Aptámeros Juan David Ospina Villa

M en C en Biomedicina Molecular

juando12358@gmail.com

Grandes problemas de la humanidad

Challenges of Antibacterial Discovery. 2011, 24:71-109.

Los medicamentos se están agotando

La era genómica

Post-genómica

Estrategia actual en el desarrollo de medicamentos

Bibliotecas químicas >100.000 compuestos

DOCKING

SELEX (evolución sistemática de ligandos por

enriquecimiento exponencial)

Tuerk and Gold (1990)Ellington y Szostak (1990)

ssDNA ssRNA

Bibliotecas de oligonucleótidos

(10*13)

Aptámero latín “Aptus” = apto o que encaja

Premio Nobel- Medicina 2009

Carol Greider Jack Szostak Elizabeth Blackburn

"for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase".

Primera terapia en base a RNA “other small structural RNAs could be exploited as a new approach for inhibiting proteins and enzymes”

• Factor de von Willebrand (vWF)• Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)• Factor de crecimiento endotelial-vascular (VEGF)• E-selectina• Antígeno de membrana especifico de próstata (PSMA)• Factor nuclear kB (NFkB)• Tenacina-C

Primeros usos de los aptámeros

• Peptidos biologicamente activos y proteinas solubles

(Jellinek et al., 1993, Ruckman et al., 1998, Williams et al., 1996, Proske et al., 2002)

• Se unen a nucleótidos (Sassanfar and Szostak, 1993, Meli et al., 2002)

• Blancos complejos como receptores de membrana y vasos sanguíneos

(Ulrich et al. 1998, Blank et al. 2001)

¿Como funciona?

Tonelli, RR. et al 2013

Debilidades de los aptámeros

Corta vida media debido a la degradación de nucleasas

presentes en el suero

5’ 3’

Extremos 5’ y 3’ son susceptibles a exonucleasas

¿Es ahora el momento?

• Mejoras químicas en la síntesis de oligonucleótidos aumentan su estabilidad y su farmacocinética.

(Trujillo et al., 2007, Ni et al., 2011)

Estructura 3D única Kd= nM ó pM

Anticuerpos químicos

• También llamados “Anticuerpos químicos” • Mas eficientes que los ligandos e inhibidores

naturales

Hernández, FJ. Hincapié, JA. 2011

Ventajas y desventajas

Como resolver las limitaciones de los aptámeros

• Los aptámeros pueden ser optimizados para la actividad y persistencia fisiológica durante la selección o durante la relación estructura-actividad y estudios de química medica realizados después de su descubrimiento

• La adición de conjugados como polietinel-glicol o colesterol puede incrementar su vida media (horas/días vs minutos)

• Modificaciones químicas incorporadas a los azucares o enlaces fosfodiester inter-nucleótido potencia su resistencia a nucleasas

• La protección por propiedad intelectual están a punto de expirar

Keefe, AD. Et al. 2010

Degradación de los aptámeros

Alarga la vida media de los aptámeros

Protegen al aptámero de la degradación por endo y

exonucleasas

Lakhin, AV et. al, 2013

Excreción de los aptámeros por filtración renal

Los aptámeros tienen entre 5-

15 kDa

PEG

PEG o colesterol aumentan entre

20-40 kDa

30-50kDa

Control de la duración de la acción

• Degradación

• Participación en procesos metabólicos

• Excreción renal

• Etc…

Los antídotos pueden ser una solución para controlar la duración

de la acción terapéutica

Interacción del aptámero con blancos intracelulares

Transfección de células con un vector de expresión

que tiene promotor U6

Transfección de células con un vector de expresión que tiene promotor tRNA

Intrámeros (concentración del aptámero

a nivel intracelular)

PSMA

Generación de aptámeros usando proteínas no purificadas

Cell-SELEX

Aptámeros específicos contra proteínas no

conocidas

Biomarcadores, diferenciación de células

tumorales…etc

Reacciones cruzadas

DNA polimerasa β DNA polimerasa κ

La adición de pasos de selección negativa con moléculas estructuralmente similares disminuye

enormemente las reacciones cruzadas

Pool de RNAs

Generación automática de aptámeros

• CE-SELEX: electroforesis capilar (una ronda) • NECEEM: electroforesis capilar sin equilibrio de

mezclas en equilibrio (1-2 días)

CE-SELEX NECEEM-SELEX

Métodos para la selección de aptámeros

Hernández, FJ. Hincapié, JA. 2011

Aptámeros en fase clínica

* f – 2'-fluoronucleotide, m – 2'-O-methylnucleotide y se adicionó PEG 40kDa

Infecciones parasitarias

Alta prevalencia en países subdesarrollados

Alta resistencia a los antiparasitarios y muchos

efectos secundarios

Bajo costo y facilidad para su aplicación

Leishmaniasis

L.infantum

H2A y H3

KMP-11•Baja actividad biológica

•Dificultad para llegar a la proteína blanco

(Bhattacharyya et al., 2002). (Moreno et al., 2003).

Leishmaniasisvisceral

Pubmed 3.000 artículo “aptamer” 10 son en parásitos

Tripanosomiasis

T.brucei

EnfermedadDel sueño

VSG

(Lorger et al., 2003) Degradación en suero

(Ulr

ich

et a

l. 2

004

)

Proteína variante

ISGsSELEX in vivoSon engullidos a

los lisosomas

T.cruzi

Células de riñón de mono

LLC-MK

70%

reducción

(Alves and Colli, 2008)

Malaria

Plasmodium sppmalaria

P.falciparum

(Niles et al., 2009)

Hemozoína(Hematina + proteínas)

PfEMP1

(Barfod et al., 2009)

Promisorios para ser

probados in vivo

Tonelli, RR. et al 2013

Intrámeros

B52Splicing

WT y sobre-exp.

Drosophila melanogasterIntrámero especifico contra

B52

D.Melanogaster B52WT

D.Melanogaster B52Shi, H. et al 1999

Intrámeros

Thiel, WH. et al. 2012

Conclusiones

• Pueden usarse tanto en diagnóstico como en terapéutica y como biomarcadores

• Cada tipo celular difiere de otro por las moléculas que expone en la superficie celular

• Se puede interferir a diferentes niveles en el crecimiento, viabilidad y proliferación de los parásitos

• Los aptámeros obtenidos in vitro deben ser validados in vivo

• Poderosa herramienta para el estudio de la función de proteínas y esclarecimiento de funciones en grandes maquinarias proteicas

• Pueden hacerse modificaciones que mejoren la técnica con las herramientas que tenemos a mano

Salvarsán 606 Ehrlich 914