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Tema 4 Transcripcin y traduccin. Interacciones relevantes.

TranscripcinSntesis de ARN sobre una sola cadena de ADN, que

acta como molde. La secuencia del ARN es complementaria a la cadena molde y equivalente a la cadena codificante.

El proceso est catalizado por la enzima ARN polimerasa. Es unidireccional de 5 a 3 o de regin proximal a distal o de regin aguas arriba a regin aguas abajo.

La unidad de transcripcin

Una unidad de transcripcin es una secuencia de ADN que se transcribe a un nico ARN, empezando por el promotor y finalizando en el terminador.

Comprende: - Promotor, al principio del gen - Sitio de inicio y regin que codifica - Terminador, secuencia al final del gen

El primer nucletido que se transcribe es el punto de referencia +1.

Fases de la transcripcin Reconocimiento del promotor: unin de la ARN polimerasa al ADN

en un promotor - Formacin del complejo cerrado: la ARN polimerasa

abrazada al ADN - Formacin del complejo abierto: ADN parcialmente

desnaturalizado Los promotores estn alineados de acuerdo a sus homologas, o

secuencias de bases similares que aparecen justo delante de la primera base transcrita (punto de iniciacin)

Iniciacin: sntesis de los primeros enlaces nucleotdicos en el ARN. Suele haber sntesis abortivas hasta que no hay 4-5 nucletidos, fase crtica, no empieza la sntesis real. La fase de iniciacin termina cuando la enzima logra elongar la cadena y abandona al promotor.

Elongacin: formacin de la cadena. Implica el movimiento de la burbuja mediante la alteracin de la estructura del ADN, en la que la cadena molde de la regin que se ha desenrollado se aparea con el ARN naciente en el punto de crecimiento.

Terminacin: requerimientos distintos en procariotas y eucariotas. Implica el reconocimiento del punto que determina el final de la adicin de bases a la cadena.

Aguas arriba Aguas abajo

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INICIACINLa burbuja de la transcripcinLa transcripcin ocurre en una burbuja, en la que el ARN es

sintetizado mediante el apareamiento de bases con una cadena de ADN en la regin desenrollada transitoriamente. A medida que la burbuja progresa, el ADN bicatenario se vuelve a formar detrs de ella, desplazando al ARN como una cadena nucletdica sencilla. Durante la transcripcin, la burbuja se mantiene dentro de la ARNpolimerasa, que desenrolla y enrolla el ADN, mantiene las condiciones de las cadenas codificante y molde.

La burbuja de la transcripcin (dentro de la ARN polimerasa) se desplaza a lo largo de la unidad de transcripcin

La polimerasa es un complejo enzimtico grande y organizado, el sitio cataltico rodea a la cadena molde.

RNA polimerasa de E. coli (Eubacterias)La capacidad de catalizar sntesis de ARN define el componente mnimo (ncleo) de la polimerasa: 2.

Holoenzima: complejo competente para la iniciacin: 2

Las ARN polimerasas de las eubacterias tienen 4 tipos de subunidades: , , tienen tamaos relativamente constantes en especies bacterianas diferentes, y es ms variable.

Las subunidades y componen el centro cataltico. La subunidad es necesaria para ensamblar el ncleo enzimtico, importante para mantener la estructura,

interviene en el reconocimiento del promotor y en la interaccin de la ARNpol con factores auxiliares. La subunidad interviene especficamente en el reconocimiento del promotor, slo aparece en la

iniciacin, para reconocer el ADN, se separa del complejo en la elongacin.

Ensamblaje de la enzima Reconocimiento del promotor Une algunos activadores

Especificidad del promotor

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Polimerasas eucariotasTpicamente 12 subunidades Polimerasa I

- Sintetiza ARNr en el nucleolo - La de mayor actividad

Polimerasa II - Sintetiza ARNhn (heterogneo nuclear) en el nucleoplasma, que dar lugar al ARNm

Polimerasa III - Sintetiza ARNm pequeos en el nucleoplasma (ARNt y otros)

Algunas subunidades son comunes a las tres.

RNApol II

Hay 3 polipptidos mayores muy similares a los de E.coli (, y ). La polimerasa en eucariotas es ms compleja, puesto que el ADN tambin lo es. Hay ms posibilidades de interaccin.

Estructura de los complejos ADN-RNA polimerasaRNA polimerasa tiene un canal para el ADN. Dimensiones de la polimerasa de E. coli: 90 95 160

Dimensiones del ADN dentro de la polimerasa, en la burbuja:

- 25 bases de longitud - 9 bases apareadas - 10 bases aguas arriba - 10 bases aguas abajo

El ADN se retuerce en el sitio activo.

El resto de subunidades mantienen la estructura.

La RNA polimerasa II de levaduras: 12 subunidades

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Hay polimerasas ms simples, bacterifagos, virus, fagos. El fago T7 tiene la polimerasa con un solo polipptido, es muy rpida.

Anlisis de interacciones ADN /protenasRetardo /retraso en gel o cambio de banda (band shift) Se detectan los complejos ADN- protena. En un gel de electroforesis se detecta porque las protenas

retrasan la movilidad del ADN, con lo que la banda se retrasa. Se necesita tener un fragmento de ADN definido, que se hace por PCR.

Se puede ver por medio de una electroforesis, en el lugar de la banda aparece una banda retardada. Se usan geles no desnauralizantes o nativos. En la prctica lo habitual es que parte de la banda se retrase (aparecen 2 o mas bandas, si hay mas de un sitio de unin pueden aparecer 3 o mas).

Se requieren fragmentos definidos de ADN y protenas purificadas o no (extractos). En principio no hace falta marcar el ADN, pero hay que poner suficiente para verlo a simple vista.

Cuando hay muy poca protena s se usa radiactividad. Esta tcnica no permite identificar secuencias para las que son afines las protenas, solamente que se

unen protenas.

Requiere: Fragmentos definidos de ADN Protenas purificadas o no (extractos)

La regin promotora de nblA: sitios de unin a protenas (diapositiva n 13)

Estrategias experimentales para mapear interacciones con protenas Footprinting

- Estrategias de proteccin frente a digestin o modificacin. - Estrategias inversas: la modificacin interfiere con la interaccin.

Se usa para mapear el sitio de unin a la protena. Se basa en que si se tiene una protena unida al ADN y se ataca a ste con endonucleasas, stas no cortan el fragmento protegido por la protena, y puede ser detectado.

Hay estrategias inversas, que consisten en modificar la regin de inters, con lo que ahora la protena no puede unirse.

- Ensayo de proteccin frente a nucleasas (DNAasa I) o footprinting clsico: localizacin precisa del sitio de unin de una protena a un fragmento de ADN. Requiere geles de secuenciacin y marcaje de ADN. Se usa ADN bicatenario marcado en un extremo. Se intenta introducir un corte en cada cadena. Permite obtener fragmentos marcados con diferentes tamaos. Se hace lo mismo en presencia de la protena y se vuelve a digerir con nucleasa, donde se encuentra la protena la endonucleasa no puede cortar.

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Una secuencia de ADN unida a la protena se digiere parcialmente con una endonucleasa para atacar enlaces fosfodister individuales en el cido nucleico. Bajo las condiciones apropiadas, un enlace particular se rompe en algunas de, pero no en todas, las molculas de ADN. Las posiciones en las que se ha cortado se reconocen mediante el marcaje de las molculas de ADN solamente en un extremo de una hebra, origina un fragmento de longitud nica. Los fragmentos digeridos se recuperan y se someten a electroforesis. Cada fragmento que tenga un extremo marcado produce una banda radiactiva. La posicin de la banda corresponde al nmero de bases en el fragmento.

Se corren dos reacciones en paralelo, un control de ADN puro y una mezcla experimental que contiene molculas de ADN unidas a protenas. Cuando una protena unida bloquea el acceso de la nucleasa al ADN en la mezcla experimental, aquellos enlaces que se encuentren en la secuencia unida no se rompern.

En el control cada enlace se rompe, generando una serie de bandas, cada una de las cuales representa una base. En el fragmento protegido, los enlaces no se pueden romper en la regin que une la protena, no se originan bandas que representen los fragmentos de las longitudes correspondientes.

Comparando el control y los carriles experimentales con una reaccin de secuencia que se corre en paralelo es posible leer la secuencia correspondiente directamente, y as identificar la secuencia de nucletidos del sitio de unin.

Hay bandas con distinta intensidad porque la ADNasa corta con cierta especificidad. Las regiones que desaparecen son los sitios de unin a las protenas.

La tcnica permite ver zonas de unin conjunta entre dos protenas. En ciertos casos se aprecia la disminucin de intensidad de las bandas en lugar de su desaparicin, o en

ciertos casos inclusive el aumento de la intensidad, porque la protena cambia la conformacin del ADN y aumenta la afinidad de la ADNasa por la zona.

- Proteccin por NFAT (factores de la transcripcin)

proteccin frente a DNAsa

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Footprinting con agentes modificadores de bases Los puntos en los que la ARN polimerasa contacta con el

promotor se pueden identificar modificando la tcnica del ensayo de proteccin con agentes modificadores de bases. Permiten la rotura en el enlace correspondiente en la cadena polinucleotdica. El sitio de rotura se puede identificar de forma similar a la anterior.

La enzima protege al ADN contra el agente qumico. En ciertos casos en vez de la ADNasa se usa un DMS

(dimetilsulfato), que modifica guaninas. Se generan footprintings con menos bandas (solo las que acaban en G). Tras el marcaje se usa piperidina, reactivo que corta detrs

Motivos de unin a ADNMotivos: segmentos de protenas (dominios) con estructura secundaria caracterstica, que interaccionan

con el ADN. Regin corta con una estructura secundaria particular, normalmente hlices .

- HTH: hlice-giro-hlice - HLH: hlice-lazo-hlice - Dedos de cinc - Cremalleras de leucina

HTH: dos hlices con un ngulo caracterstico. - Presente en reguladores procariticos y algunos eucariticos - Homeodominio: presente en genes hometicos, caractersticos del desarrollo animal. La

secuencia primaria de la protena es diferente pero la estructura secundaria se mantiene.

proteccin frente a dimetil-sulfato (DMS)

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Una de las hlices se sita en el surco mayor del ADN, hlice de posicionamiento, reconoce y realiza los contactos con el ADN. La otra hlice es de posicionamiento, participa en colocar la hlice de reconocimiento. Entre la hlice de reconocimiento y el ADN se establecen puentes de hidrgeno.

Homeodominio: forma parte de un dominio mayor de la protena. Tiene dos hlices ms de posicionamiento

La hlice 3 del homeodominio se une al surco mayor del ADN, y las hlices 1 y 2 se sitan por fuera de la doble hlice. La hlice 3 contacta tanto con la columna de fosfato como con las bases especficas. El extremo N-terminal se sita en el surco menor y realiza contactos adicionales.

El homeodominio solo es responsable de la unin al ADN

HLH: son motivos de homo y heterodimerizacin. Los contactos los proporciona la hlice- por medio de

aminocidos bsicos. Cada hlice anfiptica presenta una cara de residuos hidrofbicos en un lado y de residuos cargados en el otro lado. El motivo permite que las protenas dimericen, y una regin bsica cercana contacta con el ADN.

Diferentes tipos de heterodmeros tienen diferente afinidad por sitios de unin en el ADN y efectos muy distintos (activan o reprimen) sobre la transcripcin.

Hay dos tipos de protenas HLH dimerizadas: - bHLH: con regiones bsicas, interaccionan con el ADN - HLH: uno de las unidades no tiene regiones bsicas, no interaccionan con el ADN.

Dedos de cinc: comprende un motivo de unin al ADN, un patrn caracterstico de residuos de cistena e histidina. Un grupo de aminocidos conservados se une a un in de cinc y forma un dominio relativamente independiente en la protena.

El motivo toma su nombre del bucle de aminocidos que protuye desde el sitio de unin al cinc.

Tipo Cys2-his2: Secuencia: Phe y Leu son aminocidos hidrofbicos conservados

Presentes en protenas eucariotas y en protenas de unin al ARN, el motivo puede aparecer en un nmero variable de veces. La hlice- es la que interacciona con el ADN

Tipo Cys2-Cys2: sin histidina, forman dmeros, caracterstico de los receptores de glucocorticoides.

Cys-X 2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His

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Cremalleras de leucina: secuencia de aminocidos con un residuo de leucina en cada sptima posicin. Tpicas de eucariotas

Una cremallera de leucina en un polipptido interacta con una cremallera de leucina en otro polipptido para formar un dmero. Adyacente a cada cremallera hay una secuencia de residuos con carga positiva (bsicos), implicada en la unin al ADN. La leucina es un motivo de dimerizacin, permitiendo mantener las hlices juntas, une los monmeros y contina con la regin que mantiene los contactos con el ADN.

Las dos cremalleras de leucina forman una estructura en forma de Y, en la cual las cremalleras forman el tallo y las dos regiones bsicas se bifurcan simtricamente para formar los brazos de unin al ADN. Esto se conoce como el motivo estructural bZIP y explica por qu las secuencias diana para tales protenas son repeticiones invertidas sin separacin.

Promueven la formacin de homodmeros y heterodmeros con otras protenas, adquieren funciones distintas.

Reconocimiento del promotor en bacteriasEl promotor es una secuencia de ADN que debe ser reconocida por protenas y difiere de otras secuencias

que han de ser transcritas o traducidas. La informacin que determina la funcin del promotor la proporciona directamente la secuencia del ADN: su estructura es la seal. Ejemplo clsico de elemento de accin en cis.

Las regiones expresadas solo adquiren significado despus de que la informacin es transferida en la forma de otros cidos nucleicos o protenas.

La polimerasa tiene afinidad por el ADN pero no distingue secuencias especficas, no tiene motivos de reconocimiento.

El factor sigma (polipptido ). La transcripcin slo puede ser iniciada por la holoenzima. El factor sigma

asegura que la ARN polimerasa bacteriana se una al ADN de una forma estable solamente en los promotores. El factor sigma es liberado cuando la cadena de ARN alcanza 8-9 bases, dejando al ncleo de la enzima para que proceda con la elongacin.

El ncleo de la enzima tiene una afinidad general por el ADN, por atraccin electrosttica entre la protena bsica y el cido nucleico acdico. Cualquier secuencia de ADN (al azar) que se encuentre unida a la ARN polimerasa mediante esta unin general se denomina sitio de unin dbil.

El factor sigma introduce un cambio en la afinidad de la polimerasa por el ADN. La holoenzima ha perdido su capacidad para reconocer los sitios de unin dbiles, por tanto el factor sigma desestabiliza la capacidad de unir ADN de forma general, pero aumenta la afinidad especfica por regiones concretas que son los promotores. El factor sigma confiere afinidad por promotores.

El promotor de E.coli

Reconoce la holoenzima cargada con 70. Los sitios de reconocimiento en el ADN se pueden definir como una secuencia ideal constituda por las

bases que aparecen con ms frecuencia en una posicin determinada. Una secuencia consenso es un fragmento corto en el promotor que est conservado y es crucial para su funcin. La conservacin de slo

Las Leu en las caras hidrofbicas de las hlices interactan entre s

bZIP

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secuencias consenso muy cortas es una caracterstica de sitios reguladores (promotores) tanto en procariotas como en eucariotas.

En los promotores bacterianos hay 4 elementos conservados:

- El sitio de iniciacin: generalmente una purina, la base central de la secuencia C A /G T

- La secuencia en la regin 10. Caja TATA - La secuencia en la regin 35 - La separacin entre las secuencias 10 y 35 (16-19

pb)

Aguas arriba del sitio de iniciacin, hay una regin de 6 pb que es reconocible en casi todos los promotores. El centro se encuentra a unas 10 pb aguas arriba del sitio de iniciacin, secuencia 10. el consenso es TATAAT. Los nmeros subndice representan el porcentaje de aparicin de la base encontrada con ms frecuencia, variando entre el 45 y el 96%.

La secuencia 35 tiene el consenso TTGACA. Cuanto ms parecido sea un promotor a la secuencia consenso, ms fcil es la transcripcin.

Anlisis de interacciones promotor- ARN polimerasa: estrategias Moleculares:

- Proteccin - Modificacin

Genticas: mutaciones que afectan a la actividad promotora disminuyen la frecuencia de iniciacin - Efecto de mutaciones - Supresiones

La polimerasa se une principalmente a una cara del ADN: cadena codificante. Tiene ms flechas en el esquema indica que la relacin con la holoenzima es asimtrica.

Una cara del promotor contiene los puntos de contacto para la ARN polimerasa. De los ensayos de mutacin se deduce que las regiones 35 y 10 contienen la mayora de los puntos de

contacto para la enzima. Se demuestra que son secuencias importantes porque las mutaciones en esa zona disminuyen la eficacia de la transcripcin. (doble flecha lila)

Las mutaciones que hacen que la secuencia se aleje del consenso dan informacin sobre la especificidad (bases concretas) en la interaccin holoenzima-ADN.

Las flechas negras sealan sitios protegidos por la polimerasa (Footprinting), hay regiones que no son atacadas porque estn protegidas por la polimerasa, ms en la cadena codificante, hay dos bloques de

Regin 10 T80A95T45A60A50T96 Regin -35 T82T84G78A65C54A45

Modificaciones que impiden la unin de la polimerasa

Sitios protegidos por la polimerasa, la polimerasa protege de la modificacin

Mutaciones que afectan la actividad promotora, afecta a las 2 cadenas. Las mutaciones eliminan o reducen la actividad del promotor

-10: conversin CC a CA -35: formacin de CC

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proteccin y abarca una zona ms amplia que la anterior, siendo la zona de unin a la polimerasa donde se establecen los enlaces fuertes.

Las flechas verdes indican modificaciones que impiden la unin de la polimerasa, ensayos de interferencia (protena unida a una secuencia especfica). La interferencia se hace aguas arriba de la regin 35, cualquier grupo qumico que se aada impedir que se forme el complejo.

Como el ADN se desnaturaliza en la burbuja: las bases desapareadas de la burbuja son susceptibles de ser modificadas por agentes qumicos (metilacin) permitiendo definir que la caja TATA forma parte de la burbuja y aguas abajo se encuentra el inicio de la transcripcin.

La regin 10 est implicada en la formacin del complejo abierto, conversin del complejo cerrado a complejo abierto.

La regin 35 est implicada en la formacin del complejo cerrado y con la interaccin con la polimerasa en el contacto inicial.

Una cara del ADN establece ms y mejores contactos con la polimerasa que la otra. El inicio de la transcripcin es muy dependiente del grado de superenrollamiento del ADN. Enrollamiento

y desenrollamiento ocurren de forma simultnea a medida que la polimerasa transcribe el ADN. A medida que la polimerasa empuja hacia delante sobre la doble hlice, va generando superhlices positivas (ADN ms empaquetado), y deja superhlices negativas detrs (ADN parcialmente desenrollado); aumenta el nmero de vueltas por delante y disminuye por detrs. La torsin negativa facilita la desnaturalizacin. La girasa introduce hlices negativas; la topoisomerasa quita hlices negativas.

Muchos promotores mejoran la transcripcin disminuyendo el superenrollamiento, sobre todo las cajas que tienen menos AT.

La polimerasa cambia de conformacin segn est en iniciacin o elongacin. Cuando se encuentra en fase de elongacin se libera del factor sigma y se hace

ms compacta abarcando un menor nmero de bases.

Relacin estructura funcin en 70

Mutaciones y supresiones identifican zonas de interaccin. Los ensayos de supresin evidencian la interaccin. Las mutaciones supresoras nos indican los sitios de contacto.

La evidencia directa de que contacta con el promotor es la presencia de mutaciones en que suprimen mutaciones en las secuencias consenso. Cuando hay una mutacin que impide el reconocimiento por la polimerasa en una posicin determinada del promotor, y hay una mutacin compensatoria en que permita que la polimerasa utilice el promotor mutante, se puede decir que el par de bases de ADN relevante est en contacto con el aminocido que ha sido sustituido.

Sin mutacin (silvestre) se establece interaccin entre aminocidos de y bases especficas del ADN, si se muta alguna base no se produce interaccin, pero una mutacin en el aminocido se restablece la interaccin.

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Mapa de 70 de E.coli que identifica las regiones conservadas. Las regiones 2.1 y 2.2 contactan con el ncleo de la polimerasa, es la parte ms conservada de .

2.3 se requiere para la fusin y 2.4 y 4.2 contactan con los elementos del promotor en 10 y 35.

La regin N-terminal evita que 2.4 y 4.2 se unan al ADN en ausencia del ncleo de la enzima.

Delecionando N-terminal se produce una unin fuerte de con el ADN en secuencias promotoras, esto sugiere que esta regin se comporta como un dominio de autoinhibicin, por s solo no se establece la interaccin con el ADN, precisa de la polimerasa.

2.4 y 4.2 forman -hlices en la protena, establecen contactos, puentes de hidrgeno, con ciertas bases en la cadena que no sirve de molde en la secuencia 10 del promotor.

Los factores sigma confieren especificidad a la polimerasaEl factor 70 es universal, hay otros factores que establecen una relacin coordinada de grupos de

genes, transcriben operones relacionados y reconocen promotores caractersticos. Los factores sigma de

E.coli reconocen a los promotores con diferentes secuencias consenso.

Reguln: conjunto de operones con regulacin comn, el regulador puede ser . Se asocian en relacin a situaciones ambientales, estrs, choque trmico, se produce la sntesis de nuevas protenas.

El factor ms comn, responsable de la transcripcin de la mayora de los genes en condiciones normales es 70. los factores alternativos se activan en respuesta a cambios ambientales, o para la expresin de genes flagelares durante el crecimiento. Todos los factores pertenecen a la misma familia de protenas (son homlogos) excepto 54.

Induccin del factor : en la clula hay abundante 70, pero si cambian las condiciones ambientales la sntesis de protenas que se estn produciendo en ese momento se para o disminuye, y se sintetiza una nueva serie de protenas, stas son producto de genes relacionados con la alteracin ambiental.

En un choque trmico, por ejemplo, el gen rpoH es un regulador necesario para poner en marcha la respuesta. Su producto es 32, que funciona como un factor alternativo que activa la transcripcin de los genes del choque trmico.

Los factores alternativos compiten con 70 por el ncleo de la enzima disponible, por tanto los genes que se transcriben durante la alteracin ambiental depende del equilibrio entre .

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Cada factor obliga a la polimerasa a iniciar la transcripcin en series de promotores determinados. Analizando la secuencia de estos promotores se puede mostrar que cada serie se caracteriza por la presencia de elementos reguladores nicos. La secuencia de cada tipo de promotor asegura que slo puede ser reconocido cuando la polimerasa es dirigida por el apropiado.

Una caracterstica de los promotores para cada enzima es que tienen el mismo tamao y localizacin en relacin con sitio de iniciacin, y que muestran secuencias conservadas slo alrededor de los centros de las secuencias 35 y 10. las secuencias consenso para cada serie de promotores difieren unas de otras en una o ambas secuencias 35 y 10, la transcripcin de los diferentes grupos es mutuamente excluyente.

54, se usa en condiciones de escasez de nitrgeno, tiene una separacin de 6 pb entre las secuencias consenso.

Factores : control temporal y espacial de la expresin gnicaEsporulacin en Bacillus subtilis

La esporulacin implica la diferencia de una bacteria vegetativa en una clula madre que se lisa, y una espora que se libera. Es como un proceso de minidesarrollo por expresin gnica programada en el tiempo. Tiene ms factores . La esporulacin es un ejemplo de cambios de factores .

El ADN se replica, se segrega un genoma hacia un extremo de la clula y es rodeado por la capa de la espora, especializacin en los dos polos celulares, cuando se forma el septo, con genes que tienen que ver con diferentes procesos.

El control gnico est dirigido por diferentes que regulan diferentes operones. Dentro del grupo de genes uno codifica un factor alternativo.

La expresin gnica en el tiempo est controlada por . hay genes de esporulacin tempranos y tardos, programacin en el tiempo y diferenciacin en el espacio; cambiando se producen cambios en el tiempo y en espacio.

La esporulacin implica cambios sucesivos de los factores s que controlan la especificidad de la ARN polimerasa. Las cascadas en la protoespora y en la clula madre se relacionan mediante seales que se transmiten a travs del septo (flechas horizontales).

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Iniciacin en eucariotasLos promotores son reconocidos por factores de transcripcin y no por la polimerasa. A la polimerasa le

encuentra encontrar los promotores, necesita de los factores auxiliares que la atraen. - Tres ARN polimerasa.

ARN pol I: transcribe ARNr ARN pol II : transcribe ARNm ARN pol III: transcribe ARNt y ARNsn (nuclear pequeo), 5S

- Abundancia de factores auxiliares (TF, de transcription factor). TFIIIB, factor de la polimerasa III.

- Abundancia de secuencias reconocibles por distintos factores. Mayor complejidad que en procariotas.

Inicio en promotores tipo I (humanos) La ARN polimerasa I tiene mayor actividad, reside

en el nucleolo y transcribe los genes que codifican el ARNr.

Hay muchas copias de promotores I todos iguales, los genes ribosmicos son iguales.

Estructura modular: el promotor tiene 2 mdulos - Ncleo del promotor, secuencia necesaria para

iniciar la transcripcin, no hay un consenso claro, pero cerca del inicio hay una regin rica en GC y otra rica en AT. Rodea al punto de inicio, desde 45 a +20.

- UPE o elemento de control aguas arriba, aumenta la transcripcin. No es un elemento esencial in vitro pero permite niveles ms altos de transcripcin, in vivo es necesaria.

Factores auxiliares: protenas que se unen al ADN previo a la transcripcin. La ARN pol I tiene dos: - UBF: afinidad por UPE. Polipptido que se une a un elemento rico en GC. La unin de la

protena a la regin UPE favorece la unin de otras protenas a la regin posterior. Tiene funcin de reclutamiento, primero atrae a SL1 y segundo atrae a la polimerasa.

- SL1: unin posterior al ncleo de la polimerasa. Por s mismo no tiene especificidad por el promotor, pero una vez que se ha unido UBF, el SL1 se puede unir de forma cooperativa para extender la regin de ADN que es cubierta. SL1 consta de 4 protenas, una de ellas es la TBP (TATA bilding protein), protena de unin a la caja TATA. Factor de posicionamiento.

Una vez que ambos factores se han unido, la polimerasa se puede unir al ncleo del promotor para iniciar la transcripcin, formando una estructura muy tupida.

La ARN polimerasa III: tiene 3 tipos de promotores. Tiene ms promotores que la polimerasa I y menos que la II.

- Tipo 1 y 2, son promotores internos, de control interno, ICR (internal control region). Se encuentran aguas abajo del inicio de la transcripcin. ARNt y 5S. Tienen dos tipos de elementos, dos secuencias cortas se encuentran separadas por una secuencia variable:

A y C, tipo 1 A y B, tipo 2, si las secuencias estn demasiado

juntas se puede anular la funcin

TBP

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- Tipo 3: son promotores tpicos con tres elementos: ARNsn

Iniciacin en promotores internos de polimerasa III, tipos 1 y 2 La iniciacin a travs de los promotores internos de pol III implica a los factores de ensamblaje TFIIIA

y TFIIIC, el factor de iniciacin TFIIIB y la ARN pol III. - TFIIIA y TFIIIC: factores de ensamblaje, permiten la unin de TFIIIB (TBP) cerca del inicio - TFIIB: factor de posicionamiento, permite la unin de pol III en el sitio de inicio.

TFIIIA pertenece a la clase de protenas con dedos de cinc. TFIIIB consta de TBP, que atrae a la polimerasa, y de otras dos protenas. TFIIIC es un gran complejo protenico que contiene al menos 5 subunidades.

TFIIIC reconoce el sitio B, pero se une a una zona ms extensa que incluyen a A y B

TIIIFA se une a una secuencia que incluye el sitio C, el cual se requiere para la funcin de unin de TFIIIC.

La unin de TFIIIC permite que TFIIIB se una a una secuencia alrededor del punto de inicio.

ARN polimerasa II: iniciacin Tiene muchos promotores diferentes, para la organizacin general de un promotor se define un

promotor genrico, que ser la secuencia ms corta posible en la cual la ARN pol II pueda iniciar la transcripcin.

Promotor genrico contiene como mnimon: - Caja TATA: aproximadamente en 25, hay promotores sin caja TATA - Sitio de iniciacin: Pirimidina-A-Pirimidina, donde A es el sitio +1

Factores de transcripcin tipo II Generales: aparato basal de transcripcin, se encuentran en casi todos los promotores Especficos: de un tipo celular concreto, los ms abundantes e importantes es eucariotas

superiores Inducibles: aparecen en respuesta a determinadas seales ambientales

El complejo de iniciacin: ensamblaje El complejo de iniciacin se une a los promotores de ARN pol II en una

secuencia ordenada de asociacin de los factores de transcripcin. 1. Unin de TFIID: interacta con la caja TATA 2. Otros factores se unen en un orden determinado 3. Unin de la RNA pol II 4. Algunos factores se unen despus

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El primer paso en la formacin del complejo es la unin del factor TFIID a la caja TATA. TFIID tiene dos tipos de componentes, TBP que reconoce TATA, y TAFs son factores asociados dependientes de promotor.

TBP es un factor universal en eucariotas y comn a los tres tipos de iniciacin. Se une al ADN en la

secuencia TATA del surco menor (todas las protenas conocidas de unin al ADN lo hacen en el surco mayor) en forma de silla de montar. Engloba al ADN, tiene una estructura simtrica, dos dominios homlogos. Empuja en el surco menor de la doble hlice abrindolo un poco, esto provoca torsiones en el ADN que sufre un fuerte impacto, y permite que otras protenas entren en contacto o eviten el mismo, induce una curvatura en el ADN de 80, afectando las interacciones con otras protenas.

Las ARN polimerasas se sitan en todos los promotores mediante un factor que tiene TBP.

TFIIIB se une junto a TFIIIC mientras que SL1 se une en conjuncin con UBF1.

TFIID es responsable solamente del reconocimiento de promotores para la ARN pol II.

En un promotor con un elemento TATA, TBP se une de manera especfica al ADN, pero en otros promotores puede ser incorporado por asociacin de con otras protenas que se unen al ADN.

Cualquiera que sea el medio de entrada en el complejo de iniciacin, tiene el propsito comn de interactuar con la ARN polimerasa.

Liberacin de promotores tipo II

Requiere fosforilacin del extremo carboxi-terminal de la ARN pol II Se fosforila la subunidad mayor de la polimerasa para que pueda

empezar a trabajar.

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Terminacin de la transcripcin en bacteriasLa terminacin implica el reconocimiento del punto que determina el

final de la adicin de bases a la cadena. Para terminar la transcripcin, hay que cesar la formacin de enlaces fosfodister, y el complejo de transcripcin debe desintegrarse. Cuando se aade la ltima base a la cadena de ARN, la burbuja se colapsa porque el dplex ARN-ADN desaparece, el ADN vuelve a su doble hlice y el ARN y la enzima son liberados.

Los terminadores son secuencias necesarias para la terminacin. La secuencia terminadora, 3, siempre se transcribe. Se forman estructuras en forma de horquilla en el ARN, importantes

para la terminacin. Interactan con la polimerasa. La polimerasa no transcribe siempre a la misma velocidad, hace

pausas, si en una de esas pausas la interaccin ADN-ARN es dbil la transcripcin se acaba.

Paralelismos con la iniciacin: - Secuencias en cis, son importantes en el sitio donde estn:

Promotores Terminadores

- Rotura de puentes de hidrgeno Iniciacin: ADN-ADN Terminacin: ADN-ARN

- Interacciones ARN polimerasa con: ADN en la iniciacin ARN en la terminacin

- La terminacin es dependiente de la estructura secundaria del ARN. La estructura secundaria del ARN, provocada por apareamientos intracatenarios, es importante para la funcin y est relacionada con la terminacin.

Terminadores de E.coliLos terminadores se han clasificado segn el requerimiento de

factores adicionales por parte de la ARN polimerasa para terminar in vitro.

- Terminadores intrnsecos: la polimerasa puede terminar en sitios especficos en ausencia de cualquier otro factor. Son los ms abundantes. Hay terminadores ms eficientes que otros. Tienen caractersticas estructurales, necesarias para la terminacin: Una horquilla en la estructura secundaria, rica en pares

G-C. hace ms estable la estructura. Sucesin de residuos de U al final, apareamiento dbil

ARN-ADN Terminador: AAA en el ADN, ser UUU en el ARN

Los terminadores intrnsecos incluyen regiones palindrmicas que forman horquillas que varan entre 7-20 pb.

Regin del tallo rica en G-C

Tramo de U monocatenario

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- Terminadores dependientes de rho: necesitan de la adicin de un factor. Hay mutaciones que demuestran que el factor est implicado en la terminacin in vivo. Hay pocos terminadores dependientes de rho en E.coli, pero si en fagos.

Rho: protena esencial implicada en la terminacin de transcritos, slo funciona en la etapa de terminacin. No se puede delecionar el gen, se pueden hacer mutaciones puntuales que disminuyen la funcin, pero no de prdida total.

Las secuencias requeridas para la terminacin se encuentran aguas arriba del terminador. El ARN es rico en C y pobre en G.

Modelo de accin de rho

El factor rho persigue a la polimerasa a lo largo del ARN y puede provocar la terminacin cuando alcanza a la enzima haciendo una pausa en un terminador dependiente de rho.

La ARN pol transcribe el ADN. Rho se une a un sitio de reconocimiento sobre el ARN. Rho se mueve a lo largo del ARN siguiendo a la ARN pol. La ARN pol hace una pausa en el terminador y rho lo alcanza. Rho desenrolla el hbrido ADN-ARN en la burbuja de transcripcin. Terminacin: la ARN pol, rho y ARN se liberan.

Rho tiene actividad ATPasa, dependiente de ARN, y helicasa 5-3, causa la separacin ADN-ARN. La hidrlisis del ATP se utiliza para proporcionar energa para la reaccin.

El ARN de procariotas es policistrnico, se transcribe y se traduce a la vez, por tanto hay ribosomas en el ARNm y rho no puede funcionar mientras haya ribosomas, si no hay ribosomas rho llega al terminador y acaba la transcripcin.

Polaridad de mutaciones: sin funcin aguas abajo, hay orientacin. Una mutacin en un codn de terminacin de protena se traducir una protena mutante y el resto, aguas abajo no se traduce, el ARN se acorta.

Terminador dependiente de rho dentro de la unidad de transcripcin, antes del terminador utilizado habitualmente, normalmente estos terminadores tempranos no se utilizan debido a que los ribosomas evitan que rho alcance a la ARN polimerasa. Pero una mutacin sin sentido libera a los ribosomas entonces rho es libre de unirse o de moverse por el ARNm, capacitndolo para actuar sobre la ARN polimerasa en el terminador.

Terminacin en eucariotasTerminadores reconocibles

ARN pol I - Secuencia de 18 pb en ARN reconocible por factor de

terminacin ARN pol III

- Poli-U4 situada en una zona rica en GC

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El extremo 3 se genera (inicialmente) por terminacin ARN pol II terminadores ?

El extremo 3 se genera por corte y poliadenilacin. Es difcil conocer que extremo 3 es el que marca la terminacin. No est sujeto a regulacin. Una unidad de transcripcin suele

contener un nico gen, y la terminacin ocurre ms all de la regin codificadora.

En procariotas, transcripcin y traduccin estn acoplados, se afectan mutuamente, por tanto estn ms sujetos a regulacin. Cis: secuencias importantes per se, dependen de la situacin en le ADN, cerca del principio Trans: mutaciones en trans afectan a las protenas, lejos del principio. Trans con relacin a la

configuracin de dos puntos se refiere a su presencia en dos molculas diferentes de ADN (cromosomas)

TRADUCCIN Decodificacin del mensaje gentico y sntesis de protenas. Cada aminocido se une a una molcula de

ARNt especfico de ese aminocido mediante enlace de alta energa (ATP). El proceso est catalizado por la enzima sintetasa, hay una sintetasa para cada aminocido.

El ARNm tiene codones que interactan con los anticodones de los aminoacil-ARNt, de manera que se incorporen las series de aminocidos en la cadena polipeptdica. El ribosoma proporciona el ambiente para controlar la interaccin entre el ARNm y el aminoacil-ARNt.

Ribosomas Componentes esenciales en todas las clulas. El ribosoma posee

diversos centros activos, cada uno construido a partir de un determinado grupo de protenas que se asocian con una regin del ARNr. Los centros activos necesitan de la participacin directa del ARNr con una funcin estructural. Algunas funciones catalticas necesitan protenas individuales, ninguna de las actividades se pueden reproducir por protenas aisladas o grupos de protenas, slo funcionan en el contexto del ribosoma.

Localizacin fsica de componentes: anlisis estructural Protenas y zonas del ARNr con funciones concretas: anlisis mutacional. Estructura ribosmicaTodos los ribosomas de una clula son idnticos. Constan de dos subunidades, cada una tiene un ARNr

principal y un nmero de protenas pequeas. La subunidad mayor puede tener adems ARN pequeos. En procariotas son ms pequeos que en eucariotas y en mitocondrias son ms pequeos.

El ribosoma bacteriano (70S), la subunidad mayor (50S) tiene: - un ARNr 23S - un ARNr pequeo 5S - 31 protenas

La subunidad menor (50S): - ARNr 16S - 21 protenas

El ribosoma eucaritico (80S), subunidad mayor (60S): - ARNr 28S

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- ARNr 58S - ARNr pequeo 5S - Unas 49 protenas

La subunidad menor (40S): - ARNr 18S - Unas 33 protenas

El ribosoma tiene 3 lugares de unin a ARN, uno para ARNm y tres para ARNt, un lugar P de unin al peptidil ARNt que acoge a la molcula de ARNt unido a la cadena polipeptdica en crecimiento; un lugar A acoge a la molcula de ARNt entrante cargada con el aminocido; un lugar E ocupado transitoriamente por ARNt antes de abandonar el ribosoma. El anticodn del ARNt debe ser complementario del codn del mensajero para que se establezca una unin fuerte.

Funcin ribosmicaFases de la traduccin:

- Iniciacin: incorporacin del primer aminoacil-ARNt, formil metionina-ARNt en procariotas; metionina-ARNt en eucariotas.

La subunidad 30S colocada sobre el punto de unin del ARNm se une a la subunidad 50S y a esto se une el aminoacil-ARNt. El primer aminoacil-ARNt entra en el sitio P, el resto de aminoacil-ARNt entra en el sitio A. - Elongacin: sntesis de uniones peptdicas. El ribosoma se mueve a lo largo del ARNm y la longitud de la cadena polipeptdica se extiende mediante transferencias desde el peptidil-ARNt al aminoacil-ARNt. - Terminacin: liberacin del pptido. La cadena polipeptdica es liberada del ARNt y el ribosoma se disocia del ARNm.

Existen diferentes conjuntos de factores accesorios que ayudan al ribosoma en cada una de las fases. La energa se suministra en las diferentes etapas mediante la hidrlisis de GTP.

Se han hecho estudios con inhibidores (antibiticos) para averiguar la estructura ribosmica.

Mutaciones del ADN para protenas ribosmicas, algunas se pueden restablecer por complementacin.

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Iniciacin de la traduccinEn bacterias, la iniciacin necesita de la subunidad 30S y de

factores accesorios. La iniciacin necesita de subunidades ribosmicas libres. Cuando

los ribosomas son liberados en la terminacin, se disocian para generar subunidades libres. Los factores de iniciacin estn presentes solamente en las subunidades 30S disociadas. Cuando las subunidades se reasocian para proporcionar un ribosoma funcional en la iniciacin, liberan los factores.

Factores de iniciacin (IF) en bacterias, solo en la subunidad 30S, se liberan cuando 30S se asocia con la subunidad 50S. los factores de iniciacin solamente estn en relacin con la formacin del complejo de iniciacin, estn ausentes en los ribosomas 70S y no tienen ninguna funcin en las fases de elongacin. Las bacterias utilizan 3 factores de iniciacin:

- IF-3: se necesitan para que las subunidades 30S se unan de forma especfica a los puntos de iniciacin en el ARNm. Es necesario para estabilizar las subunidades 30S libres capacitndolo para unirse al ARNm. Se libera del complejo 30S-ARNm para permitir que se unan las subunidades 50S. Al liberarse IF-3 se recicla buscando otra 30S.

- IF-2: se une al ARNt de iniciacin (formil-metionina) y controla su entrada en el ribosoma.

- IF-1: se une a las subunidades 30S slo como parte del complejo de iniciacin completo, y puede participar en su estabilizacin. Unin al sitio A, estabiliza el complejo anti-asociacin con 50S

Reconocimiento en procariotasLa iniciacin ocurre en una secuencia especial del ARNm, es el

sitio de unin al ribosoma. Es una secuencia de bases que precede a la regin codificadora. Es el lugar donde las subunidades se asocian sobre el ARNm para formar un ribosoma intacto.

Los puntos de unin del ribosoma sobre el ARNm se pueden recuperar de los complejos de iniciacin. La subunidad 30S protege unos 30 N:

Secuencia de unin al ribosoma Shine-Dalgarno (complementarias del extremo 3 del ARN 16S). esta secuencia est ausente en eucariotas.

Codn de iniciacin: AUG: el ms frecuente GUG UUG

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Iniciacin en operonesEn un ARNm policistrnico, la iniciacin se produce de

forma independiente en cada cistrn. Cuando la regin intercistrnica es ms larga de lo que abarca el ribosoma, la disociacin en el punto de terminacin se sigue de una reiniciacin independiente en el cistrn siguiente.

En el ARNm policistrnico cada regin de codificacin comienza con un punto de unin al ribosoma.

La naturaleza de los genes bacterianos significa que la traduccin se lleva a cabo de forma secuencial a travs de sus cistrones.

El ribosoma se une independientemente al comienzo de cada cistrn. Cuando termina la sntesis de la primera protena, el ribosoma abandona el ARNm y se disocia, entonces se ensambla un nuevo ribosoma en la siguiente regin codificadora y traducir el siguiente cistrn.

Traduccin independiente de cada uno de los genes en ARNm policistrnicos. Excepcin: acoplamiento traduccional.

Iniciacin en eucariotasLos ribosomas (subunidad 40S) eucariticos migran desde el

extremo 5 del ARNm hasta el punto de unin al ribosoma, que comprende un codn de iniciacin AUG. Los ARNm son monocistrnicos y son ms largos que lo necesario para codificar una protena.

El codn de inicio siempre es AUG que codifica para metionina. Los ARNm se modifican en el extremo 5 con caperuzas (cap),

metilacin que marca el extremo 5, los ribosomas reconocen el cap y recorren una corta distancia hasta que encuentran el codn de inicio. La unin de 40S al ARNm requiere de varios factores de iniciacin, entre los que figuran protenas que reconocen el cap. No hay secuencia complementaria al ARNr 18S La subunidad 40S se une al ARNm por la caperuza (CAP) del extremo 5 y busca la secuencia de iniciacin Se requieren ms factores de iniciacin que en procariotas (eIF) La Met inicial no se modifica El ARNt iniciador: Met-tRNAi

Los requerimientos energticos se consiguen de la hidrlisis de GTP, se consume mucho y la iniciacin es la etapa ms lenta y tiene que ver con la etapa de error del proceso.

ElongacinUna vez que se ha formado el ribosoma completo en el codn de

iniciacin, est dispuesto para un ciclo en el que el aminoacil-ARNt entra en el lugar A del ribosoma cuyo lugar P est ocupado por el peptidil-ARNt. Cualquier aminoacil-ARNt puede entrar en el sitio A excepto el iniciador.

El ribosoma tiene varios centros activos. Se puede asociar con una membrana. El ARNm hace un giro segn pasa a travs de los sitios A y P, que estn angulados el uno con respecto al otro. El lugar E se sita ms all del sitio P.

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El punto de actividad peptidil-transferasa se encuentra en la subunidad grande, enzima responsable de la sntesis de la unin peptdica.

El proceso de cargar un ARNt est catalizado por la enzima aminoacil-ARNt sintetasa. Existen por lo menos 20 sintetasas, cada una reconoce un nico aminocido y todos los ARNt en los que el aminocido pueda colocarse de forma legtima. Son importantes para la fidelidad de la decodificacin del cdigo gentico.

Sitios del ribosoma: - Subunidad menor: ARNm - Subunidad grande: ARNt - Sitio P: donador - Sitio A: aceptor - Sitio E: salida de ARNt descargados

El pptido se transfiere al aminocido. El ARNt tiene una estructura secundaria en forma de cruz, y una estructura tridimensional en forma de L.

Factores auxiliares de elongacin (EF) Son protenas importantes para asegurar que las reacciones ocurren de forma especfica y en un orden

concreto. Los EF tienen una accin secuencial. Decodificacin de mensajeros: distintos factores de elongacin se asocian cclicamente con los ribosomas.

Son factores esenciales: - En procariotas:

EF-Tu: entrada del aa-ARNt en A EF-Ts: regeneracin EF-Tu EF-G: translocacin

- En eucariotas: eEF-1 eEF-1 eEF-2

EF-Tu acompaa al aminoacil ARNt al sitio A y luego abandona el ribosoma. Transporta un nucletido de guanina y su actividad est controlada por el estado del nucletido de guanina:

- Cuando existe GTP el factor Tu est en su estado activo - Cuando el GTP se hidroliza a GDP el factor se inactiva - La actividad se recupera cuando el GDP se sustituye por GTP

El complejo EF-Tu.GTP une el aminoacil-ARNt para formar ARNt.EF-Tu.GTP, ste se une solamente al lugar A del ribosoma cuyo sitio P ya est ocupado por el peptidil-ARNt.

El aminoacil-ARNt se carga en el sitio A, el extremo del anticodn se une al lugar A de 30S, el reconocimiento codn-anticodn provoca un cambio de conformacin de EF-Tu, se rompe el GPT, se libera EF-Tu-GDP, no tiene afinidad por ARNt.

EF-Ts media la regeneracin de la forma EF-Tu.GDP, inactiva, en la forma EF-Tu.GTP, activa. Primero EF-Ts desplaza al GDP de EF-Tu, formando el factor combinado EF-Tu-EF-Ts. Luego el EF-Ts es desplazado por el GTP.

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Translocacin La cadena polipeptdica se alarga mediante la transferencia del polipptido unido al ARNt en el sitio P al

aminoacil-ARNt presente en el sitio A. La actividad responsable de la sntesis de la unin peptdica se llama peptidil transferasa. El ciclo de adicin de aminocidos a la cadena polipeptdica en crecimiento se completa con la translocacin, en la que el ribosoma avanza tres nucletidos a lo largo del ARNm. El resultado es expulsar al ARNt no cargado del lugar P, de manera que pueda entrar un nuevo peptidil-ARNt. La translocacin necesita GTP y el factor EF-G.

El aa-ARNt cambia de sitio dentro del ribosoma.

Direccin A-P-E Las subunidades tambin se mueven. EF-G est implicado en las etapas iniciales

de la translocacin del ribosoma. Los ribosomas no pueden ligarse de forma

simultnea al EF-Tu y al EF-G, los factores se son alternativamente ligados y liberados del ribosoma. EF-Tu.GDP debe liberarse antes de que se pueda EF-G; entonces ste debe liberarse antes de que se pueda unir el aa-ARNt-EF-Tu.GTP.

Mimetismo molecular Similitud entre diferentes molculas, como el aa-ARNt-EF-Tu-GTP y EF-

G, compiten por el mismo sitio de unin. Hacen falta estructuras similares para entrar en el mismo sitio, hay interacciones especficas que aseguran que slo entra una molcula, cuando intenta entrar EF-G el anterior se mueve de sitio. La necesidad de que cada factor se libere antes de que otro se pueda unir asegura que los fenmenos de la sntesis de protenas se lleven a cabo de forma ordenada. Unin alternativa y excluyente al ribosoma.

Parte del ribosoma controla que slo las interacciones ms precisas sean las que permitan continuar la elongacin. Los aa-ARNt van entrando y si no hay suficiente afinidad salen del ribosoma.

La unin de los factores Tu y G se alternan segn los ribosomas aceptan un nuevo aa-ARNt, forman uniones peptdicas y se translocan.

El estudio con inhibidores permite parar la traduccin: - la kirromicina, inhibidor con estructura similar a un aa-ARNt, provoca una

terminacin temprana del pptido, no permite que se liberen los EF. - El cido fusdico atasca al ribosoma en el estado de post-translocacin.

Se produce un ciclo de translocacin: EF-G se une al ribosoma, se hidroliza GTP, y el ribosoma se mueve tres nucletidos, pero el cido fusdico no permite que se libere EF-G-GDP y no se pueden aadir ms aminocidos a la cadena.

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Terminacin Existen 64 codones, de los cuales 61 codifican para aminocidos, y slo 21 aminocidos, casi todos los

aminocidos estn representados por ms de un codn, excepto Met y Trp, hay tres codones de terminacin, marcan el fin de cada gen. El cdigo gentico es universal, redundante y degenerado.

Los tripletes de terminacin: - UAG: mbar - UAA: ocre - UGA: palo

Ninguno de los codones de terminacin est representado por un ARNt, son reconocidos por los factores auxiliares de terminacin.

- Factores de terminacin (Release Factor): RF/eRF E. coli:

RF-1 y RF-2 reconocen los codones STOP (sitio A) y activan la hidrlisis del pptido

- RF1: UAA y UAG - RF2: UAA y UGA

RF3: libera RF1 y RF2 del sitio A RRF o Factor de reciclaje ribosmico EF-G: tambin interviene en la elongacin IF3: tambin en iniciacin, deja al ribosoma listo para un nuevo

ciclo. RF1 y RF2 reconocen los codones de terminacin y activan al ribosoma

para hidrolizar el peptidil-ARNt, siendo el aceptor el H2O

Factores de elongacin, terminacin y reciclaje mimetizan al complejo aa-ARNt-factor de elongacin acompaante.

El mimetismo molecular permite que el complejo del factor de elongacin Tu-ARNt, el factor de translocacin EF-G y los factores de liberacin RF1, RF2, RF3 se puedan unir al mismo lugar del ribosoma.

El RRF acta de forma conjunta con EF-G para producir la disociacin de las subunidades 50S y 30S. tambin es necesario el IF3, que completa todo el ciclo, conectando la terminacin con la iniciacin. IF3 acta para retirar el ARNt desacilado de 30S. una vez que se han separado las subunidades, IF3 sigue siendo necesario para impedir que se vuelvan a juntar.

Los errores ms importantes se dan en la iniciacin y en la terminacin. Cuando hay errores en aa-ARNt, es menos drstico porque se introduce en el sitio A un aminocido similar (los aminocidos parecidos tienen tripletes parecidos).

Las mutaciones en los genes RF reducen la eficacia de la terminacin. RF1 y RF2 slo pueden sufrir mutaciones puntuales, la alteracin de las dosis gnicas se aumentan o disminuyen las copias de protenas.

Si disminuye RF1 se disminuye la eficacia de la terminacin aumentando el nmero de protenas. Si aumenta RF1 se puede provocar que la protena se acabe antes. La dosis gnica es importante, alterando la composicin relativa de los factores se altera la traduccin.

Son elementos esenciales solamente se pueden hacer mutaciones sutiles.

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En E.coli ARNm ARNt RibosomasEF-Tu EF-Ts (G) RF aa-ARNt sintetasa

Tipos 600 40-60 1 1 1 2 20

Copias distintas de productos gnicos

2-3 3000 20.000 70.000 20.000 600 1000

Total 1500 180.000 20.000 70.000 20.000 1800 20.000 a 60.000

Estructura y funcin en el ARNr (16S)Forma parte del sitio A

Anlisis mutacional con inhibidores: La unidad 16S es esencial porque zonas concretas

participan en funciones concretas. Tambin tiene actividad enzimtica. Se pueden identificar sitios de interaccin ARN-ARN y ARN-protena.

Asociacin de las subunidades Supresin de mutaciones de fin de mensaje, participa

en el reconocimiento de codones de fin de mensaje. Unin a ARNt y a factores de traduccin Complementariedad a ARNm (E. coli), secuencia S-D Fidelidad, las mutaciones modifican la tasa de error.

Interacciones moleculares en el ribosoma

La fidelidad de la expresin gnica: Se cometen ms errores en la traduccin que en la

transcripcin. La tasa de error tiene que ver con la velocidad del acontecimiento.

Los cambios de aminocidos tiene una tasa de error de 10- 4, la mayora sin efecto fenotpico.

Tema 5

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Tema 5 Regulacin de la expresin gnica en procariotas

Tipos de regulacin. Operones. Control a nivel de la iniciacin transcripcional. Control mediado por la

estructura del ARN: terminacin y antiterminacin. Control a nivel de la traduccin. Estrategias de

regulacin. Interacciones moleculares.

Significado biolgico de la regulacin. Genes regulados y constitutivos. En ambientes diferentes con nutrientes diferentes, los genes que tienen los procariotas relacionados con el ambiente, y reguladores, les permiten sobrevivir.

Niveles de control: - transcripcin, controlada en la fase de iniciacin, es la regulacin ms importante - traduccin - actividad.. Tipos de control: - segn regulador: puede ser positiva o negativa - segn efector: pueden ser sistemas inducibles o represibles Interacciones implicadas: - ADN-prot, - prot-prot, - ADN-ARN, - ARN-prot.. Singularidades procariticas: - ARNm: vida muy corta e inestables (importancia del inicio de la transcripcin), si se deja de activar la

transcripcin los mensajeros desaparecen. La inestabilidad hace fcil la regulacin. - Operones: transcripcin coordinada y secuencial de los genes, la regulacin afecta a varios genes - Transcripcin y traduccin acopladas, estn coordinadas.

El opern lacLos genes estructurales estn organizados en grupos que incluyen genes que codifican para protenas

con funciones relacionadas, enzimas de una ruta metablica.

Elementos (reguladores) en cis, secuencias importantes porque estn donde estn.

Elementos que actan en trans(productos difusibles): Genes estructurales y reguladores

El opern lac tiene tres genes estructurales. Los productos protenicos permiten a las clulas captar y metabolizar -galactsidos, como la lactosa. Tiene elementos reguladores en cis asociados y el gen regulador de actuacin en trans. Las funciones de los genes:

- lacZ: codifica la enzima -galactosidasa, hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. Gen estructural - lacY: codifica la permeasa de lactosa, sistema de transporte al interior de la clula - lac A: codifica transacetilasa de lactosa - lacI: represor

Induccin del opern lacLas bacterias necesitan responder rpidamente a los cambios del ambiente, pueden aparecer

fluctuaciones en el aporte de nutrientes, la supervivencia depende de la capacidad de cambiar la metabolizacin de un sustrato por otro.

Tema 5

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Induccin: sntesis de las enzimas en respuesta a la aparicin de un sustrato especfico. Cuando E.coli crece en ausencia de lactosa no necesita -galactosidasa y contiene pocas molculas,

menos de 5. Cuando aparece el sustrato adecuado la actividad enzimtica

aparece con mucha rapidez, en unos 2-3 minutos empieza a aparecer la enzima, puede suponer el 5-10% de la protena soluble total de la bacteria. Si se retira el sustrato del medio , la sntesis de enzima se detiene tan rpido como haba empezado.

La adicin del inductor da lugar a la rpida induccin del ARNm, y es seguida, tras un corto intervalo, de la sntesis de las enzimas; la retirada del inductor es seguida por el rpido cese de la sntesis. Se saturan.

Parte superior de la figura: el control de la transcripcin de los genes lac responde muy rpidamente al inductor. En ausencia de inductor, el opern es transcrito a un nivel basal muy bajo. La transcripcin es estimulada tan pronto como se aade inductor. La cantidad de ARNm lac aumenta rpidamente a un nivel inducido que refleja el balance entre la sntesis y la degradacin.

El ARNm lac es muy inestable, permitiendo que la induccin sea revertida rpidamente. La transcripcin cesa tan pronto como es retirado el inductor y el contenido celular retorna al nivel basal.

Parte inferior: se muestra la produccin de protena, medida indirecta de la unidad de transcripcin. Hay un corto intervalo entre la aparicin del ARNm y la aparicin de las primeras molculas de enzima. Cuando el inductor es retirado la actividad enzimtica persiste por ms tiempo, la -galactosidasa es ms estable.

Deteccin a distintos niveles para estudiar la regulacin: - transcritos - protenas - actividades Cuantificacin de la regulacin: puede dar detalles adicionales - niveles basales - niveles regulados (inducidos) Expresin inducible, inductores: Inductores metabolizables y gratuitos - lactosa: mejor inductor, metabolizable - IPTG: inductor gratuito, no metabolizable, mejor inductor - -galactsidos: algunos no se pueden hidrolizar El represor: lacI El componente que responde al inductor es la protena represora codificada por lacI.

Los genes estructurales son transcritos a un solo ARNm desde un promotor localizado en 5 de lacZ. El estado del represor determina si el promotor es activado o no.

El gen lacI sintetiza monmeros del represor que forman un tetrmero.

El tetrmero se une al ADN operador y bloquea la transcripcin.

El represor mantiene el opern en forma inactiva mediante su unin al operador.

Regulacin negativa: El represor se une al operador impidiendo la transcripcin.

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La adicin de inductor libera el represor y permite que la ARN polimerasa inicie la transcripcin.

El inductor convierte al represor a una forma inactiva que no puede unirse al operador.

La ARN polimerasa se une al promotor y transcribe el ARNm.

El ARNm es traducido para dar lugar a las tres protenas.

Regulacin inducible: El inductor inactiva al represor, permitiendo la transcripcin.

El represor tiene propiedades duales: - Puede evitar la transcripcin - Puede reconocer la molcula inductora

El represor tiene dos sitios de unin, uno para el operador y otro para el inductor ( 1 mol/ monmero, total 4 molculas de inductor por represor). Cuando el inductor se une en su sitio cambia la conformacin de la protena influyendo en la actividad del sitio de unin al operador (control alostrico).

Cuando el represor est unido al operador no hay transcripcin, hay una expresin basal baja y constitutiva. Un buen represor: niveles de protena bajos (unas 10 molculas de represor por clula).

Regulacin de lac y anlisis gentico Consideraciones: - Fenotipo silvestre: expresin inducible de lacZ - Mutaciones en gen(es) regulador(es) y estructural(es)

Tipos de mutaciones reguladoras (cis o trans) Constitutivas: siempre expresin de lacZ, Lac+!!! No inducibles: no hay expresin, Lac-, no sintetizan -galactosidasa

Las mutaciones en el circuito regulador pueden o anular la expresin del opern o causar una expresin no regulada.

Los mutantes que no pueden ser expresados son no inducibles. La expresin continua de un gen que no responde a la regulacin se llama expresin gentica

constitutiva y los mutantes son mutantes constitutivos. El promotor y el operador son identificados como dianas para las protenas reguladoras (ARN

polimerasa y represor) mediante mutaciones de actuacin en cis. El locus lacI es identificado por mutaciones en trans.

- Mutaciones constitutivas cis: Las mutaciones del operador son constitutivas (Oc)

porque el operador es incapaz de unirse a la protena represora, lo que permite que la ARN polimerasa tenga un acceso no restringido al promotor.

Las mutaciones Oc, son cis ( evidencia la existencia de un elemento que funciona sin estar representado por un producto difusible) ya que afectan solamente al grupo contiguo de genes estructurales.

Los genes estructurales contiguos a una mutacin Oc son expresados constitutivamente ya que la mutacin cambia el operador de forma que el represor no se una ms a l.

Un Operador constitutivo no tiene suficiente afinidad por el represor Complementable con un opern silvestre? NO: O

cdominantes en cis

Una mutacin en un sitio cis no puede ser asignada a un grupo de complementacin, la capacidad de complementacin es caracterstica de genes expresados por productos difusibles.

El represor activo no puede unirse al operador mutante Oc

El opern es transcrito y traducido

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Cuando dos sitios de actuacin en cis se sitan cerca el uno del otro, promotor y operador, no se pueden clasificar las mutaciones con un test de complementacin, estando limitados a distinguirlas por sus efectos fenotpicos.

Las mutaciones en el operador pierde la afinidad por el represor.

- Mutaciones constitutivas en trans:La ausencia de represor determina expresin

constitutiva. Complementable con un opern silvestre? SI: lacI-

recesivas. Las mutaciones que inactivan el gen lacI dan lugar a

que el opern est constitutivamente expresado porque el represor mutante no puede unirse al operador.

La mutacin lacI- supone la prdida de la funcin. Cuando el represor est inactivo o ausente la transcripcin puede ser iniciada en el promotor. Las mutaciones en el represor que suprimen su capacidad de unin al operador tendrn un fenotipo constitutivo.

Los tipos de mutaciones lacI pueden ser utilizados para identificar los sitios activos individuales en la protena represora.

- El sitio de unin al ADN reconoce la secuencia del operador y se identifica por mutaciones puntuales constitutivas que impiden al represor unirse al ADN para bloquear la ARN polimerasa.

- El sitio de unin del inductor es identificado por mutaciones puntuales que causan la no induccin del sistema dado que el inductor no puede unirse para activar el cambio alostrico en el sitio de unin al ADN.

Mutaciones lacI constitutivas: No siempre recesivas: lacI

D

Mutaciones de prdida de funcin y dominantes: Dominantes negativas /trans - dominantes /complementacin negativa La complementacin negativa o dominantes en

trans o dominantes negativas, sucede entre algunos mutantes represores, como lacID con lacI+. La mutacin lacID da lugar a la produccin de un represor que no puede unirse al operador y es por tanto constitutiva como lacI-. Lac- es recesiva porque inactiva al represor respecto al tipo salvaje. LacD es dominante cuando se empareja con un alelo original.

La razn de la dominancia es que lacD produce una subunidad mala que es incapaz de unirse al operador y como parte de un tetrmero, impide que las subunidades buenas se unan.

El represor mutado ha perdido afinidad por el operador, pero si hay ARNm y producto en la clula es dominante.

Son mutaciones recesivas si son complementadas y se establece la regulacin.

Complementacin: indica mirar 2 alelos distintos, se pueden introducir alelos interesantes consiguiendo diploides parciales, merodiploides o merozigotos, se introduce el opern con un plsmido.

El gen lacI- sintetiza un represor que no puede unirse al ADN

El opern es transcrito y traducido

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- Mutaciones no inducibles (cis). Operador: ganancia de afinidad por el Represor, son raras - Mutaciones no inducibles (trans). Represor: ganancia de afinidad por el Operador, son ms

frecuentes. Las mutaciones que reprimen son siempre supresoras.

complementable con un opern silvestre? NO: lacI

S dominantes.

Las mutaciones que anulan la capacidad del represor de unirse al inductor son lacS y son de tipo trans. El represor est cerrado en la forma activa que reconoce al operador y se impide la transcripcin. La adicin del inductor no tiene efecto ya que su sitio de unin est ausente y es imposible convertir al represor a su forma inactiva.

El represor mutante se une a todos los operadores lac de la clula para impedir su transcripcin y no puede ser desactivado, es genticamente dominante.

Lacs (suprerrepresor), no es capaz de hacer las funciones que hace el silvestre, independizan al represor

del inductor. Mutacin en dominio de unin al inductor. Mutaciones que no impiden la unin del inductor, pero no se produce el cambio conformacional, por

tanto se une al ADN. Ha perdido funcin. No es complementable con el opern silvestre. Es una mutacin dominante.

Interacciones entre subunidades. Dominancia negativa en LacI Mutacin con prdida de funcin: lacI-.

El represor mutado no tiene capacidad para reprimir pero si para formar tetrmeros, habiendo tetrmeros de varios tipos, mixtos, son menos eficaces que el silvestre. No hay suficiente represor para evitar la expresin del opern.

Es un fenmeno frecuente entre protenas polimricas: dominancia negativa/ trans- dominancia /complementacin negativa.

Mutantes de prdida de funcin: - parcial: dominancia negativa - total

Un represor silvestre ms uno mutado darn 4 tipos de mutantes, la concentracin efectiva de represor silvestre disminuye.

Ms consecuencias genticas de la oligomerizacin de LacI complementacin intragnica de mutaciones lacI

-. Caracterstica de protenas multimricas. - si dos mutaciones no se complementan, la mutacin se

encuentra en el mismo gen - si la mutacin se encuentra en 2 alelos del mismo gen, se

complementan

lacIS (Superrepresor)

Unin al O independiente de inductor

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Supresin intragnica: mutaciones en el mismo polipptido, primera y segunda mutacin en la misma protena, es una mutacin compensatoria, en cualquier tipo de protenas.

No asociado a oligomerizacin.

Interacciones DNAprotena (O-LacI): Supresin intergnica

Mutaciones en operador que son suprimidas. Las mutaciones en el represor afecta a

interacciones protena-protena y ADN-protena. Un represor mutado puede tener afinidad por el

operador silvestre, aunque no se conoce cual es, depende del tipo de mutacin del represor.

Relacin estructura/ funcin en lacI

El represor tiene varios dominios. Entre los dominios globulares se encuentra el sitio de unin al inductor, es una amplia zona en la que se pueden hacer muchas mutaciones.

Estructura de un dominio del represor. Lac identifica varios dominios independientes

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Localizacin de mutaciones en LacI

lacI- (no represoras), recesivas, las ms abundantes. Disminuye la capacidad de oligomerizar, afectan a la estabilidad. Hay unas mutaciones que impiden la formacin del dmero y otras afectan a la formacin del tetrmero a partir de los dmeros.

lacI-d, dominante negativa. No disminuye la estabilidad pero

afectan a la unin con el ADN. lacI

s, localizada en el centro de la protena, en el sitio de unin al inductor, disminuye la afinidad por el inductor.

Las mutaciones de ganancia de funcin y prdida de funcin parcial son dominantes.

Las mutaciones que disminuyen la actividad de la protena son recesivas.

Estructura del core tetramrico. Consiste en dos dmeros. El cuerpo del dmero tiene una zona intermedia poco consistente entre las regiones N-terminales del core de los monmeros, una hendidura en la cual se une el inductor, y un core hidrofbico (arriba).

Las regiones C-terminales de cada monmero protuyen como hlices paralelas. Los dmeros interactan para formar el tetrmero que se mantiene unido por un haz C-terminal.

Los puntos de mutacin son mostrados por pequeas esferas en la parte inferior de la figura. Cada esfera representa una mutacin.

Las mutaciones lacIs se dividen en dos grupos: - las que afectan a la interfase de los dmeros (amarillo),

relacionadas con el cambio conformacional de la dimerizacin.

- las que actan en la hendidura de unin al inductor (gris) Las mutaciones lacI- que afectan a la oligomerizacin:

- impiden la formacin del dmero (blanco) - impiden la formacin del tetrmero a partir del dmero

(morado), esos contactos son importantes para mantener el tetrmero.

Interacciones ADN-represor Efecto del inductor: la adicin del inductor anula la

capacidad del represor de unirse especficamente al operador. Los represores unidos al operador son liberados y se unen a sitios de baja afinidad al azar.

El represor tiene dos cabezales danzando que facilita el encontrar el sitio especfico; la interaccin la hace el dmero pero es tetrmero el que se desplaza. En una clula no inducida el tetrmero est unido al operador, mientras que el represor est unido a sitios no especficos. El efecto de la induccin es cambiar la distribucin del represor en el ADN, ms que generar represor libre.

Cuando el inductor es retirado, el represor recobra su capacidad de unirse especficamente al operador. Este paso implica movimiento desde el sitio de almacenamiento no especfico en el ADN

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Al unirse el inductor al represor se provoca un cambio conformacional, perdiendo la afinidad por el operador. La interaccin es simtrica (H-giro-H)

Cuando el inductor se une al represor la afinidad por el operador se reduce unas 1000 veces, permaneciendo inalterada la afinidad por otras secuencias inespecficas del ADN.

Protenas reguladoras: hay poco nmero de ellas, es importante, ser limitante. El nmero de protenas ser mayor si el genoma es ms grande.

El operador: sitio diana para el represor protenico. Se sita aguas abajo del promotor pero est solapado. Con

experimentos de footprinting se puede observar donde se unen las protenas. La represin provoca interferencia con la actividad de la ARN polimerasa. El solapamiento del operador con el represor no impide que se unan a la vez en el ADN junto con el promotor. El represor y la ARN polimerasa se unen en sitios que se superponen localizados alrededor del punto de inicio del opern. Represion: interferencia con la actividad de la ARN polimerasa.

El represor no impide la unin de la ARN polimerasa, sino que aumenta la afinidad de la polimerasa por el promotor, se aumenta la formacin del complejo cerrado. El represor es el regulador; el operador atrae a la polimerasa, en cuanto se separa el represor empieza la transcripcin.

El operador lac tiene una secuencia simtrica. La simetra de la secuencia de ADN refleja una simetra en la protena. El represor es un tetrmero de subunidades idnticas, cada una de las cuales debe tener un sitio de unin al ADN. Cada repeticin invertida del operador entra en contacto de la misma forma con un monmero del represor

El operador tienen un hallazgo comn a muchos sitios de reconocimiento de las protenas reguladoras, es palindrmico. Cada repeticin puede ser considerada como un medio sitio para el operador.

Las mutaciones Oc producen cambios concretos. Disminuye la afinidad por lacI 20-30 veces, la represin no es efectiva, ya no tienen afinidad especfica por el operador.

Mutaciones constitutivas: estn centradas y hay asimetra, la mitad derecha funciona mejor y por eso se puede mutar ms fcilmente.

Hay posiciones importantes, con bases concretas. La regin protegida por la protena es la misma pero slo unas cuantas bases son especficas para la interaccin: zonas protegidas.

La simetra del operador refleja la simetra del represorLa simetra del operador refleja la simetra del represor

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Los contactos son, aqu, ms simtricos, hay interacciones especficas. Las interacciones se producen en ambas cadenas.

El represor en la regin reguladora

lacI es un tetrmero y puede unirse simultneamente a dos sitios en el ADN, se forma un bucle en el ADN.

Existen dos sitios adicionales del operador en la regin inicial del opern. El operador original O1, localizado en el inicio del gen lacZ tiene mayor afinidad por el represor.

Otras secuencias ms dbiles del operador (pseudooperadores) se localizan a los lados (O2, O3). Cuando el represor se une de forma simultnea a O1 y a uno de los otros provoca en el ADN un bucle.

El operador son tres sitios: operador y pseudooperadores. La presencia de los pseudooperadores incrementa la

represin, aumenta la afinidad. La eliminacin de O2 o de O3 reduce la eficiencia de la represin 2-4 veces. Si ambos son eliminados, la

represin se reduce unas 100 veces. La habilidad del represor de unirse a uno de los otros dos operadores, as como a O1, es importante para establecer la represin.

Interacciones ADNrepresor en otros sistemasSitios de unin de protenas represoras. La relacin fsica entre represor y opern es distinta en los diferentes sistemas, tienen diferentes

mecanismos moleculares. Los operadores se pueden situar en distintas posiciones con

respecto al promotor. El operador de gal est aguas arriba del promotor, tiene

interacciones indirectas. Los sitios de unin de distintos represores varan con relacin

al promotor.

El represor trp reconoce los operadores en tres loci. La localizacin del ARNm vara segn est indicado en el esquema por las flechas. Un represor controla varios operones.

Tipos de regulacin. Directa y mediada por molculas efectoras.

Tipo de protena reguladora: Negativo: represor Positivo: activador

Tipo de molcula efectora: Inducible: inductor Reprimible: co-represor

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03 01 02

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Los sistemas de control positivo y negativo estn definidos por la respuesta del opern cuando est presente una protena reguladora. Las caractersticas de los dos tipos de control son opuestas.

Los genes bajo control negativo son expresados a menos que sean desactivados por una protena represora. Proporciona un mecanismo de seguridad, si la protena reguladora es inactivada el sistema funciona. Na protena reguladora negativa se llama represor.

Los genes bajo control positivo slo se expresan cuando una protena reguladora activadora est presente. Una protena reguladora positiva que responde a una pequea molcula se llama activador.

En ausencia de protena reguladora, hay expresin? SI, hay ms actividad: control negativo NO, hay menos actividad: control positivo Los operones inducibles funcionan slo en presencia de una molcula inductora. Los operones represibles funcionan slo en ausencia de una molcula co-represora.

Los circuitos de control son verstiles y pueden ser diseados para realizar control positivo o negativo de la induccin o la represin.

La induccin se logra cuando un inductor inactiva a una protena represora: Inducible control negativo.

La induccin se logra cuando un inductor activa a una protena activadora: inducible control positivo.

El opern trp es un sistema represible. El triptfano es el producto final de las reacciones catalizadas por enzimas biosintticas y tanto la actividad como la sntesis de las enzimas son controladas por el nivel de triptfano dentro de la clula. El triptfano funciona como un co-represor que activa a una protena represora: represible de control negativo. En las condiciones en las que el triptfano es abundante el opern est reprimido porque el complejo protena represora-co-represor se encuentra unido al operador. Bajo condiciones de represin los genes estructurales continan siendo expresados a un nivel basal o nivel reprimido.

Las rutas de aminocidos son reprimibles por producto.

Control positivo e inducible: la molcula efectora activa al activador Control positivo y reprimible: el co-represor inactiva al activador. Es un sistema caro energticamente y

muy raro. Superposicin de sistemas de regulacin en el mismo opernEl opern lac y Represin por glucosa Glucosa: fuente favorita de carbono. Interfiere con la expresin de lac a dos niveles:

- Exclusin de inductor: la glucosa impide la entrada de lactosa (inductor de lac) - Activacin transcripcional (indirecta) mediada por el activador CRP /CAP y AMPc o

fenmeno de represin catablica Cuando se dispone de glucosa como fuente de energa es utilizada con preferencia respecto de otros

azcares, por tanto cuando E.coli encuentra en el medio tanto glucosa como lactosa metaboliza la primera y reprime la segunda.

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Uno de los activadores ms comunes es una protena que controla la actividad de un grupo de operones en respuesta a nutrientes en relacin con hidratos de carbono.

La eleccin es llevada a cabo evitando la expresin de varios operones (lac, gal, ara). Este efecto se conoce como represin por catabolito, representa un sistema coordinado que ejerce una preferencia por glucosa inhibiendo la expresin de los operones que codifican las enzimas de vas metablicas alternativas.

Exclusin del inductor: la entrada de glucosa en la clula provoca cambios conformacionales en la permeasa de lactosa que impiden la entrada de la lactosa.

Cuando no hay glucosa en el medio puede entrar la lactosa a la clula por medio de la permeasa y se activa el opern lac.

Activacin transcripcional (indirecta): mediada por CAP y AMPc. Represin catablica: un catabolito de la ruta de degradacin de la glucosa.

- CRP (Protena Receptora de AMPc) = CAP (Protena Activadora por Catabolito)

La represin por catabolito es puesta en marcha por la capacidad de la glucosa de reducir el nivel de AMPc en la clula. El AMPc es sintetizado por adenilato ciclasa. Cuando hay glucosa la actividad de la adenilato ciclasa es baja y aumenta en ausencia de glucosa.

Correlacin inversa. La expresin de los operones regulados por catabolitos muestran una relacin inversa con el nivel de AMPc, que acta unindose al producto del gen cap.

Glucosa y AMPc: cuando uno sube el otro baja El efector es el AMPc. CAP es un dmero de dos subunidades idnticas, se activa con una nica molcula de AMPc. CAP-AMPc es el complejo activador. Cuando hay glucosa desciende el nivel de AMPc y no se une a CAP, es una protena inactiva incapaz de

unirse a la regin de control, impidiendo que la ARN polimerasa inicie la transcripcin. Represin catablica por glucosa de los operones activados por CRP: regulacin transcripcional

positiva (CRP) e inducible (AMPc). A nivel molecular es un sistema inducible de control positivo.

Activacin por CRP / CAP: interacciones molecularesLocalizacin de los sitios de unin al ADN e interacciones con la ARN polimerasa.

El dmero CAP se une a un sitio de unos 22 pb en un promotor determinado.

La secuencia consenso para CAP contiene el pentmero altamente conservado TGTGA y a veces una inversin de esa secuencia TCANA

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La accin de CAP tiene sus sitios de unin en distintas localizaciones con respecto al punto de inicio segn los distintos operones que regula, y el pentmero TGTGA puede situarse en cualquier orientacin.

Tipo 1: Aguas arriba del promotor (p.ejem. lac -61: sitio CAP) Favorece que se forme el complejo cerrado (CC), recluta hacia el

promotor a la polimerasa. Sitio de unin CAP adyacente al promotor.

Tipo 2: La interaccin se da solapando casi con el promotor (p.ejem. gal, -41), afecta al complejo abierto.

Favorece CA (complejo abierto): se producen contactos con la polimerasa. Sitio de unin de CAP se sita dentro del promotor.

Esto tiene que ver con que la interaccin de la polimerasa con el promotor es en sitios determinados de la polimerasa y que la enzima est en una cara del ADN. Las interacciones de la polimerasa con el promotor son asimtricas.

Otras formas de interaccin con ARN Pol (p.ej. ara -92): el sitio de unin CAP se sita en direccin 5 del promotor, mucho ms aguas arriba. CAP no est en contacto con la polimerasa, no hay interaccin directa protena- polimerasa, hay otra protena reguladora que se une entre CAP y los sitios de la ARN polimerasa. La interaccin se produce a travs de un bucle, que acerca las protenas, las protenas interaccionan cara a cara.

Existe un gran cambio en la organizacin de la doble hlice del ADN cuando se une a CAP. La curvatura permite que CAP contacte con la ARN polimerasa en el promotor.

CAP y opern ara: 2 sitios que separan e interaccionan con el promotor a veces puede actuar como represor, activador o represor; una vez acta como una cosa y otra vez como otra.

Puede haber ms de un sitio CAP en un promotor, por lo que en determinadas circunstancias puede funcionar como represor. Que funcione de una forma o de otra depende de las afinidades relativas por es tos sitios, adems de otros factores como protenas que faciliten o impidan su unin.

Regulacin transcripcional con intermediarios: transduccin de sealesHay sistemas donde encontramos ms de una protena reguladora. En bacterias hay sistemas de doble

componente (dos familias de protenas distintas). Muchos sitios de regulacin hay ms de una protena reguladora.

Sistemas de dos componentes

La protena CAP puede unirse en distintos sitios en relacin a la ARN polimerasa

CAP provoca la aparicin de un ngulo de ms de 90 alrededor del centro de simetra

El componente sensor o histidina quinasa, transmite la seal en forma de fosforilacin a un regulador de respuesta

La fosforilacin del regulador (en Asp) altera su actividad transcripcional

Dominios conservados que incluyen los sitios de fosforilacin His (fosfotransferasa) o Asp (receptor)

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En E-coli podemos encontrar hasta 30 sistemas de 2 componentes. Aumentan en organismos de vida libre. Prototipo simple de sistemas de dos componentes. En E. coli hay 30 sistemas de dos componentes. Los parsitos intracelulares apenas tienen de este tipo, pero en bacterias cambiantes s hay bastantes sistemas de este tipo.

Los dominios conservados entonces son los aa His (en el sensor) y Asp (en el regulador de respuesta).

Dos componentes: 1) Protena sensora: recoge la seal activadora, puede estar anclada o no. Determina esa seal ,la

autofosforilacin de la propia protena, es el componente sensor o histidina quinasa. Detecta molculas, cambios de temperatura,... Suelen estar en membrana. La deteccin provoca un cambio conformacional en la protena que hace que se autofosforile y que interacte con otra molcula, el regulador de respuesta.

2) Regulador de respuesta o efector que regula la respuesta (activador o represor). La fosforilacin del regulador, siempre en Asp, altera su actividad transcripcional, aumenta la afinidad cuando est fosforilado.

Dominios conservados que incluyen los sitios de fosforilacin His (fosfotransferasa, en el sensor) o Asp (receptor, regulador de la respuesta)

Control de la traduccin

El sistema ms simple es en el que un factor (protena o ARN) se une a la secuencia de iniciacin, impide el acceso de la secuencia al ribosoma e impide la traduccin. Las interacciones son por tanto ARN-ARN o ARN-protena. El control adems suele ser autgeno (la propia protena que se transcribe es reguladora de la traduccin).

La regulacin es fundamentalmente intrnseca (no hay seales externas, la acumulacin de esa protena es la que reprime su propia traduccin).

Hay que tener en cuenta la estabilidad del ARNm tambin, as como su estructura secundaria (pueden formarse bucles que impidan la traduccin). Esto provoca tambin que cuando tenemos varios genes en el ARNm tienen ms posibilidad de traducirse los primeros genes que los siguientes

Paralelismos y diferencias con el control de la transcripcin (inicio). Ejemplo de ello es la protena p32, necesaria en las fases tempranas de la iniciacin. Esta protena tiene

mucha afinidad por el ADN monocatenario. Cuando ya no hay ADN de cadena sencilla, la protena tiene tambin algo de afinidad por su ARNm. Se une a este ARNm e inhibe su propia traduccin.

Este mismo tipo de interaccin se da en la produccin de las protenas ribosmicas. Estas protenas tienen que estar en la proporcin adecuada.

Hay fenmenos de regulacin endgena de varios genes del opern. Cuando una protena ribosmica se produce en exceso, aparte del ribosoma tambin tienen afinidad por su propio mensajero y se unen a ste, con lo que se regula su cantidad.

Secuencias iniciadoras e interacciones ARN/ protena y ARN /ARN

La funcin del represor es proporcionada por una protena que se une a una regin diana el ARNm para evitar que los ribosomas reconozcan la regin de iniciacin. Esto es equivalente a la protena represora que se une al ADN para impedir que la ARN polimerasa utilice un promotor.

Una protena reguladora puede bloquear la traduccin unindose a un sitio en el ARNm que se superpone al sitio de unin al ribosoma en el codn de iniciacin.

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Otra forma de control traduccional ocurre cuando la traduccin de un cistrn requiere cambios en la estructura secundaria que dependen de la traduccin de un cistrn precedente. Esto ocurre en la traduccin de los fagos de ARN, cuyos cistrones siempre se expresan de forma ordenada.

La estructura secundaria puede controlar la iniciacin. En el ARN del fago solo hay un sitio de iniciacin disponible, pero la traduccin del primer cistrn cambia la conformacin del ARN de forma que otro sitio de iniciacin se torna disponible. El ARN del fago adopta una estructura en la cual slo es accesible una secuencia de iniciacin; el segundo no puede ser reconocido por los ribosomas porque est apareado con otras regiones del ARN.

Caracterstico de protenas con afinidad por cidos nucleicos p32: Protena implicada en reparacin, recombinacin y replicacin del fago T4, produccin de

material gentico. R17: interaccin con ADN RegA T4: reguladora, controla genes tempranos

Control negativo y autgeno. Autgeno: propia protena traducida ser propiamente reguladora. El gen que codifica para el producto regulador es una de las dianas de la regulacin. La regulacin autgena se produce siempre que una protena (o ARN) regula su propia produccin. La protena reguladora inhibe la expresin de un grupo contiguo de genes dentro del opern, siendo un ejemplo de regulacin autgena negativa.

Regulacin intrnseca: no hablamos de seales externas, van a ser la acumulacin de ese producto gnico lo que reprima la traduccin. La acumulacin de la protena inhibe la sntesis posterior de s misma y de algunos otros productos gnicos.

Estructura secundaria y estabilidad del ARNm: esta estructura 2 repercute en la estabilidad del mensajero. La estructura secundaria del ARN proporciona una regulacin en procariotas y en eucariotas.

Diferencia entre procariotas y eucariotas: se diferencia en los operones por haber varios inicios de la traduccin

Un ribosoma est leyendo y no puede seguir por haber un apareamiento incorrecto el cual impide la accesibilidad del ribosoma, este ribosoma puede romper ese apareamiento y puede seguir leyendo.

Polaridad en operones bacterianos: si no hay traduccin en el primer gen no habr en el segundo gen tampoco.

Los genes aguas arriba sern ms abundantes que los de aguas abajo: se les da preferencia.

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Protena P32

Tiene afinidad por al ADN monocaten