APROVECHAMIENTO DEL SUBPRODUCTO DE LA...

Jueves 23 y viernes 24 de Mayo de 2013, Paraninfo de la Universidad de Colima.

Colima, Col.

XV Congreso Nacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos

División Ciencias de la Vida CAMPUS IRAPUATO-SALAMANCA

APROVECHAMIENTO DEL SUBPRODUCTO DE LA DEODORIZACIÓN DE ACEITE DE SOYA COMO FUENTE DE FITOESTEROLES Y ESCUALENO

Rodríguez-Rodríguez J.a*., Amaya-Guerra C., Caballero-Mata Pb., Núñez-González Aa., Alanís-

Guzmán Ga., Aguilera-González Ca., Báez-González Ja., Moreno-Limón Sa. , Gómez Verastegui Aa

a Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas. Av. Universidad S/N

Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N. L, C.P. 66451. México.

.

b Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey. Lab. del C.de Calidad Ambiental. Av. E. Garza Sada 2501 CP 64849. Ed. CEDES SS2, CDS2015-J. Monterrey N.L. México.

* [email protected] RESUMEN: Una demanda actual en la industria es la disminución y/o aprovechamiento de subproductos generados en los procesos. En la extracción y refinación de aceite vegetal un tema de investigación prioritario es la caracterización y aprovechamiento de éstos. Durante la etapa de deodorización, se genera un subproducto conocido como ácidos grasos destilados (AGD´s) del se reporta alto contenido de componentes menores como fitoesteroles y escualeno, sustancias estructuralmente parecidas al colesterol, con actividad biológica como antiinflamatorios, antioxidantes, anticancerígenos e inhibidores de la absorción del colesterol a nivel intestinal, lo cual les da un alto valor en la industria alimentaria y farmacéutica. Se realizó la optimización y validación de una metodología analítica para cuantificación de fitoesteroles libres (FL), esterificados (FE) y escualeno en AGD´s provenientes de grados de refinación Premium y Genérico de aceite de soya americana. Se estableció dicha metodología y resultó con precisión aceptable, menos costosa, más rápida y se documentaron sus parámetros de validación. La concentración FL fue de 15.65 y 13.71 y FE de 2.1 y 4.9, Escualeno de 2.17 y 2.03 % p/p para grano americano Premium y Genérico respectivamente, lo cual indica que los AGD´s de diferentes grados de refinación, son fuente potencialmente aprovechable de estos compuestos. ABSTRACT: A current demand at the industry level is decreased and / or use of the products generated in their processes. In the mining industry and vegetable oil refining one research priority is to optimize the stages of the refining and characterization of products generated in the same. During the refining process in the edible oil industries, specifically in the stage of deodorization, generates a byproduct known as deodorizer distillates (DD) of which there are reports which indicate their high content of phytosterols as minor components, these substances are structurally similar to cholesterol but with a different configuration of the side chain, with biological activity as anti-inflammatory, antioxidant, anticancer and inhibitors of cholesterol absorption in the intestine, which gives them a high value in the food and pharmaceutical industries. In the present study was carried out the optimization and validation of an analytical method for free and esterified phytosterols and squalene in DD´s from two refining process (Premium and Generic) of American soybean oil. The method was established and resulted with acceptable precision, less expensive, faster and documented validation parameters. The concentration of free phytosterols was 15.65 and 13.71 and esterified was 2.1 and 4.9, squalene 2.17 y 2.03 % w/w to Premium and Generic respectively, indicating that the DD´s from different refining process of soybean oil are a potential source of these compounds. Palabras clave:

Ácidos grasos destilados, Fitoesteroles, Escualeno

ÁREA:

Otros.

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INTRODUCCIÓN Durante el proceso de refinación del aceite vegetal, específicamente en la etapa de deodorización, se genera un subproducto conocido como ácidos grasos destilados (AGD) del cual existen reportes que indican su alto contenido de componentes menores como los fitoesteroles, los cuales son sustancias estructuralmente parecidas al colesterol pero con diferente configuración de la cadena lateral, con actividad biológica como antiinflamatorios, antioxidantes, anticancerígenos e inhibidores de la absorción del colesterol a nivel intestinal, lo cual les da un alto valor en la industria alimentaria y farmacéutica. En cuanto a la sustentabilidad, la industria aceitera muestra interés en aprovechar el valor de los AGD, por lo que se requiere caracterizar los componentes menores que le dan el valor económico como son los fitoesteroles y el escualeno, demandando para ello metodologías analíticas que garanticen la calidad de los resultados y que a su vez impacten en una disminución significativa en tiempo, costo y generación de residuos potencialmente tóxicos. El contenido de Tocoferoles y fitoesteroles en un AGD proveniente del proceso de refinación del aceite de soya corresponde aproximadamente a 10 y 20 % p/p respectivamente (Chu et al., 2002). Otros autores reportan que el contenido de Tocoferoles y fitoesteroles en un AGD proveniente del proceso de refinación del aceite de soya corresponde aproximadamente a 18.6 y 7.1 % p/p respectivamente. Para escualeno se reportan 5.5 % p/p (Dumont & Suresh, 2007). En este trabajo se realizó la optimización y validación de una metodología analítica para la cuantificación de fitoesteroles libres (FL), esterificados (FE) y escualeno en ácidos grasos destilados. MATERIALES Y MÉTODOS Optimización de la purificación de fitoesteroles libres, esterificados y escualeno. Se realizó un método de superficie de respuesta mediante el diseño compuesto central para evaluar tres factores con dos niveles respectivamente, 23 N = 2k + 2k + n0

Cantidad de adsorbente (Silica), 2.5g(-) 5.0g(+) Factor A

= 20 experimentos considerando la respuesta el % de Recuperación (trasformado):

Volumen de los eluentes, 15ml(-) 25ml(+) Factor B

2) Hexano: Éter Etílico:Etanol ( 25:25:50), Libres 1) Hexano:Etil Acetato ( 90:1O), Esterificados

Cantidad de muestra 1800µg(-) 3000µg(+) Factor C A la fracción no polar, fitoesteroles esterificados y escualeno se realizó la saponificación después de la purificación, se concentró a aproximadamente 2ml, se añadió 20ml de solución de KOH en etanol al 6%p/p se colocó en baño maría a 75 °C por 1hr. Posteriormente se extrajeron en un embudo se separación de 250ml con dos porciones de éter etílico de 25 ml, la fracción de éter posteriormente se lavó con KOH 0.25M (50ml) y con agua destilada (50ml), se colecto la fracción de éter pasando por Sulfato de Sodio en un matraz bola de 100ml y se concentró a aproximadamente 3ml, finalmente se aforo a 10ml con hexano. La fracción polar se concentró a aproximadamente 3.0ml, finalmente se aforo

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a 10ml con hexano. Cada uno de los ensayos se analizó por Cromatografía de gases acoplado a un espectrómetro de masas con las condiciones previamente establecidas. Validación de la metodología analítica: Se prepararon 15 muestras sintéticas, es decir con una matriz semejante a la de la muestra a la cual se va a aplicar la metodología, se utilizó el producto comercial Vegapure 95 FF el cual es una pasta viscosa aceitosa de color amarillo con típico olor a grasa, el cual está constituido de 97% de fitoesteroles en forma esterificada o 60% como fitoesteroles libres, el escualeno se añadió a esta matriz a partir de una solución de 2760mg/l. Se pesaron 0.15g de la muestra sintética, se fortifico a una concentración 27.6mg/l de escualeno y se aforaron a 10ml con hexano grado HPLC, de esta solución se tomaron 0.1ml y se añadieron a la columna previamente preparada con 2.4g de Silica, para la elución de los fitoesteroles esterificados y escualeno se pasaron por la columna 24ml de una mezlca de Hexano:Etil Acetato ( 90:10), para recuperar los fitoesteroles libres se pasaron 24ml de la mezcla Hexano: Éter Etílico:Etanol (25:25:50). Después de la purificación se siguió la metodología de saponificación previamente descrita para la fracción no polar, la fracción polar igual que en el diseño de experimentos se concentró a 3.0ml. Finalmente cada muestra se aforó a un volumen de 10ml. Cada muestra fue analizada por la técnica de CG/MSD bajo un diseño de muestras pareadas para comparar dos técnicas de cuantificación, estándar interno (Colesterol) y estándar externo (Curva de Calibración) e igualmente comparar la metodología de análisis derivatizando ( BSA, 1%TCMS) y sin derivatizar. Análisis de Muestras: A manera de evaluar los factores, procedencia de grano de soya y grado de refinación en la composición de los AGD´s se realizó un diseño factorial (axbxn) a=Procedencia, b= grado de refinación, n= 5, dando como resultado 4 tipos de muestras: Americano Premium, Americano Genérico, Nacional Premium y Nacional Genérico. Cada una de las muestras fue analizada con la metodología previamente optimizada y validada. En la figura 1 se muestra procedimiento de optimización, validación y análisis de fitoesteroles y escueleno en muestras de ácidos grasos destilados provenientes de la etapa de deodorización del proceso de refinación de aceite de soya americana de dos diferentes grados: Premium y Genérico.

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Figura 1. Diagrama de flujo para el análisis de ftioesteroles y escualeno en muestras de AGD provenientes de la deodorización del aceite de soya

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN El ANOVA del diseño para optimización del análisis de fitoesteroles y escualeno se presenta en la Tabla 1 y 2 respectivamente, en la cual se muestra significancia para volumen de Eluente y cantidad de Sílica Gel, la cantidad de muestra resultó no ser significativa.

Tabla 1. ANOVA para fitoesteroles. Tabla 2. ANOVA para escualeno.

La Figura 2 muestra la gráfica de superficie de respuesta para escualeno, en la cual se obtuvo una cantidad óptima de sílica gel y volumen de eluente de 2.5g y 25ml respectivamente.

Figura 2. Método de Superficie de respuesta para escualeno mediante el diseño compuesto

central (DCC)23 N = 2k + 2k + n0

= 20 experimentos

En cuanto a la validación, los valores encontrados para cada parámetro se muestran en la Tabla 3, quedando así documentados para servir como referencia para laboratorios que requieran acreditar este análisis.

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Tabla 3. Valores de los parámetros de validación para análisis de fitoesteroles y escualeno.

LD

M

mg/

L

LCM

mg/

L

Prec

isió

n

Exac

titud

Rec

uper

aci

ón

Rep

etib

ilid

ad

Rep

rodu

cibi

-lida

d

Ince

rtidu

mbr

e R

elat

iva Rango de

Trabajo (%p/p)

Campesterol 6.55 21.83 12.9 -7.3 92.7 1.2 2.35 15.55 0.32-6.57 Estigmaesterol 3.86 12.87 12.9 -18.7 81.3 0.15 0.297 9.32 0.32-6.58 β-Sitoesterol 6.38 21.27 10.7 10 110 0.98 2.51 13.12 0.32-6.59

Escualeno 6.19 20.65 11 -12 88 0.88 1.54 13.83 0.32-6.57

La concentración de FL fue de 15.65 y 13.71 y FE 2.1 y 4.9 % p/p para AGD´s de grano americano grado de refinación Premium y Genérico respectivamente. En la Figura 2 se presenta la gráfica para fitoesteroles totales con valores de 17.75 y 18.61 % p/p para Premium y Genérico respectivamente (Saba Naz, 2012, Kellens & De Greyt, 2000, Chu et al., 2002). CONCLUSIONES Se establecieron metodologías de análisis con precisión aceptable (Horwitz 2006), menos costosas y más rápidas y se documentaron sus parámetros de validación. El grado de refinación (Premium y Genérico) no representa un factor de variación en la concentración Fitoesteroles y escualeno para grano americano. La concentración FL fue de 15.65 y 13.71 y FE de 2.1 y 4.9 % p/p para Premium y Genérico respectivamente, lo cual indica que los AGD´s residuales de diferentes grados de refinación del aceite vegetal, son una fuente potencialmente aprovechable de estos compuestos. REFERENCIAS Feng Yan, Haojun Yang, Jianxin Li, Huiling Wang. 2012. Optimization of Phytosterols

Recovery from Soybean Oil Deodorizer Distillate. JAm Oil Chem Soc. 89:1363–1370. Horwitz W., Albert R.J. 2006. The Horwitz Ratio (HorRAt): A useful Index of method

Performance with respect to Presicion. Assoc. Off. Anal. Chem. 89-4: 1095-1109. Saba Naz, S. T. H. Sherazi, Farah N. Talpur, M. Younis Talpur, Huseyin Kara. 2012.

Determination of Unsaponifiable Constituents of Deodorizer Distillates by GC–MS. J Am Oil Chem Soc. Publisher on line 14 january 2012.

Sakina Khatoon, Raja Rajan S., Gopala Krishna. 2010. Physicochemical Characteristics and Composition of Indian Soybean Oil Deodorizer Distillate and the Recovery of Phytosterols. JAm Oil Chem Soc 87:321–326

Verleyena T., Sosinska U., Ioannidoua S., Verhea R., Dewettinckb K., Huyghebaertb A., and De Greyt W. 2002. Influence of the Vegetable Oil Refining Process on Free and Esterified Sterols. JAOCS 79:10.

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División Ciencias de la Vida

CAMPUS IRAPUATO-SALAMANCA

ANALISIS DE AGUA PURIFICADA DE ESTACIONES DE AUTOSERVICIO

Gómez Verastegui A.C., Núñez González M. A.*, Espinoza Mata A., Castañeda Garza E., Sánchez Velázquez F. J., Cárdenas Ávila M. L., Heredia Rojas J. A., Rodríguez Arzave J. A.

Universidad Autónoma de Nuevo León, Facultad de Ciencias Biológicas, Av. Pedro de Alba s/n, C.P. 66451, San Nicolás de los Garza, Nuevo León, México.

* [email protected]

RESUMEN: El agua, es esencial para la vida, pero si no es potable, puede causar enfermedades ya que es un medio en el que se desarrollan fácilmente microbios y al ser el solvente universal, contener gran variedad de sustancias químicas toxicas. Dada la creciente demanda y altos costos del agua purificada embotellada, han proliferado en diversos puntos, estaciones de autoservicio, que la expenden a bajos precios. Estos novedosos sistemas deben trabajar con varios procesos de purificación y bajo criterios que garanticen agua verdaderamente purificada. En este estudio, agua de 5 auto-servidores fue sometida a pruebas fisicoquímicas (Dureza total, Alcalinidad, Turbiedad, Color, Cloruros, SDT, Conductividad y pH) y microbiológicas. La totalidad de las muestras cumple con las especificaciones de la normatividad mexicana vigente para los parámetros fisicoquímicos. Para el Microbiológico solo un 73.3 % de las muestras cumple con la normativa establecida para agua purificada envasada, el 13.3% de las muestras rebasaron lo establecido en la legislación para la cuenta de mesofílicos aerobios, 20% se excedieron con respecto a coliformes totales y un 6.6%

en la cantidad de organismos fecales. Se requiere una eficaz y permanente higienización del grifo del dispensador además de una limpieza exhaustiva en los envases de almacenamiento

ABSTRACT: The water is essential for life, but unless is potable, can cause diseases since is one medium in the what easily develop microbes and at be the solvent universal, contain great variety of substances chemistry toxic. Given the growing demand and costs of water purified stations of self-services in sundry points, that the sell a low prices. This novel system should work with several processes of purification and under criteria that ensure water truly purified. In this study, the water of 5 self-services was submitted a testing physicochemical (total hardness, alkalinity, turbidity, color, chloride, SDT, conductivity and pH) and microbiological. The entirety of the samples meets with the specs of the regulations Mexican valid for the physicochemical parameters. For the microbiological single one 73.3% of the samples meets with the regulations established for water purified packaged, the 13.3% of the samples exceeded it established in the legislation for the account of mesophilic, 20 % is exceeded with respect a total coliforms and 6.6% in the amount of fecal organism. Is requires effective and permanent sanitation of tap of dispenser also of cleaning exhaustive in packaging of storage. Palabras clave: Agua purificada, Análisis. ÁREA:

Otros.

INTRODUCCIÓN

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Debido a la creciente demanda y a los altos costos del agua purificada embotellada, desde hace aproximadamente 7 años, en diversos puntos del área metropolitana de Monterrey, estaciones de autoservicio de agua purificada, que ofrecen agua purificada a bajos precios. Estos nuevos sistemas de servicio deben trabajar con varios procesos de purificación y bajo normas que garanticen que el agua es verdaderamente purificada. Aquí en México la secretaria de salud emite las normas de potabilización y métodos de prueba para los análisis tanto fisicoquímicas como microbiológicas y organolépticas así como del muestreo para verificar que el agua se encuentre dentro de los rangos dictaminados para ser considerada Como agua de buena purificadas de buena calidad. Requerimientos establecidos por salubridad para una agua de buena calidad se muestran en la tabla de abajo para este análisis se consideraron solo los mostrados en la tabla. Según la norma oficial NOM-041-SSA1-1993 ESPECIFICACIONES FISICAS LIMITES MAXIMOS COLOR 15 Unidades de color verdadero* en

la escala de platino-cobalto TURBIEDAD 5 Unidades de UTN pH 6,5 - 8,5 ESPECIFICACIONES QUIMICAS LIMITES MAXIMOS EN mg/l (ppm) ALCALINIDAD TOTAL como CaCO₃ 300.00 CLORUROS como Cl 250.00 - DUREZA TOTAL como CaCO₃ 200.00 ESPECIFICACIONES MICROBIOLOGICAS LIMITES MAXIMOS MESOFILICOS AEROBICOS ufc/ml 100

COLIFORMES TOTALES NMP/100ml No detectables

Los parámetros fisicoquímicos son esenciales para el control de calidad del agua para el consumo, puesto que pueden alterar las condiciones de salud de los individuos que la consumen, Los efectos debidos a la presencia de materia inorgánica pueden ser de características muy diversas. Pueden ser tóxicos, como los efectos producidos por las sales de los metales pesados, inductivos, como los producidos por la acidez y la alcalinidad, que varían la toxicidad de algunas sustancias, disuelven precipitados, etc.

El grupo de los microorganismos coliformes es el más ampliamente utilizado en la microbiología de los alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para:

• La detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos.

• La evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario.

• Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas del equipo.

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• La calidad sanitaria del agua y hielo utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.

• La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales (NOM-113-SSA1-1994).

Los coliformes fecales son microorganismos con una estructura parecida a la de una bacteria común, Escherichia coli y se transmiten por medio de heces. Escherichia es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del hombre y en el de otros animales. Hay diversos tipos; algunos no causan daño en condiciones normales y otros pueden incluso ocasionar la muerte. Formas patógenas de Escherichia y de otras bacterias (que por tener forma similar se denominan genéricamente coliformes fecales) se transmiten, entre otras vías, a través de las excretas y comúnmente por la ingestión o el contacto con agua contaminada.

MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo

Para llevar a cabo este trabajo se tomaron las muestras de 5 diferentes marcas de auto servidores de agua purificada en la zona de Apodaca N.L., éste se realizó por triplicado y con un tiempo entre muestreo de una semana. La toma de muestra se llevo en las condiciones en las que el cliente compra el producto y el tiempo de traslado de muestra fue de 1 hora en una temperatura de 4 a 10° C. Para el análisis microbiológico se recogieron 100 ml en un recipiente con tiosulfato y para el análisis fisicoquímico se recogieron 1 000 ml en recipientes limpios.

Técnica del número más probable de coliformes totales (NMP)

Para la prueba presuntiva, la muestra se agitó para transferir un volumen de 10 ml a cada uno de 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado 1.5%; 1.0 ml y 0.1 ml a dos series de 5 tubos con caldo lactosado al 1%. Todos los tubos fueron incubados a 35°C por 24 a 48 h.

Prueba presuntiva

Prueba confirmatoria

A partir de cada uno de los tubos que presentaron formación de gas, se consideraron como positivos y de cada uno se tomaron 2-3 asadas para inocular tubos con caldo bilis verde brillante y realizar la prueba confirmatoria. Estos cultivos se incubaron a 35°C por 24 a 48 h a cuyo término, se revisaron para verificar la producción de gas y establecer el NMP en cada muestra de agua purificada analizada de acuerdo a la tabla correspondiente.

Cuenta en placa de mesofílicos Se mezclaron 11 ml de muestra con 99 ml de una solución de buffer de fosfatos pH 7.2 para realizar la dilución 10-1 de la cual se tomó 1 ml y se colocó en una caja de Petri; de la misma dilución se tomò 1 ml y se colocò en 9 ml de buffer de fosfatos para realizar la dilución 10-2 de la cual se inoculó 1 ml a una caja de Petri. A ambas placas se les adicionó 20 ml de agar para cuenta en placa y se homogenizaron muestra y agar. Las placas se

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dejaron solidificar y se incubaron a 35°C por 24 a 48 h. Al cabo de este tiempo se contaron todas aquellas colonias que desarrollaron en las placas y se multiplicaron por la inversa de la dilución para obtener el número de unidades formadoras de colonias por ml de muestra. Métodos fisicoquímicos (NOM-042). Determinación de dureza total

Método volumétrico complejométrico

Determinación de cloruros Método volumétrico argentométrico

Determinación de alcalinidad Método volumétrico (Neutralización)

Conductividad y SDT Método conductivimetrico

Turbiedad y Color Métodos ópticos Determinación de pH Potenciométrico. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados del análisis fisicoquímico se muestran en la tabla 1, estos fueron sometidos a un análisis estadístico Donde es posible apreciar que la totalidad de las muestras (diferentes marcas y tiempos de muestreo) cumplen con las especificaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993, bienes y servicios. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias.

Tabla 1. Resultados del análisis fisicoquímicos de las 5 estaciones analizadas.

Muestra Dureza total ppm

Cloruros ppm

Alcalinidad total ppm

Conductividad µmoho/cm

SDT ppm

Color UPCo

Turbiedad UTN

pH

1 9.3 93.3 29.2 45 30.6 0 0 6.5 2 2.6 65.3 32.5 19.6 13.6 0 0 6.5 3 0 263.6 29.2 172.3 117.3 0 0 6.5 4 0.6 70 35.7 34.3 23 0 0 6.5 5 0 49 32.5 8 8 0 0 6.5 *NOM-041-SSA1-1993

200 250 300 500 0 5 6.5 a 8.5

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En el análisis microbiológico no se trataron los datos estadísticamente, lo que se hizo, fue dar seguimiento con las fechas de muestreo para ver el efecto del tiempo en la calidad microbiológica.

Análisis microbiológicos

Como se presenta en la tabla 2, los resultados de los análisis microbiológicos muestran, solo un 73.3 % de las muestras cumple con la normativa establecida para agua purificada envasada, el 13.3% de las muestras rebasaron lo establecido en la legislación para la cuenta de mesofílicos aerobios, 20% se excedieron con respecto a coliformes totales y un 6.6% en la cantidad de organismos fecales. Es decir, conforme transcurre el tiempo, existen diversos factores que modifican las condiciones de inocuidad del agua, de una semana a otra cambian algunos resultados con respecto a los obtenidos antes. Dentro de lo observado las muestras manejan los requerimientos necesarios para ser considerados como aguas purificadas de buena calidad además de que los factores no pueden estar directamente relacionados con el sistema de purificación del autoservicio sino de las condiciones de los recipientes en los que los clientes toman el agua. En los análisis fisicoquímicos hay poca variabilidad en los resultados, es decir son más estables con respecto al tiempo. Tabla 2. Resultados de los análisis microbiológicos de las 5 marcas de agua estudiadas.

Marca Fecha Coliformes totales nmp/100ml

Coliformes fecales nmp/100ml

Mesofílicos aerobios ufc/ml

1 11/06/12 1.1 1.1 73

18/06/12 <1.1 <1.1 28 25/06/12 <1.1 <1.1 14 2 11/06/12 <1.1 <1.1 29

18/06/12 <1.1 <1.1 14 25/06/12 1.1 35 3 11/06/12 <1.1 <1.1 23

18/06/12 4.6 <1.1 >250

25/06/12 <1.1 <1.1 24 4 11/06/12 <1.1 <1.1 35uf

18/06/12 <1.1 <1.1 18uf

25/06/12 <1.1 <1.1 21

5 11/06/12 <1.1 <1.1 16

18/06/12 <1.1 <1.1 196

25/06/12 <1.1 <1.1 26 NOM-041-SSA1-1993

No detectables No detectables 100

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CONCLUSIONES El agua purificada analizada de autoservidores, cumple con las especificaciones en cuanto los parámetros fisicoquímicos de la NORMA Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993, Bienes y servicios, Agua purificada envasada. Para los Microbiológicos, solo un 73.3 % de las muestras cumple con la normativa establecida. Por lo tanto la recomendación es que se requiere una eficaz y permanente purificación del agua además de la higienización del grifo del dispensador y los tanques de almacenamiento. Indudablemente, es necesario recomendar al usuario la limpieza exhaustiva de los envases en que se dispensa y conserva el agua una vez expendida. REFERENCIAS Métodos normalizados para el análisis de aguas potables y residuales, APHA, AWWA, WPCF, 17 Edición, Ediciones Díaz de Santos S.A., 1992, Madrid, España, páginas 1060,2120 a 2150, 2310 a 2340, 2510 a 2540, 9215 a 9221. NOM-041-SSA1-1993, Bienes y servicios. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. NOM-051-SCFI-1994 Especificaciones generales de etiquetado para alimentos y bebidas no alcohólicas pre envasados. NOM-092-SSA1-1994 Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. NOM-110-SSA1-1994 Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. NOM-112-SSA1-1994 Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. NOM-113-SSA1-1994, Bienes y Servicios. Método para la cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en placa. NOM-127-SSA1-1994 Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.

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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA Y TOXICIDAD CONTRA Artemia salina: (Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-ona Y TIOUREA CYTU

a*González-Montiel L, aGuevara-López E., aCampos-Pastelín JM., aAburto-Amar R.,

aHernández-Paxtián Z.J., bEspino-García J.J. y b

Franco-Fernández M.J.

aUniversidad de la Cañada. *Cuerpo Académico de Investigación Aplicada y Desarrollo Experimental. Carr. Teotitlán-San Antonio Nanahuatipan Km. 1.7 s/n. Paraje

Titlacuatitla. Teotitlán de Flores Magón, Oax., México. C. P. 68540. bInstituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo,

Tulancingo, Hgo. México CP 43600. e-mail: [email protected]

RESUMEN: La actividad antimicrobiana de la chalcona ((Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-ona) y la tiourea CyTU fue evaluada contra diferentes microorganismos patógenos. Asimismo, se evaluó la toxicidad de ambos compuestos contra Artemia salina. Los ensayos de actividad antimicrobiana se realizaron por la técnica de difusión en pozo, probando concentraciones de la chalcona y tioruea de 1, 5, 10, 25 y 50 mg/mL. En ninguna de las concentraciones se observó inhibición del crecimiento con las cepas evaluadas. El ensayo de toxicidad se realizó por el método de Vanhaecke et al., (1981). La concentración evaluada para ambos compuestos fue de 20 mg/L. Sólo la tiourea mostró toxicidad, observándose el 63.3% de larvas muertas en los ensayos, abriendo una puerta de estudio para la determinación de la DL50

.

ABSTRACT: Antimicrobial activity of Chalcone ((Ɛ) (4-bromo-phenyl) -3 ferrocenyl prop-2-en-1-one) and thiourea (CyTU) was evaluated against differents pathogenic microorganisms. Also, the toxicity of both compounds against Artemia salina was evaluated. Antimicrobial activity tests were conducted by the well diffusion technique, testing chalcone and thiourea concentrations of 1, 5, 10, 25 and 50 mg/L. Only thiourea, at 20 mg/L, showed toxicity with 63.3% of dead larvae in trials. That opens a door of study for determining the DL50. The concentrations evaluated were not growth inhibitory for the strains of the microorganisms evaluated. Only thiourea showed toxicity against A. salina, with 63.3% of dead larvae in trials. That opens a door of study for determining the DL50. Palabras clave:

Tiourea, Chalcona, Actividad antimicrobiana y Toxicidad.

ÁREA: O

tros.

INTRODUCCIÓN En la actualidad existen diversas enfermedades que amenazan y ponen en riesgo el bienestar, así como la salud de la humanidad. Es por ello, que médicos y científicos trabajan en conjunto, en el desarrollo de nuevos fármacos que puedan ayudar a contrarrestar

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mailto:[email protected]�


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dichas enfermedades. Una alternativa al respecto, es el desarrollo de moléculas sintéticas con potencial para su uso como medicamentos sintéticos

(Balkrishna et al., 2010).

Las chalconas son compuestos que participan en la síntesis de muchos productos farmacéuticos (Rojas et al., 2002). Se ha reportado que algunos compuestos sintetizados a partir de chalconas poseen una amplia gama de aplicaciones farmacológicas, como agentes antimicrobianos, antitumorales, anticancerígenos, antiinflamatorios, antipalúdicos, antimaláricos, antioxidantes, antituberculosos, entre otras (Bhagyesh et al., 2008).

Vázquez et al. (2010) mencionan que las tioureas son una familia de compuestos orgánicos de importancia en medicina debido a su reconocida actividad biológica, por ejemplo, contra infecciones microbianas, además de utilizarse como fungicidas, herbicidas, raticidas e inhibidores de la enzima fenoloxidasa. En química, son valiosas como bloques de construcción para la síntesis de heterociclos de cinco y seis miembros.

Mediante pruebas in vitro se puede obtener información útil sobre la actividad biológica de diversos compuestos y de esta manera conocer las propiedades potencialmente útiles en el desarrollo de nuevos fármacos. El método que utiliza Artemia salina desarrollado por Vanhaecke et al. (1981), es un bioensayo preliminar, simple y de bajo costo, que nos permite medir la toxicidad de los compuestos. También se puede conocer la actividad antimicrobiana empelando diversas técnicas como son la difusión en agar con discos impregnados, técnica por difusión en pozos y el método de dilución en medio líquido o en medio sólido. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar la actividad antimicrobiana de la chalcona ((Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-ona

) y la tiourea CyTU, así como su toxicidad contra Artemia salina.

MATERIALES Y MÉTODOS Ensayo de toxicidad sobre Artemia salina. Para la obtención de los nauplii (larvas), se incubaron 100 mg de huevecillos de Artemia salina, en 50 mL de solución acuosa de sal de mar (30 g/L), durante 48 horas a 25°C. Posteriormente, en un tubo de ensaye se agregaron 10 larvas y la solución salina (5 mL), se agregó el compuesto a evaluar ((Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-ona

o la tiourea CyTU) a una concentración de 20 mg/L. Los compuestos sujeto de estudio fueron previamente solubilizados en dimetil sulfóxido. Las larvas sobrevivientes se contaron a las 24 horas. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Cepas microbianas. Se utilizaron las siguientes cepas: Proteus vulgaris ATCC 13315, Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 14065, Candida albicans ATCC 10231 y Staphylococcus aureus ATCC 29213, las cuales fueron donadas por la Dra. Margarita Canales Martínez, FES-Iztacala perteneciente a la UNAM. Evaluación de la actividad antibacteriana. Se realizó el ensayo de difusión en pozo según Cavalieri (2005). Para el ensayo, primero se activó la cepa, en un tubo con 10 mL de caldo Müller Hinton estéril, se inoculó con una asada de cultivo, el cual se incubo a 37°C + 2°C durante 24 horas, se repitió la operación (dos pases), obteniendo una concentración de 108 UFC/mL de cada una de las cepas.

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En cajas de Petri estériles de 100 x 15 mm, se agregó 1 mL de la suspensión microbiana y se adicionaron 20 mL de agar Müller Hinton a 45°C, se homogenizaron las cajas y se dejaron solidificar, con la ayuda de un sacabocados de 0.3 cm se realizaron siete pozos. En cada pozo se colocó 25 µL de, (Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-ona y la toiurea: con una concentración de: 1, 5, 10, 25 y 50 mg/mL. Los compuestos de sujeto de estudio fueron disueltos en dimetil sulfóxido (DMSO), todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las cajas se incubaron a 37°C +

2°C durante 24 horas para las lecturas de los resultados. Como control negativo se utilizó el DMSO y como control positivo una solución de antibiótico compuesta por 10,000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μg de amfotericina B por mL. Con un vernier se midieron los halos de inhibición de los compuestos, así mismo los halos de inhibición producidos por el control negativo y control positivo.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los compuestos de origen sintético sujetos de estudio, no presentaron actividad contra las bacterias y las levaduras analizadas, el comportamiento del control negativo, fue el mismo que el de los compuestos analizados, lo que indica que el DMSO no afecta la viabilidad de las cepas. Por otra parte, el control positivo si mostró un efecto inhibidor, con la presencia de halos de diferente diámetro de inhibición (Cuadro 1). Cuadro 1. Actividad antibacteriana de la (Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3 Ferrocenil prop-2-en-1-

ona

y la Tiourea (CyTU).

Compuesto Diámetro del halo de inhibición (mm)

Tiourea CyTU

Concentración (mg/mL)

P vulagris ATCC 13315

E coli ATCC 8739

C albicans ATCC 14065

C albicans ATCC 10231

S aureus ATCC 29213

1 - - - - - 5 - - - - -

10 - - - - - 25 - - - - - 50 - - - - -

Control negativo

- - - - -

Control positivo 1.7 3 1.9 1.9 1.7

(Ɛ) (4-bromo-Fenil) -3

Ferrocenil prop-2-en-1-

ona

1

- - - - - 5 - - - - -

10 - - - - - 25 - - - - - 50 - - - - -

Control negativo

- - - - -

Control positivo 1.7 3 1.9 1.9 1.7

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Respecto a la toxicidad mediante el ensayo contra Artemia salina, la chalcona, a una concentración de 20 mg/L no mostró efecto tóxico, observando que el 100 % de las larvas sobrevivió. Sin embargo, esto también puede deberse a la rápida precipitación del compuesto en presencia de la solución salina. Por otro lado, el 63.3% de las larvas de A salina se murieron con la Tiourea a una concentración de 20 mg/L, lo cual podría indicar que este compuesto es tóxico. CONCLUSIONES Los compuestos sintéticos sujetos de estudio no presentaron actividad antimicrobiana contra:

Proteus vulgaris ATCC 13315, Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 14065, Candida albicans ATCC 10231 y Staphylococcus aureus ATCC 29213, a las concentraciones evaluadas. Por otro lado, la tiourea resultó ser tóxica contra Artemia salina, abriendo una puerta de estudio para la determinación de la DL50, así como algunas pruebas de citotoxicidad

REFERENCIAS Balkrishna Tiwari, Pratapwar AS, Tapas AR, Butle SR and Vatkar BS. (2010). Synthesis and

antimicrobial activity of some chalcone derivatives. International Journal of ChemTech Research. 2: 499-503.

Bhagyesh Baviskar, Sureshbhi Patel, Bhushan Baviskar, S.S. Khadabadi, Mahendra Shiradkar (2008). Design and synthesis of some novel chalcones as potent antimicrobial agent. Asian J. Res. Chem. 1(2): 67-69.

Cavalieri S. J., Harbeck R. J., Sautter R. L., McCarter Y. S., Sharp S. E., Ortez J. H. y Spiegel C. A. (2005). Manual de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana: Métodos de Prueba University of Washington Seattle, Washington. Pp. 39-52.

Rojas J, Paya M, Dominguez JN, Luisa FM. (2002). The synthesis and effect of fluorinated chalcone derivatives on nitric oxide production. Bioorganic and Medicinal Chemestry Letters. 12:1951-1954.

Vanhaecke P, Persoone, G, Claus C, Sortgeloos P. (1981). Proposal for a short-term toxicity test with Artemia nauplii. Ecotoxicol Environ Saf. 5:382-387.

Vázquez Bravo JJ., Farfán-Martínez M. L., Campos-Pastelin J. M., López-Martínez L. X., Hernández- Cervantes G L., y Pérez-Flores F. J. (2011). Síntesis de dos tioureas quirales n,n´-disustituidas por irradiación de microondas. VII Encuentro Participación de la Mujer en la Ciencia. León Guanajuato.

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EVALUACIÓN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE Y ANTIMICROBIANO DE LAS HOJAS DE Tradescantia pendula

Aburto-Amar R., González-Montiel L.,

Universidad de la Cañada. Instituto de Farmacobiología. Carretera Teotitlán - San Antonio Nanahuatipán Km 1.7 s/n. Paraje Titlacuatitla, C.P. 68540, Teotitlán de Flores Magón, Oaxaca,

México.

Rosas-Rosas R., Saucedo-Balderas M. M., Criollo-López A., Ibáñez-Pimentel M. Á., Feliciano-Miguel H., Gómez Solís T.S.

[email protected]

RESUMEN: Tradescantia pendula

es una planta originaria de América, la cual se ha utilizado en la medicina tradicional mexicana para tratar diversos padecimientos. En un estudio previo se aisló e identificó un compuesto fenólico, el flavonoide zebrinína, a partir de las hojas de la planta. Dado que una amplia variedad de compuestos fenólicos de origen natural actúan como agentes antioxidantes y antimicrobianos, el objetivo del presente trabajo fue determinar la cantidad de fenoles totales, y evaluar las actividades antioxidante y antimicrobiana de las hojas de T. pendula. La cantidad de fenoles totales y los valores de la capacidad antioxidante del extracto metanólico de las hojas de T. pendula (determinadas con las técnicas de Folin Ciocalteau, FRAP y CUPRAC, respectivamente), fueron 68.40 ± 0.60, 19.06 ± 0.24 y 51.56 ± 4.38 mg equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto seco, respectivamente. Dicho extracto no presentó actividad antibacteriana en contra de las cepas evaluadas.

ABSTRACT: Tradescantia pendula is a plant native to America, which has been used in Mexican traditional medicine to treat various diseases. In a previous study a phenolic compound, the flavonoid zebriníne, was isolated and identified from the leaves of the plant. Since a wide variety of naturally occurring phenolic compounds act as antioxidants, the objective of this work has focused on determining the amount of total phenols, and evaluate the antioxidant and antimicrobial capacities of the leaves of T. pendula. The amount of total phenolics and the antioxidant activity (determined with Folin Ciocalteu´s, FRAP and CUPRAC techniques) were 68.40 ± 0.60, 19.06 ± 0.24 y 51.56 ± 4.38 mg of gallic acid equivalents per gram of dry extract, respectively. The extract did not show any antimicrobial activity against the evaluated strains.

Palabras clave:

Tradescantia pendula, antioxidante, fenoles.

ÁREA:

Otros.

INTRODUCCIÓN

La población de Teotitlán de Flores Magón se encuentra en la región conocida como la Cañada Oaxaqueña, asentada a un costado de la sierra Madre Occidental (INAFED, 2009). Este municipio se ubica dentro del Valle Tehuacan-Cuicatlán, una zona de particular importancia en materia de medicina herbolaria, dada su gran diversidad biológica y cultural (Dávila et al., 2002).

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A pesar de que la medicina tradicional representa una valiosa herramienta para la salud de la población en la zona, el papel que la mayoría de sus recursos herbolarios juegan en este contexto es empírico en el fundamento de su aplicación, y escasean los estudios químicos y farmacológicos que contribuyan a determinar sus efectos terapéuticos. Tal es el caso de la hierba del pollo (Tradescantia pendula), una planta originaria de México, el Caribe y Centroamérica, cuyas hojas son verdes y poseen dos bandas color púrpura. Esta hierba se utiliza en la medicina tradicional para el tratamiento de disentería, diarrea, mal de orín (sic), dolores después del parto, dolores por aire y torzón (sic), dolores de cabeza, gastritis y diabetes (UNAM, 2009). Sin embargo, son muy pocos los estudios que existen acerca de esta planta, y no permiten hacer conjeturas de la efectividad en las aplicaciones terapéuticas actuales. Previamente se reportó que las hojas de T. pendula contienen el flavonoide zebrinína (Idaka et al., 1987). Los flavonoides, y en general los fenoles, son un tipo muy común de compuestos de origen natural, muchos de ellos con probadas actividades antioxidantes y antibacterianas

(Raj Narayana et al., 2001); se puede hipotetizar entonces que la planta exhibira este tipo de acciones y así podría ejercer efectos terapéuticos para tratar enfermedades crónico degenerativas e infecciosas.

El objetivo de la presente investigación fue determinar la cantidad de fenoles totales, y evaluar el potencial antioxidante y antimicrobiano de T. pendula, colectada en Teotitlán de Flores Magón, Oaxaca.

MATERIALES Y MÉTODOS Obtención del Material vegetal. Se colectaron las hojas de Tradescantia pendula en

Teotitlán de Flores Magón, Oaxaca, en el mes de octubre del año 2011. Se eliminó la humedad de la muestra vegetal en un secador de convección libre, bajo sombra y a temperatura ambiente. El material vegetal seco se pulverizó en un molino eléctrico.

Extracción. Dado que los compuestos fenólicos y flavonoides son de naturaleza polar, se utilizó metanol para extraerlos, removiendo inicialmente los compuestos que no son de interés, utilizando hexano como disolvente. El procedimiento se llevó a cabo mediante extracción continua por la técnica Soxhlet.

El disolvente de extracción se evaporó mediante un evaporador rotativo digital marca BÜCHI modelo R-215. El extracto obtenido fue guardado protegido de la luz directa a 4º C hasta el momento de los ensayos.

Preparación de la muestra.

Se pesaron 20 mg del extracto metanólico de hojas de T. pendula y se disolvieron en 2 mL de metanol. Se tomaron distintos volúmenes de la disolución anterior y se completó el volumen con agua destilada, según la técnica correspondiente (ver tabla 1).

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Tabla 1. Preparación de la muestra para las distintas evaluaciones.

Evaluación Volumen de Extracto (µL)

Volumen final (µL)

Contenido de fenoles totales 50 3200 FRAP (Potencial antioxidante para reducir el Cobre) 20 1000 CUPRAC (Capacidad reductora antioxidante de cobre) 41 1100

Preparación de las diluciones de ácido gálico para curvas de calibración:

Se utilizó una solución estándar de ácido gálico (Sigma-Aldrich) a una concentración de 40 o de 50 mg/L (Sigma-Aldrich®), a partir de las cuales se tomaron distintos volúmenes y se completó cada uno con agua destilada a un volumen final, según lo indicado en la tabla 2.

Tabla 2. Preparación de las diluciones para las curvas de calibración.

Evaluación Disolución estándar Volúmenes de Extracto (µL) Volumen final (µL)

Contenido de fenoles totales

Ácido gálico 50 mg/L

0 μL a 800 μL (en intervalos de 160 μL) 3200

FRAP Ácido gálico 40 mg/L

de 0 μL a 100 μL (en intervalos de 20 μL) 1000 μL

CUPRAC Ácido gálico 40 mg/L

0 μL a 500 μL (en intervalos de 100 μL) 1100 μL

Contenido de fenoles totales. La concentración de fenoles totales fue determinada por el método espectrofotométrico de Singleton y Rossi (1965), con algunas modificaciones, basándose en una reacción colorimétrica de oxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu. A la muestra y a cada uno de los estándares de ácido gálico previamente preparados se les adicionaron 200 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1N y se sonicó por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 600 μL de carbonato de sodio (Na2CO3

) al 20% y se incubó a 50°C por 5 minutos. La absorbancia fue medida a 765 nm contra blanco de reactivos.

Capacidad antioxidante total mediante la metodología de FRAP. La capacidad antioxidante FRAP (Potencial antioxidante para reducir el Fe+3

El reactivo FRAP fue preparado diariamente, y mantenido a 37 ºC, con una disolución amortiguadora de acetatos (0.3 M pH 3.6), una solución 10 mM de TPTZ (2, 4, 6 tripiridil-s triazina, Sigma- Aldrich) en HCl 40 mM, y una solución 20 mM de FeCl

, de sus siglas en inglés Ferric Reducing Antioxidant Power) fue determinada de acuerdo a la metodología espectrofotométrica de Benzie y Strain (1996), con algunas modificaciones.

3 ·6H2O, en una proporción de 10:1:1. A la muestra y a cada uno de los estándares previamente preparados se les adicionaron 3000 μL de reactivo FRAP, se dejaron incubar en oscuridad por 60 minutos, y se midió la absorbancia a 593 nm contra blanco de reactivos.

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Capacidad antioxidante total mediante la metodología de CUPRAC. La capacidad antioxidante CUPRAC (de sus siglas en inglés Cupric Reducing Antioxidant Capacity) mide espectrofotométicamente la capacidad de una sustancia de reducir los iones Cu (II) a Cu(I) (Apak, 2004). A cada uno de los estándares y muestra previamente preparados se le adicionaron 1000 μL de una solución de neocuproína (2,9-dimetil-1,10-fenantrolina, Sigma-Aldrich) 7.3 mM, 1000 μL de una solución de acetato de amonio 9.7 M y 1000 μL de una solución de cloruro de cobre 9.7 mM. Se dejó incubar en oscuridad por 60 minutos, y se midió la absorbancia a 450 nmPara las técnicas anteriores, las absorbancias fueron medidas en un espectrofotómetro Lambda 35 de Perkin Elmer. Los valores se presentan como la media de los análisis realizados por triplicado ± desviación estándar.

.

Determinación de capacidad antimicrobiana por difusión en pozo. El potencial antimicrobiano del extracto metanólico de T. pendula sobre algunas bacterias y hongos (Proteus vulgaris ATCC 13315, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 14065), se evaluó descrito mediante la técnica de difisión en pozo propuesta por Giménez (1998), como se describe a continuación. Se incubó la cepa correspondiente en medio de cultivo nutritivo (Bioxon) durante 24 h a 35 ° C. Se igualó la turbidez de la suspensión microbiana a la de la solución estándar 0.5 de McFarland. Se sembraron cajas con agar Müeller Hinton (Bioxon) con 100 µL de dicha suspensión. Se hicieron en el agra orificios de 5 mm de diámetro, para depositar en ellos 50 µL del extracto metanolico de T. pendula a distintas concentraciones. Se incubó a 37 ± 2 °C por un periodo de 24 h y se midieron los diámetros de los halos de inhibición de crecimiento microbiano. Como control negativo se utilizó agua destilada y como control positivo una solución acuosa de una mezcla de estreptomicina y amfotericina B, 10 mg y 25 μg por mL, respectivamente (Sigma). RESULTADOS Y DISCUSIÓN La cantidad de fenoles totales y la capacidad antioxdante del los extracos metanólicos de la planta estudiada y los controles positivos utilizando los dos métodos seleccionados (FRAP y CUPRAC) se muestran en la tabla 3, expresados como mg equivalentes de ácido gálico por g de extracto (mg AG/g extracto), para el extracto metanólico de las hojas de Hierba del pollo (Tradescantia pendula), y para los extractos metanólicos de muestras comerciales de hojas de Té Verde (Camellia sinensis), cocoa (Theobroma cacao) y semilla de Chía (Salvia hispánica), estos últimos tres utilizados como controles positivos debido a su demostrada actividad antioxidanteLas hojas de C. sinensis son una de las fuentes naturales más ricas en compuestos fenólicos con capacidad antioxidante (Namita et al., 2012). Las semillas de las plantas mexicanas T. cacao y S. hispánica también poseen actividad antioxidante ampliamente reconocida (Ali et al., 2012; Chin et al., 2013).

.

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Planta Tabla 3. Cantidad de fenoles totales y valores de capacidad antioxidante.

Fenoles totales mg AG/ g extracto.

FRAP mg AG/ g extracto.

CUPRAC mg AG/ g extracto.

Tradescantia pendula 68.40 ± 0.60 19.06 ± 0.24 51.56 ± 4.38 Salvia hispánica 21.61 ± 9.43 1.25 ± 0.55 8.87 ± 0.33 Theobroma cacao 159.93 ± 26.46 108.06 54.97 ± 0.89 ± 6.51 Camellia sinensis 279.02 ± 14.03 120.36 ± 8.30 167.11 ± 11.58

Como se puede observar en la tabla 4, el extracto metanólico de las hojas de T. pendula presenta un contenido de fenoles más bajo que los extractos metanólico de las hojas de C. sinensis y de cocoa (T. cacao), pero mayor que el del extracto metanólico de las semillas de S. hispánica. Dado que la concentración de compuestos fenólicos está relacionada de manera directa con la capacidad actividad antioxidante de los extractos vegetales, era de esperarse que el extracto metanólico de T. pendula exhibiera también actividad antioxidante, aunque en menor proporción que los correspondientes extractos de

En la tabla 4 se presentan los resultados de la evaluación antimicrobiana del extracto metanólico de las hojas de T. pendula. A ninguna de las concentraciones evaluadas dicho extracto exhibió actividad antimicrobiana contra las cepas evaluadas.

C. sinensis y de cocoa (T. cacao), y en mayor proporción que el extracto de S. hispánica.

Tabla 4. Diámetros de inhibición bacteriana (mm) del extracto metanólico de las hojas de

T. pendula.

Cepa Proteus vulgaris

Concentración del Extracto (mg/mL)

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida albicans

100 - - - - 50 - - - - 35 - - - - 20 - - - - 10 - - - -

Control negativo - - - - Control positivo 8 6.7 8 6.9

CONCLUSIONES De acuerdo con nuestro conocimiento, este es el primer reporte de actividad antioxidante de las hojas de Tradescantia Pendula. De esta manera, los resultados presentados en este estudio contribuyen a validar el uso tradicional de dicha planta. Dado que los antioxidantes, por su capacidad conservadora, son ampliamente usados en la industria alimentaria, cosmética y farmacéutica, y que además previenen y tratan distintas enfermedades, se

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puede considerar a T. pendula como una fuente natural de agentes con propiedades antioxidantes con un alto uso potencial. Los compuestos fenólicos presentes en el extracto metanólico de T. pendula parecen ser los responsables de su capacidad antioxidante, sin embargo, se sugiere que un estudio fitoquímico a mayor profundidad debe ser llevado a cabo, con la finalidad de aislar e identificar los constituyentes antioxidantes de dicho extracto.

Asimismo, es necesario evaluar el potencial antimicrobiano de T. pendula sobre otros microorganismos patógenos para el hombre, en virtud de que varios de sus usos medicinales reportados, están relacionados con enfermedades de etiología microbiana.

REFERENCIAS Ali, N. M., Yeap, S. K., Ho, W. Y., Beh, B. K., Tan, S. W., & Tan, S. G. (2012). The Promising

Future of Chia, Salvia hispanica L. Journal of Biomedicine and Biotechnology , 2012. Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., & al, e. (2004). Novel Total Antioxidant Capacity index for

dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neucuproine: CUPRAC method. J. Agri.Food Chem 52: 7970-7981 .

Benzie, I. F., & Strain, J. J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Analytical Biochemistry , 239, 70-76.

Chin, E., Miller, K. B., Payne, M. J., Hurts, W. J., & Stuart, D. A. (2013). Comparison of antioxidant activity and flavanol content of cacao beans processed by modern and traditional Mesoamerican methods http://www.heritage. Heritage Science , 1 (9), 1-7.

Dávila, P., Arizmendi, M. d., Valiente-Banuet, A., Villaseñor, J. L., Casas, A., & Lira, R. (2002). Biological diversity in the Tehuacán-Cuicatlán Valley, Mexico. Biodiversity and Conservation , 11, 421–442.

Giménez, T. A. (1998). Manual de pruebas antibacterianas I.I.F.B. MANUAL N 001 IIFB. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB), Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas (FCFB),Universidad Mayor de San Andrés (UMSA) .

Idaka, E., Ohashi, Y., Ogawa, T., Kondo, T., & Goto, T. (1987.). Structure of zebrinin, a novel acylated anthocyanin isolated from Zebrina pendula. Tetrahedron Lett , 28, 1901-1904.

INAFED, I. N. (2009). Enciclopedia de los Municipios de México, Estado de Oaxaca. (G. d. Instituto Nacional para el Federalismo y el Desarrollo Municipal, Productor) Recuperado el 13 de Abril de 2010, de http://www.inafed.gob.mx/work/templates/enciclo/oaxaca/20reg01.html.

Namita, P., Mukesh, R., & Vijay, K. J. (2012). Camellia Sinensis (Green Tea): A Review. Global Journal of Pharmacology , 6 (2), 52-59.

Raj Narayana, K., Sripal Reddy, M., & Chaluvadi, M. R. (2001). Bioflavonoids classification, pharmacological, biochemical effects and therapeutic potential. Indian Journal of Pharmacology , 33, 2-16.

Singleton, V. L., & Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic , 16, 144-158.

UNAM. (2009). Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana. (U. N. México, Ed.) Recuperado el 10 de Abril de 2013, de http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=&id=7177

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DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE Y DEL POTENCIAL

ANTIMICROBIANO DE LOS FRUTOS DE

Ziziphus amole

Aburto-Amar R., González-Montiel L.,

Rosas-Rosas R., Saucedo-Balderas M.M., Criollo-López A., Feliciano-Miguel, H.

Universidad de la Cañada. Instituto de Farmacobiología. Carretera Teotitlán - San Antonio

Nanahuatipán Km 1.7 s/n. Paraje Titlacuatitla, C.P. 68540, Teotitlán de Flores Magón, Oaxaca, México.

[email protected]

RESUMEN: Ziziphus amole es un arbusto cuya corteza se utiliza en México para tratar heridas y golpes, y con cuyos frutos se elabora jabón casero. El objetivo de la presente investigación fue determinar la cantidad de fenoles totales, y evaluar el potencial antioxidante y antimicrobiano de los frutos de Z. amole.

La cantidad de fenoles totales y los valores de la capacidad antioxidante del extracto metanólico de los frutos de Z. amole (determinadas con las técnicas de Folin Ciocalteau, FRAP y CUPRAC), fueron 117.48 ± 2.11 12.96 ± 0.34 y 27.87 ± 1.34 mg equivalentes de ácido gálico por gramo de extracto seco, respectivamente. Dicho extracto no presentó actividad antibacteriana en contra de las cepas evaluadas.

ABSTRACT: Ziziphus amole is a shrub whose bark is used in Mexico to treat wounds and bruises, and whose fruit in water is used as homemade soap. The aim of this investigation was to determine the amount of total phenols, and evaluate the antioxidant and antimicrobial potential of the methanolic extract of the fruits of Z. amole. The amount of total phenolics and the antioxidant activity (determined with Folin Ciocalteu´s, FRAP and CUPRAC techniques) were 117.48 ± 2.11, 12.96 ± 0.34 y 27.87 ± 1.34 mg of gallic acid equivalents per gram of dry extract, respectively. The extract did not show any antimicrobial activity against the evaluated strains. Palabras clave:

Ziziphus amole, antioxidante, fenoles.

ÁREA:

Otros.

INTRODUCCIÓN Ziziphus amole (Cholulo) es un arbusto o árbol pequeño de 12m de altura, cuyos frutos son globosos y pequeños y de color rojizo. Es una planta que se utiliza en la medicina tradicional mexicana. Con su raspadura o cocimiento de su corteza se lavan las heridas y llagas externas (de personas y animales), con el propósito de secarlas y cicatrizarlas. Puesta de la misma forma se usa para curar golpes. La infusión de la corteza y ramas, se utiliza para tratar la diabetes. Los frutos se emplean para fabricar un jabón para uso casero (UNAM, 2009)

.

Sin embargo, son muy pocos los estudios que existen acerca de esta planta, y no permiten hacer conjeturas de la efectividad en las aplicaciones terapéuticas actuales. El objetivo de la presente investigación fue determinar la cantidad de fenoles totales, y evaluar el potencial antioxidante y antimicrobiano de los frutos de Z. amole.

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MATERIALES Y MÉTODOS Obtención del Material vegetal Se colectaron los frutos de Ziziphus amole en la población de San Rafael Coxcatlan, Puebla. Se eliminó la humedad de la muestra vegetal en un secador de convección libre, bajo sombra y a temperatura ambiente. El material vegetal seco se pulverizó en un molino eléctrico. Extracción El extracto metanólico de los frutos de Z. amole se obtuvo por maceración exhaustiva, removiendo inicialmente los compuestos que no son de interés, utilizando hexano como disolvente.

El disolvente de de extracción se evaporó mediante un evaporador rotativo digital marca BÜCHI modelo R-215. El extracto metanólico obtenido fue guardado protegido de la luz directa a 4º C hasta el momento de los ensayos.

Preparación de la muestra: Se pesaron 20 mg del extracto metanólico de los frutos de Z. amole

y se disolvieron en 2 mL de metanol. Se tomaron distintos volúmenes de la disolución anterior y se completó el volumen con agua destilada, según la técnica correspondiente (ver tabla 1).

Tabla 1. Preparación de la muestra para las distintas evaluaciones. Evaluación Volumen de

Extracto (µL) Volumen final (µL)

Contenido de fenoles totales 50 3200 FRAP (Potencial antioxidante para reducir el Cobre) 20 1000 CUPRAC (Capacidad reductora antioxidante de cobre) 41 1100 Preparación de las diluciones de ácido gálico para curvas de calibración:

Se utilizó una solución estándar de ácido gálico (Sigma-Aldrich) a una concentración de 40 o de 50 mg/L (Sigma-Aldrich®), a partir de las cuales se tomaron distintos volúmenes y se completó cada uno con agua destilada a un volumen final, según lo indicado en la tabla 2.

Tabla 2. Preparación de las diluciones para las curvas de calibración. Evaluación Disolución

estándar Volúmenes de Extracto (µL) Volumen final (µL) Contenido de fenoles totales

Ácido gálico 50 mg/L

0 μL a 800 μL (en intervalos de 160 μL) 3200

FRAP Ácido gálico 40 mg/L

de 0 μL a 100 μL (en intervalos de 20 μL) 1000 μL

CUPRAC Ácido gálico 40 mg/L

0 μL a 500 μL (en intervalos de 100 μL) 1100 μL

Contenido de fenoles totales La concentración de fenoles totales fue determinada por el método espectrofotométrico de Singleton y Rossi (1965), con algunas modificaciones, basándose en una reacción colorimétrica de oxido-reducción. El agente oxidante utilizado fue el reactivo de Folin-Ciocalteu.

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A la muestra y a cada uno de los estándares de ácido gálico previamente preparados se les adicionaron 200 μL de reactivo de Folin-Ciocalteu 1N y se sonicó por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 600 μL de carbonato de sodio (Na2CO3

) al 20% y se incubó a 50°C por 5 minutos. La absorbancia fue medida a 765 nm contra blanco de reactivos.

La capacidad antioxidante FRAP (Potencial antioxidante para reducir el FeCapacidad antioxidante total mediante la metodología de FRAP

+3

, de sus siglas en inglés Ferric Reducing Antioxidant Power) fue determinada de acuerdo a la metodología espectrofotométrica de Benzie y Strain (1996), con algunas modificaciones.

El reactivo FRAP fue preparado diariamente, y mantenido a 37 ºC, con una disolución amortiguadora de acetatos (0.3 M pH 3.6), una solución 10 mM de TPTZ (2, 4, 6 tripiridil-s triazina, Sigma- Aldrich) en HCl 40 mM, y una solución 20 mM de FeCl3 ·6H2O, en una proporción de 10:1:1. A la muestra y a cada uno de los estándares previamente preparados se les adicionaron 3000 μL de reactivo FRAP, se dejaron incubar en oscuridad por 60 minutos, y se midió la absorbancia a

593 nm contra blanco de reactivos.

La capacidad antioxidante CUPRAC (de sus siglas en inglés Cupric Reducing Antioxidant Capacity) mide espectrofotométicamente la capacidad de una sustancia de reducir los iones Cu (II) a Cu(I) (Apak, 2004).

Capacidad antioxidante total mediante la metodología de CUPRAC

A cada uno de los estándares y muestra previamente preparados se le adicionaron 1000 μL de una solución de neocuproína (2,9-dimetil-1,10-fenantrolina, Sigma-Aldrich) 7.3 mM, 1000 μL de una solución de acetato de amonio 9.7 M y 1000 μL de una solución de cloruro de cobre 9.7 mM. Se dejó incubar en oscuridad por 60 minutos, y se midió la absorbancia a 450 nm

.

Para las técnicas anteriores, las absorbancias fueron medidas en un espectrofotómetro Lambda 35 de Perkin Elmer. Los resultados se expresan en mg equivalentes de ácido gálico por g de extracto (mg AG/g extracto). Los valores se presentan como la media de los análisis realizados por triplicado ± desviación estándar. Se utilizaron como controles positivos extractos metanolicos de muestras comerciales de hojas de Té Verde (Camellia sinensis), cocoa (Theobroma cacao) y semilla de Chía (Salvia hispánica), debido a su

demostrada actividad antioxidante (Ali et al., 2012; Chin et al., 2013; Namita et al., 2012).

Determinación de capacidad antimicrobiana por difusión en pozo El potencial antimicrobiano del extracto metanólico de Z. amole sobre algunas bacterias y hongos (Proteus vulgaris ATCC 13315, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 8739, Candida albicans ATCC 14065), se evaluó descrito mediante la técnica de difisión en pozo propuesta por Giménez (1998), como se describe a continuación. Se incubó la cepa correspondiente en medio de cultivo nutritivo (Bioxon) durante 24 h a 35 ° C. Se igualó la turbidez de la suspensión microbiana a la de la solución estándar 0.5 de McFarland. Se sembraron cajas con agar Müeller Hinton (Bioxon) con 100 µL de dicha suspensión. Se hicieron en el agra orificios de 5 mm de diámetro, para depositar en ellos 50 µL del extracto metanolico de Z. amole a distintas concentraciones. Se incubó a 37 ± 2 °C

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por un periodo de 24 h y se midieron los diámetros de los halos de inhibición de crecimiento microbiano. Como control negativo se utilizó agua destilada y como control positivo una solución acuosa de una mezcla de estreptomicina y amfotericina B, 10 mg y 25 μg por mL, respectivamente (Sigma). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Contenido de fenoles totales La curva de calibración obtenida para este ensayo se presenta en la figura 1 a) y el contenido de fenoles totales de Ziziphus amole y los controles positivos, se puede observar en la tabla 3. El extracto metanólico de los frutos de Ziziphus amole contiene este tipo de compuestos en una cantidad equivalente a 117.48 ± 2.11 mg AG/ g extracto, la cual es menor a la cantidad que presentan C. sinensis y T. cacao, pero mayor a la que se determinó para S. hispánica. Capacidad antioxidante total mediante la metodología de FRAP La curva de calibración obtenida para este ensayo se presenta en la fig. 1 b) Los resultados muestran que el extracto metanólico de Z. amole posee capacidad reductora del ion hierro en una cantidad equivalente a 12.96 ± 0.34 mg AG/ g extracto. De la tabla 3 se observa que Z. amole exhibe una capacidad antioxidante mayor que la de S. hispánica, pero menor que T. cacao y C. sinensis. La capacidad antioxidante generalmente depende del método utilizado, y los resultados obtenidos pueden no ser reproducibles entre laboratorios (Huang et al., 2005). Debido a lo anterior, resulta complicado interpretar los datos de capacidad antioxidante realizados por otros investigadores. En este sentido se procedió a comparar los resultados para el extracto metanólico de frutos de Z. amole con extractos con demostrada actividad antioxidante. Capacidad antioxidante total mediante la metodología de CUPRAC La curva de calibración obtenida para este ensayo se presenta en la fig. 1 c). Los resultados (tabla 3) muestran que, el extracto metanólico de Z. amole posee capacidad reductora del ion cobre, en una cantidad equivalente a 27.87 ± 1.34

mg AG/ g extracto.

Se ha reportado previamente que existe una correlación positiva entre la cantidad de fenoles totales y la actividad antioxidante de muchas especies vegetales (Velioglu et al., 1998). La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos de las plantas, se debe principalmente a sus propiedades redox, que les permiten actuar como agentes reductores y donadores de hidrógenos (Parr and Bolwell, 2000).

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Planta

Tabla 3. Cantidad de fenoles totales y valores de capacidad antioxidante en mg AG/ g extracto.

Fenoles totales FRAP CUPRAC Ziziphus amole 117.48 ± 2.11 12.96 ± 0.34 27.87 ± 1.34 Salvia hispánica 21.61 ± 9.43 1.25 ± 0.55 8.87 ± 0.33 Theobroma cacao 159.93 ± 26.46 108.06 54.97 ± 0.89 ± 6.51 Camellia sinensis 279.02 ± 14.03 120.36 ± 8.30 167.11 ± 11.58 Figura 1 a) Curva de calibración para fenoles totales, 1 b) Curva de calibración FRAP, 1 c) Curva de calibración CUPRAC, utilizando en cada caso ácido gálico como estándar.

y = 0.112x + 0.005R² = 0.9995

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

0 2 4 6 8 10

Abs

orba

ncia

a 7

65 n

m

Concentración de ácido gálico (mg/L)

y = 0.883x + 0.0101R² = 0.9995

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Abs

orba

ncia

a 4

50 n

m


a) b)

y = 0.2583x + 0.0086R² = 0.9993

0.0000

0.2000

0.4000

0.6000

0.8000

1.0000

1.2000

1.4000

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00

Abs

orba

ncia

a 4

50 n

m


c)

Dado que la concentración de compuestos fenólicos está relacionada de manera directa con la capacidad actividad antioxidante de los extractos vegetales, era de esperarse que el extracto de Z. amole

exhibiera una mayor capacidad antioxidante; sin embargo los resultados muestran que esta correlación no se presentó para la planta objeto de estudio de este trabajo.

En la tabla 4 se presentan los resultados de la evaluación antimicrobiana del extracto metanólico de las hojas de Z. amole. A ninguna de las concentraciones evaluadas dicho extracto exhibió actividad antimicrobiana contra las cepas evaluadas.

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Tabla 4. Diámetros de inhibición bacteriana (mm) del extracto metanólico de las hojas de

Z. amole.

Cepa Proteus vulgaris

Concentración del Extracto (mg/mL)

Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Candida albicans

100 - - - - 50 - - - - 35 - - - - 20 - - - - 10 - - - -

Control negativo - - - - Control positivo 8 6.7 8 6.9

CONCLUSIONES La demostración de la capacidad antioxidante de las hojas del Z. amole contribuye a validar el uso de esta planta en la medicina tradicional. Además, dicha especie vegetal representa una fuente natural regional de antioxidantes con usos potenciales para procurar la salud o conservar productos de la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética. La planta es una buenas candidata para llevar a cabo estudios con una mayor profundidad fitoquímica y farmacológica, llevar a cabo el aislamiento de sus substancias bioactivas, y elucidar el hecho de que a pesar de su relativamente elevado contenido de fenoles, su capacidad antioxidante es relativamente baja. Asimismo, es necesario evaluar el potencial antimicrobiano de Z. amole sobre otros microorganismos patógenos para el hombre, en virtud de que varios de sus usos medicinales reportados, están relacionados con enfermedades de etiología microbiana. REFERENCIAS Ali, N. M., Yeap, S. K., Ho, W. Y., Beh, B. K., Tan, S. W., & Tan, S. G. (2012). The

Promising Future of Chia, Salvia hispanica L. Journal of Biomedicine and Biotechnology , 2012.

Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., & al, e. (2004). Novel Total Antioxidant Capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neucuproine: CUPRAC method. J. Agri.Food Chem 52: 7970-7981 .

Benzie, I. F., & Strain, J. J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Analytical Biochemistry , 239, 70-76.

Chin, E., Miller, K. B., Payne, M. J., Hurts, W. J., & Stuart, D. A. (2013). Comparison of antioxidant activity and flavanol content of cacao beans processed by modern and traditional Mesoamerican methods http://www.heritage. Heritage Science , 1 (9), 1-7.

Giménez, T. A. (1998). Manual de pruebas antibacterianas I.I.F.B. MANUAL N 001 IIFB. Instituto de Investigaciones Fármaco Bioquímicas (IIFB), Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas (FCFB),Universidad Mayor de San Andrés (UMSA)

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Huang D., O. B.-W. (2002). High-throughput assay of oxygen radical absorbance capacity (ORAC) using a multichannel liquid handling system coupled with a microplate fluo-rescence reader.

Namita, P., Mukesh, R., & Vijay, K. J. (2012). Camellia Sinensis (Green Tea): A Review. Global Journal of Pharmacology , 6 (2), 52-59.

Parr, A., & Bolwell, G. P. (2000). Phenols in the plant and in man: The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. J. Sci. Food Agric. , 80, 985-1012.

Singleton, V. L., & Rossi, J. A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am J Enol Vitic , 16, 144-158.

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Velioglu, Y. S., Mazza, G., Gao, L., & Oomah, B. D. (1998). Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J. Agric. Food Chem , 46, 4113-4117.

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APROVECHAMIENTO DEL SUBPRODUCTO DE LA...

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