Artículo de Revisión Transporte iónico en el epitelio ... · de los niveles de excreción de...

85REVISTA LASALLISTA DE INVESTIGACIÓN - Vol. 7 No. 1

Transporte iónico en el epitelio branquial de peces de agua dulce*

Carlos Arturo David Ruales**, Walter Vásquez Torres***

Artículo de Revisión

* EstetrabajohacepartedelarevisiónbibliográficadelatesisdemaestríaenAcuiculturadeAguasContinentalestitulada:¨CuantificacióndelosnivelesdeexcrecióndenitrógenoamoniacalenfuncióndelniveldeproteínaenladietaylamasacorporalenCachamablanca(PiaractusBrachypomus)(Cuvier,1818)bajocondicionesdelaboratorio¨.Trabajorealizadoduranteelaño2008.GrupodeInvestigaciónenNutriciónyAlimentacióndeOrganismosAcuáticos¨GRANAC¨-UNILLANOS-.

** Biólogo.EspecialistaenEcología,MSc.enAcuiculturadeAguasContinentales.DocenteCorporaciónUniversitariaLasallista,GrupodeInvestigaciónenNutriciónyAlimentacióndeOrganismosAcuáticos¨GRANAC¨(UNILLANOS).

*** Msc,Ph.D.ProfesortitularUniversidaddelosLlanos,InstitutodeAcuiculturadelosLlanos.

Correspondencia:CarlosArturoDavidRuales,e-mail:[email protected] Artículorecibido:06/08/2009;artículoaprobado:05/04/2010

Resumen

Introducción.Labranquiadelospeceseselprinci-palórganodetransporteyregulacióndegradientesiónicosyosmóticos,asícomotambiéndelbalanceácido-base, excreción de desechos nitrogenadosy metabolismo de hormonas circulantes, constitu-yendoelcentrodelasrespuestasfisiológicasaloscambios internos y medioambientales. Objetivo.Documentar la estructura, la vascularización y lasprincipalescélulasconstituyentesdeesteepitelioysurelaciónconlosmecanismosdetransporteióni-coparaelmantenimientodesuhomeostasis,paraargumentarelpapeldelaregulacióniónicaenlaho-meostasisdelpezteniendoencuentaqueestosme-canismosfisiológicossuponeneléxitoofracasodelaactividadpiscícola.Criterios de selección para la búsqueda bibliográfica. Sehizorevisióndeau-toresclásicosdelafisiologíaenpecesydeartículoscientíficosproductodeinvestigaciónyrevisionesenlosúltimosdiezaños,esencialmentelospublicadoseninglésyportugués.Resultados.existeuncampoinexploradosobrelosmecanismosquemantienenlahomeostasisenlospeces.Lostrabajosparanues-trasespeciesestánaúnporrealizarse.Lasnuevasherramientasmolecularespodríanayudaraelucidarlacontribucióndevariosprocesosdetransportedemembranaalaregulacióndelbalanceácido–base,altransporteiónicoyalaexcrecióndemetabolitosasociados a estos procesos.Retos. integrar dife-rentesdisciplinasparaobtenerunaimagenclaradecómofuncionanlasbranquiasdelospecesycómotalesprocesosdeterminansubienestar.

Palabras clave: Transporte iónico, epitelio bran-quial,homeostasis.

Ionic transportation in the branchial epithelium of fresh water fish

Abstract

Introduction. Thegillsare,forthefish,themostim-portant organ for the transportation and regulationofionicandosmoticgradients,andforthebalanceacid-base,theexcretionofnitrogenwastesandthemetabolismof circulatinghormones, becoming thecenterofthephysiologicalresponsestointernalandenvironmentalchanges.Objective. Tomakeado-cumenttoregisterthestructure,thevascularizationandthemaincellsofthisephitelium,anditsrelationwithionictransportationformaintainingitshomeos-tasis,inordertosustaintheroleoftheionicregula-tioninthehomeostasisoffish,keepinginmindthatthese physiological mechanisms can be a reasonto fail or to succeed in the fishbreedingactivities.Selection criteria for the bibliography. Classicau-thorsonthefishphysiologyfieldwererevised,plusmany articles produced from research works andrevisions from the last ten years. ThesematerialswerepublishedespeciallyinEnglishandPortugue-se.Results. There is an unexplored field concer-ningthemechanismsthatmaintainthehomeostasisinfish.Theworkforourspecies isyettobedone.Thenewmoleculartoolscouldhelptoelucidatethecontributionsofmanymembranetransportationpro-cesses to theacid-basebalance regulation, to theionictransportationandtotheexcretionofmetabo-litesassociatedwiththeseprocesses.Challenges. Tointegratedifferentdisciplinesinordertoobtainaclearimageofhowgillsworkandhowtheprocessesmentionedbeforedeterminethewellbeingoffish.

Key words: Ionic transportation, branchial epithe-lium,homeostasis.

86 REVISTA LASALLISTA DE INVESTIGACIÓN - Vol. 7 No. 1

Artigo de Revisão Transporte iônico no epitélio branquial de peixes de água doce

Resumo

Introdução.Abrânquiadospeixeséoprincipalór-gãodetransporteeregulaçãodegradientesiônicoseosmóticos,bemcomotambémdobalançoácida-base,excreçãodosrefugosnitrogenadosemetabo-lismodehormônioscirculantes,constituindoocen-trodasrespostasfisiológicasàsmudançasinternasemeioambientais.Objetivo.Documentaraestru-tura,avascularizaçãoeasprincipaiscélulasconsti-tuintesdesteepitélioesuarelaçãocomosmecanis-mosdetransporteiônicoparaamanutençãodesuahomeostasis,paraargumentaropapeldaregulaçãoiônicanahomeostasisdopeixetendoemcontaqueestes mecanismos fisiológicos supõem o sucessoou fracassodaatividadepiscicultura.Critérios de

seleção para a busca bibliográfica.Fez-serevisãodeautoresclássicosdafisiologiaempeixesedear-tigoscientíficosprodutodeinvestigaçãoerevisõesnosúltimosdezanos,essencialmenteospublicadoseminglêseportuguêsResultados.existeumcam-poinexploradosobreosmecanismosquemantêmahomeostasisnospeixes.Ostrabalhosparanossasespéciesestãoaindapor realizar-se.Asnovas fe-rramentasmoleculares poderiamajudar a elucidaracontribuiçãodeváriosprocessosdetransportedemembranaàregulaçãodobalançoácido–base,aotransporte iônico e à excreção demetabólitos as-sociadosaestesprocessos.Reptos. integrardife-rentesdisciplinasparaobterumaimagemclaradecomo funcionamas brânquias dos peixes e comotaisprocessosdeterminamseubem-estar.

Palavras importantes: Transporte iônico, epitéliobranquial,homeostasis.

Introducción

Lospecessonelgrupomásnumerosoydiver-sodelosvertebradossuperioresquedominanelmundoacuáticograciasasusextraordinariasadaptacionesmorfológicas,fisiológicasycom-portamentales.Actualmenteexistenaproxima-damente25.000especiesdepeces.Sudiver-sidad y la gran variedad de hábitats, reflejansu larga historia evolutiva de al menos 500millonesdeaños.Estegrupohaevolucionadoen tres grandes linajes: Agnatha (lampreas),ChondrichthyesoElasmobranquios(tiburones)yActinopterygii(pecesóseos),conelgrupote-leósteos,elmásrepresentativo1.Independien-temente de su línea evolutiva, lamayoría delospecesusanlasbranquiascomoelsitiopri-marioderespiración.Esteórganodeintercam-biogaseosoestáesencialmentecompuestodeungran complejo vascularizado, rodeadoporunaextensasuperficieepitelialqueproveeunadelgadabarreraentrelasangreyelambienteacuático2.Variosautorescoincidenenafirmarqueelepiteliobranquialeselsitioprincipaldelosprocesosdetransporteyregulacióndegra-dientesiónicosyosmóticos,asícomotambiéndel balance ácido-base, de la excreción dedesechosnitrogenadosydelmetabolismodehormonascirculantes.Ademásjuegaunpapelcentral en las respuestas fisiológicas a cam-biosinternosyambientales3,4,5,6

Lapresenterevisióntieneporobjetoargumen-tar el papel de la regulación iónica en la ho-

meostasisdelpez,teniendoencuentaquees-tosmecanismosfisiológicossuponeneléxitoofracasodelaactividadpiscícola.

Estructura Branquial

• Anatomía

Lasbranquiasde lospecesestán localizadasen la región cefálica y están compuestas devariosparesdearcosubicadosen la faringe.Ancladosalosarcosbranquialesseencuentraunconjuntocomplejodetejidosepiteliales,cir-culatoriosynerviosos.Losradiosbranquiales,constituidosporbarrasóseasocartilaginosas,selocalizanlateralmenteproyectándosedesdelabasemedialdecadaarcobranquial.Juntocon el tejido conectivo presente entre éstos,formanelsepto interbranquial7.Esteseptosos-tiene muchas filas de filamentos branquialescarnososquerecibenladenominacióndehe-mibranquias,quecorren paralelamente a los radios branquiales, craneal y caudal. Losfi-lamentosbranquiales son launidad funcionalbásicadeltejidobranquial.Unconjuntodehe-mibranquias craneales y caudales delmismoarco,sonllamadostambiénholobranquias8. En teleósteos,sóloestánpresentescuatroparesdeholobranquiasyel septo interbranquial esmuchomásreducidoyúnicamenteseextiendehastalabasedelosfilamentos,permitiendounmayorymáslibremovimientocomparadoconloselasmobranquios.Nosedistinguenabertu-rasbranquialesexternasenteleósteos,perosí


el opérculo,queprotege lacámarabranquial.Enestegrupo,elaguaentraalafaringedes-delaboca,pasandoporlosfilamentosylapa-redinteriordelopérculo,hastasalirvíacaudalabriendoéste9.

• Anatomía y vascularización de los fila-mentos branquiales

Enmuchos peces los filamentos branquialesson largas y estrechas proyecciones latera-lesdelarcobranquial,quesealineanhaciaelextremodesupartedistal.Losfilamentossonplanosaplanadosdorsoventralmenteyeláreade su superficie se incrementaenormementeporplieguessecundariosdenominados lame-las,lascualestienenaparienciadeplacasdel-gadasconuncentrovascularrecubiertoporunepitelio delgado.Deesta característica resul-taunapequeñadistanciadedifusiónentre lasangrequeinundacadalamelayelaguaparaelintercambio.Estadistanciapuedesermenordeunamicraenpecesactivosyhasta10µmenpecesmenosactivos10.

Elfilamentobranquialesconsideradocomolaunidadbásica funcionalde labranquia.Cadafilamento es irrigado por sangre de la arteria filamental aferente (AFA), la cual se extien-dealolargodelfilamento.Lasangreenestevasotambiénviajaaloancho,atravésdelaslamelas.Estasangrequefluyeatravésdelalamela drenaen la arteria filamental eferente (AFE),quecorrealolargodelfilamentoyllevasangreendirecciónopuestade laAFA11.Laslamelasestánuniformementedistribuidasalolargo del filamento y los espacios entre ellasson los canales por los cuales fluyeel agua.Una mirada más cercana a una lamela indi-vidual revelaqueenesenciaestácompuestadedosláminasepiteliales,sostenidasporunaseriedecélulas individuales llamadascélulas pilar.Olson12,indicaqueestascélulassonúni-casenlasbranquiasdelospeces,formandoelforrodelavasculaturarespiratoria,soportandoydefiniendo losespaciossanguíneos lamela-res,influyendoenlaresistenciavascularyasuvezmodulandolosefectosmetabólicosenlashormonascirculantes.Estudiosentruchaarcoirispermitieronevaluarelefectodelaacetilco-linasobrelaresistenciabranquialysurelaciónconlosespaciosentreestetipocelular13.Losespaciosalrededordelascélulaspilaryentrelas dos capas epiteliales, son inundadas con

sangre,quefluyelaminarmenteatravésdees-tosespacios(figura1).

Entodoslospeceselflujodeaguaatravésdelabranquiaes̈ contra-corriente¨alflujosanguí-neo.Deestamaneralalamelaestáadaptadapara el intercambio gaseoso, pero a su vezeste es el medio para pérdidas o gananciaspordifusióndeionesyaguadesdeyhaciaelambiente15

• Sistema vascular

Existendosvíasdeirrigacióndelabranquia:lavía arterio-arterial (respiratoria),dondelasan-gre viaja de la arteriabranquialaferente(ABA),aunaarteriafilamentalaferente(AFA),lacualcorrealolargodelfilamento.LaAFAdistribuyelasangrealalamelaatravésdelasarteriolas lamelaresaferentes (ALA)y la sangre lame-lar es recibida por un conjunto de arteriolas lamelares eferentes (ALE), las cuales con-ducen a la arteria filamental eferente (AFE). LaAFEretornasangredelfilamentoalaarte-riabranquialeferente(ABE),lacualdistribuyela sangre a la aorta dorsalpara lacirculaciónsistémica. La segunda víade irrigaciónde labranquiasedenominavía arteriovenosa,enlaquelasangredelaAFEpuedeserdistribuidaa lacirculaciónarteriovenosa,enestecasoalos vasos interlamelares (VIL),poranastomo-sis postlamelar arteriovenosa o por arterias nu-trientes (AN),lascualesvienendeAFEoABE.Los VIL son presumiblemente drenados porvenas branquiales(VB),lascualesretornanlasangrealcorazón16.Lafigura2indicadema-nerageneralestasdosvías.

• El epitelio branquial, células branquiales y su papel en la regulación iónica

Perry18 indica que el epitelio que cubre el fi-lamentobranquialy la lamela,suministranunlímiteentreelambienteexternodelpezy losfluidosextracelulares,jugandounpapelcríticoen las funciones fisiológicas de la branquia.El epitelio branquial está compuesto por dossuperficiesepitelialesdiferentes:elepiteliofi-lamentosoyelepiteliolamelar(tambiénllama-dos lamelaprimariaysecundaria, respectiva-mente),queasuvezestáncompuestosdetresdiferentestiposdecélulas:células de moco o neuroepiteliales,células del pavimento(PVCs)


Figura 2. Esquema generalizado del fl ujo sanguíneo a través de los vasos mayores de un arco branquial y un fi lamento. ABA: arteria branquial aferente, lleva sangre pobre en O2. ABE: arteria branquial eferente, lleva sangre rica en O2.AFA: arteria fi lamental aferente.

ALA: arteriola lamelar aferente. L: lamela. VIL: vasos interlamelares. AFE: arteria fi lamental eferente. ALE: arteriola lamelar eferente. AN: arterias nutrientes. VB: venas branquiales.

Sistema pobre en oxígeno color gris (ABA, AFA, ALA); sistema rico en oxígeno color blanco (ABE, AFE, ALE, AN). Modifi cado de Olson

Figura 1. Esquema y fotomicrografía electrónica de transmisión de un corte transversal y una porción exterior de una lamela de trucha arco iris. La forma de carretel de las células pilar

(PC), con sus proyecciones citoplasmáticas (PF) limitan los espacios sanguíneos lamelares, los cuales están llenos con glóbulo rojos (RBC). Las células pilar cubren paquetes de co-lágeno (C), los cuales se conectan a la membrana basal (BM) que une por debajo al epitelio lamelar (por ejemplo a las células del pavimento PVCs). Dentro de las células pilar existen microfi lamentos (MF), que pueden estar involucrados en la contracción de las células pilar. El canal marginal exterior (OMC), en su límite interior, está formado por células pilar y, en su límite exterior, por células endoteliales (ECs). La barra indica 5 μm. Modifi cado de Olson14.


o células epiteliales ycélulas ricas en mitocon-drias (MRCs.),o ionocitos o células de cloro. Deestostiposdecélulaslasmásrepresenta-tivassonlasPVCsylasMRCs,ycomprendenrespectivamente entre el 90% y el 15% delárea de superficie epitelial19. SegúnWilson yLaurent20, se definen las PVCs como célulasescamosas delgadas o de tipo cuboidal, queposeen una extensa superficie apical de tipomucoso,aparatodeGolgidesarrolladoyretí-culo endoplasmático rugoso con numerosasvesículas, características queevidencian unaaltaactividadmetabólicaapesardetenermuypocasmitocondriasysonusualmenteelprimertipodecélulaquecubrelossitiosdeestetipodeintercambioenlalamela.

Enlasbranquiasdeteleósteosdeaguadulce,lasPVCspuedenjugarunpapelmuyactivoenlatomabranquialdeiones,principalmentedeNa+ (asociado a bombade protones) y en eltransporteácido-base.LostrabajosdeGoss21,yBaylli,et al. 22,mencionanqueen periodosdeácidosisrespiratoriaestetipodecélulasau-mentansuáreadesuperficie,permitiendounmayor intercambio deNa+/H+. Goss,et al. 23,24,25 reportan, por medio de estudios ultraes-tructuralesdelepiteliobranquialdelCatfish(Ic-talurus nebulosus), la presencia de vesículascercadelamembranaapicaldelasPVCs,lascuales se parecen a laATPasa vacuolar ricaenprotones(V-ATPasaobombadeprotones).Estetipodevesículastambiénseencuentranen otros epitelios iono reguladores26, comoejemploenlavejigaurinariadelatortugayenlos túbulos renales de losmamíferos.Un re-portedeinmunolocalizaciónentruchaarcoiris(Onchorynchus mykiss), verifica la presenciadeV-ATPasaenlasPVCs27.Subsecuenteses-tudios de aproximación inmunológica realiza-dos en tilapia (Oreochromis mossambicus)yentruchaarcoiris(Onchorynchus mykiss),hanverificadolapresenciadeV-ATPasaenPVCs28.EstudiosmásrecientesdeGalvez et al29. han aisladounasubpoblacióndePVCsricasenmi-tocondrias(MR-PVCs)delabranquiasdetru-chaarcoirisquesonricasenV-ATPasa.EstasMR-PVCs,alparecer,tambiénparticipanenelintercambioiónicoyen lasalidadeprotones(extrusiónácida)

LasMRCs,sonconsideradascomoelsitiopri-mariodelinflujotransepitelialdeCl-yCa+2ydela regulaciónácido-base, por su relación conel antiporte Cl-/HCO3

-. Son usualmente máscomunes en el borde de salida del filamentobranquial, así como también en las regionesentrelalamelaindividual,manteniendosusu-perficiebasolateralencercanaproximidadconlacirculaciónarteriovenosa.Porlogeneral,lasMRCsson célulasde formaovoide-alargada,altapolarizaciónyconaltasdensidadesdemi-tocondriasensucitoplasma30. Enlasbranquiasdevariasespeciesdeteleós-teosdeaguadulce(Salmo salar;truchacafé;Poecilia reticulata; Cobitis taenia; Gobio gobio yO. niloticus),sehandetectadosubtiposmor-fológicamentediferentesdeMRC.Asísedes-criben lossubtiposαyβ,basadosenelgra-dodetinciónconosmio(clarouoscuro)enelcitoplasma31.Lasfuncionesespecíficasdeαyβ–MRCsenteleósteosdeaguadulceaúnnohansidoidentificadas,peronopodríaexcluirselaposibilidaddequeestascélulasrepresentendiferentesactividadesenlaregulaciónácido-basey/oseanestadosdedesarrollodeunsolotipocelular32.Galvezycolaboradores33 deter-minanlosdossubtiposdecélulasricasenmito-condrias,queestánasociadasconlareaccióndeaglutinaciónpositivaonegativaalalectinadeMani (PNA+(β)/PNA-(α)) y, junto a análisisdeWestern blotting, indican que ambos sub-tipos expresan altos niveles Na+-K+-ATPasa.Además PNA- muestra una mayor expresión(eldoble)deV-ATPasaen relaciónaPNA+ yresponde apropiadamente a estimulación porhipercapnia,incrementandolaexpresióndeV-ATPasa.EstosresultadossugierenqueelsitiodeexcrecióndeH+,estápresenteenelsubtipoPNA-,queenuniónconlasPVCs,puedenserlossitiosdeintercambioNa+/H+(Influjo/Eflujo).Comoresultadodeestetrabajo,Parks34 et al.proponen un nuevo modelo que implica queunodelossubtiposdecélulasdecloro(PNA-)estáinvolucradoenelintercambioNa+/H+,víacanal apical de Na+enuniónconunaV-ATA-PasayquelasalidadelNa+ del interior de la célula de cloro está directamente acopladoauncootransportebasolateralNa+/Base(NBC),encontrasteconlateoráenlaquesesostienequelaNa+-K+-ATPasaeslaúnicarutaparalasalida de Na+altorrentesanguíneo.


Mecanismos de transporte iónico branquial

Parapecesdeaguadulcelaconsecuenciadevi-virenunmediohiposmóticoydetenerunagranáreadesuperficiedeintercambio(labranquia),sujetaagrandesgradientesexternoscomolapér-didacontinuadesalespordifusiónpasivayunagananciadeaguaporósmosis,sehaconvertidoenun retofisiológicoal cualestosvertebradoshan respondido de maneras muy particulares.Paraelcaso,lospecesmanejanlagananciadeaguamediantelaproduccióndegrandescantida-desdeorina.Sinembargoestosuponeunapér-didadeiones,debidoaqueelriñónnoescapazdereabsorbertodaslassales.Porestarazón,latomabranquialactivadeNa+yCl-escrucialparamantenerlahomeostasisiónica35,35,36

Modelos para la entrada (influjo) de Na+

Elmodeloclásicopara latomadeNa+, incor-pora un cambiador electroneutral (antiporte) sensitivo a la amilorida Na+/H+ o Na+/NH4

+ pre-senteenlacéluladecloro.Ambosrepresentanun acoplamiento Na+/ácido38,39. Sin embragootros reportes indicanque losnivelesdeNa+ enelepiteliobranquialsonmáselevadosquelos encontrados en el agua circundante (queusualmente son menores a 1mM). De estamanera,elgradienteelectroquímicodelNa+ a travésdelamembranaapicalnopodríafavore-cerun intercambioNa+/H+40,41.Enconsecuen-ciaAvellayBornancin42,trabajandocontruchaarco iris (Salmo gairdneri),proponenunmodeloalternativoparalatomadeNa+,elcualimplicasuentradaatravésdecanales de Na+ presen-tesenlamembranaapical,acompañadadeungradiente electroquímico creado por la salidaactiva de H+, mediadaporunproteínadetipovacuolar (V-ATPasa) o H+-ATPasa (bomba de protones) localizadaapicalmenteenlasPVCs.UntrabajoposteriordeLinyRandall43,in vitroydeinmunolocalizacióndeH+-ATPasaenbran-quiasdetruchaarcoiris,daevidenciaclaradelaexistenciadeunabombadeprotonesactiva(H+-ATPasa)enlamembranaapical.Losautoresconcluyenqueunabombadeprotonesindirec-tamenteacopladaconuncanaldeNa+,envezdelosantiporteselectroneutralesNa+/H+(NH4

+),eslaresponsableparaelinflujodeNa+ylaex-crecióndeH+ enpecesdeaguadulce, yqueestabombaestácontenidatantoenlasMRCs

comoenlasPVCs.Porlotanto,latomadelNa+ atravésdelasbranquiasprobablementetengalugarenlosdostiposcelulares.

Sin embargo, la pregunta de cuál de los dostiposcelulareseselresponsableparalatomade Na+enpecesdeaguadulcenoestátotal-mente clara. Otras investigaciones sugierenevidenciaclaradequelasPVCs,másquelasMRCs,sonlasresponsablesdelinflujodelNa+.LasinvestigacionesdeMorganet al44.enbran-quias de trucha café (Salmo trutta), revelanque los cambios en las concentraciones am-bientales de Na+, tienen influenciadirectaso-brelosnivelesintracelularesdeNa+enlascé-lulasdelpavimento,sinafectaralascélulasdecloro.ParaSullivan43ycolaboradores,quienes trabajaroncon truchaarco iris, la localizacióndeV-ATPasaesexclusivamente las regionesapicalesdelascélulasdelpavimento.Porotraparte,GossyPerry46afirmanqueduran-teperiodosdeácidosisrespiratoria(disturbiosácido-base)eláreadesuperficiedeexposicióndelascélulasdeclorosereduceysimultánea-mente la tasadeentradadeNa+ yexcreciónácidase incrementa, indicandoquenoexisteunacorrelaciónentrelasuperficiedelascélu-lasdecloroylosprocesosmencionados.Engeneral,losmodelosparalatomadeNa+hansidotrabajadosensalmónidosytilapiasdeaguadulce,enlosquelasalidadeprotonesatravésdelaV-ATPasa(v)generaelgradienteeléctriconecesarioparaconducirelNa+ a tra-vésdelasuperficieapicalvíacanalapicalparael Na+ (ENaC).ElpasodesalidadelNa+ a tra-vésdelamembranabasolateralydelesperadorol de Na+-K+-ATPasaesaúnpococlaro,aun-quetambiénpuedenestarpresentesantiportesdelafamiliaNHC1

47.

Modelo para la entrada (influjo) de Cl-

SegúnMarshall48,lanaturalezadelatomadeCl- a través del epitelio branquial no ha sidoaúnfirmementeestablecida.Sinembargoexis-teevidenciaindirectadequesuabsorciónocu-rriríavíacootransporteelectroneutralapicaldemembrana(antiporte)Cl−/HCO3

−.Esteplantea-mientohasidoapoyadoporvariostrabajosenloscuales,medianteadicióndeinhibidoresdeintercambiadoresaniónicosalaguaomedianteremocióndelCl-,seobtuvounareducciónenlatasadeinflujodeCl-yretencióndeHCO3

-,


desarrollando una alcalosis metabólica49,50.ParaPerryyLaurent51, laproliferacióndecé-lulasdecloroenpecesexpuestosaambientespobresenionespareceserunarespuestaqueincrementa la capacidad de transporte bran-quialparaelCl-yelCa++.Noobstante,pesealostrabajosdesarrollados,sedebedilucidarelmecanismoa travésdel cual un intercambia-dorelectroneutralparaelCl-podríaoperarbajogradientesquímicosdesfavorablesatravésdelamembranaapical. Unaposibleexplicaciónpodríaserqueelantiporteestéconducidoporun gradiente químico favorable para la base(HCO3

-). Claro está que la concentración deCl- intracelular es de 40mmol L-1, y ademáslaconcentraciónintracelulardeHCO3

-(2mmolL-1) es insuficiente para superar el gradientedesfavorabledelCl-52.Esimportantenotarquelaactividad intracelulardelCl-puedesersig-nificativamentemásbajaquelaconcentraciónmedida.Además,laconcentracióndeCl- en la capalímitedeaguaqueestájuntoalepitelionohasidobiendeterminada.

SiseconsideralaconcentracióndeCl-yHCO3- tantoenelaguacomoenelinteriordelacélula,sepensaríaenqueunantiporteCl−/HCO3

− no seríaoperacional.PorestarazónTresguerreset al53,proponenunnuevomodeloparalatomadeCl-queincluyeunantiporteaniónicoapical(AE),funcionalmenteunidoalaanhidrasacarbónica(AC)yaltrabajodeunaV-ATPasaenlamem-branabasolateralconectadaalsistematubular,la cual provee la suficiente fuerza conductoraparavencerelgradientedesfavorableparaelin-flujodeCl-.Losautoreshandenominadoaestearreglo como “metabolon”, definido como uncomplejo de enzimasmetabólicas o cualquiergrupoproteicoqueactúansiempreefectuandounafunciónmetabólicaparticular.Suimportan-ciametabólica, es debida a la unión estrechaentreenzimasquepermiteelrápidomovimientodemetabolitosdeunsitioactivoaotro,loqueesconocido comocanalización de sustratos. Lasventajasdeestearregloson limitar lapérdidade ionesometabolitospordifusiónycrearungrupoespecíficodesustratosaaltasconcentra-ciones.EstemodeloqueresultadelaunióndeAE,ACyV-ATPasapodríacrearconcentracio-nesdeHCO3

-losuficientementeelevadasparaconducirlatomadeCl-delaguavíaAE.

Estudiosdehibridizaciónin situdemostraronlapresenciadeunARNmensajero(mARN)espe-

cíficoparaelantiporteCl−/HCO3−enbranquias

detrucha.Laseñaldelahibridizaciónfuemásabundanteen las regiones interlamelares.Es-tasregionescontienenlamásaltadensidaddecélulas de cloro y, además, durante alcalosismetabólica la cantidad delmARN, incrementómarcadamente54, locualesconsistentecon loreportadoporPerryet al55,Elmodeloqueindi-calasalidadelCl-delcitosolalcompartimientoextracelularpuedeserpresumiblementea tra-vésdeuncanalbasolateraldeCl-56;queimplicaademásunantiporteelectroneutralCl−/HCO3

−yelaniónbicarbonatoessuplidopor lahidrata-cióndeCO2 en presencia de anhidrasa carbó-nica(CA),quepasapordifusiónatravésdelamembranabasolateralalespaciointracelular57.Esprecisoanotarqueel transportedelCl- del citosolhacialasangrenoestáaúnestablecido,exceptoparaelmodelodelmetabolón.

Lafigura3resumelosposiblescaminosparaeltransporte de Na+,Cl-yCa++enunmodelodeintercambioenunacélulaβdecloro(MRC)yenunacéluladelpavimento(PVC).

Por lo anterior el papel de los antiportes o de NHCnopuedeserdescartado,dados losva-ciospordilucidarenlosprocesosdetransporteointercambioiónico.

Regulación ácido-base.

Al igual que en otros vertebrados, los pecespuedenmantenersuhomeostasisdelpHintrayextracelular.Comoenmamíferos,lospecesutilizan estrategias paralelas de excreción ysistemasbuffer,quecontrolan lasvariacionesintra y extracelulares del pH59. Los procesosmetabólicos celulares están constantementegenerando compuestos ácidos, con la libera-cióndeH+e indirectamente laproduccióndeCO2.Almismotiempo,elCO2puedeviraryserconvertidoenH+yHCO3

-.EsteprocesoenlaprácticasepuedesimplificarenlareaccióndeequilibrioCO2+H2O↔H++HCO3

-60.Bajocier-tascondicioneslasbranquias,elintestinoylosriñonesparticipandelintercambioácido-base,peroesaceptadoqueelepiteliobranquialesdonde ocurre lamayoría de losmovimientosácido-base(90%omás)61.

SegúnRandallyTsui62,latransferenciaácido-base a través del epitelio branquial es domi-nadaporlaexcrecióndegascarbónico(CO2)


Figura 3. Esquema donde las líneas sólidas indican transportes activos; líneas punteadas indican difusión o intercambio a través de canales de membrana o a través de la célula.

Bombas de H+-ATPasa están representadas con círculos sólidos; cotransportadores (anti-portes) por círculos abiertos y canales iónicos por líneas paralelas. Anhidrasa carbónica y sus productos están presentes en ambas células, pero estas características son excluidas. En las células MR una V-ATPasa presente en la membrana apical (típicamente con micro-vellosidades) genera un gradiente electroquímico favorable para la difusión pasiva (toma

o infl ujo) de Na+ a través de un canal epitelial para el Na+, acidifi cando el medio de la capa límite entre el agua y el epitelio branquial. En la membrana apical un intercambiador Cl-/

HCO3- (tipo 3), el HCO3

-, posiblemente aprovechando su baja concentración en la capa lími-te, conduzca Cl- al interior de la célula, saliendo vía canal aniónico (tipo NBC) o canal anió-nico específi co. La toma de Na+ se completa por intermedio de una Na+-K+-ATPasa ubicada en la membrana basolateral. El K+, es bombeado al interior de la célula vía Na+-K+-ATPasa y reciclado a través de un canal específi co para él en la membrana basolateral. La toma de Ca++, se hace a través de canales apicales y en la membrana basolateral por intermedio de Ca++-ATPasa o por un antiporte Na+/Ca++. El intercambio de Na+/H+ en la membrana baso-lateral previene la acidifi cación del citosol. Entre las células están bien desarrolladas las uniones estrechas que impiden o minimizan la pérdida de iones por difusión a través de canales paracelulares. La línea punteada que forma una burbuja, podría ser un microam-

biente propicio para mantener la regulación ácido-base. Adaptado de Marshall58.

y amonio (NH3), pero especialmente por elprimero,debidoaqueésteseexcretaenma-yores cantidades en comparación con el se-gundo.ElamonioexcretadoporlasbranquiasincrementaelpHy,porelcontrario,elCO2 lo disminuye.Estarelacióntieneunagranimpor-tanciaenelaumentodelaexcrecióndeNH3,debidoalatrapamientodeH+porpartedelNH3 paraformarNH4

+(menostóxico),perolaforma

deexcreciónquepredominaesladifusióndeNH3porsumayorpermeabilidad.Sinembargo,esposiblequelaproporcióndeNH4

+ excretado por difusión sea alrededor de un 2-3%.A suvez, elCO2 también puede ser excretado enforma deHCO3- a través de un intercambia-doraniónicoenlamembranaapicaldelabran-quia.Estaclasedeexcreciónesconsideradageneralmentepequeñaen relaciónalflujode


CO263.SegúnGossycolaboradores64 ,existe

unaestrecharelaciónentrelosmecanismosderegulacióniónicayelbalanceácido-basedebi-doaqueelCl-esremovidodelaguaenunin-tercambioporunabaseequivalente,elHCO3

-,mientrasqueelNa+esremovidodelaguaenun intercambio por un ácido equivalente, elH+. Sepuede indicarentoncesqueentenderdichosmecanismosprediceelcomportamientoácido-base.

Enresumen, losmecanismoscelularesymo-leculares involucrados en el balance ácido-baseson:1, los antiportes(intercambiadores)de la familiaNHE,principalmente losdel tipoIIy IIIquesontípicosde lamembranaapicalydeltipoIenlamembranabasolateral.Estosintercambiadores permiten la entrada deNa+ delaguaylasalidadeH+delmediointracelu-lar(IIyIII).LosdeltipoI,permitenlaentrada de Na+almediointracelulardesdeelplasma,acompañados con la salida de H+ del mediointracelularalplasma,segúntrabajosdeinmu-nolocalización que soportan estos datos65. 2. Canales apicales (epiteliales)deNa+ en rela-ciónconunabombadeprotones(H+-ATPasa/ENaC), concepción principalmente soportadaporel trabajodeAvella yBornancin,quienesindicanquelasalidadeorigeneléctricodeH+ pormediodeunaV-ATPasaen lamembranaapical generaunpotencial eléctriconegativo,elcualgenera la fuerzaconductorasuficienteparaelinflujodeNa+ desde el exterior a pesar del bajo gradiente electroquímico, por mediode canales apicales de Na+.3. Intercambiador o antiporte Cl-/HCO3

-, responsable del inter-cambioaniónicoenelepiteliobranquial.EstemodelofuesugeridoporMaetz,EnelmodelopropuestoporWrightet al66,sepuedeobservarcómoelmovimientodelCO2atravésdelepi-teliobranquialpuedemodificarelpHdelaguadelacapalímiteentrelamembranaapicaldelepitelioyelaguadelmedio,todomediadoporlaanhidrasacarbónicaqueactúanosóloden-trodelascélulaepiteliales,sinotambiénenlacapalímite67.

Excreción de Nitrógeno.

SegúnWood68,ladesaminacióndelexcesodeaminoácidosliberaesqueletosdecarbonoquepueden ser conducidos dentro de rutas me-tabólicas como la gluconeogénesis y el ciclodel ácido cítrico, para la obtencióndeácidos

grasos, cuerpos cetónicos y carbohidratos,proceso que conlleva a una gran producciónde amonio tóxico (NH3), que es excretado almedioprincipalmenteporvíabranquial.Enlospeceslamayorproduccióndeamoniotomalu-garenel hígado,aunqueenzimasasociadascon ladesaminacióndeaminoácidospuedenser encontradas en otros tejidos tales comomúsculo, intestino y riñón69. En solución, elamonioestádeterminadoporelequilibrioen-tresusdosformas:noionizado(NH3,tóxico)yionizado(NH4

+),siendoaltamentedependientedepH.Lareacciónindicaestarelación:NH4

+ + H2O↔NH3+H3O

+70.Ademásdelaexcreción,las concentraciones de amonio en el mediosepuedenincrementarpor ladegradacióndemateria orgánica presente en los sedimentosypuedeserespecialmentepronunciadacuan-dolanitrificaciónesimpedidacomoresultadode bajas concentraciones de oxígeno. Otrascondiciones que se suman a este aumentosonlasaltasdensidadesdesiembraylasac-tividadespropiasdelhombreensusprocesosagroindustriales71,72. Estas concentracioneselevadasy/ocrónicasdeamoniocausanda-ñosenelepiteliobranquial(hiperplasia,fusiónlamelar, hipertrofia, necrosis y descamación),interfiriendo en los procesos de intercambiogaseoso,regulacióniónicayregulaciónácido-base,loqueconllevaadesbalancesenlaho-meostasis,generandoepisodiosdeestrésquepuedenconduciralamuerte73.

Existen varias razones que han influido paraquelosmecanismosdetransportedeamonioatravésdelepiteliobranquialaúnpermanezcanen controversia. Entre ellos está la dificultadparamedirocontrolarlosgradientestransepi-telialesdelpH,presiónparcialdeNH3yNH4

+yelpotencialeléctricoquesegeneraentodoelpezoeneltejidoqueseestéestudiando.Lamayoríadelosdatosexperimentalessoportanprincipalmentetrescaminosparalaexcrecióndeamonio:1, DifusióndeNH3 y de NH4

+; 2, DifusióndeNH3 y atrapamiento y 3, Antiporte Na+/NH4

+.Noexisteunmecanismoexclusivo,ysucontribucióncuantitativaestádeterminadaporfactoresexternosdelaguacomosalinidad,pHycapacidadbuffer.

1. Difusión de NH3

Como se describió anteriormente, la mayorparte del amonio total que cruza el epitelio


branquial lo hace en forma de NH3, bajo ungradientededifusiónfavorableentrelasangreyelagua.Estemecanismoestásoportadoporlos siguientesargumentos:a) Ladisminución moderadadelpHexternoimplicaunacaídaenlaconcentracióndeNH3víaprotonación.Estogeneraunincrementoenlatasadeexcrecióndeamoniototal,locualesobservadoentruchaarco iris74, carpa75 y goldfish76. b) Según Ca-meronyHeisler77,entruchaarcoirisel incre-mentoenelpHexternodelmedioincrementalaconcentracióndeNH3 en el exterior debido a lapobredisponibilidaddeH+enelmedioparaconjugarseyformarNH4

+,locualinfluyeenladisminucióndelatasadeflujodeamoniototalyc),elmismoautor,usando inyeccionesconNH4Clo(NH4)2SO4(clorurodeamonioosulfatodeamonio)entruchaarco irisyenbagredelcanal78(chanelcatfish),causanunincrementoinicialenlaexcrecióndeamoniototal, locualfavorecelareddeexcreciónácidaysugiriendoquealmenosalgodelainfusiónosoluciónin-yectadadeamonioionizadosedisociaycruzalasbranquiascomoNH3.LadifusióndeNH4

+ es probablementemínimaenpecesdeaguadul-ce,debidoasubajapermeabilidadconrespectoalepiteliobranquial,peroKarnaky79,indicaquefactores hormonales podrían estar implicadosmodificando lapermeabilidadde lamembranaapical para que el NH4

+ pase a través de lasuniones estrechas entre las células epiteliales(caminos paracelulares). En este sentido sesabe que la acción de la prolactina reduce lapermeabilidaddelepiteliobranquialalosionesyalagua,peronadasesabedesuacciónfrentealapermeabilidadbranquialparaelNH4

+80.

2. Difusión de NH3 y atrapamiento

Teóricamente,sostener ladifusióndeNH3 de-penderíade la remociónconstantedeNH3 de lacapa límitedebidoaque laacumulacióndeNH3enestacapapodríareducirlapresiónpar-cialdelgradientededifusión(pNH3).Paraestoexistendosvíasderemoción:una,físicamenteatravésdedifusióncontinuadadelflujoquevie-nedelasbranquiashacialacapalímiteylue-go al agua delmedio y, la otra, por remociónquímicauniéndose(atrapamiento)coneliónH+ para formar NH4

+ en la capa límite.MantenerlosgradientesdedifusióndeNH3 a travésdelabranquiapodríadependerdeladisponibilidadde ionesH+en la capa límite, lo cual facilita-ría tal conversiónoatrapamiento. Unposible

papeldelaanhidrasacarbónicaseríaservirdecatalizadorparalaconversióndeCO2 excretado comoHCO3

-+H+enlacapalímite,procesoquesupliríalosionesH+paraelatrapamiento81

3. Antiporte Na+/NH4+.

En estemodelo, el influjo deNa+ a través delamembranaapicalen labranquiaesunidoala salidadeNH4

+, el cual reemplazael iónH+ enelantiporteelectroneutralNa+/H+.Estahipó-tesisfueformuladaapartirdeobservacionesatravésdelaadicióndeamiloridaconremocióndel Na+delaguaexternaeinyeccionesdesalesde amonio. La primera implica una reduccióndelatasadeexcrecióndeamonioylasegun-daincrementalaabsorcióndeNa+82.Wilson et al83, quienes trabajaronen truchaarco iris, noencontraron evidencia directa de un intercam-biador Na+/NH4+aplicandolamismametodolo-gíadeMaetz.Ampliamentedebatidosporvariosautores,indicanqueelantiporteNa+/NH4

+ nece-sitaríaserenergizadoparapoderfuncionar,de-bido a los gradientes bajos del Na+ en el exterior con respecto a su concentración interna, queimposibilitarían si influjo84,85,86.Estas afirmacio-nesreafirmanelmodelopresentadoporAvellayBornancin87quienesdescartanelantiporte(almenosparapecesdeaguadulce)yexplicanlaentrada de Na+atravésdeuncanalepitelialenrelaciónconunaV-ATPasa.Wilkie88indicaqueestemodeloescasiespecíficoparapecesmari-nosyque,bajociertascircunstancias,enpecesdeaguadulceelNH4+podríacompetirconelNa+oconelK+ de la Na+-K+ATPasaoconelan-tiporte Na+/2Cl-/K+delamembranabasolateral.Aunqueelretoparafuturasinvestigacionesse-ríaidentificarunapotencialNa+/NH4+-ATPasaenlamembranabasolateral.

Concluyendo, bajo condiciones normales, elCO2 excretado a través de las branquias eshidratadoen la capa límiteoenel citosoldela célulabranquial (céluladecloro),para for-marH+yHCO3

-;además,elH+generado,tantodelahidratacióndelCO2ypormediodelaV-ATPasa,acidifican lacapa límite.Estaacidifi-caciónimplicaelatrapamientodelNH3aNH4

+,quepermite ladifusiónpasivademásNH3 a travésde lamembranabranquial (incrementode gradientes de presión parcial favorablespara pNH3, entre el citosol y la capa límite).Estos gradientes son conservados aún bajo condiciones ambientales elevadas de pH y


amonio.Elamonioqueentrapordifusiónpa-sivaalabranquiapodríaestarrelacionadoconun única Na+/NH4

+-ATPasa desde el plasmaa través de la membrana basolateral. El po-sible papel de poros acuosos (acuaporinas)ysuparticipaciónenel transportede ionesymetabolitos en la membrana apical aún está

por resolverse,peroellospodríanestar impli-cadosenladifusiónpasivadelNH3

89 teniendo presentequeenlageneralidadqueelNH3 es capazdeatravesarlasmembranasbiológicas,debidoasuapolaridad.Lafigura4resumelasposiblesvíasdeexcrecióndeamonioaniveldelepiteliobranquial.

Figura 4. 1.Difusión de NH3. 2. Atrapamiento de H+ para formar NH4+. 3.

Antiporte Na+/NH4+. 4. Difusión de NH4

+. Adapatada de: Maetz89; Maetz90, Cameron & Kormanik91 (1982); Wright92 et al., Cameron & Heisler93;

Calirborne & Heisler94; Avella & Bornancini95; Lin & Randall96 Wood97 Perry98; Wilkie99 et al., Wilson100 et al., Wilkie101; Evans et al102

Excreción de amonio bajo condiciones anormales Según varios autores, los peces tienen res-puestas que están directamente asociadascon la concentración de amonio en elmedioexterno,a lacantidadycalidadde ladieta,alos periodos de ayuno y a factores fisicoquí-micosentre loscualessedestacaelpH.Lostipos de respuestas van desde la conversióndeamonioasustanciasmenostóxicas,comoglutamina103y urea104; incremento de enzimasespecíficas para la disponibilidad de amino-ácidos105 (GDH Glutamina deshidrogenasa yAATalaninaaminotransferasa)y la reducciónen laproduccióndeamonio; volatilizacióndeamonioenlaformaNH3

106,excreciónactivadeionesdeamonioymantenimientohastadon-delesesposibledelascondicionesdeacidezen la capa límite107, además de modificar lamorfologíadelascélulasqueparticipanenlosintercambiosiónicosenelepiteliobranquial108

(célulasdecloroycélulasdelpavimento).Esde anotar que muchas de estas respuestasestánligadasconlasvariacionesácido-baseyconelintercambioiónico.Cuandoestosmeca-nismosnofuncionan,elpezseenfrentaaunaseriedeacontecimientosquepuedenbloqueartodoslostransportadoresasociados,crearundesbalanceiónicoyácido-base,perderlaho-meostasisyconducirloalamuerte.

SegúnBaldisserotto109,lainfluenciadelpHáci-doenlosmecanismosdetransporteiónicoenel epitelio branquial se traduce posiblementeenbloqueodelabombadeprotones,impidien-do la entrada de Na+ ya sea por los canalesapicales o por el antiporte Na+/NH4

+, causan-doacidosismetabólicaal interiorde lacélulay acumulacióndeNH4

+. Si estas condicionessemantienen,elpezperderíasuhomeostasisymoriría.Porelcontrario,sielpHesalcalino,elsistemadeatrapamientodeNH3severíase-riamenteafectadoy,enestacircunstancia,elamonionopodríaserexcretadoyseríaacumu-


ladoenlacélula.OtrosistemaafectadoseríaelantiporteCl-/HCO3

-,causandoalcalosisme-tabólicaypotencializandolatoxicidaddelamo-nioalinteriordelacélula.

Sepuedeconcluirqueelepiteliobranquialpo-seeunaseriedemecanismosparatransportarlos iones de Na+yCl-,losqueasuvezestánin-volucradosenlaexcrecióndeionesdeamonioy equivalentes ácido – base. Desafortunada-mentelacomplejaestructuradelasbranquiasnohapermitidoaclarardemaneracontunden-te los diferentesmodelos propuestos para eltransporte iónico, teniendo en cuenta que eltransporte iónico en peces de aguadulce in-volucra varios tipos celulares y que elmediodulceacuícolavaríaampliamenteensucompo-sición (lossistemasdeaguadulceson todostemporales), loquehaceque laconfirmacióncientíficaenlaboratorioseamásdifícil.Desdehacetresdécadaslacombinacióndeestudiosin vivo,combinadosconaproximaciones inte-gralesusandotécnicascelulares,bioquímicas,inmunológicasymoleculares,hanincrementa-do substancialmente el entendimiento de losmecanismosbranquialesbajoloscualessedalaregulaciónácido–baseenpeces.

Estepanoramaindicaentoncesqueexisteuncampototalmenteinexploradosobrelosmeca-nismos quemantienen la homeostasis en lospecesyquelostrabajosparanuestrasespeciesestán aún por realizarse. Las nuevas herra-mientasmolecularespodríanayudaraelucidarlacontribucióndevariosprocesosdetransportedemembranaalaregulacióndelbalanceácido–base,altransporteiónicoyalaexcrecióndemetabolitosasociadosconestosprocesos.En-tre losretosquedamantener lahabilidadparaintegrar lasdiferentesdisciplinasparaobtenerunaimagenclaradecómofuncionanlasbran-quiasdelospecesycómotalesprocesosdeter-minanelbienestardeestosanimales.

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Artículo de Revisión Transporte iónico en el epitelio ... · de los niveles de excreción de...

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