Arginina en Goma Acacia 9115-9364-1-PB

Dilucidación estructural de la fracciónoligómero-proteína de la goma de Acacia tortuosa

Rosa E. Ferrer *, Gladys León de Pinto y Maritza MartínezCentro de Investigaciones en Química de los Productos Naturales, Departamento de Química.

Facultad de Humanidades y Educación. Universidad del Zulia.

Recibido: 29-09-00 Aceptado: 12-06-01

Resumen

La hidrólisis básica de la goma de Acacia tortuosa facilitó la separación de tres fraccionesoligómero-proteína mediante cromatografía de gel permeación (GPC). La comparación de losperfiles de elución de la goma cruda original y de la goma hidrolizada evidenció una estructurapolidispersa representada por dos fracciones tipo arabinogalactán-proteína (AGP). La hidróli-sis ácida de estas fracciones, aisladas y caracterizadas por técnicas cromatográficas (PC yHPLC), demostró el posible compromiso entre arabinosa e hidroxiprolina como unidades inter-nas, posiblemente involucradas en el enlace carbohidrato-proteína.

Palabras clave: Acacia tortuosa; arabinogalactán-proteína; gel filtración; goma.

Structural dilucidation of oligomer-protein fractionfrom Acacia tortuosa gum

Abstract

Basic hidrolysis of Acacia tortuosa gum, followed by gel permeation chromatography(GPC), led to separate three oligomer-protein fractions. Comparison of the elution profiles of theoriginal crude gum and the hydrolysed gum evidenced the presence of a polydisperse structure,represented by two arabino-galactan- protein fractions. Acid hidrolysis of these fractions, iso-lated and characterized by chromatography techniques (PC, HPLC) demostrated that arabinoseand hydroxiprolin, internal units, are possibly involved in the linkage carbohydrate-protein

Key words: Acacia tortuosa; arabinogalactan-protein; gel permeation; gum.

Introducción

El estudio de exudados gomosos, pro-ductos naturales de gran complejidad, hasido de gran interés. La creciente aplicaciónde las gomas en las industrias alimentaria,farmacéutica, cosmética, textil y vitícola(1,2), entre otras, se basa en su capacidadde modificar las propiedades reológicas delos sistemas acuosos en los cuales intervie-nen. Se han aprovechado tradicionalmente

sus usos como espesantes (3), emulsifican-tes (4), gelificantes (5) y clarificantes (6). Ac-tualmente, se han descrito implicacionesnutricionales de las gomas, tales como: efec-tos gastrointestinales, absorción de lípidos yproteínas, agentes hipocolesterolémicos yefectos antitumorgénicos (7).

En Venezuela, se ha evidenciado laexistencia de especies productoras de go-mas (8). Se han publicado estudios fisico-

Scientific Journal from the Experimental Faculty of Sciencesat La Universidad del ZuliaVolume 9 Nº 2, April-June 2001

CIENCIA 9(2), 277-284, 2001Maracaibo, Venezuela

* Autor para la correspondencia.

químicos y estructurales de las gomas deAcacia tortuosa (9), Cercidium praecox (10),Enterolobium cyclocarpum (11), Albizialebbeck (12) y Acacia macracantha (13), en-tre otras.

Tradicionalmente se consideró a lagoma como un polímero complejo de carác-ter glucídico; sin embargo, recientemente seha comprobado la presencia de una porciónglucídica y proteica unidas covalentemente.La porción glucídica, componente mayorita-rio de la goma, corresponde a un heteropoli-sacárido ácido. Las gomas se denominanarabinogalactán-proteína (AGP) (14-16).

La estructura química de los polisacá-ridos aislados de gomas, está constituídapor hexosas (galactosa, manosa y glucosa),pentosas (arabinosa y xilosa), metilpentosa(ramnosa) y ácidos urónicos (ácido glucuró-nico, su derivado 4-O-metil y ácido galactu-rónico). Estos ácidos urónicos existen en laestructura del polímero parcialmente neu-tralizados por cationes, tales como: calcio,magnesio, potasio, sodio, etc. Los estudiosestructurales de muchos polisacáridos ais-lados de gomas demuestran la presencia deuna estructura tipo -1,3 galactán con rami-ficaciones constituidas por arabinosa, ram-nosa y ácidos urónicos (9-13,17,18).

La presencia de nitrógeno como pépti-do o proteína es un rasgo importante en laestructura de los AGP. Se han efectuado es-tudios relacionados con la composición deaminoácidos de gomas de Acacia (17), Proso-pis (19), Astragalus (20) y Albizia (21). Se haevidenciado que la hidroxiprolina es el ami-noácido más abundante en la goma de Aca-cia seyal (“goma talha”) (22), mientras que elácido aspártico existe predominantementeen las gomas Combretaceae (23,24).

Posteriormente, las investigacionestendentes a determinar la naturaleza del en-lace carbohidrato-proteína en Acacia robus-ta (25), Acacia tortilis (26) Acacia erioloba(27) y Acacia senegal (28), demostraron quela hidroxiprolina es el aminoácido unido alcarbohidrato.

El objetivo principal de esta investiga-ción consiste en caracterizar fracciones oli-gómero-proteína de la goma de Acacia tor-tuosa, con el propósito de indagar acerca dela naturaleza del enlace carbohidrato-pro-teína.

Materiales y Métodos

Origen y colección de la goma

La muestra estudiada se obtuvo me-diante la práctica de una herida a nivel deltallo de la especie de Acacia tortuosa. La pro-ducción del polímero tuvo lugar en períodosvariables (8-15 días), posterior a la estimu-lación de la planta. La goma cruda se secó enuna estufa a 110°C.

Hidrólisis alcalina de la goma

Se disolvieron los nódulos de la gomacruda (5g) en solución saturada de Ba (OH)2(200 mL) a temperatura ambiente por 2 h.Se hidrolizó la mezcla a 100 °C por 8 h. Lasolución obtenida se neutralizó con H2SO41M, se filtró y se obtuvo una solución degoma de color característico, la cual se liofi-lizó posteriormente (Equipo LABCONCOFREEZE ONE).

Obtención de los perfiles de eluciónde la goma cruda e hidrolizada porcromatografía gel permeación (GPC)

Se empleó una columna de vidrio (30 x1 cm) empacada con FRACTOGEL TSK-H-W-65 (s). Con la muestra liofilizada se pre-paró una solución acuosa de la goma hidro-lizada (100 mg/ 10 mL), se tomó una alícuo-ta (0,3 mL) y se agregó a la columna, previa-mente empacada con el material poroso; seusó como eluyente una solución de NaCl0,1M. Se tomaron alícuotas (2 mL), a una ve-locidad de elución de 3,5mL/h. Se determi-nó la presencia de carbohidrato y proteínapor métodos espectroscópicos visible y ul-travioleta, respectivamente (29). Las curvasde absorción correspondientes se obtuvie-ron al graficar absorbancia versus volumen


278 Fracción oligómero-proteína de la goma de Acacia tortuosa

de elución (mL). Este barrido permitió obte-ner, en las mismas condiciones, los perfilesde elución de la goma cruda original.

Aislamiento de las distintas fraccionesobservadas en los perfiles de eluciónde la goma hidrolizada

Se colectaron tres fracciones que elu-yeron en los intervalos determinados: 16-30mL (fracción 2), 34-38mL (fracción 3) y40-44mL (fracción 4), las cuales se seleccio-naron según los máximos de absorbanciaobservados en los perfiles de elución de lasfracciones glucídica y proteica de la gomasometida a hidrólisis básica. Las tres frac-ciones se redujeron en volumen y se deseca-ron para su posterior estudio.

Caracterización de las distintasfracciones aisladas de la gomahidrolizada

Hidrólisis ácida: La muestra (mg), ob-tenida por evaporación del solvente de lasfracciones, se disolvió en ácido trifluoracéti-co (TFA 0,1M) hasta obtener un concentra-ción específica (5mg/mL). Seguidamente secalentó por 1h a 100°C. Se extrajo una alí-cuota (2 mL), la cual se redujo en volumen.El resto de la solución se ajustó a una con-centración 2M de TFA; y se calentó por 6h a100°C. Se extrajo otra alícuota y se redujoen volumen. El calentamiento continuó a100°C y se repitió el mismo procedimientocon tiempos de hidrólisis de 15 y 24h. Final-mente, se obtuvieron 4 alícuotas de cadafracción aislada por hidrólisis con TFA.

Métodos cromatográficos:

1. Determinación cualitativa de carbohi-dratos: A cada una de las alícuotas obteni-das en la hidrólisis de cada fracción oligó-mero-proteína con TFA se determinó el con-tenido de carbohidratos por el método del fe-nol-sulfúrico (29). Los azúcares hidroliza-dos se identificaron por cromatografía de

papel, empleando papel Whatman #1 y seuso un sistema de solvente básico formadopor: benceno:butanol:piridina:agua(1:5:3:3).

2. Determinación cualitativa de aminoá-cidos:

2.1. Cromatografía de papel (PC): Sedeterminó cualitativamente aminoácidosempleando la cromatografía de papel unidi-mensional descendente, utilizando papelWhatman #3 en un sistema de solventesconstituído por butanol: acido acético: agua(120:30:50) a temperatura ambiente. Se em-pleó una solución de ninhidrina en acetona(0,25 %) como revelador.

2.2. HPLC: Las muestras hidrolizadasse ajustaron a un pH de 2,2 con HCl 6N, conel empleo de un potenciómetro (Methrom620), estandarizado con un buffer de refe-rencia (pH 7). Las muestras se llevaron a unbalón de 100mL, filtrándolas previamentecon papel Whatman #1. Se aforó con BufferCitrato (pH 2,2) y se filtró la solución con fil-tro millipore (0,45µm). Se conservaron enrefrigeración para su posterior análisis.

Los aminoácidos se analizaron por cro-matografía líquida de alta resolución(HPLC). Se empleó un cromatógrafo modeloSHIMADZU (LCGA HPLC), equipado con de-tector de fluorescencia (FLDGA). Se usó unacolumna de ALTEX ULTRASPHERE ODS,C18 (15 cm x 4mm). Los sistemas de solven-tes empleados se describen a continuación:A:Buffer acetato (0.05 M), metanol y tetrahi-drofurano (80:19:1); B: Buffer acetato, me-tanol (80:20).

Se empleó como referencia una solu-ción de aminoácidos (50nmol/mL) Sigma.Se realizó una derivatización pre-columnade los aminoácidos con un reactivo OPT (O-pthalaldehido); las muestras (20µL) se in-yectaron en la columna; el flujo correspon-dió a 1 mL/min. La fluorescencia se leyó a470 nm con una longitud de onda de excita-ción de 350nm.


R.E. Ferrer, G. León de Pinto y M. Martínez / Ciencia Vol. 9, Nº 2 (2001) 277-284 279

Resultados y Discusión

El conocimiento global de la goma deAcacia tortuosa amerita investigar las frac-ciones glucídica y proteica. El alto contenidode nitrógeno en esta goma (37,8%) facilita elestudio de la fracción proteica (30).

El perfil de elución de la goma originalde Acacia tortuosa obtenida a 490 nm, Figu-ra 1, muestra un sólo pico de máxima absor-bancia a un volumen de elución de 22mL; encontraste con la goma hidrolizada quemuestra tres fracciones perfectamente dife-renciables (A, B, C) correspondientes a volú-menes de elución definidos (22, 36 y 42mL).Este perfil corrobora que la estructura pre-dominante es la que se separó al menor vo-lumen de elución (Fracción A). Las fracció-nes B y C presentan un peso molecular rela-tivamente menor, en función de su mayorvolumen de elución. Este hecho sugiere quela hidrólisis alcalina permitió la degradaciónde la fracción de mayor peso molecular, locual se ha reportado para las gomas de Aca-cia tortilis (26) y Acacia senegal (28). Por otraparte, el resultado obtenido podría indicarque el tiempo de hidrólisis no fue suficientepara romper un mayor número de enlaces,por lo tanto, los dos fragmentos liberados (By C), poseen un peso molecular relativamen-te bajo; este hecho explicaría que la fracciónmayoritaria (A) no varió significativamentecon respecto a la fracción mostrada en elperfil de elución de la goma original, por lotanto, el volumen de elución de la banda semantiene constante (22mL). El predominiode la fracción de mayor peso molecular (A)podría indicar que la degradación de lagoma original no fue suficiente como se hareportado en el caso de la goma de Acaciaerioloba (27).

El perfil de elución de la goma original,obtenida a 220 nm, Figura 2, exhibe 2 máxi-mos a volumenes de elución definido (4 y18mL), los cuales podrían indicar que haydos tipos de estructuras químicas con pre-dominio de la estructura de menor peso mo-lecular (volumen de elución 18mL). La diver-

sidad de estos dos tipos de estructura es unindicador de la presencia de un sistema poli-disperso, es decir, un posible comporta-miento de un sistema heterogéneo. El siste-ma polidisperso podría estar relacionadocon un complejo tipo AGP presente en lagoma investigada. En este perfil de eluciónde proteínas de la goma cruda se observanotros picos a mayores volumenes de elución(30, 38 y 46mL), los cuales probablementecorresponden a péptidos susceptibles de de-gradación; estos picos disminuyen su inten-sidad en el perfil de elución de la goma hi-drolizada y en su lugar aparece otro pico aun volumen de elución mayor, el cual podríacorresponder a los aminoácidos liberados.

La comparación de los perfiles de elu-ción para carbohidratos y proteínas de lagoma cruda, Figura 3, corrobora lo antes ex-puesto confirmándose la existencia de uncomplejo AGP y de péptidos probablementeen la periferia de la molécula, los cuales sonsusceptibles a hidrólisis básica.

La comparación de los perfiles de elu-ción de la goma hidrolizada de Acacia tortuo-sa obtenidos a 490 y 220nm, Figura 4, evi-



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VOLUMEN DE ELUCIÓN (mL)

ABSORBANCIA

A

BC

Figura 1. Comparación de los perfiles de elu-ción de la fracción glucídica de lagoma original crudae hidrolizada de Acaciatortuosa.

denció 5 máximos. Las fracciones 2, 3 y 4 re-velan la presencia tanto de carbohidratocomo de proteína y en función de este crite-rio se aislaron para su posterior análisis. Lafracción 2 volumen de elución de 22mL, talcomo se discutió anteriormente, correspon-de a un AGP. Las distintas fracciones aisla-das se sometieron a hidrólisis ácida con áci-

do trifluoracético (TFA), para posteriormen-te determinar su composición en carbohi-dratos y aminoácidos.

El estudio del comportamiento de laporción glucídica, Tabla 1, mostró presenciade ácido glucurónico en las diferentes frac-ciones analizadas, el cual se removió des-pués de 1 h de hidrólisis. Se observa poste-



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ABSORBANCIA

Figura 3. Comparación de los perfiles de elución de la fracción glucídica y proteicade la goma original cruda de Acacia tortuosa.

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ABSORBANCIA

Figura 2. Comparación de los perfiles de elución de la fracción proteica de la goma original crudae hidrolizada de Acacia tortuosa.

riormente la remoción de galactosa en tiem-pos variables (6, 15 y 24 h), en las fracciones2, 4 y 3, respectivamente. La separación dearabinosa se observó en todos los casos en elmismo tiempo de hidrólisis (24 h). La facili-dad relativa de remoción de los distintosazúcares pudiera estar relacionada con laposición de estos monosacáridos dentro deloligómero; el ácido glucurónico podría estarcomo posible residuo terminal y la arabino-sa como residuo interno involucrado en elenlace al péptido en las fracciones oligóme-ro-proteína. Es importante destacar que re-sultados similares se han publicado paraAcacia tortilis (26) y Acacia erioloba (27), lascuales, al igual que Acacia tortuosa pertene-

cen a la serie Gummiferae. Los azúcares pe-riféricos liberados (ácido glucurónico y ga-lactosa), se han descrito en la goma originalde Acacia tortuosa (30) como integrante deloligosacárido más abundante.

El análisis cromatográfico por HPLC yPC muestra los aminoácidos presentes enlas distintas fracciones sometidas a hidróli-sis ácida, Tabla 2. Se requirió 24 h en la frac-ción 2 para observar la presencia de ácidoaspártico (Asp), ácido glutámico (Glu), histi-dina (His), arginina (Arg) y valina (Val);mientras que en la fracción 3 se observa laliberación de His. y Arg. a las 6 h de hidróli-sis, a las 15 h comienza a liberarse Val. y fi-nalmente, a las 24 h se muestra la hidroxi-



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ABSORBANCIA

1

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34

5

Figura 4. Comparación de los perfiles de elución de la fracción glucídica y proteicade la goma hidrolizada de Acacia tortuosa.

Tabla 1Carbohidratos identificados por PC, a partir de las fracciones AGP aisladas por GPC

Tiempo de Hidrólisis(h)

Fracciones

2 3 4

1 A. Glc A. Glc A. Glc

6 A. Glc, Gal A. Glc A. Glc

15 A. Glc, Gal A. Glc A. Glc, Gal

24 A. Glc, Gal, Ara A. Glc, Gal, Ara A. Glc, Gal, Araacido glucurónico ( A.Glc.), arabinosa (Ara), galactosa (Gal).

AB

SO

RB

AN

CIA

prolina (Hyp). Para la fracción 4 se observaliberación de Asp., Glu., His., Arg. y Val a las15 h, mientras que a las 24 h se muestra laseparación de la Hyp. El estudio comparati-vo de la facilidad relativa para remover losdistintos aminoácidos constituyentes de lasdiferentes fracciones investigadas parecieraque está relacionada con la presencia de laHyp, el cual probablemente está involucra-do en la unión carbohidrato-proteína. Estehecho se ha reportado para: Acacia robusta(25), Acacia tortilis (26), Acacia erioloba (27)y Acacia senegal (28).

Por otra parte, los aminoácidos libera-dos por hidrólisis ácida de la fracción 2 sonlos mismos que se describen como periféri-cos para las fracciones 3 y 4. La ausencia deHyp en las alícuotas obtenidas a partir de lahidrólisis ácida de la fracción 2, podría rela-cionarse con el hecho de que la hidrólisisácida no fue suficiente para liberar los ami-noácidos más internos debido a la compleji-dad de dicha fracción.

Los resultados obtenidos en esta in-vestigación evidencian la presencia de uncomplejo tipo AGP e indica el posible com-promiso entre arabinosa e hidroxiprolinacomo unidades responsables de la unióncarbohidrato-proteína.

AgradecimientoDeseamos expresar nuestro agradeci-

miento a la Unidad de Investigación de Cien-

cias y Tecnología de Alimentos (UDICTA) dela Facultad de Ciencias Veterinarias de LUZ,y a la Unidad de Genética Médica (UGM-LUZ) del Hospital Universitario de Mara-caibo, por el aporte prestado para la culmi-nación de este trabajo.

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Tabla 2Aminoácidos identificados por PC y HPLC, a partir de las fracciones AGP aisladas por GPC

Tiempo de Hidrólisis(h)

Fracciones

2 3 4

1 - - -

6 - His, Arg -

15 - His, Arg, Val Asp, Glu, His, Arg, Val

24 Asp, Glu, His, Arg,Val

His, Arg, Val, Hyp Asp, Glu, His, Arg,Val, Hyp

acido aspártico (Asp), acido glutámico (Glu), arginina (Arg), hidroxiprolina (Hyp), histidina (His), valina (Val).

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