Mejoramiento genético: Obtención de planta haploides a través

del cultivo de granos de polen.Díaz, Juan Fernando; González, Andrea.

Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales in vitro, Ingeniería en Biotecnología,

Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela Politécnica del Ejército.

18 de enero de 2012

Resumen:

La obtención de individuos haploides estériles mediante anteras es una de las técnicas de

cultivo de tejidos in vitro que está ganando auge, en especial cuando se trata de hacer

fitomejoramiento. El objetivo de la práctica fue sembrar y cultivar anteras de las flores

empleadas por nosotros, lirios (Lilium candidum), siguiendo la metodología adecuadamente en

cuanto a desinfección y sembrado del material se refiere. Tras el lavado y desinfección de las

flores, las anteras se cultivaron completas en medio Murashige y Skoog enriquecido con

2.5mg/L de 2,4-D, 40g/L de azúcar y 7.5g/L de agar, y pH ajustado a 5.7-5.8. Se controló

contaminación durante la segunda y tercera semana luego de la siembra, durante la

incubación, consiguiendo un 0% de frascos contaminados. De los cuatro frascos sembrados,

dos de ellos empezaron el proceso de necrosis del tejido de la antera, que cubre al polen, lo

que antecede normalmente a la generación de callo a partir de los granos polínicos. Además se

discutió de los posibles resultados obtenidos tras más semanas de incubación, y de los factores

que afectan la androgénesis.

Introducción:

Los organismos haploides han tenido una enorme importancia desde que se los descubrió

naturalmente en algunas especies vegetales, las cuales los producían espontáneamente, pero

con una frecuencia muy baja (7).

Existen algunas formas de considerar a los organismos haploides, esto respecto a si provienen

de otros seres diploides o poliploides. Independientemente de ello, para este caso se

considerará como individuos haploides a aquellos que tengan una constitución cromosómica

igual a la mitad del número cromosómico normal de la especie, en células somáticas (7).

La demanda mundial actual no puede ser satisfecha con las técnicas tradicionales de

mejoramiento vegetal, es por ello que con los avances en biotecnología y biología molecular se

ha implementado el desarrollo de los haploides y los doble haploides (7).

Para originar este tipo de organismos, la ciencia se ha valido de la hibridación interespecífica o

intergenérica, y el cultivo de esporas masculinas y femeninas. Estas metodologías de

fitomejoramiento han permitido fijar sistemas genéticos de gametos individuales, fáciles de

evaluar en cualquier momento del mejoramiento; además se puede conseguir líneas

homocigóticas sin usar la endogamia normal (6, 8).

El obtener líneas puras (homocigotas) suele requerir de una cantidad importante de

autofecundaciones, mientras que con el uso de los haploides y doble haploides se puede llegar

a tener homocigotas en apenas una sola generación, lo cual implica reducir costos de

producción y tiempo utilizado. Por otra parte esta tecnología tiene su aplicación en estudios

genómicos y citogenéticos, construcción de mapas genéticos y evaluación de diversidad

genética (7, 10).

El uso de anteras para generar organismos haploides, a partir del polen contenido en ellas, fue

descubierto por Guha y Maheshwari en 1966, al cultivar anteras de Datura innoxia Mill. (7).

Este proceso se llama androgénesis (8), y ha demostrado su utilidad en la familia de las

solanáceas, crucíferas, gramíneas y ranunculáceas (7, 8, 10). Sin embargo, no se ha conseguido

el mismo éxito con especias arbustivas y arbóreas (7).

Se debe tener claro que las plantas originadas por esta técnica de cultivo de tejidos, no se

originan de la antera en sí, sino del grano de polen, ya que es éste el que tiene la carga

genética haploide, mientras que la antera es tejido diploide (4, 7).

El objetivo de esta práctica fue el de sembrar y cultivar anteras en medio MS enriquecido, para

mediante los granos de polen, obtener plantas haploides estériles.

Materiales y Métodos:

Material vegetal

Se empleó cuatro flores cerradas de Lirio (Lilium candidum) (1). Todas ellas estaban ya en un

estado alto de maduración, ya que el color de los tépalos era de un rosa junto a verde. Se

seleccionó esta especie ya que posee flores grandes, donde las anteras son igualmente

grandes y facilita su manipulación.

Desinfección

Se lavó las flores con agua corriente durante algunos minutos. Posteriormente, se sumergieron

los botones en 500ml de solución de detergente al 3% más tres gotas de Tween, y se mantuvo

en agitación por 10 minutos.

Pasado el tiempo, se enjuagó las flores con agua destilada un par de veces y una tercera con

agua estéril, para luego sumergir las muestras en una solución de cloro al 4% más tres gotas de

Tween 20, durante 10 minutos en constante agitación.

Finalmente, dentro de la cámara de siembra, se realizaron 3 lavados con agua destilada estéril.

Siembra del material

El procedimiento normal para la siembra del material vegetal, indica que se sobre un pedazo

de papel autoclavado, se debe rociar las flores con alcohol al 90% y luego flamearlas sobre el

mechero hasta que la llama se extinga por sí sola1. Sin embargo, solo se flameó las flores sobre

el mechero, cuidando que no se cocine el tejido vegetal.

A continuación, se cortó la flor longitudinalmente, sacudiendo las anteras para que los granos

de polen ya desarrollados caigan al medio Murashige y Skoog (MS) enriquecido con 2.5mg/L de

2,4-D, 40g/L de azúcar y 7.5g/L de agar (pH ajustado a 5.7-5.8). También se cortó las anteras y

se las colocó en el medio ya descrito.

Se flameó la boca del frasco y se lo tapó con papel plástico. Todo este procedimiento se

efectuó con los dos lirios.

1 Protocolo entregado por la Msc. Mónica Jadán.

Los frascos se incubaron a oscuridad, y la contaminación se evaluó una semana más tarde.

Resultados y Discusión:

Los resultados obtenidos hasta la fecha han sido satisfactorios, ya que ninguno de los cuatro

medios sembrados se ha contaminado, indicando que los métodos de desinfección utilizados

(8) son eficaces, incluso a pesar de que no se asperjó las flores con alcohol al 90% por ciento

para luego flamearlas, el uso solo de fuego fue eficiente (Imagen 1).

Imagen 1. Anteras, una semana tras la siembra.El medio de cultivo junto a las anteras no presenta ningún tipo de contaminación, una semana después de la siembra.

Imagen 2. Proceso de necrosis.Las anteras muestran zonas oscuras, las que corresponden a la necrosis que ha dado inicio dos semanas después de la siembra. Además no hay contaminación alguna.

Por otra parte, el proceso de necrosis en las anteras inició, en las dos semanas posteriores a la

siembra del tejido, en dos de los cuatro frascos (Imagen 2). Esto se puede observar en el

aspecto del material vegetal colocado sobre el medio MS, ya que los bordes de las anteras se

han oscurecido y han forma irregular (3).

Si se quiere ir más allá, según Vélez et al. (2010), los mejores resultados al obtener callo se

obtienen con anteras completas, sin que ellas hayan sufrido algún tipo de corte o incisión con

el objetivo de generar una abertura por la cual los granos de polen tengan un contacto más

directo con el medio enriquecido. Esto ocurre porque el tejido diploide de las anteras (4) actúa

como amortiguador fisiológico, almacenando granos de almidón, lo que a su vez le permite al

grano de polen germinar (7).

Los dos resultados posibles para el cultivo de anteras son: la formación de callos u

organogénesis, donde se puede obtener tejido haploide (proveniente de granos de polen) o

tejido diploide (proveniente del tejido propio de la antera); el segundo resultado es la

embriogénesis, donde se obtienen células conocidas como poliembriones (2, 4, 7).

La formación directa de embriones somáticos en lugar de callos, ayuda a reducir la variación

somaclonal posible (10).

Otro aspecto importante a tener en cuenta, es que el genotipo del material de origen (o de la

planta madre), ya que la forma en que las anteras respondan al cultivo dependerá en gran

parte de este factor. En especial porque se ha detectado que la formación de callo y la

regeneración de las plántulas es heredable, lo que significaría una ganancia en cuanto al

fitomejoramiento (5, 8). Además, el genotipo también afecta la habilidad del callo para

regenerar vástagos y establecer la corona (5).

Relacionado al origen del material vegetal y el genotipo, está saber si el tejido proviene de una

planta monocotiledónea o dicotiledónea. En este punto se puede ver algo que discutir, ya que

según Roca et al. (1991), se ha hecho más androgénesis en plantas monocotiledóneas como el

arroz, la cebada y el maíz (8), mientras que Polci et al. (Sin año), afirma que hay más facilidad

de conseguir androgénesis en especies dicotiledóneas (7). Esto debe ser un ámbito de

investigación, para determinar porque en ciertas especies es más fácil obtener organismos

haploides, antes que en otras.

Por otra parte, identificar correctamente la etapa más sensible a la inducción androgénica en

la microgametogénesis ayudaría a obtener mejores resultados en la obtención de callos y

regeneración de plantas. Por ejemplo, en un estudio efectuado sobre tomate Solanum

lycopersicon, se encontró que la mayor producción de callos ocurre cuando el meiocito está

entre metafase I y telofase II. La determinación de esta etapa incluso influirá en la consecución

de haploides o dobles haploides (9). Roca et al. (1991) menciona que las mejores respuestas se

han conseguido cuando las anteras se cultivaron en un desarrollo del polen entre la

microespora tardía y el polen temprano (8), sin embargo es posible que este factor cambie

entre especies (7).

El pretratamiento de las anteras puede ayudar a la androgénesis, cambiando la expresión de

genes relacionados a la generación del esporofito. Hasta ahora las bajas temperaturas se han

considerado como el mejor tratamiento (7, 8), sin embargo existen muchos tratamientos más,

así se tiene: al calor, el choque osmótico, la centrifugación de anteras, realizar incisiones en la

parte superior de las anteras, aunque como se vio más arriba no necesariamente funciona bien

(10). Otros pretratamientos probados son: la poda, la pulverización con etrel, la irradiación, la

reducción de la presión atmosférica, la anaerobiosis, una atmósfera saturada de agua o la

aplicación de gametocidas (7).

El usar bajas temperaturas estimula la embriogénesis, la división mitótica simétrica de las

microesporas (7, 8).

La composición del medio de cultivo es de igual manera un aspecto a considerar para cada

especie cultivada. Así se ha visto que un medio solidificado con agar y carbón activado da una

mejor respuesta que al solo emplear agar (7).

El medio de cultivo también debe poseer carbohidratos que le servirán como nutrientes al

tejido. Respecto a los reguladores de crecimiento, los más usados son las citoquininas y las

auxinas, como el 2,4-D usado para esta práctica. La presencia de estos reguladores exógenos

es requerida principalmente por especies cereales de plantas (7), a pesar de ello, se ha

reconocido que la respuesta del cultivo depende mucho más de los niveles endógenos de los

mismos reguladores (7, 10). Este factor es más influyente en la generación de embriones

somáticos, por ello, probar varios medios con distintas combinaciones de fitorreguladores y de

sus concentraciones, ayudaría a seleccionar los mejores tratamientos para obtener buenos

resultados, y no solo eso, sino de igual forma conseguir callos o embriones según se desee

(10).

Finalmente, el fotoperiodo, la intensidad de luz, la temperatura y la nutrición e incluso la

posición de la antera sobre el medio, son factores que se controlan al momento de originar

androgénesis, ya que pueden afectar los resultados alcanzados en algunas especies (7, 8, 10).

En un caso particular, uno de los medios se volvió totalmente líquido, a pesar de ello las

anteras de este frasco presentaban un aspecto parecido a las de los otros tres.

Conclusiones:

Los métodos de esterilización y desinfección tanto del lugar de trabajo como del

material vegetal fueron 100% efectivos, ya que no existió un solo frasco contaminado.

La formación de callo o de embrión dependerá de los factores externos o de estrés a los

que esté sometido un explante, de esta forma, la respuesta conseguida, en un tiempo

determinado y con características específicas dependerá del ambiente y el medio de

cultivo que se les dé a las anteras.

Seleccionar un buen genotipo, mediante elección de las características favorables para

lo que busca el investigador, es muy importante. Aquí estará presente la influencia del

pretratamiento dado al material de origen, ya que al inducir la expresión de genes que

se observan durante la embriogénesis, también se estará influenciando sobre la

presencia y cantidad de fitorreguladores endógenos, lo que es más importante que la

presencia exógena de los mismos.

El establecer en qué estadío se hallan las anteras, o en qué etapa es más conveniente

utilizarlas es primordial, ya que se está descubriendo que este factor sí cambia el tipo de

respuesta obtenida en un callo o un embrión.

El porqué la androgénesis no puede ser inducida en todas las especies

monocotiledóneas y dicotiledóneas de interés, es un área que necesita desarrollarse e

investigarse, para ver qué factores, seguramente propios de cada especie, interfieren

con este proceso in vitro.

Bibliografía:

1. Foro creativo. 2009. Azucena, Lirio de San Antonio.

http://www.foro-creativo.com/viewtopic.php?f=55&t=6666

2. Infojardín. 2011. Cultivo in vitro de árboles frutales. Multiplicación o reproducción de

frutal in vitro. http://articulos.infojardin.com/Frutales/cultivo-in-vitro-reproduccion.htm

3. Jauch, C. 1979. Necrosis. Patología Vegetal. Ed. El Ateneo, Buenos Aires.

4. Lentini, Z.; Roca, W.; Martínez, Z. 1997. Cultivo de anteras de arroz en el desarrollo de

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5. Muñoz, S.; Espósito, M.; Cravero, V.; García, S.; López, F.; Cointry, E. 2006. OBTENCIÓN

DE PLANTAS A PARTIR DE ANTERAS DE ESPÁRRAGO (Asparagus officinalis L.). Revista de

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6. Polci, P.; Conti, V.; Aldao, G.; Miranda, R.; Echenique, V. 2005. Obtención de Plantas

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7. Polci, P.; Conti, V.; Miranda, R.; Gear, N. Sin año. Obtención de Plantas Doblehaploides.

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Biotecnología y mejoramiento vegetal. pp. 19-36,295-350

8. Roca, W.; Mroginski, L. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura. Fundamentos y

aplicaciones. Centro Internacional de Agricultura Tropical. Cali, Colombia. pp. 272-290

9. Seguí, J.; Nuez, F. Sin año. Obtención de plantas doble haploides androgénicas mediante

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10. Vélez, M.; Robledo, A.; Corona, T.; Heber, V.; Ramírez, P.; Suárez, J. 2010. OBTENCIÓN

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