Arquitectura Celular y Arquitectura Molecular

como nuevos paradígmas en nutrición vegetal del

Aguacate

(Persea americana Mill, variedad Hass ) Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas

Abstract

Según el Modelo Bioquimico Lightbourn, la eficiencia y eficacia en la asimilación de los nutrientes aportados por las moléculas usadas para alimentar las plantas responde directamente a su arquitectura femtológica, la cual es determinada y determinante por la arquitectura nanológica de la membrana celular.

2

IntroducciónEl desarrollo de medios matemáticos para penetrar en Espacios de Riemann permite conocer los niveles enantiomórficos y las distribuciones energéticas de enlace para diseñar moléculas específicas que tengan como característica fundamental su acoplamiento transitivo a través de los canales iónicos de la membrana celular, lo que marca una nueva era en el diseño de moléculas que no solo penetren eficientemente por las capas fosfolipídicas de las membranas celulares sino que además sinergicen en tiempo y forma con rutas metabólicas especifícas que son las responsables directas del metabolismo primario y secundario.

3

DesarrolloTeniendo como base las perspectivas topológicas de la Ingeniería Metabólica Lightbourn y los balances energéticos entrópico-entálpicos de los procesos anabólicos, podemos hacer la enantiomorfía propia para que las moléculas que aporten tanto nutrientes estructurales como funcionales tengan la topología idónea de acuerdo a los fenómenos de transferencia de calor y al determinar las energías libres y los moméntums específicos para cada isomería geométrica de las rutas metabólicas intraestructurales de acoplamiento e impulso, podemos optimizar la transferencia de energía intracelular, tanto en moméntum de masa como de polaridad y polarizabilidad de enlaces sinérgicos. Esto es en pocas palabras diseñar moléculas específicas de acuerdo a la estructura de la membrana celular. Este Nuevo paradígma marca un salto cuántico con respecto a lo tradicional que se maneja en la alimentación de las plantas en cuanto a las formas salinas de aporte de nutriente, las cuales no son diseñadas en base a sus funciones homológicas y cohomológicas, sino simplemente se manipulan para hacerlas mas “solubles” en agua, sin importar la enantiomorfía específica que las hará penetrar o no a la célula. Éste es hasta hoy día el estado actual de la nutrición tradicional.

4

Pasos fundamentales del diseño arquitectónico Nano - Femto

5

Trazabilidad Exo- Endógena del Nutriente

Producción de la Molécula

Diseño de la Molécula

Ingeniería Metabólica

Consideraciones Termodinámicas y Estereoquímicas

Estudio Topológico de la Membrana Celular

Economía: Energética, de Recursos y de Bajo Impacto Ambiental

Resultados Confiablemente Cuantificables

Resultados Precisamente Proyectables

Programa de Nutrición Ad Hoc

Glycobiología Correlacional

Una Nueva Forma de Interpretar los Análisis de Suelo, Agua y Planta

Lipogénesis y Síntesis de Lípidos Complejos

6

Características del mesocarpio del fruto del Aguacate (Persea americana Mill.)

Mesocarpio

Contenido de lípidos (hasta un 30% de la pulpa)

Diferenciación de carbohidratos

La formación de lípidos depende:

Carbohidratos → acetato → ácidos grasos

ácidos grasos + glicerol = lípidos complejos

7

Esquema para la conversión de los hidratos de carbono a los lípidos complejos por los cortes de tejido del mesocarpio de la fruta del aguacate Hass en desarrollo.

G-6-P 6PGA CO₂NADPH NADPH

Pentosa fosfatoF-6-PPiATP

F-1 , 6-P

T-3-PDHAPGlicerolATP

Glicerol-PNADPH NADH

3-PGA

PEPATP

OAANADH

MalatoPiruvato

CO₂

NADPH

CitratoAcetilo-CoA

Isocitrato

NADPH

CO₂

A-Cetoglutarato

CO₂Succinato

Fumarato

MalatoOAA

Ácido de grasaNADPH

CO₂CO₂

Glucosa

Monoglicerol

Diglicerol

Triglicerol

Ácido lisofosfatídico

Ácido fosfático

Ácidos grasos- CoA

Sin embargo se carece de información acerca de la lipogénesis del fruto del aguacate

Fuentes de: Glicerol Acetil CoA NADPH

Y su relación con la síntesis de

Triglicéridos

Glicolípidos

FosofolípidosÁcido graso

Grupo fosfato

Glicerol

Serina

Carbohidrato

GlicerolÁcido graso

Síntesis de glicéridos en aguacate

Glicerol -3-fosfato Ácido lisofosfatídico Ácido fosfatídico

Diacilglicerol

Triglicerol

Microsomas aislados del mesocarpio de aguacate parecen sintetizar glicéridos vía una ruta similar a la del sistema de tejido animal, llamada ruta Kennedy

Ruta Kennedy

←Fracción mitocondrial

Microsoma →

Centrifugación a 10 000 g

La adición de la fracción de sobrenadante a la fracción mitocondrial tiene un poco de efecto en la incorporación de glicerol a lípidos

Antecedentes

Barron and Stumpf (1962)

Síntesis de los tiglicéridos: Glicerofosfato → Fosfolípidos → Monoglicéridos → Diglicéridos → TriglicéridosSeñalaron que el origen de los monoglicéridos permanecía en cuestión , a pesar de que concluyeron que los monoglicéridos podrían surgir del ácido lisofosfatídico por una remoción hidrolítica de un fosfato inorgánico.

Bradbeer and Stumpf (1960)

Encontraron que la mitocondria del maní incorporó P32 de ATP32

predominantemente en ácido fosfatídico junto con una pequeña incorporación en fosfatidil etanolamina. Esta incorporación no involucró glicerofosfato como intermediario pero resultó de una fosforilación de 1,2-diglicérido por ATP. Este diglicérido fosfoquinasa también fosforilado 1-monoglicéridopara producir ácido lisofosfatídico.

11

Papel del ácido fosfatídico en la síntesis de fosfolípidos y triglicéridos

Existen 2 principales rutas por las cuales el ácido fosfatídico es matabolizado en los organismos vivos:

1. La formación de CDP-diglicéridos por interacción con CTP

2. La remoción hidrolítica de una fosfato inorgánico con la formación de diglicéridos, un precursor común de triglicéridos y fosfolípidos

Brades and Shapiro (1967)

Reportaron que el ácido fosfatídico fosfatasa fue inhibida por palmitol CoA. Esta inhibición es competitiva con respecto al ácido fosfatídico.

Cheniae (1965)

Examinaron la incorporación de glicerofosfato en lípidos con el extracto de microsomas de espinacas. Los estudios cinéticos de los productos indicaron que el ácido fosfatídico fue un precursor para triglicéridos. Y que la ocurrencia de monoglicéridos resultó de otro fosfolípido , probablemente ácido lisofosfatídico.

12

Se utilizaron frutos de Persea americana MILL. Variedad Hass

Corte y selección del tejido de mesocarpio

de cada fruto

Infiltración del tejido con sustrato radioactivo en

buffer de bicarbonato de potasio 0.05 M

Enjuague de las piezas con buffer de

bicarbonato de potasio no

radioactivo

Secado con papel filtro

Las piezas se colocaron sobre una red de acero inoxidable con una tela

de queso encima dentro de un frasco a 25 °C

Hackett (1953)

Infiltración al vacío de glucosa o acetato

13

Aislamiento de lípidosCromatografía de gases

QuímicosAcetato-1-C14, Glucosa-1-C14,Glucosa-6-

C14, Glucosa-U-C14, CoA, ATP, NAD, NADP

Estimación de la participación vía catabólica

100 cortes de tejido de mesocarpio infiltrados con

Glucosa-1-C14 y/o Glucosa 6-C14 específicamente marcadas

Estimación de la proporción Acil-C14 y glicerol C14

Acidificación y separación de la mitad del glicerol acuosos y la

mitad del acil

Preparación de las partículas citoplámicas

Homogenización con sucrosa 0.4 M y centrifugaciones

Ensayos con enzimasNADPH con actividad dehidrogenasa dependiente

NADPH con actividad ácido graso sintetasa dehidrogenasa dependiente

Determinación de proteínaDigestión con Micro-Kjeldahl

Determinación de radioactividad

Contador de impulsos Compumatic II

Estrategia Experimental

Porcentaje de incorporación de la glucosa uniformemente marcada en dioxido de carbono

respirable, lípidos y ácidos solubles por los cortes de tejido del fruto de aguacate Hass

Aproximadamente el 50 % del total de los carbonos marcados fueron acumulados en lípidos y el 30 % de esto fue en dióxido de carbono respiratorio después de 6 h de incubación. Los residuos fueron en alcohol soluble y fracciones insolubles.

Ácidos solubles

Glucosa

Lípidos

CO2

1 2 3 4 5 6Tiempo (horas)

10

20

30

40

50

60

0

Porc

enta

je d

e di

stri

buci

ón d

el C

14

15

Cambios en la distribución del marcaje en lípidos sintetizados a partir de glucosa-U-C14 y la relación

acilo graso/glicerilo

Del total de los carbonos marcados: 4 % estuvo en la fracción glicerilo46 % estuvo en la fracción acilo graso

La relación acilo graso-C14 a glicerilo-C14 fue inicialmente baja, pero más tarde incrementó arriba de 11.3 donde la glucosa-U-C14 fue utilizada

El valor de 11.3 muestra el completo marcaje de diglicérido o ácido fosfatídico que aparece en los cortes de tejido donde la relación falla mostrando su máxima expectación de 17 incluso después de las 16 h de incubación

10

20

30

40

Porc

enta

je d

e di

stri

buci

ón d

el C

14

1 2 3 4 5 6Tiempo (horas)

0 0

2

4

6

8

10

12

Proporción de acilo graso-C14/G

licerilo-C14

Proporción

Glicerilo-C14

Acilo graso-C14

16

Distribución de marcaje en lípidos sintetizados a partir de glucosa marcada uniformemente por las piezas de tejido de aguacate Hass

después de 4 h de incubación

Lípidos Distribución %

Proporción de acilo graso/glicerilo

Observado Teórico

Triglicérido 45.6 15.9 16.0-18.0

Diglicérido 14.1 11.7 10.7-12.0

Monoglicérido 12.1 5.8 5.3-6.0

Glicolípido 12.1 8.2 2.2-4.0

Ácido fosfatídico 4.3 3.1 10.7-12.0

Fosfatidil glicerol 1.9 1.5 5.3-6.0

Fosfatidil etanolamina 1.8 6.7 9.4-7.2

Fosfatidil inositol 0.7 1.9 3.5-4.2

Fosfatidil colina 7.4 10 4.6-4.5

Los radios para lípidos neutrales están relacionados a los valores teóricos pero aquellos para fosfolípidos indican la multiplicidad de su metabolismo

17

La evolución de C14O2 de la glucosa-1-C14 y glucosa-6-C14 indican la participación de la ruta pentosa fosfato oxidativa en los cortes de tejido.

Sin embargo, la proporción C-1 y C-6 no pueden aproximar una medida de la participación de la ruta pentosa fosfato en el tejido de manera que la síntesis de lípidos fue de mayor interés en el metabolismo del tejido.

Incorporación de la glucosa-1-C14 específicamente marcada y la glucosa-6-C14 de igual radioactividad específica por los

cortes de tejido de aguacate Hass

Glucosa-1-C14 Glucosa-6-C14

CO2

Ácido graso

Ácido graso

Ácido soluble

CO2

Glicerol

Glicerol

Ácido soluble

Inco

rpor

acio

n de

C14

, cm

p/g

FW

2,000

1,000

0 30 60 120 240 30 60 120 240

Tiempo (min)

3,000

18

Niveles relativos de actividad de la enzima en el mesocarpio de aguacate

Actividad total

Requerimiento

Experimento I: fracción particulada

Enzima málica 65 NADP+, Mn++

NADPH: glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 140 NADP+, Mn++

NADPH: isocitrato deshidrogenasa 220 NADP+, Mn++

NADH : isocitrato deshidrogenasa 130 NAD+, Mn++

Experimento II: sobrenadante

Enzima málica 1,425 NADP+, Mn++

NADPH: glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 3,337 NADP+, ?

NADPH: isocitrato deshidrogenasa 3,600 NADP+, ?

NADH : isocitrato deshidrogenasa 0

Experimento III: NADPH: isocitrato deshidrogenasa

Sobrenadante después de 10 000 g 4,300 NADP+, ?

Sobrenadante después de lavado 218 NADP+, Mn++

Fracción particulada después de lavado 84 NADP+, Mn++

19

Participación relativa de los niveles de actividad enzimática que ayudan a la asimilación de acetato por el sistema particulado

aislado del mesocarpio del futo del aguacate

Incorporación de acetato

Sustrato Lípidos cpm Ácidos solubles en agua cpm

Experimento I

Isocitrato 2,054 3,489

Malato 1,608 4,114

Glucosa-6-fosfato 1,582 4,560

Ninguno - 6,300

Experimento II

Isocitrato 2,249 4,876

Malato 1,716 5,529

Glucosa-6-fosfato 1,578 5,036

Ninguno 701 7,400

20

El marcaje de la glucosa-6-C14 fue metabolizado por formas de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa y de la ruta glicolítica sin pérdida del marcaje, y podría llegar a ser eventualmente un equilibrio entre las 2 triosas, las cuales mostraron un estado de incorporación estable del marcaje en la fracción lípídica de los cortes de tejido.

Incorporación de la glucosa-6-C14 en los ácidos grasos de clases de lípidos por los cortes de tejido del fruto del aguacate

Inco

rpor

acio

n de

C14

, cm

p/g

FW

Tiempo (min)

21

La proporción de acilo graso-C14 a glicerilo-C14 de las clases de lípidos ha sido trazado contra el tiempo de incubación. Este valor indica la síntesis de novo de los lípidos complejos

Cambios en las proporciones de acilo graso-C14/glicerilo-C14 de glucosa-6-C14 por los cortes de tejido del mesocarpio del fruto

del aguacate

Tiempo (min)

Prop

orci

ón d

e ac

ilo g

raso

-C14

/glic

erilo

-C14

22

La radioactividad específica de las fracciones de acilo graso en las clases de lípidos indican que todas las fracciones de fosfolípidos son diluidas en tiempo por los ácidos grasos no marcados

Radioactividad específica de los ácidos grasos en clases de lípidos sintetizados de glucosa-6-C14 por los cortes de tejido

del fruto del aguacate Hass

Tiempo (min)

Radi

oacti

vida

d es

pecí

fica

cpm

/mm

ol á

cido

gra

so

23

De la observación de los 3 gráficos anteriores se puede considerar las siguientes posibilidades

1. Hay un lisofosfolípido metabólicamente lábil

2. Se produjo una acilación directa de lisofosfolípido

3. Las fracciones de acilo graso fueron intercambiadas con los otros fosfolípidos que no habían sido marcados y viceversa

4. Se produjo una síntesis de novo de fosfolípidos. La multiplicidad en la formación de fosfolípidos puede ser debido a la incorporación de un ácido graso diferente en la posición específica de cada tipo de fosfolípidos

24

• Análisis de la composición normal de ácidos grasos de lípidos

• Porcentaje de distribución de los ácidos grasos marcados en las clases de lípidos complejos y su composición normal de ácidos grasos

• La radioactividad específica de los ácidos grasos en clases de lípidos sintetizados a partir de Glucosa-6-C14

Estos estudios mostraron que los ácidos palmitoléico, linoléico, linolénico y araquídico fueron los ácidos grasos menos marcados entre los examinados.

Por otro lado, los ácidos palmítico y oléico en monoglicérido, diglicérido y ácido fosfatídico fueron rápidamente marcados.

El ácido esteárico fue sintetizado casi tan rápido como los ácidos palmítico y oléico después de la infiltración al vacío del acetato, debido a la anaerobiosis.

Estudios en el tiempo de la síntesis de ácidos grasos a partir de acetato-1-C14

25

La transformación de NADH a NADPH en un sistema biológico dado permanece aún

incierta, a pesar de que NADH es equivalente a NADPH sobre la base de energéticos

biológicos, en que la transformación de NADH a NADPH por la mitocondria requiere

ATP. La síntesis de ácidos grasos por un sistema mitocondrial, el 50 % del total de

NADPH requerido puede ser remplazado por NADH.

Contrario al sistema mitocondrial, la síntesis de ácidos grasos, especialmente la

síntesis de ácido palmítico en aguacate, parece ser el más apropiado del sistema de

la enzima soluble y toma una ruta avidina sensible. Así el sistema de generación

de NADPH es importante para elucidar el proceso metabólico de lipogénesis

en la fracción soluble en el tejido de mesocarpio del aguacate.

26

La participación de 3 sistemas de generación de NADPH se predijeron de los experimentos in vitro

1. NADPH: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

2. NADPH: isocitrato deshidrogenasa

3. Enzima málica o NADPH: malato deshidrogenasa

Todos ellos facilitan NADPH para la síntesis de lípidos del aguacate. Es evidente que el metabolismo de los ácidos orgánicos en el tejido también regulan la

lipogénesis en plantas

27

En plantas, la tasa de utilización de NADPH es un factor primario para el control de la participación de la ruta de

la pentosa fosfato oxidativa

La liberación de C14O2 de glucosa-1-C14 y glucosa-6-C14 indica la presencia de

la ruta de la pentosa fosfato oxidativa en los cortes de tejido

Desde que el marcaje de C-1 de la glucosa fue incorporado en los lípidos del

fruto del aguacate, el uso de la relación glucosa-1-C14/glucosa-6-C14 errónea

como una medida de la participación de esta ruta

28

La relativa participación de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa apoyando la síntesis de lípidos

como un donador de NADPH puede ser estimada de la siguiente manera:1. Un mol de C14O2 producido por la vía de la descarboxilación de 6-

fosfogluconato (G1(CO2) – G6(CO2)) puede proveer 2 moles de NADPH los cuales pueden ser equilibrados para la asimilación de un mol de acetil CoA en ácido graso.

2. El total de ácidos grasos sintetizados durante el período podría ser la cantidad total de C14 encontrada en las fracciones acilo graso de C-1 y C6 de glucosa .

La relativa participación de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa apoyando la síntesis de lípidos (GNADPH) se define como:

GNADPH =

1 02 6 2

1 6

C CO

acilo acilo

G G

G G

29

Posible proceso de conversión de carbohidratos a lípidos complejos en el fruto de aguacate en

desarrollo

El 50 % de la glucosa metabolizada se acumula en lípidos cuya síntesis

puede ser regulada por la disponibilidad de glicerofosfato, en los cuales un

acilo graso CoA se acumula. De esta manera, el ácido fosfatídico formado a

partir de glucosa por los cortes de tejido, actúa como un precursor para

triglicéridos y fosfolípidos en plantas.

Es conveniente discutir la síntesis de triglicéridos y fosfolípidos juntos

porque su síntesis está estrechamente relacionada a través de un

intermediario común, D-α, β-diglicérido y L-α, β-ácido fosfatídico.

30

La síntesis de ácido oléico en aguacate fue un modo predominante de acumulación de lípidos durante el desarrollo del fruto, y el fruto almacenó exclusivamente triglicéridos.

Desde que la concentración de ácido palmítico y ácidos grasos insaturados en los triglicéridos y monoglicéridos indicaron la relación precursor-producto, esto sugiere que los triglicéridos fueron sintetizados de monoglicéridos con la incorporación de un ácido graso insaturado.

Mientras que el ácido graso en diglicéridos, ácido fosfatídico y otros fosfolípidos fue altamente insaturado, es dificil sugerir una ruta de monoglicéridos.

31

Resumen

Estudios sobre el metabolismo de los lípidos relativo a la lipogenésis a partir de glucosa y la síntesis de lípidos complejos en el fruto de aguacate, Persea americana Mill., fue realizado para elucidar la rutas de degradación de la glucosa seguido por la síntesis de fosfolípidos y triglicéridos.

En los cortes de tejido de mesocarpio del fruto de aguacate en desarrollo, en el cual predominó la acumulación de lípidos, aproximadamente el 50 % del total de la glucosa aplicada fue convertido a lípidos, donde el 83.9 % de los lípidos marcados fueron los lípidos neutrales.

Se determinó la participación de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa, aproximadamente el 30 % de la glucosa metabolizada por la rutas catabólicas fue directamente oxidada para liberar dióxido de carbono y proveer el 50 % del total del poder reductor responsable de la síntesis de ácidos grasos.

32

Mientras que el C-1 de glucosa se incorporó en las fracciones de glicerilo, el C-6 de glucosa se incorporó en las fracciones de acilo graso de lípidos complejos en los cortes de tejido del fruto de aguacate en desarrollo.

El NADPH producido por la enzima málica y el isocitrato deshidrogenasa soluble podría también participar en la síntesis de ácidos grasos por el sistema aislado del mesocarpio.

Las conclusiones de la síntesis de lípidos de que puede haber 2 rutas de ácido lisofosfatídico, vía ácido fosfatídico a diglicérido y fosfolípido, y vía monoglicérido a triglicérido por la esterificación de ácidos grasos insaturados , estuvieron basadas en el análisis de experimentos trazados con glucosa-C14 y acetato-C14 por los cortes de tejido de mesocarpio del fruto de aguacate.

Resumen

33

Metabolismo de la glucosa en relación a la síntesis de lípidos en frutos de Persea

amaricana

34

Materiales y métodos

Aguacate Persea americana,

Almacenado a 5 °C por 24 h

Material de la Planta

1Cortes de 10.4 mm de diámetro por 1 mm de

espesor del mesocarpio del aguacate

Preparación de Muestra

2Infiltración de los

cortes con glucosa marcada

con 14C

Marcaje con 14C3

Concentración de CO2

Extracción de lípidos con cloroformo-

metanol

Determinaciones4

Análisis de la actividad enzimática durante la

síntesis de lípidos

Partículas Citoplasmáticas

5

35

Porcentaje de incorporación de glucosa marcada en dióxido de carbono respiratorio y en lípidos del tejido del fruto de

aguacate Hassa

Tiempo (min) Incorporación del marcado (%) Proporción ácido graso/Glicerilo

CO2 Lípidos

15 7.5 1.5 1.8

30 12.7 2.9 2.0

60 17.8 6.4 2.3

120 22.5 13.5 3.4

180 25.2 28.8 7.5

240 27.1 38.1 11.1

360 30.0 50.1 11.3a198,000 cpm de glucosa-U-14C fueron infiltrados por cada gramo de tejido. El CO2, lípidos y los residuos solubles e insolubles en agua fueron medidos en secuencia acumulativa. Los lípidos fueron saponificados para separar el glicerilo y el ácido graso.

Tabla 1

36

Distribución del marcado en lípidos sintetizados a partir de glucosa uniformemente marcada en el tejido de fruto de aguacate Hass, después de cuatro horas de incubación

Lípidos Distribución (%)

Proporción ácido graso/Glicerilo

Observada Teórica

Triglicéridos 45.6 15.9 16.0-18.0

Diglicéridos 14.1 11.7 10.7-12.0

Monoglicéridos 12.1 5.8 5.3-6.0

Glicolípidos 12.1 8.2 2.2-4.0

Ácido fosfatídico 4.3 3.1 10.7-12.0

Fosfatidil glicerol 1.9 1.5 5.3-6.0

Fosfatidil etanolamina 1.8 6.7 6.4-7.2

Fosfatidil inositol 0.7 1.9 3.5-4.2

Fosfatidil colina 7.4 10.0 4.0-4.5aLos lípidos extraídos fueron separados por cromatografía en columna y saponificados para medir la proporción de ácido graso y glicerilo. El ácido graso representa a los ácidos grasos C16 y C18, y el gicerilo incluye a el glicerol, etanolamina, inositol y colina.

Tabla 2

37

Metabolismo de la glucosa específicamente marcada en el tejido del mesocarpio del aguacate Hass

Tiempo (min) 30 60 120

MarcadoC-1 C-6 C-1 C-6 C-1 C-6

cpm cpm cpm cpm cpm cpm14CO2 326 54 645 114 1582 332

Lípidos 526 505 893 879 1716 1890

Glicerilo 365 189 522 203 911 268

Ácidos grasos 161 316 371 676 805 1622

Ácidos c 51 81 127 171 270 498

C-6/C-1d 0.166 0.176 0.210

Gp 0.301 0.304 0.350

GNADPH 0.570 0.508 0.515a33,300 cpm de glucosa fueron infiltrados por gramo tejido. El CO2, lípidos y ácidos solubles en agua fueron medidos en secuencia acumulativa. bLos lípidos fueron saponificados y separados en glicerilo y ácidos grasos. cLos ácidos representan la fracción soluble en agua. Las fracciones fueron secadas y extraídas con acetona para eliminar los residuos de glucosa. dC-6/C-1: CO2 de la glucosa-6-14C/CO2 de glucosa-1-14C. Gp: Participación relativa de la vía de la pentosa fosfato. GNADPH: Participación relativa de la vía de la pentosa fosfato manteniendo la síntesis de ácidos grasos.

Tabla 3

38

PA

TGMG

DG200

400

600

800

30 60 120 240Tiempo, min

Inco

rpor

ació

n de

14C,

cpm

Incorporación de glucosa-6-14C en los residuos de ácidos grasos de los lípidos de los tejidos de mesocarpio de aguacate. Un μmol de glucosa-6-14C (37,000 cpm/μmol) fue infiltrado en 1 gramo de tejido. La incorporación de 14C en los lípidos fue medida en secuencia acumulativa. Los lípidos fueron separados por cromatografía en columna de ácido silícico y saponificación para separar las fracciones de glicerilo y ácido graso . TG: Triglicéridos, DG: Diglicéridos, MG: Monoglicéridos, PA: Ácido fosfatídico.

Metabolismo de la glucosa marcada 14C

39

Prop

orci

ón d

e ác

ido

gras

o-14

C/gl

icer

ilo-14

C

TG

DG

PA

MG

1

Tiempo, min

2

3

4

5

6

7

8

30 60 120 240

Cambios en la proporción de acilo graso-14C de glicerilo a lípidos sintetizados a partir de la glucosa-6-14C del tejido del aguacate.TG: Triglicéridos, DG: Diglicéridos, MG: Monoglicéridos, PA: Ácido fosfatídico.

Metabolismo de la glucosa marcada 14C

40

PA

PE PG

PC

PI

TG

30 60 120 240 0

5

10

15

20

25

Radi

oacti

vida

d es

pecí

fica,

cpm

x 1

0-3/m

mol

áci

do g

raso

Tiempo, min

Radioactividad específica de ácidos grasos en los lípidos sintetizados a partir de glucosa-6-14C de tejido de aguacate. La radioactividad específica fue determinada por titulación de ácidos grasos con NaOH 0.01 N en solución alcoholica seguido de 14C continuo. PA: ácido fosfatídico, PC: Fosfatidil colina, PE: Fosfatidil etanolamina, PG: Fosfatidil glicerol, PI: Fosfatidil inositol.

Participación de la vía pentosa fosfato

41

Los niveles relativos de la actividad de la enzima en homogenizado del mesocarpio del aguacate

Actividad totala Requerimiento Experimento I

Fracción particulada

Enzima málica 65 NADP+, Mn++

NADPH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 140 NADP+, Mn++

NADPH: Isocitrato deshidrogenasa 220 NADP+, Mn++

Sobrenadante

Enzima málica 1425 NADP+, Mn++

NADPH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 3337 NADP+, ?

NADPH: Isocitrato deshidrogenasa 3600 NADP+, ?

Tabla 4

42

Tabla 4Los niveles relativos de la actividad de la enzima en homogenizado del mesocarpio del aguacate

Actividad totala Requerimiento Experimento II

NADPH: Isocitrato deshidrogenasa

Sobrenadante después de 10, 000 X g 4300 NADP+, ?

Sobrenadante después de lavado 218 NADP+, Mn++

Fracción particulada después de lavado 84 NADP+, Mn++

NADPH: Isocitrato deshidrogenasa

Sobrenadante después de 10, 000 X g 0

Sobrenadante después de lavado 0

Fracción particulada después de lavado 130 NAD+, Mn++

43

Discusión

1) El tejido de los frutos de aguacate en desarrollo acumulan lípidos en el mesocarpio, y muestran la participación de la vía de la pentosa fosfato en la síntesis de lípidos aportando un 50% del requerimiento de NADPH:malato deshidrogenasa y NADPH:isocitrato deshidrogenasa.

2) Además, la participación de la vía de la pentosa fosfato fue de aproximadamente el 30%. La rápida eliminación de la dihidroxiacetona fosfato de la secuencia glucolítica fue un factor dominante para la esterificación de ácidos grasos en la síntesis de lípidos de novo. De esta manera, el ácido fosfatídico formado a partir de la glucosa en los tejidos del mesocarpío actúa como precursor de glicéridos y fosfogliceridos.

44

3) Es probable que la presencia de ácido fosfatídico en el tejido se deba a la inactivación de la lipasa D durante los procedimientos de aislamientos.

Discusión

45

Conclusiones

1) Aproximadamente el 30% de la glucosa metabolizada por rutas catabólicas, es directamente oxidada hasta dióxido de carbono, y el 50% del total es destinada a la síntesis de ácidos grasos.

2) El carbono número 1 de la glucosa es incorporado en la estructura del glicerilo, mientras que el carbono número 6 es incorporado en ácidos grasos del tejido del fruto en desarrollo.

3) .Además de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la enzima málica y la isocitrato deshidrogenasa participan en el abastecimiento de NADPH2, para la síntesis de ácidos grasos del mesocarpio del fruto de aguacate.

46

Anteriormente los modelos de NADH eran diseñados de acuerdo a tres aspectos:

1

• Controlando la estereoselectividad cambiando el sustituyente del dihidronicotinamida con miras a formar una cadena lateral alejada esteáricamente-exigente.

Pero el dihidronicotinamida necesita ser modificado significativamente por introducción de grandes auxiliares quirales, un complicado anillo o por cambio del grupo amina por un grupo sulfinil quiral.

2

• Incorporando un sustituyente a la reacción central, la posición C4 del anillo dihidropiridina.

3• Diseñar la conformación especifica

para obtener alta estereoselectividad.

Sufre de perdida de quiralidad en la posición C4 durante el curso del modelo de la reacción de reducción.

47

METODOLOGIAEnsayo 1

C2H5OH, H2SO4

1,3,5-Tris(bromometil)benzeno, CH3OH, reflujo, 45%

2 3

4

Na2S2O4, Na2CO3, H2O, temperatura ambiente, 26%;

5

2. Ácido 3,5-piridinadicarboxilico; 3. 3,5-dietoxicarbonilpiridina;4. Grupo fenil 1,3,5-trimetileno (+) estabilización del grupo metileno y remoción de Br en metileno.

6

1. NaOH, H2O, temperatura ambiente, 5 h; 2. SOCl2, reflujo 8 h

(1R,2R)-Diaminocyclohexane, THF, temperatura ambiente,12 h

NADH6. Sustitución del grupo etileno por Cl, ciclación de la molecula para la obtencion del modelo de 1 NADH

Ensayo 2

Pentafluorofenol, DMF, temperatura ambiente, 6 h, 92%

2

8

7

1,3,5-Tis(bromometil)benzeno, DMF, 85 ºC, 12 h, 35%

(1R,2R)-Diaminociclohexane, THF, temperatura ambiente, 4 h, 21%

2. Ácido 3,5-piridinadicarboxilico;7. Conjugación de grupos etileno con pentafluorofenol; 8. remoción de pentafluorofenol por diaminociclohexano.

NADH

Na2S2O4, Na2CO3, H2O, temperatura ambiente, 10 h, 42%..

9

51

RESULTADOS

El ensayo 1 no fue satisfactorio debido a que el intermediario 5 mostro sensibilidad a la temperatura, la luz y el aire

5

52

ESTRUCTURA DEL NADH

El modelado molecular vía dinámica molecular seguida de minimización de energía con Gaussian 03, mostró que tiene una forma de cavidad cóncava estable “tazón”

Carbonos quirales

53

T (°C) t Relación Mg(ClO4)2/ Modelo 1ee [%][a,b]

Configuración10 Rendimiento [%][c]

1 r.t. 3 d 3.0 88 R 96

2 50 18 h 3.0 82 R 96

REACCIÓN DE REDUCCIÓN ASIMETRICA DE METIL BENZOILFORMATO

Mg(ClO4)2

CH3CN

10

+ +

54

Este modelo podría ser usado para la investigación en biosimulación,

como una nueva prueba fluorescente en el curso de la traducción de

señales y para algunas investigaciones de mecanismos de reacción.

El nuevo modelo de NADH es capaz de emitir fluorescencia a 455 nm

cuando es excitado a 390 nm (λexc= 390 nm, λem= 455nm).

El NADH podría utilizarse como una nueva prueba fluorescente, sensible

a pH que con potencial como una pequeña molécula de prueba para la

investigación de la artereoesclerosis en la transducción de señales.

CONCLUSIÓN

55

ESPECTRO DE EMISIÓN DEL NADH EN METANOL COMO FUNCIÓN DEL pH

LONGITUD DE ONDA (nm)

INT

EN

SID

AD

DE

FL

UO

RE

SC

EN

CIA

pH 8.0pH 7.8pH 7.7 pH 7.0pH 6.8pH 6.4pH 6.0

Wang y Zhao, 2009

56

BIBLIOGRAFÍA

Metabolism of glucose in relation to thelipid synthesis in the fruit of

Persea americana MILL.YOSHIO KIKUTA1 and Louis C. ERICKSON

Department of Biochemistry, Citrus Research Center and AgriculturalExperimental Station, University of California, Riverside,

California 92502, U. S. A.(Received January 13, 1969)

57

LUIS ALBERTO LIGHTBOURN ROJAS., PhDDIRECTOR DE LA DIVISIÓN DE GENERACIÓN, EXCOGITACIÓN Y TRANSFERENCIA DE CONOCIMIENTO, BIOTEKSA, S.A. DE C.V.

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58

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