BENEMÉRITAUNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

APUNTES IMPRESOS Pruebas bioquímicas

Curso: LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA I

M.S.P. MARÍA DE LA CRUZ MENESES SÁNCHEZ

M.C. PATRICIA GPE. SUÁREZ ALBORES

M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRÁN P.

INDICE

Página

IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA 3

ENSAYOS BIOQUIMICOS 4

REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS 7

FUNDAMENTO Y METODOLOGÍA DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS 9

Prueba de la Oxidasa 9Prueba de la Catalasa 10Licuefacción de gelatina 10Prueba de Reducción de Nitratos 11Prueba de óxido/fermentación 12Prueba de extracción de pigmento con cloroformo 13Prueba de hidrólisis de almidón 14Investigación de producción de acetil metil (Voges Proskauer)y ácidos (Rojo de metilo) 14Prueba de Movilidad 15Fenilalanina desaminasa 15Prueba de Lactosa 16Prueba de Manitol 16Prueba de Coagulasa 17Prueba de TSI (Agar de hierro y triple azúcar) 17Prueba de LIA (Agar de hierro y lisina) 19Prueba de Indol 20Prueba de Citrato 21Prueba de Ureasa 22

Agar cisterna tripticasa (CTA) 23 Agar sellers 23

RESUMEN DE RESULTADOS 24

ALGUNOS PRUEBAS REALIZADAS A COCOS GRAMPOSITIVOS 27

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IDENTIFICACIÓN DE UNA CEPA BACTERIANA

Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente utilizado es el Manual de Bacteriología de Bergey.

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada.  Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.

 A continuación se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo):

1. Obtener un cultivo puro

2. Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

3. Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

4. Realización de pruebas primarias: En la tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual de Identificación de Bacterias de Interés Médico, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Tinción de Gram, morfología, catalasa, oxidasa, O/F, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad.

5. Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)

 Serotipo

A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos. Los antígenos bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al

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lipopolisacárido de la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras y el número o letra del antígeno correspondiente.

  En una primera identificación se usan sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro de cada tipo de antígeno. Existen en el comercio antisueros para caracterización de: Salmonella, Shigella, E. coli, Haemophilus, etc. También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc.

Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera:                 Yersinia entercolítica  4         03    género   especie     biotipo  serotipo   

ENSAYOS BIOQUIMICOS

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.

  Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas (manuales de identificación, comerciales, etc.).

1. Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeños compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos numéricos para la interpretación de resultados.

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 Los sistemas comerciales más comúnmente usados son:

* BBL, ENTEROTUBE II  (Becton Dickinson).  Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas.

* OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson).  Es un sistema listo para usar para la identificación de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plástico de 12 medios de cultivo que permite la realización simultánea de 14 pruebas bioquímicas.

* API 20 E.  Es un sistema estandarizado para la identificación de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensión bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas bioquímicas a partir de una única colonia bacteriana. Algunas de las reacciones e interpretación que se producen en el API son las siguientes: ONPG: determina la actividad de la enzima β-galactosidasa.                                 β-galactosidasaONPG---------------------------------------------ortonitrofenol(Orto-nitrofenil-                                                (amarillo)-D-galactopiranósido) Reacción positiva: amarillo.Reacción negativa: incoloro.  ADH: determina actividad de la enzima arginina dehidrolasa.                         ADHarginina---------------------------ornitina + NH4 + CO2  El amonio produce un cambio en el pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo.  Reacción positiva: rojo.Reacción negativa: amarillo. LDC: determina actividad de la enzima lisina decarboxilasa.                          LDClisina------------------------------cadaverina (amina)  La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reacción positiva: rojo.Reacción negativa: amarillo. ODC: determina actividad de la enzima ornitina decarboxilasa.                          ODCornitina---------------------------putrescina (amina)   

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La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reacción positiva: rojo.Reacción negativa: amarillo. CIT: determina la capacidad de la bacteria de usar el citrato como única fuente de carbono. El consumo del citrato produce un aumento de pH y un viraje del indicador de verde a azul.Reacción positiva: azul.Reacción negativa: verde. H2S: determina la capacidad de la bacteria de reducir el tiosulfato a H2S para reducir la tensión de oxígeno.El H2S se combina con sales de hierro y forma un precipitado negro. Reacción positiva: precipitado negro.Reacción negativa: ausencia de precipitado. URE: determina la actividad de la enzima ureasa.                      ureasa urea---------------------------NH4

 El amonio produce un cambio de pH y un viraje del indicador de amarillo a rojo si se observa entre las 18 hs. y las 24 hs., o de naranja a rojo si se observa entre las 36 y 48 hs. Reacción positiva: rojo o naranja.Reacción negativa: amarillo.  TDA: determina la actividad de la enzima triptofano deaminasa.                            TDAtriptofano-----------------------indolpirúvico + NH4

 Al final de la incubación se agrega una gota de cloruro férrico al 10%. El ácido indolpirúvico produce un color rojo-amarronado en presencia del mismo. Reacción positiva: rojo-amarronado.Reacción negativa: amarillo. IND: determina la capacidad de la bacteria de metabolizar el triptofano.                    triptofanasatriptofano------------------------indol Al final de la incubación se agrega una gota del reactivo de Kovacs. La reacción debe ser leída dentro de los dos minutos de agregado el mismo. El indol se combina con el p-dimetilamino benzaldehído presente en el reactivo y se forma una quinona de color rojo violáceo. Reacción positiva: color rojo.Reacción negativa: amarillo.

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 VP: Determina la presencia de acetoína como intermediario en el metabolismo de la glucosa. Al final de la incubación se agrega una gota de KOH al 40% y luego una gota de alfa-naftol. Se esperan 10 minutosantes de observar el resultado. Reacción positiva: rojoReacción negativa: incoloro Reducción de nitratos: Determina la capacidad del microorganismo de reducir el nitrato a nitrito o a nitrógeno libre. La prueba se lleva a cabo en el mismo microtubo que la de glucosa. Además de anotar el resultado de dicha prueba, se observa si hay burbujas, lo cual indica que se redujeron los nitratos a nitrógeno gaseoso.Se agregan dos gotas de ácido sulfanílico al 0.8% y dos gotas de N,N- dimetil- naftilamina. Se esperan de 2-3 minutos. Si hay nitritos en el medio, los mismos forman un complejo de color rojo con los reactivos. Los resultados negativos se confirman agregando zinc al microtubo. Los nitratos son reducidos por el zinc dando un color rosa anaranjado. Si no hay un cambio de color, es porque los nitratos fueron reducidos primeramente a nitritos y posteriormente a N2 o a alguna amina aerogénica.  

REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Lo primero que se tiene que realizar para llevar a cabo una prueba bioquímica es lo siguiente:

1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un  determinado sustrato o inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación.

2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática.

En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test.

Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente.

1. Enzimas vinculadas con la respiración a) oxidasa b) catalasa

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2. Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y  otrosa) Requerimientos de oxígeno - O/F (óxido-fermentación) - Crecimiento en caldo tioglicolatob) Producción de ácido, o ácido y gas

- Fermentación de carbohidratosc) Detección de enzimas y vías metabólicas

- RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) - Gluconato - O.N.P.G. (orto nitro ß-D-galactopiranósico) - Esculina - Hipurato

3. Fuente única de carbonoa) citrato b) malonatoc) hipurato para coliformes

4. Utilización de compuestos nitrogenadosa) Reducción de nitrato

- asimilación- denitrificación

b) Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros- indol - H2S - Fenilalanina - Lisina, arginina, ornitina - Urea

5. Ensayos combinadosa) TSI (Triple Azúcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina

6. Detección de exoenzimasa) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas e) desoxirribonucleasas f) acción de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7. Misceláneosa) KCN b) Bilis c) producción de pigmentos

8. Test de crecimiento o inhibicióna) Temperatura b) NaCl  c) Antibióticos

FUNDAMENTO Y METODOLOGÍA DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

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Prueba de la Oxidasa 

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.

La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las

enterobacterias.

La prueba de oxidasa utiliza ciertos reactivos colorantes como el diclorhidrato de p-fenilendiamina que actúa como aceptor artificial de electrones sustituyendo al oxígeno. Se utilizan sensidiscos impregnados de clorhidrato de p-fenilendiamina el cual es incoloro en estado reducido pero en presencia de la oxidasa se oxida formando azul de indofenol.

Realización de la prueba:

Colocar un sensidisco impregnado con clorhidrato de p-fenilendiamina, sobre un portaobjetos

Con el asa recta colocar una muestra de una colonia aislada a probar sobre el sensidisco

La bacteria oxidasa +, desarrolla en segundos un color azul intenso en el sitio de la inoculación

Las bacterias que no presentan a la enzima, no producen ningún cambio en el sensidisco.

Prueba de catalasa

La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen el sistema citocromo, La catalasa es una

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N

hemoproteína, cuyo grupo prostético está formado por 4 átomos de hierro trivalente por molécula. Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar géneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+); Bacillus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de Erysipelothrix (-).Realización de la prueba:

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.

Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.

Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua

oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

Interpretación de resultados:* Prueba positiva: formación inmediata de burbujas bien visibles (desprendimiento de O2).* Prueba negativa: no hay formación de burbujas (no se forma O2).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaución de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dará un falso resultado positivo.

Prueba de licuefacción de la gelatina

  Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Permite diferenciar especies: Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (lento y +) y especies de Micrococcus (variables y lentas); Listeria monocytogenes  (-) de Corynebacterium ulcerans (+), Corynebacterium haemolyticum (+) y Corynebacterium pyogenes (variable).También ayuda a identificar: Serratia liquefaciens (+), Serratia marcescens (+), Pseudomona aeruginosa (+, rápida) y especies de Flavobacterium (+). Realización de la prueba:

Inocular por punción los tubos conteniendo gelatina nutritiva. Dejar un tubo sin inocular como control.

Incubar a 37 oC durante 48 horas. Colocar en heladera 2 horas y luego observar

licuación y crecimiento. 

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Interpretación de resultados:* Prueba positiva: a) tubo inoculado: medio líquido.b) tubo control: medio se mantiene sólido.* Prueba negativa: a) tubo inoculado: el medio se mantiene sólido. Volver a incubar un tiempo adicional.b) tubo control: el medio se mantiene sólido. Prueba de reducción de nitratos

  Esta prueba permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre. Sirve para identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae (por lo general +) Realización de la prueba:

Inocular tubos de caldo nitrato con el microorganismo que se desea estudiar. Incubar durante 18-24 horas a 37 oC Determinar nitritos: Fase I :

- Agregar directamente al cultivo en caldo nitrato, 1 ml de reactivo A y 1 ml de reactivo B.

- Agitar bien.- Esperar 30 segundos y observar coloración.

Si el resultado fuera positivo, la prueba se da por terminada. Si el resultado fuera negativo, continuar con la fase II. Fase II :

- Agregar al tubo que ya contiene los reactivos A y B una pizca de polvo de cinc.

- Agitar bien.- Esperar 30 segundos y observar coloración.

Interpretación de los resultados:A) Fase I:* Prueba positiva: color rosado a rojo intenso porque el nitrato ha sido reducido a nitrito por el organismo.* Prueba negativa: no se observa cambio de color.B) Fase II (prueba de la reducción del cinc): * Prueba positiva: no se observa cambio de color, por ausencia de nitrato en el medio, lo cual indica que el organismo redujo el nitrato en nitrito y luego redujo nuevamente el nitrito.* Prueba negativa: color rosado a rojo intenso, por presencia de nitrato que no ha sido reducido por el organismo. El cinc redujo el nitrato en nitrito.

Solución A: Ácido sulfanílico 0.5 g en 1 L de ácido acético glacialSolución B:N,N-dimetil-l-naftilamina 6 mL en 1 L de ácido acético 5N

  Prueba de oxido/fermentación

  Esta prueba permite determinar el tipo de metabolismo (oxidativo o fermentativo) sobre un hidrato de carbono. Sirve para diferenciar: a) géneros de

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bacterias intestinales no entéricas, gramnegativas (oxidativos) de las enterobacterias (fermentativas) y especies de Micrococcus (oxidativas) de especies de Staphylococcus (fermentativas).  Realización de la prueba:

Para cada carbohidrato usado, inocular por punción 2 tubos de OF para cada microorganismo en estudio (el inóculo debe ser poco denso).

Sellar uno de ellos con un tapón de parafina. Incubar a 37 oC durante 48 horas o el tiempo necesario. Observar los resultados.

 Interpretación de resultados:Además de la utilización de un hidrato de carbono puede detectarse en un medio O-F la producción de gases y la motilidad.A) Formas de utilización de un hidrato de carbono:La utilización de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH.

Si el metabolismo del microorganismo en estudio es OXIDATIVO (O): tubo cerrado sin cambio (-) y tubo abierto amarillo (+) en la superficie

* Si el metabolismo del microorganismo en estudio es FERMENTATIVO (F): tubo cerrado amarillo (+) y tubo abierto amarillo (+). En este caso puede haber o no producción de gas.

* Si el metabolismo del microorganismo en estudio no es ni fermentativo ni oxidativo (-): tubo cerrado sin cambio (-), y tubo abierto azul (en la superficie), se trata de un microorganismo NO SACAROLÍTICO Ó INERTE

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B) Motilidad:* Si el microorganismo en estudio es móvil (+), el crecimiento se aleja de la línea de punción.* Si el microorganismo en estudio no es móvil (-), crecimiento limitado a la línea de punción.  Prueba de extracción de pigmento con cloroformo

  Esta prueba bioquímica permite investigar los pigmentos producido por cepas de Pseudomonas.  Realización de la prueba:

Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo. Incubar a 37 oC. Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. Observar los resultados.

 Interpretación de resultados:* Prueba positiva: la fase clorofórmica toma color azul verdoso por extracción de piocianina.* Prueba negativa: la fase clorofórmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento). Prueba de hidrólisis de almidón

  Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de hidrolizar el almidón. Esta enzima es muy común en distintos miembros del género Bacillus.          Realización de la prueba:

Sembrar el microorganismo en estudio por estría en una placa con agar almidón.

Incubar a 37 oC hasta observar desarrollo. Inundar la placa con lugol. Dejar actuar 10 minutos. Observar la coloración.

 Interpretación de resultados:* Prueba positiva: halos de degradación (marrones o transparentes)  alrededor de las colonias sobre fondo azul.* Prueba negativa: ausencia de halos; coloración azul alrededor de las colonias (presencia de complejo Iodo-almidón).   

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Investigación de la producción de acetilmetilcarbinol (Voges Proskauer) y productos terminales ácidos (rojo de metilo).

  Con estas dos pruebas se estudia qué tipo de fermentación (butilenglicólica o ácido mixta) realiza el microorganismo en estudio. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la fermentación (butilenglicólica) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+) de Escherichia coli y otras especies de Klebsiella (-). La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación (ácido mixta) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar Escherichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a los géneros Enterobacter y Klebsiella (-).

Realización de la prueba:

Inocular tubos conteniendo caldo glucosa fosfato.  Dejar un tubo sin inocular como control.

Incubar a 37oC durante 48 horas. Dividir el contenido de cada uno de los tubos en dos partes iguales. En una

mitad, investigar la presencia de acetilmetilcarbinol y en la otra la presencia de ácidos.

Para determinar acetilmetilcarbinol: Agregar 0.6 ml de solución alcohólica de naftol al 5% Agregar 0,2 ml de solución de KOH al 40% Agitar y dejar en reposo 5-10 minutos Observar la coloración resultado.

Para determinar ácidos: Agregar al cultivo 10 gotas de solución de rojo de metilo 0,1% Observar la coloración

 Interpretación de resultados:Voges-Proskauer* Prueba positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetoína).* Prueba negativa: sin cambio de color (color amarillo) en la superficie del medio.Rojo de Metilo* Prueba positiva: el cultivo es lo suficientemente ácido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH= 4,4) en la superficie del medio.* Prueba negativa: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio.

Prueba de movilidad

Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunque existen algunas formas de cocos móviles.

  Permite analizar la capacidad de movimiento del microorganismo en estudio. Las bacterias tienen movilidad por medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos (especies de Bacillus, Enterobacter y Vibrio). Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el género Klebsiella (-) de las

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restantes que suelen ser movilidad (+) y pueden existir además algunas formas de cocos móviles.

Realización de la prueba:

Sembrar la muestra del microorganismo en estudio por punción con asa recta, en un tubo conteniendo agar en baja concentración (0,4%)

Incubar a 37 oC durante 48 horas. Observar presencia o ausencia de crecimiento a lo largo de la línea de punción.

Interpretación de resultados:* Prueba positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y difunden en el medio provocando turbidez.* Prueba negativa: crecimiento bacteriano en la línea de siembra, el medio circundante se mantiene claro. 

Fenilalanina Desaminasa

Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico por su actividad enzimática de fenilalanina desaminasa, con la consiguiente acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies del género Proteus y del grupo Providencia por lo que se usa para separar ambos géneros de otras enterobacterias.

Realización de la prueba:

Se cultiva el microorganismo en agar fenilalanina sembrando la superficie del slant con abundante inóculo e incubando durante 12-16 horas.

Se añade 0,2 mL de una solución de cloruro férrico al 10% de manera que inunde todo el crecimiento.

Interpretación de resultados:* Prueba positiva: La presencia de ácido fenilpirúvico se manifiesta por la aparición de un color característico verde oscuro o verde-azulado.

Prueba de la Lactosa

Esta prueba se usa para diferenciar entre las enterobacterias en general y el grupo de las coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importancia debido a que los coliformes se utilizan como organismos indicadores de contaminación fecal en análisis, sobre todo, de aguas. En bacteriología se define el grupo de organismos coliformes como los "bacilos Gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas y que fermentan la lactosa con formación de gas a 35 ºC en 48 horas". No se trata de un grupo taxonómico e incluye una gran variedad de bacterias, la mayoría de ellas de origen intestinal.

Realización de la prueba:

Una manera sencilla de realizar la prueba de la fermentación de la lactosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo en agar MacConkey, ya que

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este medio, además de selectivo frente a bacterias no entéricas, es diferencial ya que contiene lactosa y un indicador de pH (rojo neutro).

Incubar de 24 a 48 horas a 37 ºC Observar resultados

Interpretación de resultados:* Prueba positiva: Las colonias lactosa (+) aparecerán de color rosado debido a la liberación de productos ácidos que producirán un cambio de pH en el medio que se detectará gracias al rojo neutro.* Prueba negativa: Las colonias lactosa (-) presentarán un color amarillento.

Prueba del Manitol

Sirve para detectar si los gérmenes son capaces de fermentar el manitol liberando productos ácidos que serán detectados gracias al indicador rojo de fenol que cambiará a color amarillo. Para esta prueba el medio manitol incluye 10.0 g/L de D-Manitol. Dentro de las bacterias manitol (-) se encuentran las enterobacterias como Proteus mirabilis, Proteus vulgaris y Shigella dysenteriae. Entre las bacterias de importancia clínica, la prueba del manitol sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (-).

Realización de la prueba:

Se inocula un agar de sal y manitol por estría cruzada, este medio es un medio selectivo por contener altas concentraciones de sales y diferencial ya que contiene manitol y un indicador de pH (rojo de fenol).

Incubar de 24 a 48 horas a 37º C Observar resultados

Interpretación de resultados:* Prueba positiva: Las colonias manitol (+) aparecerán de color amarillo debido a la liberación de productos ácidos que producirán un cambio de pH en el medio que se detectará gracias al rojo de fenol.* Prueba negativa: Las colonias manitol (-) presentarán un color rojo.

Prueba de la coagulasa

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la fibrina del plasma. El objetivo es buscar un factor de aglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del género Staphylococcus.

Procedimiento:

Mezclar 0.5 mL de plasma sin diluir con un volumen igual de cultivo puro de Sta. aureus. Examinar entre una y cuatro horas la formación de coágulo, los tubos negativos deberán conservarse durante toda la noche a temperatura ambiente y volverse a examinar.

Resultados:

Prueba positiva: presencia de un gran coágulo organizado o todo el contenido del tubo aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.

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Prueba negativa: ausencia de coágulos.

(+) Staphylococcus aureus

( - ) Staphylococcus epidermidis.

Prueba de TSI (Agar hierro y triple azúcar)

  Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico incorporado a un medio de crecimiento básico así como la de producir gas y ácido sulfhídrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

Este medio contiene 3 azúcares, los cuales se encuentran en diferente concentración:Glucosa 0.1 %, lactosa 1.0 %, Sacarosa 1.0 % Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar  nutritivo.- tubos en pico de flauta con agar hierro y triple azúcar, pH=7,4.- asa. Procedimiento:1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por punción y por estría 2.- Incubar a 37 oC durante 18-24 horas.3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni después).  Interpretación de resultados:La utilización de un hidrato de carbono implica la liberación al medio de productos ácidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio.Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los siguientes aspectos:A) Utilización del hidrato de carbono:* Si el microorganismo en estudio sólo fermenta la glucosa:a) en superficie: reacción alcalina, color rojo y en profundidad: reacción ácida, color amarillo.

K/A

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* Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar glucosa y lactosa o glucosa y sacarosa:NOTA: NO PUEDEN OCUPAR LAS TRES FUENTES DE CARBONOb) en superficie: reacción ácida, color amarillo y en profundidad: reacción ácida, color amarillo

A/A K/A K/A K/SC

* Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa ni la sacarosa (no entérico):C) en superficie: reacción alcalina, color rojo y en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color, el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla

K/SC

B) Producción de gas:* Si el microorganismo en estudio es aerogénico, la producción de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formación de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando un área clara.* Si el microorganismo en estudio es anaerogénico, no hay producción de gases.

C) Producción de ácido sulfhídrico (SH2):

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* Si el microorganismo en estudio produce este ácido, se manifestará por la presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo.

* Si el microorganismo en estudio no produce este ácido, se manifestará por la ausencia de dicho precipitado

Prueba LIA (Agar de hierro y lisina)

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar además la producción de H2S

Existen bacterias capaces de descarboxilar el aminoácido L-lisina para dar cadaverina y anhídrido carbónico por acción de la enzima lisina descarboxilasa, que es una enzima inducida que se produce en presencia del sustrato , de acidez y de condiciones de anaerobiosis, los productos de la descarboxilación producen desvío del pH hacia la alcalinidad, lo cual se hace visible por el vire del indicador (púrpura de bromocresol) a púrpura, indicando una prueba de lisina positiva.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de microorganismos en el medio de cultivo por picadura y en la superficie e incubar por 24 horas a 37° C .

Interpretación y Resultados:

Descarboxilación de la lisina +: coloración púrpura

Descarboxilación de la lisina -: Coloración amarilla en el fondo por la utilización de la glucosa, dando productos ácidos.

NOTA: Con este medio se pueden diferenciar los géneros de Proteus y Providencia debido a que son capaces de desaminar a la lisina provocando la aparición de una coloración roja en el pico de flauta. 

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K/A SH2

Prueba de Indol.

Con esta prueba bioquímica se mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de la molécula de triptofano.Sirve para diferenciar Escherichia coli y distintas especies del género Edwarsiella (+) de especies de los géneros Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (-). Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar  nutritivo.- tubos agar MIO- asa.- reactivo de Kovacs: alcohol amílico + paradimetilbenzal- dehído en medio ácido.

Procedimiento:1.- Inocular tubos por punción con asa recta. Dejar un tubo sin inocular como control.2.- Incubar a 37 oC durante 24 horas.3.- Determinar la presencia de indol utilizando el reactivo de Kovacs. Para ello, agregar 0,1 ml de reactivo y dejar reposar hasta la formación de un anillo.6.- Observar coloración. Interpretación de los resultados* Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohólica (corresponde a la formación de un compuesto quinónico coloreado derivado del indol).* Prueba negativa: anillo amarillo en la superficie del medio en la capa alcohólica (ausencia de indol en medio de cultivo). 

Prueba del citrato

 Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Entre las

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enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno respectivamente y azul de bromotimol como indicador de pH. Sólo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Materiales:- cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar  nutritivo.- tubos con agar citrato de Simmons- asa        Procedimiento:1.- Inocular tubos con agar citrato de Simmons inclinado e inocular la superficie por estría. Dejar un tubo sin inocular como control.2.- Incubar a 37oC durante 24 horas.3.- Observar la presencia o ausencia de crecimiento. Interpretación del resultado:* Prueba positiva: hay crecimiento con o sin vire* Prueba negativa: ausencia de crecimiento. 

Prueba de la Ureasa

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Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo retardado.

Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio se complementa después del autoclavado con 50ml/l de urea. Ésta será degradada por aquellos microorganismos capaces de producir la enzima ureasa. Esta degradación produce amoniaco que hará variar el color del indicador (rojo fenol) de amarillo a rosa, poniéndose así de manifiesto la actividad ureasa.

Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo de incubación ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco después de la inoculación y sus resultados deben ser leídos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48 horas de incubación.

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MEDIO SEMISÓLIDO CISTINA-DIGERIDO TRÍPTICO CTA

Este medio se utiliza principalmente para la identificación de Neisseria. Contiene 1%

de hidratos de carbono y rojo de fenol como indicador de pH. Se utiliza

fundamentalmente para la detección del ácido producido por los organismos

fermentadores, las pequeñas cantidades de ácido producidas en forma oxidativa por

algunas especies de Neisseria pueden ser no detectadas.

AGAR SELLERS

Es un medio diferencial ampliamente utilizado para estudiar determinadas

características bioquímicas que sirven para la identificación del grupo de bacilos Gram

negativos No fermentadores o con poco poder degradante de los carbohidratos

En este medio se induce la producción de pigmentos fluorescentes producidos

principalmente por algunas especies del género Pseudomonas, además podemos

determinar la capacidad de una bacteria para reducir los nitratos presentes en el

medio hasta gas nitrógeno (principalmente presente en Pseudomonas aeruginosa

INGREDIENTES: Cloruro de Sodio 2g, Nitrato de Sodio 1g, Nitrito de Sodio 0.350g,

Sulfato de Magnesio 1.50g, Fosfato Dipotásico 1g, Peptona de gelatina 20.0g, D-

Manitol 2g, L-Arginina 1g, Extracto de levadura 1g, Azul de bromotimol 0.040g, Rojo

de fenol 0.008g, Agar 13.5g (fórmula aproximada en gramos por litro). pH final 6.7

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RESUMEN DE RESULTADOS

PRUEBA RESULTADO POSITIVO

Oxidasa Aparición de color azulCatalasa Aparición de burbujas de O2

Licuefacción de gelatina Medio líquidoNitratos Cambio de color (rojo oscuro)O/F Oxidación Color amarillo en la superficieO/F Fermentación Color amarillo en todo el tuboExtracción de pigmento (cloroformo) Color azul verdosoHidrólisis de almidón Halos de degradaciónVoges Proskauer Color rojo rosado en la sup. del medio

Rojo de metilo Color rojo definido en la sup. del medio

MovilidadDifusión a partir de la línea del inóculo o turbidez

Fenilalanina desaminasa Aparición de color verde oscuroLactosa Colonias de color rosadoManitol Colonias de color amarilloCoagulasa Presencia de coágulo

TSICarbohidrato- cambio de color a amarilloGas- formación de burbujasH2S- ppdo negro

LIALisina + color púrpura en el fondo de tuboH2S- ppdo negro

Indol Anillo rojo en la superficie del medioCitrato positivo CrecimientoUrea Crecimiento y coloración rosada

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MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL CRECIMIENTO DE COCOS

GRAMPOSITIVOS.

Agar Sangre.

Uso. Para aislamiento de bacterias y diferenciación de acuerdo a la actividad

hemolítica.

Principio. La abundante base nutritiva proporciona condiciones óptimas de desarrollo a

todos los microorganismos. La infusión de músculo cardiaco y la peptona, son la

fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento. El cloruro de sodio

actúa para mantener el equilibrio osmótico y la sangre para diferenciar el tipo de

hemólisis.

Agar de Sal y Manitol

Uso. Medio selectivo empleado para aislar estafilococos patógenos de materiales

clínicos (orina, heridas, exudados faríngeos, etc.). En la industria alimenticia se aplica

para el mismo objetivo.

Principio. La degradación de manitol con producción de ácido cambia el color del

medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto contenido de cloruro de sodio, puede

hacerse una siembra masiva del material en estudio. Las placas se incuban de 24 a 48

hrs. La formación de colonias de estafilococos no patógenos son de tamaño pequeño

rodeadas de una zona roja. Los estafilococos patógenos producen ácido del manitol,

dan colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si se agrega a cada litro

de medio una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que

además de fermentar el manitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de

ácidos grasos alrededor de la colonia. Este fenómeno comprueba la propiedad de

coagular el plasma que presentan los estafilococos patógenos coagulasa positivos. La

elevada concentración de cloruro de sodio inhibe a la mayoría de las bacterias que son

halo-sensibles y favorecen a los estafilococos haloresistentes.

Agar para Estafilococos No.110

Uso. Para el aislamiento de cepas patógenas de estafilococos a partir de muestras

clínicas y alimentos.

Principio. El medio contiene peptona de caseína y extracto de levadura, que actúan

como fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento para los

microorganismos. La alta concentración de cloruro de sodio produce una inhibición

completa de bacterias diferentes a los estafilococos (que no poseen alta tolerancia al

NaCl). El manitol y la lactosa se utilizan como fuentes de energía y la gelatina pone de

manifiesto la capacidad del microorganismo para hidrolizarla.

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Agar para Prueba de DNasa

Uso. Para la demostración de la actividad de la enzima desoxirribonucleasa (DNasa)

de bacterias, hongos y especialmente en la identificación de Estafilococos DNasa

positivos.

Principio. Las peptonas proporcionan los nutrientes necesarios para el desarrollo de

los microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmótico. El DNA

manifiesta la presencia de la enzima DNasa, la cual depolimeriza al DNA. Cuando se

incorpora azul de toluidina al 1% en toda la superficie del medio, toma un color azul

donde queda DNA.

Sembrar por estría la superficie del medio, con cultivos puros del microorganismo en

estudio. Sobre una misma placa pueden sembrarse varias cepas, hacer estrías de 2

cm de largo. Incubar 24h a 35 °C. La temperatura y el tiempo de incubación pueden

variar, según el microorganismo de prueba. Después de obtener un buen desarrollo,

cubrir cuidadosamente la superficie de las placas con ácido clorhídrico 1N. Las

colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor al ácido desoxirribonucleico

(DNA) contenido en el medio. Al acidificar precipita el DNA observándose turbidez por

lo que las colonias DNasa-positivas presentan a su alrededor halos de aclaramiento

perfectamente delimitados, contrastando con el medio turbio. Los DNasa-negativos se

observan sin formación de halo.

Ingredientes: Agar 15.0gr, Ácido desoxirribonucleico 2.0gr, Cloruro de sodio 5.0gr,

Peptona de caseína 15.0gr, Peptona de soya 5.0gr.

Para el caso de Staphylococcus aureus se observa buen crecimiento, con halo claro o

rosa brillante; para Staphylococcus epidermidis se da buen crecimiento, sin halo claro.

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PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARA Streptococcus

Sensibilidad a Bacitracina

Se utiliza en la identificación presuntiva de los estreptococos ß-hemolíticos del grupo

A de Lancefield que suelen ser sensibles a bajas concentraciones de este antibiótico.

Se realiza sobre placas de agar sangre de carnero al 5% inoculadas en superficie,

colocando discos con 0,04 U de bacitracina.

Principio de la prueba:

Los discos del papel estériles cada uno que contiene 0.04-0.05 unidades de

bacitracina, para la diferenciación los Estreptococos del Grupo A de Lancefield de otro

beta-hemolítico.

Se mostró que el Grupo A de Streptococcus eran más sensibles a la bacitracina que

los beta-hemolíticos, del grupo B y por consiguiente podrían usarse bacitracina como

un agente de diagnóstico rápido para el Grupo A.

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Prueba de CAMP La identificación en el laboratorio de los Streptococcus b-hemolíticos del grupo B ha

sido simplificada con la implementación de la prueba de CAMP, la cual es fácil de

realizar. El fenómeno de CAMP fue reportado por primera vez en 1994 por Christie,

Atkins y Much-Peterson.

Principio. Se basa en la potenciación de la zona de lisis formada por Staphylococcus

aureus productores de ß-lisina por el denominado factor CAMP de los Streptococcus

tipo B.

Medio y reactivos. El desarrollo de la prueba es en cajas petri convencionales con

Agar Gelosa sangre de carnero.

La prueba se lleva a cabo marcando unas líneas de Streptococcus (a ser identificado)

perpendiculares a una de Staphylococcus aureus para que se produzca la B-lisina. Las

dos líneas no se deben tocar la una a la otra. Las placas se incuban a temperatura

ambiente, no se deben incubar en condiciones anaerobias porque provocan que

Streptococcus del grupo A den positivo en ausencia del oxígeno.

Interpretación: La zona donde hay lisis toma la forma de una cabeza de flecha

apuntando hacia la línea de Staphylococcus aureus. Un resultado Bacitracina

negativa, CAMP positivo, bili-esculina-negativa, puede ser reportado como

Streptococcus del grupo B.

Control: Positivo: S. grupo B (S. agalactiae)

Negativo: S. grupo A (CAMP negativo) o S. grupo D.

CAMP positivo CAMP negativo

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Bibliografía

1.-Bailey and Scott. 2009. Diagnóstico Microbiológico. 12ª. edición. Ed Médica

Panamericana.

2.-Bergey’s 1994. Manual. Determinative bacteriology. 9a. edición. Williams &

Wilkins.

3.-Cowan y Steel.1988. Manual para la identificación de bacterias de interés médico.

Ed. Panamericana.

4.-Hernández–Méndez, J.T y colbs. 2003. Bacteriología Médica Diagnóstica. Instituto

Politécnico Nacional. 2ª. edición. Ed. Cuéllar.

5.-Koneman. 2003. Diagnóstico Microbiológico. 5ª. Edición. Ed. Médica

Panamericana.

6.-Mc Faddin 1998. Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Interés

Médico. Ed. Panamericana.

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