positivo, es producto de las respuestas inmediatas a los estímulos inesperados

del medio. Reacciones como lucha y huida suelen estar relacionadas con este tipo de estrés (Gow et al.,

2010).

Las catecolaminas (como la epinefrina y norepinefrina) generalmente indican estrés agudo, (Gow et al.,

2010). Son responsables de causar manifestaciones metabólicas y comportamentales de manera temporal,

la hormona más importante para la regulación del eustrés es la epinefrina. Según estudios de Kvetnansky

en 2009 citados por (McCormick and Mathews, 2010), las catecolaminas son reguladas por el SNS el cual

consta de componentes simpato-neuronales y simpato-suprarrenales que liberan catecolaminas desde los

nervios simpáticos y la médula adrenal, respectivamente. La liberación de catecolaminas en ambos

sistemas está regulada por proyecciones colinérgicas de la médula espinal y la liberación de catecolaminas

se activa mediante la unión de los receptores nicotínicos y muscarínicos en los ganglios simpáticos y las

células cromafines.

La función principal de catecolaminas liberadas es redistribuir los recursos hacia los procesos que

promueven la supervivencia, lo que resulta en una mayor utilización de la glucosa, aumento de la

frecuencia cardíaca, dilatación de la pupila, broncodilatación, disminución de la motilidad y

vasoconstricción intestinal (McCormick and Mathews, 2010).

20

Estrés crónico:

Es el resultado de una exposición continua del organismo a eventos estresantes. Comportamentalmente

podría generar desde variación de consumo de alimento (Ruis et al., 2001) y peso corporal (Bartolomucci

et al., 2004) hasta ansiedad, depresión (Bourke and Neigh, 2011), variación en la capacidad de respuesta a

situaciones de estrés (van der Staay et al., 2010) e incluso auto-agresiones (Davenport et al., 2008).

Fisiológicamente, el distrés es mediado por glucocorticoides, entre ellos los más importantes están el

cortisol en la gran mayoría de mamíferos y la corticosterona en la rata (Dallman et al., 2004). Tanto el

cortisol como la corticosterona son secretados por acción del centro hipotálamo-pituitaria-adrenal

afectando órganos blanco (Sharpley et al., 2009) como riñones, corazón, pulmones, huesos, entre otros, y

manteniendo una activación sostenida del HPA (Johnson et al., 1992). El estrés crónico y la exposición

prolongada a glucocorticoides alteran la estructura y la función de regiones cerebrales implicadas en

procesos de memoria y aprendizaje como hipocampo, amígdala y corteza pre-frontal (Morrissey et al.,

2011).

El organismo de los mamíferos produce respuestas a los eventos de estrés para protegerse y adaptarse. La

respuesta sistémica a los factores estresantes incluye la retroalimentación entre la estructura hipocampal y

el eje HPA (Alfonso., 2005). Según Alfonso J., 2005, el hipocampo hace parte del sistema límbico. Las

neuronas del hipocampo se encuentran particularmente alineadas por lo que se pueden distinguir capas

compuestas predominantemente por dendritas apicales, somas, dendritas basales y axones. La formación

hipocampal se encuentra dividida en regiones, denominadas las zonas Cornu Ammonis CA1 a CA4, el

giro dentado y el subiculum. La información inicia en el hipocampo desde el giro dentado, a través de las

zonas CA3 y CA1, hacia el subiculum.

La entrada de información se produce principalmente a través de la vía perforante compuesta por axones

provenientes de la corteza entorrinal que atraviesan el subiculum y llegan hasta las células granulares del

giro dentado donde establecen contacto sináptico. Los axones de las neuronas del giro dentado conforman

las fibras musgosas haciendo sinapsis con las neuronas piramidales de la zona CA3. La información va

posteriormente hacia las neuronas piramidales de la zona CA1 a través de las fibras colaterales de

Schaffer.

21

Los axones de las neuronas de la zona CA1 proyectan hacia el subiculum y la corteza entorrinal

constituyendo la principal vía de salida de información del hipocampo, (Alfonso et al., 2005b; Alfonso et

al., 2006; Alfonso et al., 2005a). El hipocampo posee una alta densidad de receptores para

glucocorticoides, motivo por el cual esta estructura resultaría particularmente sensible a la acción de los

mismos, los receptores ubicados en el hipocampo son de tipo I o de alta afinidad y de tipo II de baja

afinidad (McEwen, 2003). El hipocampo se relaciona en muchas especies con la conducta exploratoria, la

memoria explícita, episódica, declarativa, contextual (McEwen, 2000) y controla las funciones

autonómicas y vegetativas (Kandel ER, 2000, citado por Valencia-Alfonso et al en 2004).

El hipocampo regula la liberación hipotalámica desde el núcleo paraventricular (PVN) del complejo

arginina-vasopresina (AVP) y de la hormona liberadora de corticotropina (CRH), la cual activa los

receptores hipofisarios (CRH CRH-R), seguido por la producción y liberación de propiomelanocortina

(POMC) (Tobin and Kauser, 2005), de ella se deriva la adenocorticotropina (ACTH) que por vía

sanguínea va a las glándulas adrenales para estimular la secreción de cortisol y corticosterona (Figura 1).

Se ha identificado que los niveles basales de glucocorticoides contribuyen al desarrollo de funciones

cognitivas, sin embargo cuando el nivel aumenta pueden presentarse efectos nocivos sobre la estructura y

función hipocampal (de Kloet et al., 1999).

La corticosterona es una hormona esteroidea que junto a su receptor posee función transcripcional

específica, regulando genes que intervienen en la plasticidad neuronal (de Kloet et al., 1998).

La corticosterona se libera como respuesta al estrés y retroalimenta negativamente la estructura

hipocampo-HPA. La actividad del sistema Hipotálamo-pituitaria-adrenocortical muestra cambios cíclicos

a lo largo de las veinticuatro horas, que se manifiestan en variaciones de la concentración de

corticosterona en plasma. Esta periodicidad circadiana activa se describe en especies diurnas como los

humanos, y nocturnas como la rata en.

La corticosterona también incrementa el nivel de azúcar en la sangre a través de la gluconeogénesis y la

lipólisis, contribuye con la supresión del sistema inmunológico, con la inhibición de la síntesis

de proteínas y también disminución de la formación ósea.

22

Figura 1. Regulación del sistema Hipotalámico-Pituitario-Adrenal. El principal centro modulador de la respuesta al estrés

es el hipotálamo, el cual posee conexiones con niveles superiores como el sistema límbico, incluyendo aferentes excitatorios

desde la amígdala e inhibitorios (polisinápticos) desde el hipocampo. Las neuronas del núcleo paraventricular del hipotálamo

(NPV) secretan el factor liberador de la corticotrofina (CRF o CRH) que se transporta a través de los capilares del sistema

circulatorio portahipofisiario al órgano blanco, las células corticotróficas de la adenohipófisis. Éstas, a su vez, liberan

adenocorticotrofina (ACTH) que pasa al torrente sanguíneo y alcanza la corteza de las glándulas suprarrenales, cuyas partes

facsiculada y reticular secretan gluococorticoides en respuesta a la ACTH. Además de otras numerosas funciones, los

glucocorticoides inhiben la síntesis y liberación de CRF y ACTH, regulando su propia liberación. (Tomado de Alfonso J., 2005).

La respuesta sistémica de estrés incluye el bloqueo en la fosforilación de la familia AKT Serina/Treonina

quinasa, activando a Foxo, el cual es responsable de iniciar el proceso de gluconeogénesis en músculo. La

corticosterona también modula la vía de señalización Camp/PKA/CREB (Li et al., 2008) además de la vía

FosB y C-Fos (Das et al., 2009), (Donet et al., 2008, Szakacs et al., 2010) influyendo en la función del

sistema inmune (Ito, 2010), que a su vez regula las funciones del sistema nervioso central recíprocamente

a través de la liberación de citoquinas (Botchkarev, 2003), las cuales participan activamente en reacciones

inflamatorias (Black, 2002). Recientes investigaciones han hallado que los corticosteroides en la piel

pueden regular las actividades inmunes locales y una falla en la regulación de los mismos está ligada a la

aparición de respuestas inflamatorias cutáneas (Slominski et al., 2013)

23

2.3. Hacinamiento como modelo de estrés crónico

La exposición a situaciones estresantes durante la maduración puberal está implicada en alteraciones

fisiológicas y psicológicas en la etapa adulta (Romeo, 2010). El desarrollo de modelos animales permite

estudiar los procesos desencadenados por la respuesta al estrés. El hacinamiento consiste en la

convivencia de varios individuos en un espacio reducido; se considera importante como modelo de estrés

crónico en la investigación con modelos animales, además tiene impacto directo en animales de

producción y en la calidad de vida humana.

Investigaciones indican que en ratas adultas un rango de 4 a 12 animales por caja parece provocar menor

ansiedad; cuando los animales son agrupados en números fuera de este rango, las ratas muestran

comportamientos ansiogénicos, evidenciando que el tamaño de grupo es una medida importante a tener en

cuenta en términos de alojamiento (Botelho et al., 2007). En ratas, las condiciones de espacio vital desde

el destete hasta la edad adulta tienen impacto en el desarrollo y la salud (Valencia-Alfonso et al., 2004).

El hacinamiento es estresante para el animal juvenil y promueve la aparición de ansiedad, depresión e

hipertensión, además aumenta la capacidad de respuesta al estrés en la edad adulta (Fournier et al., 2011).

El estrés crónico generado por condiciones de hacinamiento refleja cambios a largo plazo en la regulación

del sistema HPA como hipercortisolemia, el incremento en la capacidad de generar esteroides y la

sensibilidad de las glándulas adrenales a la ACTH, CRF y vasopresina, provocando decrementos notables

de peso, e induciendo el crecimiento anormal de las glándulas adrenales en ratones (Aioi et al., 2001).

Adicionalmente, estudios han demostrado que periodos de hacinamiento en ratas causan incremento en los

niveles de los neurotransmisores serotonina y noradrenalina (Boranic et al., 1982), hiperactividad del eje

HPA (Ely et al., 1997), supresión de la conducta exploratoria y remodelación neuronal del área CA3 del

hipocampo (Valencia-Alfonso et al., 2004).

2.4. Etapa juvenil y hacinamiento

En animales, el periodo juvenil (referenciado como adolescencia por algunos autores), es un periodo de

transición de la infancia a la edad adulta, que implica la maduración de la conducta tanto fisiológica como

cognitiva (Sisk and Foster, 2004). Un sistema general de clasificación juvenil para roedores como la rata

consiste en tres etapas: en primer lugar, la pre pubescencia, la cual es el período de adolescencia de los

días 21 a 34 de edad (las ratas son destetadas normalmente a los 21 días de edad), en segundo lugar un

24

período de adolescencia media, la cual está entre los días 34 a 46 de edad, y un período final de la

adolescencia de días de 46 a 59 de edad (Tirelli et al., 2003). Un método diferente consiste en observar la

separación balano-prepucial (separación del prepucio y el glande del pene) en el macho, la cual se da a

partir de los 40 días y está relacionada con el aumento de testosterona y estimulación en los procesos de

motilidad espermática (McCormick and Mathews, 2007). Independientemente de los métodos de

clasificación, se ha consensuado que a partir del día 60 se inicia la edad adulta y que en la etapa final de la

adolescencia el animal ha alcanzado la madurez física y sexual (Figura 2), implicando aumento pulsátil de

hormona liberadora de gonadotrofina y la activación del eje hipotálamo-hipófisis-gonadal (McCormick

and Mathews, 2007).

Figura 2. Principales momentos del desarrollo desde la gestación hasta la edad adulta en la rata. Fuente: McCormick and Mathews., 2010. Modificado por el autor.

El eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal es inmaduro en la adolescencia, la necesidad de consolidarse

morfológica y funcionalmente le da mayor plasticidad, por ello los eventos de neurogénesis y densidad

dendrítica son altos antes de la pubertad (<40 días después del parto en las ratas macho) y disminuyen en

la edad adulta (Morrissey et al., 2011). Durante el periodo juvenil, el cerebro está madurando, lo que

sugiere que ratas jóvenes pueden ser más susceptibles a los factores de estrés, exponiéndose a altos

niveles de glucocorticoides con respecto a la edad adulta. Los animales jóvenes pueden estar en mayor

riesgo que los adultos de sufrir los efectos nocivos del estrés crónico (McCormick and Mathews, 2007)

por lo tanto se presume que si bien a nivel morfológico no existen variaciones significativas en el

hipocampo de animales jóvenes estresados, la exposición a factores de estrés conduce a cambios

25

relativamente permanentes en el comportamiento cognitivo y tal vez, a diferencias en las respuestas

neuroendocrinas a factores de estrés en la edad adulta (Ver Hoeve et al., 2013).

A nivel comportamental existen marcadas diferencias entre jóvenes y adultos, por ejemplo, animales en

etapa juvenil tienden a mayores niveles de búsqueda de la novedad, la impulsividad y la reducción de

estrés en respuesta a la novedad que los adultos (McCormick and Mathews, 2007).

Como se ha mencionado previamente, la etapa juvenil es un periodo de cambios en el desarrollo y la

reorganización de los circuitos cerebrales, por lo tanto animales jóvenes pueden ser más vulnerables que

los adultos a los efectos del estrés crónico (Morrissey et al., 2011). El hacinamiento como modelo de

estrés crónico en ratas jóvenes recién destetadas produce un retraso en el desarrollo de la talla y el peso

corporal, así como un déficit en el aprendizaje espacial de ratas macho (McCormick et al., 2008).

Además, conduce a alteraciones de la conducta exploratoria, en las que los machos muestran mayor

excitabilidad y actividad en la exploración (Valencia-Alfonso et al., 2004).

El estrés crónico en la etapa juvenil altera particularmente el desarrollo del hipocampo, aumentando así

comportamientos patológicos en la edad adulta. Por lo tanto, la exposición a los factores de estrés en la

etapa juvenil puede alterar el desarrollo cerebral permanente llevando a una alteración del rendimiento

cognitivo en la edad adulta (McCormick and Green, 2012).

Las ratas jóvenes muestran aumento de la neurogénesis en el giro dentado en respuesta al estrés crónico,

mientras que los adultos que experimentan el mismo procedimiento responden con una reducción de la

neurogénesis.

Los roedores jóvenes muestran una liberación prolongada de glucocorticoides en respuesta a factores de

estrés crónico en comparación con los adultos (Morrissey et al., 2011). Además se ha demostrado que el

estrés en el periodo adolescente (28-56 días) afecta el desempeño de ratas en su edad adulta, pues entre

otros cambios, modulan la respuesta adrenal a estresores agudos y generan disminución en los receptores

para glucocorticoides en el hipocampo (Weintraub et al., 2010).

La evidencia anterior, se puede establecer que ante eventos de estrés crónico los sistemas de aprendizaje y

la memoria son más vulnerables en la etapa juvenil, pero sus efectos más marcados se presentan en la edad

adulta (Romeo, 2010).

26

2.5. Glucocorticoides y medición de estrés crónico

Cambios a largo plazo de la secreción de glucocorticoides se considera que desempeñan un papel crucial

en la mediación de la relación entre el estrés crónico y el desarrollo de numerosas enfermedades

relacionadas con la resistencia a insulina (Vinson, 2009), el sistema inmune (Stalder and Kirschbaum,

2012), además del adecuado desarrollo fisiológico y comportamental (Munsterhjelm., 2010).

La determinación de glucocorticoides es uno de los métodos más aplicados en la evaluación de estrés

crónico en humanos y animales. Se ha demostrado que en todas las especies de mamíferos la dinámica del

cortisol y la corticosterona es similar (Cockrem, 2013).

La vía principal para la obtención de estas hormonas en mamíferos es el plasma, sin embargo durante los

últimos años la búsqueda de métodos no invasivos para el diagnóstico de estrés crónico ha permitido la

ampliación del conocimiento hasta la obtención de glucocorticoides en saliva, heces, orina y pelo

(Accorsi et al., 2008).

Una de las principales desventajas en la determinación de estrés crónico por los métodos mencionados es

que se requiere un número mayor de mediciones, pues en el caso de plasma y saliva dependen del ciclo

circadiano, además implica cierto grado de invasividad en la recolección de las muestras (Russell et al.,

2012) (Rutherford et al., 2006). Algunos estudios plantean que las concentraciones de glucocorticoides en

plasma, orina y heces no serían fieles marcadores de estrés crónico, debido a eventos como ritmo

circadiano y unión de las hormonas a proteínas globulares y conjugación (Hellhammer et al., 2009).

Durante los últimos años la investigación sobre fisiología del estrés crónico se ha enfocado a buscar sitios

alternativos de síntesis y/o almacenamiento de glucocorticoides, que garanticen fiabilidad y disminuyan la

Invasividad en la toma de muestras.

2.6. Glucocorticoides en pelo como indicadores fisiológicos de estrés

crónico

Las investigaciones han arrojado que la piel es uno de los lugares de mayor actividad e importancia en la

homeostasis (Slominski and Wortsman, 2000). No está dilucidado si los niveles de corticoides hallados en

pelo dependen directamente de los niveles en el torrente sanguíneo, o si existe producción de corticoides

en la piel y/o el pelo (Sharpley et al., 2009).

27

Estudios en cultivos de fibroblastos (Slominski et al., 2006) y folículos pilosos de cuero cabelludo humano

(Ito et al., 2005) indican que la piel de mamíferos podría ser un sitio extra-adrenal de síntesis de

glucocorticoides, allí se ha documentado una vía esteroidogénica estimulada por la hormona ACTH, CRH

(Slominski et al., 2007) y propiomelanocortina, provocando producción de corticosteroides en humanos

(Slominski et al., 2005).

La hipótesis de producción de corticosteroides por la existencia de un eje HPA cutaneo producido en

melanocitos, fibroblastos (Slominski et al., 2008), folículos pilosos, glándulas sebáceas y sudoríparas

viene teniendo amplia aceptación en la literatura (Sharpley el al., 2010; Sharpley et al., 2012; Arck et al.,

2006; Keckeis et al., 2012; Russell et al., 2011), esto plantea que la síntesis y producción periférica de

cortisol no depende únicamente del ritmo circadiano normal sino también de su propio ritmo (figura 3).

Figura 3. Rutas de secreción de cortisol en el tallo del pelo. Diagrama que ilustra las posibles vías por las que el corticoide puede ser secretado en el tallo piloso. El tallo del pelo podría tener dos depósitos de cortisol. Uno que está incorporado dentro del tallo piloso y puede reflejar las concentraciones de cortisol histórico, y otro que es transitorio y refleja las concentraciones de cortisol actuales. Se mantiene incógnita de si la fuente de corticoides almacenados en pelo es la sangre, la piel o el folículo piloso, y si el estímulo para la producción de cortisol es central (a través del sistema nervioso simpático) o inducida por los efectos directos de un factor de estrés local. Fuente: Sharpley et al., 2012. Modificado por el autor.

28

Si bien la relación entre piel, glucocorticoides y pelo no es clara, está evidenciada la presencia de

glucocorticoides en pelo ante eventos de estrés crónico (Paus et al., 2008) (Raul et al., 2004).

Investigadores han demostrado que el folículo piloso representa un vástago rico en células ectodérmicas y

mesodérmicas (Paus and Foitzik, 2004). La piel y sus anexos podrían permitir el estudio de respuesta

neuroinmunoendocrinas complejas como base para la identificación de nuevos blancos para la

intervención terapéutica del estrés (Paus et al., 2006). Aunque la literatura relacionada con producción de

corticosterona pilosa es escaza, existen trabajos que demuestran niveles del corticoide en plumas

(Fairhurst et al., 2013) (Will et al., 2014). Independientemente de la procedencia del corticoide, se sabe es

precedido por la progesterona (Slominski et al., 2000), tiene la capacidad de sintetizarse en los

fibroblastos y llegar al folículo piloso (Ito et al., 2005). El hallazgo de esta hormona en el pelo (Meyer and

Novak, 2012; Mcbeth et al., 2010) apoya la hipótesis de que el folículo piloso tiene la capacidad de

modularse de acuerdo a la respuesta al estrés (Tobin and Kauser., 2005). Actualmente es rutinaria la

cuantificación de los niveles de corticoides en pelo como indicador de estrés crónico en varias especies de

mamíferos (Davenport et al., 2008) (Morris et al., 2011) (Steudte et al., 2011) (Zoccola and Dickerson,

2012) ) (Staufenbiel et al., 2012) (Cavigelli and Chaundhry, 2012) (Meyer and Novak, 2012) (Luo et al.,

2012) (Comin et al 2012), (Sinicalchi et al., 2013).

Es importante tener en cuenta que aunque los glucocorticoides de las muestras de pelo son herramientas

útiles para el seguimiento de enfermedades asociadas al metabolismo hormonal a largo plazo, siendo

estratégico en el monitoreo del eje HPA de animales comprometidos en etapa adulta, prenatal y neonatal

(Comin et al 2012); algunas investigaciones han arrojado resultados que indican que la concentración de

glucocorticoides en pelo están ampliamente asociadas con efectos ambientales (Davenport et al., 2008;

Morris et al., 2011), nutricionales (Zoccola and Dickerson, 2012), respuestas emocionales, temperamento

(Sinicalchi et al., 2013), acondicionamiento físico (Staufenbiel et al., 2012), alteraciones metabólicas

(Cavigelli and Chaundhry, 2012), enfermedades infecciosas (Meyer and Novak, 2012), desordenes

psicológicos como la ansiedad (Steudte et al., 2011), el estrés postraumático (Luo et al., 2012), el color del

pelo (González-de-la-Vara Mdel et al., 2007; Bennet and Hayssen, 2010), (Mcbeth et al., 2010 y la

genética (Fairbanks et al., 2011), causando un modelo aditivo dependiente de influencias genéticas y

ambientales en la actividad HPA a largo plazo (Dickerson and Kemeny, 2004).

La determinación del contenido de glucocorticoides en muestras de pelo es una herramienta útil para el

seguimiento de enfermedades asociadas al metabolismo hormonal a largo plazo, siendo estratégico en el

monitoreo del eje HPA de animales en etapa adulta, prenatal y neonatal (Comin et al 2012).

29

Es importante destacar que la medición de glucocorticoides en pelo no puede detectar el impacto de los

factores de estrés que se producen durante periodos breves de tiempo (Haverbeke et al., 2008). Para la

evaluación de estrés, la medición de cortisol en pelo debe ser pensada como medida de largo plazo,

complementaria al cortisol salival o plasmático, si lo que se pretende lograr es una curva de diagnóstico

completo (Jensen et al., 1996).

En lo respectivo a la muestra de pelo, investigaciones han establecido que se deben tomar de la región del

cuello posterior, puesto que en ese lugar existe menor riesgo de contaminación por contacto (Gow et al.,

2010; Keckeis et al., 2012. Para la obtención de las muestras es recomendable afeitar al ras de la piel y

lavar aproximadamente tres veces, con esto se disminuyen los inconvenientes de contaminación por

glándulas, folículos y restos de sangre (Bechshoft et al., 2012). Comparar los niveles hormonales en

muestras de pelo es un método alternativo no invasivo que puede ser utilizado para evaluar una gran

variedad de animales en el campo, la cantidad de pelo para recolección según estudios va desde los 5 mg

en humanos, hasta los 60mg en perros y 250 mg en monos (Koren et al., 2008).

2.7. Técnicas para la cuantificación de glucocorticoides en pelo

De acuerdo con Gow en 2010, para obtener niveles de corticoides como indicadores de estrés crónico,

estos se analizan por medio de diferentes métodos, entre los cuales los más utilizados son: El

Inmunoensayo enzimático (ELISA), el Radioinmunoanálisis (RIA) y la espectrometría de masa-HPLC. A

continuación se describen brevemente las técnicas:

ELISA (o EIA): Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. Es una técnica en la cual un antígeno se

detecta mediante anticuerpos ligados a enzimas, generando un cambio colorimétrico para su detección. La

aparición de colorantes permite medir indirectamente mediante un espectrofotometro la cantidad de

antígeno en la muestra.

Espectrometría de masas: consiste en la medición de iones derivados de moléculas. Se basa en el análisis

de la composición de diferentes elementos químicos, separando los núcleos atómicos en función de su

relación masa-carga (m/z). Los métodos de espectrometría de masas son técnicas muy específicas y

sensibles. Hasta ahora sólo HPLC / MS (o LC / MS) se ha utilizado para cuantificar cortisol en el pelo.

Radioinmunoensayo (RIA): El radioinmunoensayo (RIA) Su fundamento es la competencia existente para

la unión de anticuerpos específicos entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma

30

sustancia marcada con un isótopo. Al establecerse esta competición, a mayor cantidad de sustancia a

cuantificar, menor cantidad de sustancia radiactiva que se une al anticuerpo

El método ELISA ofrece varias ventajas, tales como una buena sensibilidad, bajo costo y resultados

bastante rápidos, el método de espectrometría de masas se considera el más fiel para análisis de pelo,

proporcionando mayor sensibilidad y especificidad. El tema de la contaminación externa en vivo es una

preocupación para todas las medidas de análisis de cabello (Gow et al., 2010).

Finalmente, es importante estudiar la asociación entre estrés y el desarrollo en diferentes órganos

(Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009), para así lograr establecer relaciones que permitan

profundizar en la dinámica del estrés en sujetos durante la etapa juvenil (Sisk and Foster, 2004)

(McCormick and Mathews, 2007) (Morrissey et al., 2011).

Aunque el desarrollo de este trabajo tiene como eje el contribuir en la búsqueda de métodos no invasivos

en la cuantificación de glucocorticoides, son muchos los interrogantes que hay en torno a la cuantificación

de corticosterona pilosa, hasta ahora no se tiene certeza absoluta de cuál es la dinámica de los

glucocorticoides en el pelo y solo recientemente se ha comenzado a trabajar en protocolos para extracción

de esteroides en pelo de ratas, pues son muy pocos los resultados publicados en los que han cuantificado

corticosterona pilosa en cualquier especie.

31

Capítulo 3

Objetivos

3.1. Objetivo General:

Determinar cambios en la concentración de corticosterona en plasma y pelo de ratas Wistar en etapa

juvenil sometidas a condiciones de hacinamiento como modelo de estrés crónico.

3.2. Objetivos Específicos:

Determinar si se deposita corticosterona en el pelo de rata Wistar.

Identificar si los niveles de corticosterona plasmáticos y pilosos se ven afectados por un modelo

de hacinamiento en ratas Wistar en etapa juvenil.

Evaluar si existe correlación entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa al final de la

etapa juvenil.

Estandarizar de la técnica desarrollada para cuantificación de corticosterona en pelo de rata.

Determinar si el peso del corazón, riñones, pulmones y glándulas adrenales se ve afectado por un

modelo de hacinamiento en ratas Wistar jóvenes.

32

Capítulo 4

Materiales y métodos

La investigación se llevó a cabo en el bioterio del laboratorio de Neurociencia y Comportamiento

de la Universidad de los Andes. El espacio se encuentra localizado en la ciudad de Bogotá -

Colombia, bajo un clima templado y una altura sobre el nivel del mar de 2640 m. Las coordenadas a

informar son Latitud Norte 4°35'56''57 Longitud Oeste de Greenwich 74°04'51''30.

4.1. Animales y condiciones de alojamiento.

El experimento fue aprobado por el CICUAL de la Universidad de los Andes y por el comité de

bioética de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de

Colombia. Dieciocho ratas Wistar machos de treinta y ocho días de edad (DPN 38), provenientes

del bioterio del laboratorio de Neurociencia de la Universidad de los Andes se dividieron

aleatoriamente en un grupo control compuesto por nueve individuos distribuidos en tres cajas de

acrílico de 15 cm X 31cm X 18cm, es decir, 155 cm2 por animal (Jayo y Cisneros, 1999) y un grupo

experimental de nueve individuos distribuidos en tres cajas de acrílico en un área de 15,2cm X

10cm X18cm, es decir 50,5 cm2 por animal (Cárdenas y col, 2010; Díaz y col, 2010; Djordjevic y

col, 2005 & Dronjak y col en 2004). El DPN 38 Se Tomaron las muestras iniciales dando inicio a la

fase experimental, En el DPN 65 fueron obtenidas las muestras finales y se llevó a cabo el sacrificio

de los sujetos experimentales. Los sujetos fueron mantenidos en un ciclo luz/oscuridad de 12

h (encendido de la luz a las 09:00 h), a una temperatura de 21±2 ˚C.

4.2. Muestras de sangre y análisis hormonal

Se tomó la muestra de sangre de la vena safena en el DPN 38 y DPN 65, todas las muestras fueron

recogidas por el personal veterinario adscrito al laboratorio de Neurociencia y comportamiento de la

Universidad de los Andes. Para obtener las muestras de sangre se usaron agujas 23G x 25mm.

Posterior a la punción, la sangre obtenida fue almacenada en dos o tres tubos capilares

heparinizados de 80 µL por muestra. Para el análisis hormonal, las muestras de sangre fueron

centrifugadas a 2500 RPM durante 10 minutos y el plasma extraído se almacenó a -20°C. Para la

33

obtención de los niveles de corticosterona plasmática se utilizó el Kit de Enzo Life Sciences

inmunoensayo enzimático (Catálogo # ADI-901-097). Inmediatamente después de la aplicación del

Kit las muestras fueron leídas a una longitud de onda de 490nm. Finalmente las concentraciones de

corticosterona se determinaron a partir de la curva de calibración del Kit, utilizando en software

GEN 5.

|

4.3. Muestras de pelo y análisis hormonal

Para la obtención de las muestras de pelo se afeitó el flanco derecho de cada animal en el DPN 38 o

inicio del experimento y el DPN 65 o final del experimento. Las muestras de pelo sin folículo se

lavaron durante cinco minutos (x3) con 5 mL de isopropanol con el fin de disminuir contaminación

del pelo por contacto con glándulas, folículos y restos de sangre, (Bechshoft et al., 2012).

Posteriormente las muestras fueron secadas durante cuatro días a temperatura ambiente. Luego del

proceso de secado, cada muestra de 150 a 200mg de pelo se pulverizó en un molino electrónico

(Grinding ball mil).

El pelo pulverizado (49,5 – 50,5g por muestra), se incubo en un eppendorf durante un día con 1mL

de metanol a temperatura ambiente. Para secar las muestras, se sometieron a evaporación por medio

del SpeedVac durante dos horas. Para la purificación por extracción en fase sólida se utilizaron

columnas de 1mL Supelco Super Select C18-30mg. Cada una de las columnas fue activada usando

1mL de metanol y 1mL de agua des-ionizada. Posterior a la preparación, para el ensayo, las

muestras fueron adicionadas a las columnas y lavadas con metanol 5%. Finalmente, en el proceso

de elución las muestras fueron colectadas en tubos con 1mL de metanol y secadas en el SpeedVac

por 3 horas. Este protocolo fue formulado y desarrollado por el Profesor Jerrold Meyer de la

Universidad de Massachusetts en EE.UU.

Para el análisis de corticosterona en pelo, se usó el kit Arbor Assays DetectX enzyme inmunoassay

(Catalog # K104-H1). Las absorbancias se leyeron a una longitud de onda de 450nm y las

concentraciones de corticosterona se determinaron a partir de la curva patrón usando el software

GEN 5. El nivel de corticosterona obtenido en pg/ml fue transformado a pg/mg de acuerdo al

protocolo.

34

4.4. Punto final/Eutanasia

Previo al sacrificio los animales fueron anestesiados con 90 mg/Kg de ketamina y 10 mg/Kg de

xilacina. El método de eutanasia utilizado fue el de perfusión, que permitió obtener las mediciones

de peso de algunos órganos. Tanto el veterinario responsable como los investigadores tomaron

todas las medidas para minimizar el sufrimiento de los sujetos experimentales.

4.5. Análisis estadístico

Las concentraciones de corticosterona en el pelo (pg/mg) y plasma (ng/mL) se transformaron

logarítmicamente con el fin de normalizar los datos. Para las muestras de plasma y corticosterona y

para el peso corporal se utilizó ANOVA de dos vías mixto con variable entre sujetos (tratamiento) y

variable intra sujeto (día) seguido por un post-hoc univariado para ANOVA´s. Para observar si

existe relación entre la corticosterona pilosa y plasmática se usó la correlación de Pearson.

Comparaciones del peso de los órganos entre el grupo control y el grupo experimental se evaluaron

utilizando la prueba t-student. Para la ejecución de los análisis estadísticos se utilizó el GraphPad

Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE.UU.) y Systat 11 (Systat Software, San Jose, CA,

EE.UU). En este experimento, un valor de P < 0.05 fue considerado significativo y todas las barras

de error muestran el error estándar (SEM).

4.6. Consideraciones éticas y disposiciones vigentes

El presente proyecto contribuye al desarrollo de estrategias asociadas al uso y cuidado de los

animales, el desarrollo del mismo aporta a la estandarización y aplicación de técnicas no invasivas

de cuantificación de estrés en animales de laboratorio. Este estudio se realizó cumpliendo la ley 84

de 1989 y la Resolución 008430 de 1993 (por la cual se establecen las normas científicas, técnicas

y administrativas para la investigación en salud). Los investigadores principales: Luis Fernando

Cárdenas, Manuel J. Rojas y Duván Fernando González Uarquin, acompañados y asesorados por la

profesional en Medicina Veterinaria Marlly Guarín garantizaron el cumplimiento de los protocolos

de uso y cuidado de animales, así como los protocolos de bioseguridad. Los investigadores declaran

que no tienen conflictos de interés derivados de la investigación propuesta.

35

Respecto a las implicaciones de bioseguridad:

1. En el presente proyecto fueron mínimos los riesgos para la salud humana.

2. En el presente proyecto se detallaron las muestras biológicas obtenidas de los diferentes

ensayos y el uso que éstas recibieron.

3. En el laboratorio de neurociencias de la Universidad de los Andes así como en la Universidad

de Massachusetts disponen de instalaciones de laboratorio apropiadas para el manejo de las

diferentes técnicas experimentales.

4. Los desechos biológicos fueron depositados en bolsa roja y entregados al centro encargado de

manipulación de residuos biológicos.

5. La unidad de recursos físicos de la Universidad de los Andes y de la Universidad de

Massachusetts se hicieron cargo de la disposición definitiva de los desechos orgánicos y

químicos producidos por el presente proyecto.

36

Capítulo 5

Resultados y discusión

5.1. El pelo de rata Wistar contiene corticosterona y el hacinamiento

durante el periodo juvenil causa incremento en los niveles de

corticosterona pilosa.

Los resultados presentados confirman que el pelo de la rata Wistar almacena corticosterona. Los niveles

del corticosteroide durante el periodo inicial fueron significativamente mayores a los niveles presentados

por el control durante el periodo final. Se encontró diferencia significativa que (P<0,05) entre el grupo

control (19,67± 9,75pg/mg) y el grupo experimental (40,5 ± 9,75pg/mg) posterior al tratamiento. La

gráfica No. 1 muestra los niveles de corticosterona en pelo.

Gráfica 1. Niveles de corticosterona pilosa de ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas en el día posnatal 38 y el día

posnatal 65. Para este experimento el n fue de 9 por grupo. El valor de P fue < 0,05. Hay diferencias significativas entre los

sujetos controles y hacinados el día posnatal 65. Las barras de error indican el error estándar (SEM) de los promedios.

37

5.2. El hacinamiento de ratas Wistar durante su periodo juvenil causa

incremento en los niveles de corticosterona plasmática.

La gráfica No. 2 indica alta dispersión de los niveles de corticosterona de los sujetos experimentales a los

38 días de edad, por lo que no se presentó diferencia significativa entre los niveles iniciales y finales del

corticosteroide.

Respecto a la comparación entre tratamientos, el análisis mostró que existen diferencias significativas

entre los sujetos controles (232,6 ± 78,72 ng/ml) y hacinados (470,16 ± 113,24 ng/ml) el día posnatal 65.

La gráfica No. 2 muestra los niveles de corticosterona en pelo. Todos los sujetos al día posnatal 38

fueron homogéneos”.

C o n tr o l D P N 6 5 H a c in a m ie n to D P N 6 5

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

Co

rtic

os

te

ro

na

n

g/m

l

*

L in e a d e b a s e D P N 3 8

Gráfica 2. Niveles de corticosterona plasmática de ratas Wistar jovenes controles y hacinadas en el día posnatal 38 y el día

posnatal 65. Para este experimento el n fue de 9 por grupo. El valor de P fue < 0,05. Hay diferencias significativas entre los

sujetos controles y hacinados el día posnatal 65.Las barras de error indican el error estándar (SEM) de los promedios.

38

5.3. No hay correlación entre los niveles plasmáticos y pilosos de

corticosterona en ratas jóvenes hacinadas.

Como se ha observado previamente, el grupo control y el grupo hacinado muestran un patrón en los

niveles de corticosterona plasmática y pilosa, indicando diferencias significativas entre los tratamientos;

sin embargo el análisis de Pearson no arrojó correlación significativa entre los niveles totales del

glucocorticoide en plasma sanguíneo y pelo. De acuerdo con lo observado en la gráfica No 3, los

resultados soportan la independencia entre los niveles de corticosterona en plasma y pelo.

Gráfica 3. Correlación de Pearson entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa de ratas Wistar jóvenes hacinadas

en el día posnatal 65. Para este experimento, el n fue de 17. La correlación no fue significativa.

El análisis detallado de la correlación de Pearson entre los niveles de corticosterona

plasmática y pilosa arrojó, para el grupo control un R2=0,017 y P=0,75 y para el

grupo hacinado un R2=0,0013 y P=0,92.

C o rr e la c ió n e n tre c o r t ic o s te r o n a p la s m á tic a y p ilo s a

C o rt ic o s te ro n a e n p la s m a (n g /m l)

Co

rtic

os

tero

na

en

pe

lo (

pg

/mg

)

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

R2

= 0,1381

P = 0,1418

39

5.4. El hacinamiento demostró diferencias significativas en la ganancia de

peso con respecto al grupo control durante la etapa juvenil de ratas

Wistar.

La ganancia del peso entre los individuos control y los individuos experimentales se muestra en la gráfica

No. 4 Se observa que la condición de hacinamiento causó una variación significativa entre el peso de los

grupos durante el tratamiento.

El promedio de peso al final del experimento para el grupo control fue de 347,53g y para el grupo

experimental fue de 266,52g.

Gráfica 4. Promedio de ganancia de peso de ratas Wistar jóvenes desde el día posnatal 38 al día posnatal 65. Para el

presente experimento el n por grupo fue de 9. La línea gris corresponde al grupo control, mientras que la línea verde corresponde

a los sujetos hacinados,* es considerado como diferencia significativa (P<0,05). y ** como diferencia altamente significativa

(P<0,01). Las líneas verticales corresponden al error estándar (SEM) de los promedios.

40

5.5. El peso de los órganos analizados en este estudio no está

significativamente correlacionado con el peso corporal tanto en

sujetos controles como en sujetos hacinados.

La gráfica No. 5 muestra que según el análisis estadístico de Pearson, no existe correlación significativa

entre el peso del corazón, los pulmones, riñones, glándulas adrenales y el peso corporal.

Correlación entre el peso absoluto de los órganos evaluados y el peso

corporal del grupo control:

Gráfica 5. Correlación de Pearson entre los pesos de corazón, pulmones, riñones y glándulas adrenales y el peso corporal de

ratas Wistar jóvenes controles en el día posnatal 65. No hay correlación entre el peso de órganos y el peso corporal.

41

Resultados similares al grupo control fueron encontrados en el grupo hacinado (gráfica No 6), en este caso se

encontró que ninguno de los órganos evaluados posee correlación significativa con el peso corporal de los

sujetos experimentales.

Correlación entre el peso absoluto de los órganos evaluados y el peso

corporal del grupo hacinado:

Gráfica 6. Correlación de Pearson entre los pesos de corazón, pulmones, riñones y glándulas adrenales y el peso corporal de ratas

Wistar jóvenes hacinadas en el día posnatal 65. El experimento contó con un n de 18 animales por grupo. No hay correlación entre el

peso de los órganos y el peso corporal.

42

5.6. El peso absoluto de pulmones y glándulas adrenales no varía entre

ratas Wistar jóvenes controles y hacinadas; sin embargo sí se

presenta aumento significativo entre el peso del corazón y riñones de

los sujetos controles versus los sujetos hacinados.

La gráfica No 7 muestra que en concordancia con la disminución de peso corporal, los sujetos hacinados

presentaron disminución significativa en el peso de corazón y riñón respecto al grupo control; sin embargo

no hubo diferencias entre los grupos en lo que respecta al peso de los pulmones y de las glándulas

adrenales.

Gráfica 7. Peso absoluto de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales de ratas Wistar jóvenes controles

y hacinadas en el día posnatal 65. Para el presente experimento el n por grupo fue de 9 animales. La barra negra

corresponde al grupo control, mientras que la barra gris corresponde al grupo hacinado. * es considerado como

diferencia significativa (P<0,05). y ** como diferencia altamente significativa (P<0,01). Las líneas verticales

corresponden al error estándar (SEM) de los promedios.

43

5.7. El peso relativo calculado a partir del peso de los órganos sobre el

peso corporal de ratas Wistar jóvenes en condiciones de

hacinamiento muestra diferencias significativas en el peso de los

pulmones, riñones y glándulas adrenales respecto a los controles.

Aunque se evidenció que no existe correlación entre el peso de los órganos y el peso corporal, la gráfica

No 8 indica que el peso relativo, donde se resalta la diferencia significativa entre el peso de la glándula

adrenal derecha del grupo control y del grupo hacinado.

Gráfica 8. Índice de peso de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales con relación al peso corporal de ratas Wistar

jóvenes controles y hacinadas en el día posnatal 65. La formula utilizada para obtener los índices fue: “(Peso del órgano / peso

corporal)*100”. n=9 por grupo. (P<0,05). * índica diferencia significativa y ** índica diferencia altamente significativa (P<0,01).

Las líneas verticales corresponden al error estándar (SEM) de los promedios.

44

Discusión

Reportes previos han demostrado la utilidad de cuantificar corticosterona plasmática para la evaluación de

estrés en periodos breves de tiempo (Stalder, Kirschbaum., 2012). La concentración de corticosterona en

muestras de plasma varía en función del ritmo circadiano y es susceptibles a variación por perturbaciones

ambientales (Meyer and Novak., 2012). Se sabe que el estado físico, social y la defensa de territorio son

factores constantes que determinan la vulnerabilidad de los animales expuestos a estrés (Bartolomucci et

al., 2004). La medición de glucocorticoides en plasma, saliva, orina y/o heces permite monitorear

concentraciones de corticoides por minutos horas y días después de aplicado el evento estresor. Estudios

sobre la concentración de glucocorticoides en pelo representan una nueva herramienta, válida, no invasiva

y efectiva para cuantificar glucocorticoides para el diagnóstico de estrés crónico (Sharpley et al., 2012)

(Siniscalchi et al., 2013).

Los datos obtenidos en el presente trabajo (gráfica No. 1) exponen por primera vez la presencia de

corticosterona en pelo de rata Wistar macho en etapa juvenil. También se cuantificó la concentración

(pg/mg) de corticosterona pilosa, evidenciando que como herramienta de diagnóstico para estrés crónico

su dinámica se comporta de manera similar al cortisol en pelo de otros mamíferos.

El hacinamiento generó aumento significativo de la concentración de corticosterona pilosa frente a los

sujetos control. Probablemente, el pelo de la zona afeitada crece almacenando la corticosterona plasmática

circundante en el organismo durante el periodo de hacinamiento, o crece sintetizando corticosterona en

conexión con un eje HPA autónomo durante el periodo de hacinamiento (Sharpley et al., 2009). Aún no se

tiene evidencia certera de cuál de las dos vías está regulando los niveles de corticosterona en el pelo, por

lo que lo único que se puede concluir de acuerdo a los resultados de este estudio, es que se comporta de la

misma forma que el cortisol en otros mamíferos (Davenport et al., 2008) (Morris et al., 2011) (Steudte et

al., 2011) (Zoccola and Dickerson, 2012) ) (Staufenbiel et al., 2012) (Cavigelli and Chaundhry, 2012)

(Meyer and Novak, 2012) (Luo et al., 2012) (Comin et al 2012), (Sinicalchi et al., 2013), la corticosterona

pilosa es una herramienta útil y no invasiva para el diagnóstico de estrés crónico en ratas Wistar.

Algunos estudios han planteado que el cortisol piloso es mayor en etapas juveniles y va disminuyendo con

el tiempo (Sharpley et al., 2012) (Ouschan et al., 2013), lo que podría explicar los elevados niveles de

corticosterona encontrados el DPN 38; sin embargo los datos obtenidos en este estudio no son suficientes

para corroborar esta hipótesis, para ello se requiere hacer una curva durante las etapas de vida de la rata

Wistar.

45

Los datos iniciales (DPN 38) encontrados para corticosterona en pelo presentaron alta variabilidad.

Aunque no existe evidencia sobre gestación y depósito de corticoides en folículo piloso, es importante

tener en cuenta eventos relacionados con el estrés prenatal (Modir et al., 2014) (Amugongo and Hlusko,

2014) y alteraciones en la función de 11β-Hidroxiesteroide Deshidrogenasa (Chapman et al., 2014),

eventos que además de favorecer el paso de corticoides al feto a través de la placenta (Weinstock, 2005),

podrían aumentar la concentración de corticoides disponibles en el líquido amniótico (Tanswell and Smith

1978).

Respecto a la variabilidad en la concentración de corticosterona plasmática, es importante tener en cuenta

los eventos asociados a la reestructuración social de los grupos (Cavigelli et al., 2006) (Buwalda et al.,

2011). La variabilidad de los niveles plasmáticos encontrada en las muestras del DPN 65 corroborarían

que la dinámica fisiológica se ve alterada constantemente por factores físicos y sociales (Bartolomucci et

al., 2004), en este caso, del estrés por hacinamiento. La evaluación realizada en este trabajo, comparando

valores iniciales de corticosterona (DPN 38) y finalización de la etapa juvenil o adolescencia (DPN 65),

no arrojó correlación significativa entre los niveles de corticosterona plasmática y pilosa.

Respecto a este resultado (gráfica No. 3) es importante resaltar que actualmente no existe evidencia que

concluya que los glucocorticoides presentes en el pelo deriven del flujo sanguíneo, de hecho algunos

resultados sugieren que el cortisol piloso no se derivaría del torrente sanguíneo ni estaría mediado por la

vía central ACTH (Sharpley et al., 2009), por otra parte existe evidencia que soporta la no correlación

entre corticoides plasmático y piloso en humanos (Sauve et al., 2007), perros (Ouschan et al., 2013), osos

polares (Bechshoft et al., 2011) y aves (Fairhurst et al., 2013), entre otros; esto posiblemente porque las

concentraciones de cortisol piloso cambian de forma más gradual que en plasma sanguíneo, y por lo tanto

parece representar una muestra ideal para el análisis de concentraciones de metabolitos de

glucocorticoides a través del tiempo (Ouschan et al., 2013).

La literatura científica ha documentado disminución significativa de peso en ratas Wistar sometidas a

estrés social crónico (Aioi et al., 2001) (Bartolomucci et al., 2004) (McCormick et al., 2008) y a estrés por

hacinamiento (Nagaraja and Jeganathan, 2002) (Bernatova et al., 2007) (Knyazeva et al., 2012)

(Puzserova et al., 2010). La variación en peso corporal encontrada en este estudio podría explicarse de

acuerdo a variaciones tanto sociales (derrota social, sobrepoblación) como físicos (espacio mínimo vital,

manipulación) y/o ambientales (temperatura, humedad, amoniaco) propios de la complejidad del

hacinamiento.

46

La discusión sobre la tasa de peso de algunos órganos respecto al peso corporal de ratas Wistar se ha

estudiado en numerosos trabajos, no obstante la obtención de índices depende de diversos factores a

considerar (Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009). En la presente investigación no se encontró

correlación entre el peso corporal y el peso de pulmones, corazón, riñones y glándulas adrenales tanto para

el grupo control como en el grupo hacinado, esto se podría atribuir a que la etapa juvenil o adolescencia

se considera una etapa de desarrollo y de constantes cambios fisiológicos (Sisk and Foster, 2004)

(McCormick and Mathews, 2007) (Morrissey et al., 2011). De acuerdo a los anteriores argumentos, los

resultados del presente estudio se han discutido de acuerdo al peso absoluto (gráfica N. 7), aunque es

importante generar la discusión en cuanto a la cuantificación y exposición de pesos relativos (gráfica N.

8). Se ha demostrado que el peso de los riñones de animales sometidos a una condición de estrés crónico

es significativamente menor que el peso del órgano en el grupo control, factor que según los autores está

relacionado con menor volumen glomerular y menor número de nefronas por riñón (de Souza et al.,

2001); sin embargo a nivel morfológico es poco lo que se sabe sobre la respuesta de los riñones a la

exposición por hacinamiento.

La diferencia encontrada entre el peso del corazón de los sujetos controles y los hacinados podría ser

interpretada como resultado de una mayor actividad física, aumento del área de caja, y la posibilidad de

expresar su comportamiento natural por medio de su nivel de actividad, en el grupo control (Spangenberg

et al., 2005).

Aunque no se midió el nivel de amoniaco en este experimento, es importante destacar que una cantidad

considerable de estudios previos han documentado el efecto causado por el amoniaco en la respiración y

calidad de vida de las ratas (Horn et al., 2012) (Burn et al., 2006). En el presente trabajo, el peso de los

pulmones no fue significativamente diferente entre los dos grupos evaluados. Es necesario destacar la

importancia de la limpieza y la frecuencia en el cambio de las camas. Los animales de ambos grupos

fueron manipulados con la misma frecuencia y por el mismo tiempo.

En relación con el peso de las glándulas adrenales, los resultados parecen depender del tipo de estresor

utilizado. Estrés crónico por inmovilización (Rostamkhani et al., 2012) y por estrés crónico variable

(Ulrich-Lai et al., 2006) presentan aumento significativo en el peso de las glándulas adrenales, mientras

que acorde a lo mostrado en este estudio, el estrés crónico por hacinamiento no genera diferencias

significativas en el peso de las glándulas adrenales de animales jóvenes (Armario et al., 1984) (Kirillov et

al., 2003) (Nyuyki et al., 2012). Los anteriores resultados sugieren continuar el debate sobre características

propias del estrés por hacinamiento, la exposición y la capacidad de adaptación (Puzserova et al., 2010).

47

Es importante plantear estudios futuros que involucren la variable de estrés por hacinamiento con análisis

de peso, morfología y funcionalidad de los órganos, pues aunque existen estudios de proporcionalidad

entre peso de algunos órganos y peso corporal (Webster et al., 1947) (Onyeanusi et al., 2009) en este

modelo de estrés crónico las variables, edad, dieta, temperatura, humedad, exposición a amoniaco y

consumo de agua juegan un papel preponderante en la dinámica fisiológica. Además, debe tener en

consideración los resultados en peso relativo, los cuales podrían ser útiles en la evaluación del peso de

diferentes órganos en otras etapas de la vida.

Falta dilucidar cuales son las posibles asociaciones entre niveles de corticosterona pilosa y masa corporal,

peso total, peso de órganos, entre otras variables afectadas por eventos de estrés crónico, pues aunque

haya datos prometedores en humanos (Stalder et al., 2012) y otras especies para algunas de estas variables,

la investigación con animales para experimentación recién comienza.

48

Capítulo 6

6.1. Conclusiones

En este estudio se demostró que la corticosterona se deposita en el pelo de rata Wistar en etapa juvenil.

La técnica usada en este experimento para la cuantificación de corticoides demostró ser potencialmente

útil para el monitoreo de la corticosterona en pelo de rata Wistar

El hacinamiento induce diferencias significativas en la concentración de corticosterona pilosa y

plasmática en ratas Wistar jóvenes

Nuestros resultados demuestran que no hay correlación entre la variación de la corticosterona depositada

en pelo y la concentración plasmática de la misma.

49

6.2. Recomendaciones

El hallazgo obtenido en el presente trabajo, y la estandarización de la técnica en Colombia, contribuirán al

desarrollo de metodologías más precisas y menos invasivas para la el monitoreo de corticosterona en

eventos de estrés crónico

Complementando el aporte al conocimiento que representa el presente trabajo, es relevante la necesidad

de establecer mecanismos genéticos, epigenéticos, de señalización, procesos celulares y procesos

sistémicos asociados a la dinámica de la corticosterona en pelo tanto en individuos machos como en

hembras.

Este trabajo plantea incógnitas importantes para el desarrollo de futuros estudios que permitan

determinar entre otros factores, la curva de concentración de corticosterona en pelo durante la vida de la

rata Wistar, y la relación entre aspectos comportamentales y corticosterona pilosa

Se espera que este estudio contribuya al trabajo interdisciplinario relacionado con el monitoreo de estrés

crónico y el bienestar animal.

50

Bibliografía

1. Accorsi PA, Carloni E, Valsecchi P, Viggiani R, Gamberoni M, Tamanini C, Seren E (2008) Cortisol

determination in hair and faeces from domestic cats and dogs. Gen Comp Endocrinol 155:398-402.

2. Aioi A, Okuda M, Matsui M, Tonogaito H, Hamada K (2001) Effect of high population density environment

on skin barrier function in mice. J Dermatol Sci 25:189-197.

3. Alfonso J, Fernandez ME, Cooper B, Flugge G, Frasch AC (2005a) The stress-regulated protein M6a is a key

modulator for neurite outgrowth and filopodium/spine formation. Proc Natl Acad Sci U S A 102:17196-17201.

4. Alfonso J, Frasch AC, Flugge G (2005b) Identificación de genes regulados por estrés y sus efectos sobre

neuronas del hipocampo. Universidad Nacional de General San martín. Chile.

5. Alfonso J, Frick LR, Silberman DM, Palumbo ML, Genaro AM, Frasch AC (2006) Regulation of hippocampal

gene expression is conserved in two species subjected to different stressors and antidepressant treatments. Biol

Psychiatry 59:244-251.

6. Amugongo SK, Hlusko LJ (2014) Impact of maternal prenatal stress on growth of the offspring. Aging Dis 5:1-

16.

7. Arck PC, Slominski A, Theoharides TC, Peters EM, Paus R (2006) Neuroimmunology of stress: skin takes

center stage. J Invest Dermatol 126:1697-1704.

8. Armario A, Ortiz R, Balasch J (1984) Effect of crowding on some physiological and behavioral variables in

adult male rats. Physiol Behav 32:35-37.

9. Ashley NT, Barboza PS, Macbeth BJ, Janz DM, Cattet MR, Booth RK, Wasser SK (2011) Glucocorticosteroid

concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone

challenge. Gen Comp Endocrinol 172:382-391.

10. Bartolomucci A, Pederzani T, Sacerdote P, Panerai AE, Parmigiani S, Palanza P (2004) Behavioral and

physiological characterization of male mice under chronic psychosocial stress. Psychoneuroendocrinology

29:899-910.

11. Bechshoft TO, Sonne C, Dietz R, Born EW, Novak MA, Henchey E, Meyer JS (2011) Cortisol levels in hair of

East Greenland polar bears. Sci Total Environ 409:831-834.

12. Bechshoft TO, Riget FF, Sonne C, Letcher RJ, Muir DC, Novak MA, Henchey E, Meyer JS, Eulaers I, Jaspers

VL, Eens M, Covaci A, Dietz R (2012) Measuring environmental stress in East Greenland polar bears, 1892-

1927 and 1988-2009: what does hair cortisol tell us? Environ Int 45:15-21.

51

13. Bennett A, Hayssen V (2010) Measuring cortisol in hair and saliva from dogs: coat color and pigment

differences. Domest Anim Endocrinol 39:171-180.

14. Bernatova I, Puzserova A, Navarova J, Csizmadiova Z, Zeman M (2007) Crowding-induced alterations in

vascular system of Wistar-Kyoto rats: role of nitric oxide. Physiol Res 56:667-669.

15. Black PH (2002) Stress and the inflammatory response: a review of neurogenic inflammation. Brain Behav

Immun 16:622-653.

16. Boranic M, Pericic D, Radacic M, Poljak-Blazi M, Sverko V, Miljenovic G (1982) Immunological and

neuroendocrine responses of rats to prolonged or repeated stress. Biomed Pharmacother 36:23-28.

17. Botchkarev VA (2003) Stress and the hair follicle: exploring the connections. Am J Pathol 162:709-712.

18. Bourke CH, Neigh GN (2011) Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually

dimorphic. Horm Behav 60:112-120

19. Botelho S, Estanislau C, Morato S (2007) Effects of under- and overcrowding on exploratory behavior in the

elevated plus-maze. Behav Processes 74:357-362.

20. Burn CC, Peters A, Day MJ, Mason GJ (2006) Long-term effects of cage-cleaning frequency and bedding type

on laboratory rat health, welfare, and handleability: a cross-laboratory study. Lab Anim 40:353-370.

21. Buwalda B, Geerdink M, Vidal J, Koolhaas JM (2011) Social behavior and social stress in adolescence: a focus

on animal models. Neurosci Biobehav Rev 35:1713-1721.

22. Calvo A (2011). Efecto antidiabético de los polisacáridos del fruto de xoconostle (Opuntia matudae) en ratas.

Colegio de postgraduados.

23. Cavigelli SA, Yee JR, McClintock MK (2006) Infant temperament predicts life span in female rats that

develop spontaneous tumors. Horm Behav 50:454-462.

24. Cavigelli SA, Chaudhry HS (2012) Social status, glucocorticoids, immune function, and health: can animal

studies help us understand human socioeconomic-status-related health disparities? Horm Behav 62:295-313.

25. Chapman K, Holmes M, Seckl J (2013) 11_-Hydroxysteroid Dehydrogenases: Intracellular Gate-Keepers of

Tissue Glucocorticoid Action. Physiol Rev 93: 1139–1206.

26. Cockrem JF (2013) Individual variation in glucocorticoid stress responses in animals. Gen Comp Endocrinol

181:45-58.

52

27. Comin A, Veronesi MC, Montillo M, Faustini M, Valentini S, Cairoli F, Prandi A (2012) Hair cortisol level as

a retrospective marker of hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity in horse foals. Vet J 194:131-132.

28. Dallman, M. F., la Fleur, S. E., Pecoraro, N. C., Gomez, F., Houshyar, H., Akana, S. F. (2004) Minireview:

glucocorticoids-food intake, abdominal obesity, and wealthy nations in 2004.Endocrinology 145, 2633–2638.

29. Das G, Uchida K, Kageyama K, Iwasaki Y, Suda T, Itoi K (2009) Glucocorticoid dependency of surgical

stress-induced FosB/DeltaFosB expression in the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat

hypothalamus. J Neuroendocrinol 21:822-831.

30. Davenport MD, Lutz CK, Tiefenbacher S, Novak MA, Meyer JS (2008) A rhesus monkey model of self-injury:

effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol Psychiatry 63:990-996.

31. Davenport MD, Tiefenbacher S, Lutz CK, Novak MA, Meyer JS (2006) Analysis of endogenous cortisol

concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen Comp Endocrinol 147:255-261.

32. de Kloet ER, Oitzl MS, Joels M (1999) Stress and cognition: are corticosteroids good or bad guys? Trends

Neurosci 22:422-426.

33. de Kloet ER, Vreugdenhil E, Oitzl MS, Joels M (1998) Brain corticosteroid receptor balance in health and

disease. Endocr Rev 19:269-301.

34. De Souza DB, Silva D, Costa Silva CM, Barcellos Sampaio FJ, Silva Costa W, Martins Cortez C (2011)

Effects of immobilization Stress on Kidneys of Wistar Male Rats: A Morphometrical and Stereological

Analysis. Kidney Blood Press Res 34:424-429.

35. Cárdenas A, López A, Martínez A, Franco K, Díaz F, Aguilera V, Valdez E (2010) Consumo de alimento,

crecimiento y ansiedad, tras estrés por hacinamiento o aislamiento de ratas. Revista mexicana de análisis de la

conducta. N° 2 (sept). Pags 129 – 142.

36. Davenport MD, Lutz CK, Tiefenbacher S, Novak MA, Meyer JS (2008) A rhesus monkey model of self-injury:

effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol Psychiatry 63:990-996.

37. Dickerson SS, Kemeny ME (2004) Acute stressors and cortisol responses: a theoretical integration and

synthesis of laboratory research. Psychol Bull 130:355-391.

38. Donet E, Bayo P, Calvo E, Labrie F, Perez P (2008) Identification of novel glucocorticoid receptor-regulated

genes involved in epidermal homeostasis and hair follicle differentiation. J Steroid Biochem Mol Biol 108:8-

16.

39. Djordjevic J, Cvijic G, Petrovic N, Davidovic V (2005) Effect of the acute crowding stress on the rat brown

adipose tissue metabolic functionComparative Biochemistry and Physiology, Part A 142. 433 – 438.

53

40. Dronjak S, Gavrilovic L´, Filipovic D, Radojcic MB (2004) Immobilization and cold stress affect sympatho–

adrenomedullary system and pituitary–adrenocortical axis of rats exposed to long-term isolation and crowding.

Physiology & Behavior 81.409– 415.

41. Ely D, Caplea A, Dunphy G, Smith D (1997) Physiological and neuroendocrine correlates of social position in

normotensive and hypertensive rat colonies. Acta Physiol Scand Suppl 640:92-95.

42. Fairbanks LA, Jorgensen MJ, Bailey JN, Breidenthal SE, Grzywa R, Laudenslager ML (2011) Heritability and

genetic correlation of hair cortisol in vervet monkeys in low and higher stress environments.

Psychoneuroendocrinology 36:1201-1208.

43. Fairhurst GD, Marchant TA, Soos C, Machin KL, Clark RG (2013) Experimental relationships between levels

of corticosterone in plasma and feathers in a free-living bird. J Exp Biol 216:4071-4081.

44. Fournier S, Joseph V, Kinkead R (2011) Influence of juvenile housing conditions on the ventilatory,

thermoregulatory, and endocrine responses to hypoxia of adult male rats. J Appl Physiol 111:516-523.

45. Geverink NA, Schouten WG, Gort G, Wiegant VM (2002) Individual differences in behavioral and

physiological responses to restraint stress in pigs. Physiol Behav 77:451-457.

46. Gonzalez-de-la-Vara Mdel, Valdez RA, Lemus-Ramirez V, Vazquez-Chagoyan JC, Villa-Godoy A, Romano

MC (2011) Effects of adrenocorticotropic hormone challenge and age on hair cortisol concentrations in dairy

cattle. Can J Vet Res 75:216-221.

47. Gow R, Thomson S, Rieder M, Van US, Koren G (2010) An assessment of cortisol analysis in hair and its

clinical applications. Forensic Sci Int 196:32-37.

48. Haverbeke A, Diederich C, Depiereux E, Giffroy JM (2008) Cortisol and behavioral responses of working

dogs to environmental challenges. Physiol Behav 93:59-67.

49. Hellhammer DH, Wust S, Kudielka BM (2009) Salivary cortisol as a biomarker in stress research.

Psychoneuroendocrinology 34:163-171.

50. Hiramoto K, Jikumaru M, Yamate Y, Sato EF, Inoue M (2009) Ultraviolet A irradiation of the eye induces

immunomodulation of skin and intestine in mice via hypothalomo-pituitary-adrenal pathways. Arch Dermatol

Res 301:239-244.

51. Hogan LA, Lisle AT, Johnston SD, Robertson H (2012) Non-invasive assessment of stress in captive numbats,

Myrmecobius fasciatus (Mammalia: Marsupialia), using faecal cortisol measurement. Gen Comp Endocrinol

179:376-383.

52. Horn MJ, Hudson SV, Bostrom LA, Cooper DM (2012) Effects of cage density, sanitation frequency, and

bedding type on animal wellbeing and health and cage environment in mice and rats. J Am Assoc Lab Anim Sci

51:781-788.

54

53. Ito N, Ito T, Kromminga A, Bettermann A, Takigawa M, Kees F, Straub RH, Paus R (2005) Human hair

follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and synthesize cortisol.

FASEB J 19:1332-1334.

54. Ito T (2010) Hair follicle is a target of stress hormone and autoimmune reactions. J Dermatol Sci 60:67-73.

55. Jayo M, Cisneros J (1999) Guía para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. dicion Mexicana

auspiciada por la Academia Nacional De Medicina. 1999. Copyright National Academy Press, Washington,

D.C. 1996.

56. Jensen KH, Pedersen LJ, Nielsen EK, Heller KE, Ladewig J, Jorgensen E (1996) Intermittent stress in pigs:

effects on behavior, pituitary-adrenocortical axis, growth, and gastric ulceration. Physiol Behav 59:741-748.

57. Johnson EO, Kamilaris TC, Chrousos GP, Gold PW (1992) Mechanisms of stress: a dynamic overview of

hormonal and behavioral homeostasis. Neurosci Biobehav Rev 16:115-130.

58. Keckeis K, Lepschy M, Schopper H, Moser L, Troxler J, Palme R (2012) Hair cortisol: a parameter of chronic

stress? Insights from a radiometabolism study in guinea pigs. J Comp Physiol B 182:985-996.

59. Kim JJ, Diamond DM (2002) The stressed hippocampus, synaptic plasticity and lost memories. Nat Rev

Neurosci 3:453-462.

60. Kirillov OI, Khasina EI, Durkina VB (2003) [Effect of stress on postnatal growth in weight of rat body

and adrenal gland]. Ontogenez 34:371-376.

61. Knyazeva SI, Loginova NA, Loseva EV (2012) Anxiety level and body weight changes in rats living in

overpopulated cages. Bull Exp Biol Med 154:3-6.

62. Li LA, Xia D, Wei S, Hartung J, Zhao RQ (2008) Characterization of adrenal ACTH signaling pathway and

steroidogenic enzymes in Erhualian and Pietrain pigs with different plasma cortisol levels. Steroids 73:806-814.

63. Luo H, Hu X, Liu X, Ma X, Guo W, Qiu C, Wang Y, Wang Q, Zhang X, Zhang W, Hannum G, Zhang K, Liu

X, Li T (2012) Hair cortisol level as a biomarker for altered hypothalamic-pituitary-adrenal activity in female

adolescents with posttraumatic stress disorder after the 2008 Wenchuan earthquake. Biol Psychiatry 72:65-69.

64. Mcbeth BJ, Cattet MRL, Stenhouse GB, Gibeau ML, Janz DM (2010) Hair cortisol concentration as a

noninvasive measure of long-term in free ranging grizzly bear (Ursus arctos): considerations whit implications

for other wildlife. Can. J. Zool. 88.

55

65. McCormick CM, Green MR (2012) From the stressed adolescent to the anxious and depressed adult:

Investigations in rodent models. Neuroscience.

66. McCormick CM, Mathews IZ (2007) HPA function in adolescence: role of sex hormones in its regulation and

the enduring consequences of exposure to stressors. Pharmacol Biochem Behav 86:220-233.

67. McCormick CM, Mathews IZ (2010) Adolescent development, hypothalamic-pituitary-adrenal function, and

programming of adult learning and memory. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 34:756-765.

68. McCormick CM, Smith C, Mathews IZ (2008) Effects of chronic social stress in adolescence on anxiety and

neuroendocrine response to mild stress in male and female rats. Behav Brain Res 187:228-238.

69. McEwen BS. Effects of adverse experiences for brain structure and function. Biol Psychiatry 2000; 48: 721-31.

70. McEwen BS (2003) Mood disorders and allostatic load. Biol Psychiatry 54:200-207.

71. Meyer JS, Novak MA (2012) Minireview: Hair cortisol: a novel biomarker of hypothalamic-pituitary-

adrenocortical activity. Endocrinology 153:4120-4127.

72. Modir F, Elahdadi SM, Goudarzi I, Lashkarboluki T, Abrari K (2014) Prenatal stress decreases spatial learning

and memory retrieval of the adult male offspring of rats. Physiol Behav 129:104-109.

73. Morris CA, Amyes NC, Hickey SM (2011) Responses of prolactin and hair growth to selection for age at

puberty in Angus cattle. Animal 5:198-201.

74. Morrissey MD, Mathews IZ, McCormick CM (2011) Enduring deficits in contextual and auditory fear

conditioning after adolescent, not adult, social instability stress in male rats. Neurobiol Learn Mem 95:46-56.

75. Munsterhjelm C, Valros A, Heinonen M, Halli O, Siljander-Rasi H, Peltoniemi OA (2010) Environmental

enrichment in early life affects cortisol patterns in growing pigs. Animal 4:242-249.

76. Nagaraja HS, Jeganathan PS (2002) Voluntary alcohol drinking & caloric intake in rats exposed to crowding

stress. Indian J Med Res 116:111-116.

77. Oitzl MS Champagne DL, van d, V, de Kloet ER (2010) Brain development under stress: hypotheses of

glucocorticoid actions revisited. Neurosci Biobehav Rev 34:853-866.

78. Onyeanusi BI, Adeniyi AA, Onyeanusi CG, Ayo JO, Ibe CC (2009) A Study of the Kidney of the Wistar Rat in

Northern Guinea Savannah Zone: the Morphometric aspect. Pakistan Journal of Nutrition 8: 1040-1042.

56

79. Ouschan C, Kuchar A, Mostl E (2013) Measurement of cortisol in dog hair: a noninvasive tool for the

diagnosis of hypercortisolism. Vet Dermatol 24:428-4.

80. Paus R, Arck P, Tiede S (2008) (Neuro-)endocrinology of epithelial hair follicle stem cells. Mol Cell

Endocrinol 288:38-51.

81. Paus R, Foitzik K (2004) In search of the "hair cycle clock": a guided tour. Differentiation 72:489-511.

82. Paus R, Theoharides TC, Arck PC (2006) Neuroimmunoendocrine circuitry of the 'brain-skin connection'.

Trends Immunol 27:32-39.

83. Raul JS, Cirimele V, Ludes B, Kintz P (2004) Detection of physiological concentrations of cortisol and

cortisone in human hair. Clin Biochem 37:1105-1111.

84. Romeo RD (2010) Pubertal maturation and programming of hypothalamic-pituitary-adrenal reactivity. Front

Neuroendocrinol 31:232-240.

85. Rostamkhani F, Zardooz H, Zahediasl S, Farrokhi B (2012) Comparison of the effects of acute and chronic

psychological stress on metabolic features in rats. J Zhejiang Univ Sci B 13:904-912.

86. Ruis MA, te Brake JH, Engel B, Buist WG, Blokhuis HJ, Koolhaas JM (2001) Adaptation to social isolation.

Acute and long-term stress responses of growing gilts with different coping characteristics. Physiol Behav

73:541-551.

87. Russell E, Koren G, Rieder M, Van US (2012) Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: current

status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology 37:589-601.

88. Rutherford KM, Haskell MJ, Glasbey C, Lawrence AB (2006) The responses of growing pigs to a chronic-

intermittent stress treatment. Physiol Behav 89:670-680.

89. Sauve B, Koren G, Walsh G, Tokmakejian S, Van Uum SH (2007) Measurement of cortisol in human hair as a

biomarker of systemic exposure. Clin Invest Med 30:E183-E191.

90. Sharpley CF, Kauter KG, McFarlane JR (2009) An initial exploration of in vivo hair cortisol responses to a

brief pain stressor: latency, localization and independence effects. Physiol Res 58:757-761.

91. Sharpley CF, Kauter KG, McFarlane JR (2010) An Investigation of Hair Cortisol Concentration Across Body

Sites and within Hair Shaft. Clin Med Insights Endocrinol Diabetes 3:17-23.

92. Sharpley CF, McFarlane JR, Slominski A (2012) Stress-linked cortisol concentrations in hair: what we know

and what we need to know. Rev Neurosci 23:111-121.

57

93. Simeon, D., et al. "Hypothalamic-pituitary-adrenal axis function in dissociative disorders, post-traumatic stress

disorder, and healthy volunteers." Biol.Psychiatry 61.8 (2007): 966-73.

94. Siniscalchi M, McFarlane JR, Kauter KG, Quaranta A, Rogers LJ (2013) Cortisol levels in hair reflect

behavioural reactivity of dogs to acoustic stimuli. Res Vet Sci 94:49-54.

95. Sisk CL, Foster DL (2004) The neural basis of puberty and adolescence. Nat Neurosci 7:1040-1047.

96. Skobowiat C, Dowdy JC, Sayre RM, Tuckey RC, Slominski A (2011) Cutaneous hypothalamic-pituitary-adrenal

axis homolog: regulation by ultraviolet radiation. Am J Physiol Endocrinol Metab 301:E484-E493.

97. Slominski A, Gomez-Sanchez CE, Foecking MF, Wortsman J (2000) Active steroidogenesis in the normal rat

skin. Biochim Biophys Acta 1474:1-4.

98. Slominski A, Wortsman J (2000) Neuroendocrinology of the skin. Endocr Rev 21:457-487.

99. Slominski A, Zbytek B, Semak I, Sweatman T, Wortsman J (2005) CRH stimulates POMC activity and

corticosterone production in dermal fibroblasts. J Neuroimmunol 162:97-102.

100. Slominski A, Zbytek B, Szczesniewski A, Wortsman J (2006) Cultured human dermal fibroblasts do

produce cortisol. J Invest Dermatol 126:1177-1178.

101. Slominski A, Wortsman J, Tuckey RC, Paus R (2007) Differential expression of HPA axis homolog in the

skin. Mol Cell Endocrinol 265-266:143-149.

102. Slominski A, Wortsman J, Paus R, Elias PM, Tobin DJ, Feingold KR (2008) Skin as an endocrine organ:

implications for its function. Drug Discov Today Dis Mech 5:137-144.

103. Slominski A, Zbytek B, Nikolakis G, Manna PR, Skobowiat C, Zmijewski M, Li W, Janjetovic Z, Postlethwaite

A, Zouboulis CC, Tuckey RC (2013) Steroidogenesis in the skin: implications for local immune functions. J

Steroid Biochem Mol Biol 137:107-123.

104. Spangenberg EM, Augustsson H, Dahlborn K, Essen-Gustavsson B, Cvek K (2005) Housing-related activity in

rats: effects on body weight, urinary corticosterone levels, muscle properties and performance. Lab Anim 39:45-

57.

105. Stalder T, Kirschbaum C (2012) Analysis of cortisol in hair--state of the art and future directions. Brain

Behav Immun 26:1019-1029.

58

106. Stalder T, Steudte S, Alexander N, Miller R, Gao W, Dettenborn L, Kirschbaum C (2012) Cortisol in hair,

body mass index and stress-related measures. Biol Psychol 90:218-223.

107. Staufenbiel SM, Penninx BW, Spijker AT, Elzinga BM, van Rossum EF (2012) Hair cortisol, stress

exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology.

108. Steudte S, Stalder T, Dettenborn L, Klumbies E, Foley P, Beesdo-Baum K, Kirschbaum C (2011) Decreased

hair cortisol concentrations in generalised anxiety disorder. Psychiatry Res 186:310-314.

109. Szakacs R, Fazekas I, Mihaly A, Krisztin-Peva B, Juhasz A, Janka Z (2010) Single-dose and chronic

corticosterone treatment alters c-Fos or FosB immunoreactivity in the rat cerebral cortex. Acta Histochem

112:147-160.

110. Tanswell AK, Smith BT (1978) The relationship of amniotic membrane 11-oxidoreductase activity to lung

maturation in the human fetus. Pediatr Res 12:957–960.

111. Tirelli E, Laviola G, Adriani W (2003) Ontogenesis of behavioral sensitization and conditioned place

preference induced by psychostimulants in laboratory rodents. Neurosci Biobehav Rev 27:163-178.

112. Tobin DJ, Kauser S (2005) Hair melanocytes as neuro-endocrine sensors--pigments for our imagination. Mol

Cell Endocrinol 243:1-11.

113. Ulrich-Lai YM, Figueiredo HF, Ostrander MM, Choi DC, Engeland WC, Herman JP (2006) Chronic stress

induces adrenal hyperplasia and hypertrophy in a subregion-specific manner. Am J Physiol Endocrinol Metab

291:E965-E973.

114. Valencia-Alfonso CE, Feria-Velasco A, Luquin S, Diaz-Burke Y, Garcia Estrada J (2004) [The effects of the

social environment on the brain]. Rev Neurol 38:869-878.

115. Van der Staay FJ, Schuurman T, Hulst M, Smits M, Prickaerts J, Kenis G, Korte SM (2010) Effects of

chronic stress: a comparison between tethered and loose sows. Physiol Behav 100:154-164.

116. Ver Hoeve ES, Kelly G, Luz S, Ghanshani S, Bhatnagar S (2013) Short-term and long-term effects of repeated

social defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience 249:63-73.

117. Vinson GP (2009) The adrenal cortex and life. Mol Cell Endocrinol 300:2-6.

118. Webster SH, Liljegreen ET, Zimicen DJ (1947) Body weight ratios for liver, kidneys and spleen of laboratory

animals. The American journal of Anatomy 81:477-513.

119. Weinstock M (2005) The potential influence of maternal stress hormones on development and mental

health of the offspring. Brain Behav Immun 19:296-308.

59

120. Weintraub A, Singaravelu J, Bhatnagar S (2010) Enduring and sex-specific effects of adolescent social

isolation in rats on adult stress reactivity. Brain Res 1343:83-92.

121. Wust S, Federenko I, Hellhammer DH, Kirschbaum C (2000) Genetic factors, perceived chronic stress, and

the free cortisol response to awakening. Psychoneuroendocrinology 25:707-720.

Zoccola PM, Dickerson SS (2012) Assessing the relationship between rumination and cortisol: a review. J

Psychosom Res 73:1-9.

Reference List

Amugongo SK, Hlusko LJ (2014) Impact of maternal prenatal stress on growth of the offspring. Aging Dis 5:1-16.

Armario A, Ortiz R, Balasch J (1984) Effect of crowding on some physiological and behavioral variables in adult

male rats. Physiol Behav 32:35-37.

Bartolomucci A, Pederzani T, Sacerdote P, Panerai AE, Parmigiani S, Palanza P (2004) Behavioral and

physiological characterization of male mice under chronic psychosocial stress. Psychoneuroendocrinology 29:899-

910.

Bechshoft TO, Sonne C, Dietz R, Born EW, Novak MA, Henchey E, Meyer JS (2011) Cortisol levels in hair of East

Greenland polar bears. Sci Total Environ 409:831-834.

Bernatova I, Puzserova A, Navarova J, Csizmadiova Z, Zeman M (2007) Crowding-induced alterations in vascular

system of Wistar-Kyoto rats: role of nitric oxide. Physiol Res 56:667-669.

Bourke CH, Neigh GN (2011) Behavioral effects of chronic adolescent stress are sustained and sexually dimorphic.

Horm Behav 60:112-120.

Burn CC, Peters A, Day MJ, Mason GJ (2006) Long-term effects of cage-cleaning frequency and bedding type on

laboratory rat health, welfare, and handleability: a cross-laboratory study. Lab Anim 40:353-370.

Buwalda B, Geerdink M, Vidal J, Koolhaas JM (2011) Social behavior and social stress in adolescence: a focus on

animal models. Neurosci Biobehav Rev 35:1713-1721.

Cavigelli SA, Yee JR, McClintock MK (2006) Infant temperament predicts life span in female rats that develop

spontaneous tumors. Horm Behav 50:454-462.

Davenport MD, Lutz CK, Tiefenbacher S, Novak MA, Meyer JS (2008) A rhesus monkey model of self-injury: effects

of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol Psychiatry 63:990-996.

Fairhurst GD, Marchant TA, Soos C, Machin KL, Clark RG (2013) Experimental relationships between levels of

corticosterone in plasma and feathers in a free-living bird. J Exp Biol 216:4071-4081.

Hiramoto K, Jikumaru M, Yamate Y, Sato EF, Inoue M (2009) Ultraviolet A irradiation of the eye induces

immunomodulation of skin and intestine in mice via hypothalomo-pituitary-adrenal pathways. Arch Dermatol Res

301:239-244.

Horn MJ, Hudson SV, Bostrom LA, Cooper DM (2012) Effects of cage density, sanitation frequency, and bedding

type on animal wellbeing and health and cage environment in mice and rats. J Am Assoc Lab Anim Sci 51:781-788.

60

Ito N, Ito T, Kromminga A, Bettermann A, Takigawa M, Kees F, Straub RH, Paus R (2005) Human hair follicles

display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and synthesize cortisol. FASEB J

19:1332-1334.

Ito T (2010) Hair follicle is a target of stress hormone and autoimmune reactions. J Dermatol Sci 60:67-73.

Kirillov OI, Khasina EI, Durkina VB (2003) [Effect of stress on postnatal growth in weight of rat body and adrenal

gland]. Ontogenez 34:371-376.

Knyazeva SI, Loginova NA, Loseva EV (2012) Anxiety level and body weight changes in rats living in overpopulated

cages. Bull Exp Biol Med 154:3-6.

Li LA, Xia D, Wei S, Hartung J, Zhao RQ (2008) Characterization of adrenal ACTH signaling pathway and

steroidogenic enzymes in Erhualian and Pietrain pigs with different plasma cortisol levels. Steroids 73:806-814.

McCormick CM, Smith C, Mathews IZ (2008) Effects of chronic social stress in adolescence on anxiety and

neuroendocrine response to mild stress in male and female rats. Behav Brain Res 187:228-238.

Modir F, Elahdadi SM, Goudarzi I, Lashkarboluki T, Abrari K (2014) Prenatal stress decreases spatial learning and

memory retrieval of the adult male offspring of rats. Physiol Behav 129:104-109.

Morrissey MD, Mathews IZ, McCormick CM (2011) Enduring deficits in contextual and auditory fear conditioning

after adolescent, not adult, social instability stress in male rats. Neurobiol Learn Mem 95:46-56.

Nagaraja HS, Jeganathan PS (2002) Voluntary alcohol drinking & caloric intake in rats exposed to crowding stress.

Indian J Med Res 116:111-116.

Nyuyki KD, Beiderbeck DI, Lukas M, Neumann ID, Reber SO (2012) Chronic subordinate colony housing (CSC) as

a model of chronic psychosocial stress in male rats. PLoS One 7:e52371.

Ouschan C, Kuchar A, Mostl E (2013) Measurement of cortisol in dog hair: a noninvasive tool for the diagnosis of

hypercortisolism. Vet Dermatol 24:428-4.

Rostamkhani F, Zardooz H, Zahediasl S, Farrokhi B (2012) Comparison of the effects of acute and chronic

psychological stress on metabolic features in rats. J Zhejiang Univ Sci B 13:904-912.

Ruis MA, te Brake JH, Engel B, Buist WG, Blokhuis HJ, Koolhaas JM (2001) Adaptation to social isolation. Acute

and long-term stress responses of growing gilts with different coping characteristics. Physiol Behav 73:541-551.

Sauve B, Koren G, Walsh G, Tokmakejian S, Van Uum SH (2007) Measurement of cortisol in human hair as a

biomarker of systemic exposure. Clin Invest Med 30:E183-E191.

Simeon D, Knutelska M, Yehuda R, Putnam F, Schmeidler J, Smith LM (2007) Hypothalamic-pituitary-adrenal axis

function in dissociative disorders, post-traumatic stress disorder, and healthy volunteers. Biol Psychiatry 61:966-

973.

Siniscalchi M, McFarlane JR, Kauter KG, Quaranta A, Rogers LJ (2013) Cortisol levels in hair reflect behavioural

reactivity of dogs to acoustic stimuli. Res Vet Sci 94:49-54.

Skobowiat C, Dowdy JC, Sayre RM, Tuckey RC, Slominski A (2011) Cutaneous hypothalamic-pituitary-adrenal axis

homolog: regulation by ultraviolet radiation. Am J Physiol Endocrinol Metab 301:E484-E493.

Slominski A, Gomez-Sanchez CE, Foecking MF, Wortsman J (2000) Active steroidogenesis in the normal rat skin.

Biochim Biophys Acta 1474:1-4.

61

Slominski A, Wortsman J (2000) Neuroendocrinology of the skin. Endocr Rev 21:457-487.

Slominski A, Wortsman J, Paus R, Elias PM, Tobin DJ, Feingold KR (2008) Skin as an endocrine organ:

implications for its function. Drug Discov Today Dis Mech 5:137-144.

Slominski A, Zbytek B, Nikolakis G, Manna PR, Skobowiat C, Zmijewski M, Li W, Janjetovic Z, Postlethwaite A,

Zouboulis CC, Tuckey RC (2013) Steroidogenesis in the skin: implications for local immune functions. J Steroid

Biochem Mol Biol 137:107-123.

Slominski A, Zbytek B, Semak I, Sweatman T, Wortsman J (2005) CRH stimulates POMC activity and corticosterone

production in dermal fibroblasts. J Neuroimmunol 162:97-102.

Slominski A, Zbytek B, Szczesniewski A, Wortsman J (2006) Cultured human dermal fibroblasts do produce cortisol.

J Invest Dermatol 126:1177-1178.

Spangenberg EM, Augustsson H, Dahlborn K, Essen-Gustavsson B, Cvek K (2005) Housing-related activity in rats:

effects on body weight, urinary corticosterone levels, muscle properties and performance. Lab Anim 39:45-57.

Stalder T, Kirschbaum C (2012) Analysis of cortisol in hair--state of the art and future directions. Brain Behav

Immun 26:1019-1029.

Stalder T, Steudte S, Alexander N, Miller R, Gao W, Dettenborn L, Kirschbaum C (2012) Cortisol in hair, body mass

index and stress-related measures. Biol Psychol 90:218-223.

Ulrich-Lai YM, Figueiredo HF, Ostrander MM, Choi DC, Engeland WC, Herman JP (2006) Chronic stress induces

adrenal hyperplasia and hypertrophy in a subregion-specific manner. Am J Physiol Endocrinol Metab 291:E965-

E973.

Ver Hoeve ES, Kelly G, Luz S, Ghanshani S, Bhatnagar S (2013) Short-term and long-term effects of repeated social

defeat during adolescence or adulthood in female rats. Neuroscience 249:63-73.

Weinstock M (2005) The potential influence of maternal stress hormones on development and mental health of the

offspring. Brain Behav Immun 19:296-308.

Will AP, Suzuki Y, Elliott KH, Hatch SA, Watanuki Y, Kitaysky AS (2014) Feather corticosterone reveals

developmental stress in seabirds. J Exp Biol 217:2371-2376.

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