Análisis morfo-funcional de folículos aislados de tiroides ...

Análisis morfo-funcional de folículos aislados de tiroides

de rata y cerdo en presencia de I- y de hormona

Tirotrópica

Jhon Erick Rivera Monroy

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C., Colombia

2010

Análisis morfo-funcional de folículos aislados de tiroides

de rata y cerdo en presencia de I- y de hormona

Tirotrópica

Jhon Erick Rivera Monroy

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias-Bioquímica

Directora:

Clara Matilde Spinel Gómez , PhD.

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de ciencias, Departamento de Química

Bogotá D.C., Colombia

2010

La ignorancia afirma o niega rotundamente; la ciencia duda

Voltaire

A mi familia por hacer de mi todo lo que soy

Agradecimientos

Al laboratorio de Biofísica de la Universidad Nacional de Colombia y el Centro

internacional de Física por su apoyo en este trabajo y su aporte en mi formación

personal y profesional.

A la División de Investigación de la Universidad Nacional de Colombia (Proyectos

DIB 290310, 803857, 803825, 8003014 y 8003249) y Colciencias

(Convocatoria 405, proyecto No. 110140520161 Dic 2007-Dic2009) por su

participación en la financiación de este trabajo.

A la profesora Clara Spinel por su amistad, su guía, motivación, orientación e

invalorable formación que hicieron posible la elaboración de este trabajo.

A la profesora Marcela Camacho por sus amables y pertinentes críticas y apoyo en

la realización de este trabajo.

A la Maestría en Ciencias-Bioquímica de la Universidad Nacional de Colombia y

en especial a los profesores Myriam Sánchez, María Helena Ramírez, Gerardo

Pérez y Elizabeth López por su acompañamiento en mi formación académica.

A Frigoríficos San Martín de Porres Ltda y al Bioterio de la Universidad Nacional

de Colombia por facilitar el material biológico necesario.

A los doctores Manuel Elkin Patarroyo y Hernando Curtidor de la Fundación

instituto de Inmunología de Colombia por permitirnos llevar a cabo parte de este

trabajo en sus instalaciones.

Al Dr. Thierry Pourcher de la “Unité TIRO Université de Nice Sophia-Antipolis por

los anticuerpos donados a nuestro grupo.

Al Dr. Alfonso Barreto de la Pontificia Universidad Javeriana por permitirnos tomar

algunas imágenes en el equipo confocal.

A todos mis compañeros de laboratorio, en especial a Magnolia Herrera, Cristina

Zapata, y Carolina Ochoa por su amistad y por el acompañamiento en la

elaboración de este trabajo.

A mi familia, a mis amigos y a Laura por ser el sostén de mi vida.

V

Resumen

La producción y secreción de hormonas por parte de la tiroides se encuentra regulada por la tirotropina y por la concentración de I- en la sangre. El I- en altas dosis bloquea la función de la tiroides de manera transitoria en un mecanismo complejo y que involucra la regulación de muchos genes y proteínas así como la formación de moléculas orgánicas yodadas. En este estudio se evalúa el efecto de dosis crecientes de I- (0,2x10-9 - 1x10-3 M) sobre las funciones de captación y organificación de I- y la morfología de folículos aislados de tiroides de cerdo y rata. Los folículos en cultivo mantienen su estructura tridimensional y su polaridad, reproducen el efecto Wolff-Chaikoff y no presentan signos ultraestructurales de muerte celular bajo dosis elevadas de I- (1x10-5 y 1x10-3 M). Estos resultados muestran que el I- inhibe rápidamente la organificación con una dosis de 1x10-

3 M aún en presencia de TSH. Palabras clave: Folículo tiroideo, Tirocito, Cultivo tridimensional, Efecto Wolff-Chaikoff, Tirotropina, Captación de I-, Organificación de I-.

Abstract

The thyroid follicles function is regulated by thyrotropin and the I- concentration in the blood. In presence of an excess of I-, Wolff and Chaikoff described that normal rat glands inhibit the I- organification and synthesis of thyroid hormones temporarily. Several researches have shown that the mechanism of the Wolff-Chaikoff effect is complex and involves the regulation of many genes, proteins and organic iodine molecules. However, until now, this effect has not been yet reproduced in culture. The aim of this work is to evaluate in isolated follicles form pig and rat, the functions of I- uptake and organification, and the morfological characteristics of this follicles in contact with different I- concentrations (0,2x10-9 - 1x10-3 M) and TSH. The follicles keep their tridimensional structure and polarity, reproduce the Wolff-Chaikoff effect and have no ultrastructure signs of cellular death under high I- concentrations (1x10-5 y 1x10-3 M). These results show that the organitication is rapidly inhibited by I- 1x10-3 M still in THS presence. Keywords: Thyroid follicle, Thyrocyte, Tridimensional Culture, Wolff-Chaikoff Effect, Thyrotrophic, Iodide uptake, Iodide organification.

VI

Contenido

Resumen ......................................................................................................................... V

Lista de Figuras ........................................................................................................... VIII

Lista de Tablas .............................................................................................................. IX

Introducción ................................................................................................................... 1

1. Marco teórico ........................................................................................................... 3

1.1 Glándula Tiroides ............................................................................................. 3

1.1.1 Morfología de la glándula Tiroides .................................................................. 3

1.1.2 Función de la glándula tiroides ....................................................................... 5

1.1.2.1 Producción y secreción de las hormonas tiroideas .................................. 5

1.2 Modelos de cultivo del tejido tiroideo ............................................................. 6

1.2.1 Cultivos organotípicos..................................................................................... 6

1.2.2 Células aisladas y monocapas ........................................................................ 7

1.2.3 Estructuras seudofoliculares ........................................................................... 7

1.2.4 Folículos cerrados .......................................................................................... 8

1.3 Regulación de las hormonas tiroideas por la TSH ........................................ 9

1.4 El I- en la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas: efecto Wolff-

Chaikoff ..................................................................................................................... 11

1.4.1 Efecto del I- sobre su captación .................................................................... 11

1.4.2 Efecto del I- en exceso sobre la organificación del I- y la secreción de las

hormonas tiroideas .................................................................................................. 13

1.4.3 Toxicidad del exceso de I- ............................................................................. 14

1.4.4 Los efectos del I- son dependientes de su concentración ............................. 15

1.4.5 Moléculas potencialmente involucradas en la mediación del efecto Wolff-

Chaikoff ................................................................................................................... 15

1.4.6 La TSH y el I- ................................................................................................ 16

2. Materiales y métodos ............................................................................................ 17

2.1 Aislamiento de Folículos tiroideos ............................................................... 17

2.2 Cultivo en suspensión de folículos aislados ............................................... 17

VII

2.3 Análisis de captación y organificación de I- ................................................. 18

2.4 Análisis morfológico ...................................................................................... 19

2.5 Inmunofluorescencia indirecta de los folículos ........................................... 20

2.6 Análisis estadístico ........................................................................................ 20

3. Resultados ............................................................................................................. 21

3.1 Morfología y viabilidad de los folículos aislados ......................................... 21

3.2 Función: captación y organificación de I- ..................................................... 25

3.3 Expresión y localización subcelular del cotransportador NIS en folículos

de rata ........................................................................................................................ 29

4. Discusión ............................................................................................................... 32

4.1 Efecto del I- en la Morfología de folículos aislados...................................... 32

4.2 Efecto del I- y de la TSH sobre la cantidad de NIS y su distribución

subcelular en folículos de rata in vitro. ................................................................... 33

4.3 Efecto del I- y de la TSH sobre las funciones de captación y organificación

en folículos aislados. ................................................................................................ 34

5. Conclusiones ......................................................................................................... 37

6. Bibliografía ............................................................................................................ 38

VIII

Lista de Figuras

Figura 1-1: Fisiología de la glándula tiroides. .................................................................. 4

Figura 3-1: Cultivo de folículos aislados de rata y cerdo luego del periodo de

preincubación. ................................................................................................................ 21

Figura 3-2: Autoradiografías de folículos de rata incubados bajo diferentes dosis de I-

durante diferentes tiempos. ............................................................................................ 22

Figura 3-3: Efecto de la dosis de I- sobre la ultraestructura de tirocitos de rata sin y con

TSH. ............................................................................................................................... 23

Figura 3-4: Efecto de la dosis de I- sobre la viabilidad tirocitos de rata. ......................... 24

Figura 3-5: Efecto de la dosis de I- sobre su captación y organificación en folículos de

rata en presencia y ausencia de TSH a corto tiempo...................................................... 25


rata en presencia y ausencia de TSH a largo tiempo...................................................... 27


cerdo en presencia y ausencia de TSH. ......................................................................... 28

Figura 3-8: Inmunofluorescencia indirecta de la expresión y localización subcelular del

cotransportador NIS. ...................................................................................................... 30

Figura 3-9: Inmunofluorescencia indirecta de la expresión y localización subcelular del

cotransportador NIS. ...................................................................................................... 31

IX

Lista de Tablas

Tabla 2-1: Tratamientos experimentales ........................................................................ 18 Tabla 3-1: Porcentaje de yoduro captado que es organificado por folículos de rata en

cultivo. ............................................................................................................................ 26

Tabla 3-2: Porcentaje de yoduro captado que es organificado en folículos de cerdo en

cultivo. ............................................................................................................................ 29

1

Introducción

La tiroides es una glándula endocrina cuya función principal es la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas T3 y T4, las cuales contienen yodo en su estructura. Estas hormonas desempañan un papel esencial en la fisiología de vertebrados dado que mantienen la homeostasis metabólica, así como son relevantes en el desarrollo embrionario normal de diversos sistemas y tejidos, dentro de los cuales se destacan el sistema nervioso central y el músculo esquelético. La producción de las hormonas tiroideas se realiza en los folículos tiroideos, estructuras ovoides constituidas por una capa de células epiteliales cúbicas (tirocitos) que encierran un coloide proteico viscoso secretado por los tirocitos (Denef et al., 1980). La síntesis de las hormonas tiroideas inicia con el transporte de yoduro (I-) desde la sangre hasta el lumen folicular, en un proceso mediado por varias proteínas (Dai et al., 1996; Rodriguez et al., 2002; Scott et al., 1999). Una vez en el coloide, el I- es catalíticamente incorporado dentro de residuos de tirosina en la tiroglobulina (Tg), en un proceso conocido como organificación (Bjorkman y Ekholm, 1984). Finalmente, la Tg yodada es procesada para liberar las hormonas tiroideas (Van Den Hove-Vandenbroucke, 1980). La producción de la T3 y T4 se encuentra regulada positivamente por la tirotropina (TSH) y negativamente por la concentración de I- en la sangre. Wolff y Chaikoff (1948) reportaron que altas dosis de I- en el plasma bloquean la organificación de I- en tiroides de rata in vivo. Este fenómeno, conocido como efecto Wolff-Chaikoff, es un proceso transitorio que ocurre en varias especies. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de estudios realizados, aún no están completamente claros los mecanismos por los cuales ocurre este efecto, dada la complejidad en la regulación tanto de los genes involucrados, como de sus mRNAs y proteínas que participan de manera directa o indirecta en la producción de las hormonas tiroideas (Leoni et al., 2008). Varios estudios han revelado que un exceso de I- altera su captación (Grollman et al., 1986; Takasu et al., 1985) reduciendo los niveles del cotransportador de Na+/I- (NIS) (Eng et al., 1999; Eng et al., 2001). Además, I- en exceso impide la organificación de yodo disminuyendo la cantidad y actividad de proteínas relevantes en este proceso (Eng et al., 1999; Morand et al., 2003) así como puede bloquear la secreción de las hormonas tiroideas al torrente sanguíneo (Becks et al., 1987; Corvilain et al., 1994). varios estudios muestran que el I- puede ocasionar alteraciones morfológicas en la glándula tiroides (Belshaw y Becker, 1973), así como citotoxicidad y muerte celular por necrosis y/o apoptosis en modelos in vitro, como por ejemplo, en folículos aislados de tiroides humana (Many et al., 1992; Vitale et al., 2000) o en células de la línea FRTL-5 provenientes de tiroides de rata (Golstein y Dumont, 1996).

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Cabe resaltar que la gran mayoría de las investigaciones enfocadas hacia el entendimiento de los mecanismos de regulación y funcionamiento de la tiroides, se han realizado sobre cultivos en monocapa de células derivadas de esta glándula (particularmente células de la línea FRTL-5) y sobre modelos animales. Sin embargo, los cultivos en monocapa no conservan la polaridad morfológica ni el lumen coloidal por lo que son incapaces de sintetizar hormonas tiroideas. Por otra parte, los modelos animales no permiten el aislamiento del sistema de estudio debido a que se puede presentar la influencia de otros sistemas o tejidos del organismo. En contraste, los cultivos tridimensionales de folículos aislados mantienen la polaridad morfológica así como la función de producción de las hormonas tiroideas, propias del tejido in vivo (Spinel-Gomez et al., 1990), permitiendo la evaluación selectiva de diversos factores bajo condiciones controladas. En el presente estudio, mediante la elaboración de cultivos tridimensionales primarios de folículos de rata y cerdo, se quiso evaluar el impacto de diferentes dosis de I- y de la TSH, en la morfología, ultraestructura y función de estos folículos, con el objetivo de corroborar si el cultivo tridimensional de estos responde a dosis crecientes de I- reproduciendo el efecto Wolff-Chaikoff. El cultivo de folículos de rata se escogió como modelo debido a que la gran mayoría de los estudios en tiroides se ha desarrollado con tiroides in vivo de este organismo o con cultivos derivados de esta, lo que permite la comparación de los resultados presentados en este trabajo frente a otros sistemas de cultivo; mientras que el modelo de cultivo de cerdo se escogió dada la cercanía con el humano y la posibilidad de trabajar con tejidos completamente sanos (Prather et al., 2008). Los estudios morfológicos incluyeron análisis de viabilidad por medio del ensayo con azul Tripán, análisis autoradiográficos para I- radioactivo (I- 125) y estudios de localización y expresión de la proteína NIS mediante microscopía confocal. El estudio ultraestructural se llevó a cabo por medio de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y en el estudio funcional se evaluó la captación de I- y su organificación empleando I- 125 como trazador. La importancia del presente trabajo radica en que el uso de cultivos de folículos aislados permite estudiar in vitro, en un modelo homologable a la glándula in vivo, diferentes aspectos de la fisiología de la tiroides tanto en condiciones normales como patológicas asociadas con la glándula. Este modelo supera algunos de los inconvenientes que se presentan en otros modelos tales como la pérdida de la polaridad de dominios de membrana, la no organificación de I-, la no producción de hormonas tiroideas, la limitación para extrapolar a la tiroides humana, entre muchos otros. A futuro, se espera que el presente estudio aporte herramientas que permitan estudiar los transportadores basales y apicales de I- y la implicación de este halógeno en la fisiología de la glándula tiroides tanto en condiciones normales como patológicas, con el fin de brindar el conocimiento necesario para implementar medidas terapéuticas.

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1. Marco teórico

1.1 Glándula Tiroides

1.1.1 Morfología de la glándula Tiroides

La tiroides es una glándula endocrina de origen endodermal que en mamíferos se encuentra ubicada en la parte anterior del cuello por debajo del cartílago cricoides. Está constituida por dos lóbulos unidos por un istmo, los cuales ocupan la región lateral de la laringe y de la tráquea a la altura del segundo y tercer anillo cartilaginoso de la tráquea. La tiroides está rodeada por una cápsula externa que es una prolongación de la fascia prebranquial, y por una cápsula interna formada por tejido conectivo que penetra la glándula a manera de tabiques. Estas cápsulas proporcionan soporte a la gran vascularización e inervacion del tejido tiroideo (Werner y Ingbar, 1971). A nivel histológico, la tiroides está constituida principalmente por folículos tiroideos, los cuales están rodeados por la membrana basal o lámina basal en íntimo contacto con una red de capilares y tejido conectivo que contiene adipocitos, fibras nerviosas, algunos mastocitos y ocasionalmente linfocitos y macrófagos. La unidad morfológica y funcional de la tiroides es el folículo, una estructura ovoide cerrada constituida por células cúbicas epiteliales que encierran un coloide proteico viscoso secretado por estas. Este coloide está constituido en un 80 % por la tiroglobulina (Tg) (Denef et al., 1980; Werner y Ingbar, 1971). El tamaño de los folículos tiroideos varía según la especie, la edad y su localización en la glándula, siendo los folículos centrales más grandes que los folículos encontrados hacia la periferia. El diámetro de los folículos oscila entre 50 y 150 µm en ratas y ratones (Nitsch y Wollman, 1980) y entre 150 y 500 µm en cerdos y humanos (Spinel-Gómez, 1987). En condiciones normales, los tirocitos dentro del folículo presentan una polaridad morfológica bien diferenciada (Figura 1-1): la membrana apical, que está en contacto con el coloide y presenta microvellosidades (Raben, 1949) (Nitsch y Wollman, 1980); la membrana basolateral, que está en contacto con la membrana basal de las células vecinas y en íntimo contacto con la membrana basal del endotelio de los capilares (Denef et al., 1980; Werner y Ingbar, 1971). El núcleo está ubicado hacia la membrana basolateral y se encuentra rodeado por abundante retículo endoplásmico rugoso (RER); el complejo de Golgi (CG) está ubicado en la región supranuclear; y en la región apical se

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encuentran vesículas de endocitosis y exocitosis así como complejos de unión en la membrana basolateral que mantienen aislado el lumen folicular (Morton et al., 1944).

Figura 1-1: Fisiología de la glándula tiroides. TBG: Globulina fijadora de tiroxina; T4: 3,5,3’5’-tetrayodo-L-tironina; T3: 3,5,3’-triyodo-L-tironina; TSH: hormona tirotrópica; rTSH: receptor de la TSH; NIS: Na+/I– symporter; Na+/K+ATPasa: bomba de sodio potasio; D: desyodinasas lisosomiales; MIT: monoyodotirosina , DIT:diyodotirosina; RER: retículo endoplásmico rugoso; AIT: Apical Iodide Transporter; DUOX: NADPH oxidasa; Tg: tiroglobulina; TPO: tiroperoxidasa.

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Adicionalmente, el parénquima de la tiroides está conformado por las células parafoliculares o células claras que constituyen del 1 al 2 % del total de células en la glándula. Las células C se encuentran en la región basal de las células foliculares y secretan la calcitonina (Braverman y Ingbar, 1963).

1.1.2 Función de la glándula tiroides La función principal de la glándula tiroides es la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas 3,5,3’-triyodotironina (T3) y 3,5,3’,5’-tetrayodotinonina (T4), siendo la T3 biológicamente más activa. Estas hormonas son muy importantes dado que presentan múltiples efectos en la maduración, el desarrollo y el funcionamiento del sistema nervioso central y el músculo esquelético (Takasu et al., 1992); además, controlan la tasa metabólica basal y son esenciales para mantener alta y constante la temperatura corporal en los animales homeotérmicos (Dayem et al., 2006). El efecto de las hormonas tiroideas sobre el metabolismo de las proteínas y de los lípidos depende de la concentración de la T3 y T4 en la sangre: a bajas concentraciones fisiológicas se presenta anabolismo y a altas concentraciones catabolismo (Werner y Ingbar, 1971). Existen diferentes patologías asociadas a desbalances en la producción de hormonas por parte de la glándula tiroides, dentro de las que se destacan a nivel mundial el hipotiroidismo, el hipertiroidismo, el bocio endémico y el cáncer de tiroides, presentes también en nuestro país (Spitzweg et al., 1999), lo cual hace necesario el estudio fisiológico de la glándula.

1.1.2.1 Producción y secreción de las hormonas tiroideas Aunque el yodo es un elemento escaso en la atmósfera, es un componente esencial de las hormonas tiroideas. Este halógeno se acumula en la glándula tiroides donde alcanza contenidos 40 veces mayores a los encontrados en el plasma sanguíneo (Serrano-Nascimento et al., 2010). Pese al gran número de estudios que se han realizado, actualmente la fisiología de la glándula tiroides (Figura 1-1) no se encuentra elucidada completamente. Un avance en el conocimiento de la fisiología de la tiroides se consiguió con la clonación del gen NIS por el grupo de Nancy Carrasco en 1996 (Dai et al., 1996). NIS (Na+/I– symporter) es una glicoproteína localizada en la membrana basolateral de los tirocitos que media el transporte activo de 2Na+/I- hacia el interior de los tirocitos (Dai et al., 1996; Gruffat et al., 1992; Serrano-Nascimento et al., 2010). Una vez en la célula, el I- difunde hacia el lumen coloidal gracias al transporte a través de la pendrina (PDN), ubicada en la membrana apical (Scott et al., 1999). Por otra parte, los tirocitos secretan Tg al coloide folicular, una glicoproteína homodimérica de aproximadamente 660kDa rica en residuos de tirosina (Fradkin y Wolff, 1983; Wolff, 1969). En esta proteína ocurre el proceso de organificación del I- captado por los tirocitos. El coloide está en contacto con la membrana apical donde se encuentra anclada la tiroperoxidasa (TPO) que cataliza la oxidación del I– y el ataque de las formas oxidadas del yodo sobre los residuos de tirosina de la Tg (Figura 1-1) formando las monoyodotirosinas (MIT) y las diyodotirosinas (DIT). Este proceso requiere H2O2 producido por NADPH oxidasas, que en la glándula tiroides corresponden a Duox1 y Duox2 (Ohayon et al., 1994). Posteriormente, la TPO realiza la reacción de acoplamiento entre dos yodotirosinas (MIT y/o DIT), formándose

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las yodotironinas (principalmente T3 y T4) que permanecen unidas a la Tg en el lumen. En presencia de la TSH, esta Tg es endocitada, transportada por vesículas e hidrolizada en los prelisosomas y lisosomas (Dubois et al., 1991) liberándose las hormonas T3 y T4 que pueden atravesar la membrana basal y van a la sangre, mientras que el yodo de las MIT y DIT que no se acoplaron se recicla por acción de la proteína yodotirosina deshalogenasa anclada a membrana (Follis, 1964; Rognoni et al., 1987). En el torrente sanguíneo, ocurre la desyodinación enzimática de la T4 en la posición 5’ del anillo fenólico externo produciendo la hormona T3 (Yen, 2001). Por otra parte, la desyodinación en la posición 5 del anillo fenólico interno de la T4 genera el metabolito inactivo T3 inverso (rT3), el cual tiende a incrementarse cuando hay bajos niveles de ingesta (Yen, 2001). Pese a que la glándula tiroides secreta en mayor proporción la T4, cabe destacar que la T3 es la de mayor actividad biológica. Dada la naturaleza hidrofóbica de las hormonas tiroideas, estas viajan por el torrente sanguíneo unidas a globulinas como la globulina fijadora de tiroxina (TBG) (Zhang et al., 2003); sus receptores son nucleares (Flamant et al., 2006).

1.2 Modelos de cultivo del tejido tiroideo

1.2.1 Cultivos organotípicos Se conoce como cultivo organotípico u órgano-cultivo aquel en el que se coloca un fragmento del tejido del animal en una caja de cultivo. Si bien desde 1911 fue posible el cultivo de grandes fragmentos tiroideos de diferentes mamíferos (Carrel y Burrows, 1911), las condiciones de alta contaminación que presentaban estos cultivos hicieron muy difíciles los progresos en el área hasta ya bastante entrado el siglo XX (Paul, 1975). La incubación, que puede definirse como el mantenimiento de células o tejidos en suspensión dentro de un medio de cultivo sin pasar más de 24 horas, fue realizada en tiroides por primera vez por Morton y Chaikoff (1943) utilizando tejido tiroideo de cordero. Este tejido conservó su función de incorporación de yodo en la DIT y en la T4 en presencia de yodo radiactivo, pero no fue descrito su porcentaje de incorporación en proteínas (organificación). En los años 50, se realizaron cultivos organotípicos con tiroides de rata consiguiendo mantener el coloide en el lumen folicular durante 115 días; también se demostró la síntesis de hormonas tiroideas en los lóbulos luego de 25 días, aunque esta síntesis era mínima y poco representativa. En años posteriores fue posible conservar la morfología de los lóbulos tiroideos durante 6 días (Trowell, 1959) o fragmentos de tiroides entre 10 a 14 días (Flanagan et al., 1966). Los cultivos organotípicos de tiroides de ratón sobre una superficie hidrófoba se pueden conservar durante 14 días aunque se forme un tejido fibroso mayor entre los folículos que quedan (Parr et al., 1980). El problema principal con los cultivos organotípicos radica en la rápida necrosis celular, siendo además cultivos de varios tipos celulares, como endoteliales, epiteliales etc. (Spinel-Gómez, 1987). Recientemente, un nuevo cultivo organotípico de tejido tiroideo ha sido descrito (Toda et al., 1993), en el que se conserva la estructura folicular embebiendo el tejido en un gel de colágeno en contacto con el aire, manteniendo así los cultivos por más de 45 días; sin embargo, estos pierden la respuesta a la TSH.

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1.2.2 Células aisladas y monocapas El aislamiento de células de la tiroides humana fue descrito por primera vez por Pulvertaft et al (1959) mediante digestión con tripsina. También se hicieron cultivos con células aisladas de cordero, ratón, rata, perro (Pastan y Wollman, 1967) y otros organismos. El grupo de Tong y Kerfof, describió un cultivo de células en monocapa de formas planas y poligonales, lo que hoy conocemos como cultivo primario de células epiteliales (Tong et al., 1962; Kerkof et al., 1964 en Spinel, 1987), pero los tirocitos cultivados en monocapa pierden su capacidad de incorporar I- desde el primer día (Fayet et al., 1971). A partir de los años 70, se implementaron los cultivos sobre geles de colágeno, donde se forma una monocapa polarizada con su polo apical en contacto con el medio, y la membrana basal en contacto con el colágeno (Spinel-Gómez, 1987). De esta forma se demostró que el I- se concentra junto a la membrana basal donde se encuentran los receptores de TSH (Chambard et al., 1983). Por esta época también se comienzan a desarrollar las líneas celulares continuas de origen tiroideo como la FRLT (Fischer Rat thyroid cell line), la OVNIS (Ovine Nihil Serum) y la PORTHOS (Porcine Thyroid O Serum), que no exhiben polaridad celular (Kogai et al., 2000). Posteriormente, se desarrollaron otras líneas celulares provenientes de carcinomas o tumores como la línea humana SMC R86 F1, que expresa Tg-19S (Tsuda, 1992), y la FRTC de cáncer de tiroides de rata (Iitaka et al., 1997) entre otras. Si bien las líneas celulares son esencialmente “inmortales”, poseen serios problemas a largo plazo como pérdida de respuesta a la TSH, alteraciones en la producción de Tg y cambios cromosómicos, entre otros (Eggo et al., 2003; Kimura et al., 2001). Dependiendo de las necesidades de la investigación, los cultivos primarios muestran algunas ventajas sobre los cultivos realizados a partir de líneas celulares (Kimura et al., 2001), sobre todo si se quieren conservar las funciones básicas del tirocito que pueden ser indispensables en estudios sobre captación y organificación del I-, análisis de moléculas esenciales del metabolismo normal de los tirocitos, localización de proteínas en membranas polarizadas entre otros.

1.2.3 Estructuras seudofoliculares Desde los años 70 numerosos autores han tratado de reproducir in vitro estructuras similares a folículos para poder homologar los resultados con los estudios in vivo, ya que es muy difícil estudiar en cultivos en monocapa diferentes aspectos fisiológicos de la tiroides que se encuentran ligados a la estructura tridimensional. Una de las características principales de esta estructura es la separación de los dominios membranales apical y basal, lo que se traduce en una polaridad celular que permite en el tirocito separar un medio basal de uno apical que está en contacto directo con el coloide. Para estudiar distintos aspectos de la función tiroidea es indispensable contar con una luz similar al coloide, lo que garantiza la estructura funcional del tirocito. De esta forma, los primeros estudios se centraron en lograr la construcción de estructuras similares a los folículos, denominadas seudofolículos (Fayet et al., 1971; Lissitzky et al., 1971), los cuales concentran I- en su cavidad y están compuestos de 2 a 3 tirocitos (Remy et al., 1977). Adicionalmente, sintetizan Tg-19S yodada sobretodo bajo fuertes concentraciones de TSH (100 U/mL). Sin embargo, al cuarto día pierden la capacidad de captar e incorporar I- aunque conservan su morfología hasta el sexto día, tras lo cual pierden su lumen y se reorganizan de nuevo en monocapa.

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Pantic et al. (1970) lograron generar estructuras seudofolículares a partir de cultivos de tiroides de rata en monocapa, mediante la utilización de TSH. Estas estructuras se conservaban hasta el noveno día, presentando cambios de la ultraestructura en el RER, el complejo de Golgi y la síntesis de Tg, pero sin organificación ni síntesis de hormonas tiroideas. A partir de la línea celular FRLT, y usando medio COON, sin suero y junto con 6 hormonas y microelementos, Ambesi-Impiombato et al. (1980) lograron mantener células epiteliales de la tiroides que retienen funciones específicas de la misma, siendo notoria la formación de grandes estructuras vacuolares semejantes al coloide folicular. En los años 90 se continúa experimentando con la reorganización in vitro de estructuras seudofoliculares con el uso de moléculas de la matriz extracelular para formar estructuras tridimensionales, ya que estas brindan el soporte para una orientación espacial adecuada para que las células manifiesten la polaridad celular y la organización del citoesqueleto (Eggo et al., 2003; Takasu et al., 1992). Toda et al (1993), empleando geles de colágeno, lograron reconstruir algunos folículos de 5 a 10 tirocitos y agregados celulares sin luz folicular a los 21 días de cultivo. Con líneas celulares también se logró obtener seudofolículos con TSH y factor de crecimiento epidermal (EGF) (Curcio et al., 1994). Se ha encontrado que con tirocitos humanos transplantados en la dermis de ratones SCID (Severe combined inmunodeficient), se logra obtener estructuras foliculares que los autores denominan organoides o neofolículos (Martin et al., 1997) que sintetizan Tg y la almacenan en el lumen. Sin embargo, estos autores no aclaran el tipo de Tg que se produce, y si se presenta o no organificación y síntesis de hormonas. Algunas moléculas de la matriz extracelular secretadas por los tirocitos o añadidas al cultivo favorecen la polaridad celular en seudofolículos manteniendo su estabilidad hasta por 4 semanas de cultivo (Andre et al., 1994; Pellerin et al., 1999). Tonoli et al (2000) intentaron la generación de estructuras foliculares porcinas mediante la transfección genética del gen connexin 32, implicado en la formación de las uniones cerradas (tight junctions) y también en la foliculogénesis Sin embargo, las estructuras foliculares formadas contenían una polaridad “inside-out”. Otros esfuerzos en los cultivos de tiroides van dirigidos a la generación de tirocitos humanos a partir de células madre embrionarias, buscando dilucidar la embriogénesis de la tiroides y los factores moleculares implicados en la foliculogénesis (Lin et al., 2003).

1.2.4 Folículos cerrados En los años 80 se logró desarrollar por primera vez la metodología de obtención de cultivos foliculares en suspensión (Denef et al., 1980; Nitsch y Wollman, 1980), mostrándose tanto aspectos de su morfología como de su fisiología, los cuales están estrechamente relacionados. En este último aspecto es esencial mencionar el trabajo de Karlsson y et al (1982) en folículos porcinos tiroideos, en el cual conseguían mantener estructuras foliculares y folículos abiertos durante cuatro días en cultivos con un soporte de agarosa que impide la adhesión celular, logrando mantener su arquitectura sin coloide y su respuesta a la TSH con una mayor organificación de la Tg. Empleando esta técnica y una disociación enzimática y mecánica muy controlada, se evita al máximo la apertura de los folículos y su morfología es similar a la de los folículos observados in vivo (Spinel-Gómez, 1987). En contraste, si la digestión de la tiroides no es controlada, los folículos

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tiroideos aislados se abren, lo que ocasiona pérdida de coloide y en algunos casos pérdida de la membrana (Denef et al., 1980; Spinel-Gómez, 1987). Con una metodología de disección y digestión controlada se puede llegar a obtener un 80% de folículos cerrados que en cultivo mantienen su morfología y ultraestructura normales hasta por 12 días en ausencia de TSH, es decir que poseen la misma estructura de los folículos in vivo. Además, con TSH 0,1 y 1 mU/mL mantienen la captación y organificación del I- durante los 12 días de manera homóloga a in vivo, con relaciones de organificación/captación (O/C) cercanas al 90% (Spinel-Gomez et al., 1990). En este último trabajo, se demostró por primera vez que a partir de tejido de rata se puede mantener, por más de 24 horas, la organificación del I- sobre la Tg y, lo más importante, la formación de T3 y T4. Sin embargo, estos resultados no han sido tomados en cuenta por la mayoría de otros autores que realizan cultivos de la glándula tiroides. A partir de los estudios realizados por Spinel (1990), se desarrolló un método de aislamiento y cultivo de folículos de ratón, cerdo y humano que permite mantener en cultivo folículos cerrados aún en ausencia de una matriz extracelular que los recubra durante todo el tiempo de cultivo como se ha descrito para rata (Cabezas et al., 2005). Este tipo de cultivo tampoco requiere de TSH, factores de crecimiento, ni ningún otro tipo de hormonas adicionales para mantener los folículos, siendo un modelo idóneo para el estudio in vitro de las funciones y de las bases moleculares de la tiroides bajo condiciones controladas y que sean homologables a la glándula in vivo. Además, responden a la TSH como in vivo (Herrera et al., 2008).

1.3 Regulación de las hormonas tiroideas por la TSH

La TSH es la hormona más importante en el control de la fisiología de la glándula tiroides (Vassart y Dumont, 1992). Los efectos de la TSH sobre la glándula tiroides están mediados por la interacción específica con el receptor de la tirotropina (rTSH). El rTSH es un receptor acoplado a proteína G con 7 dominios transmembranales que en tirocitos modula la proliferación, la síntesis y la liberación de las hormonas tiroideas (Postiglione et al., 2002). Algunos estudios con ratones transgénicos muestran que este receptor es importante en el mantenimiento de la organización folicular, así como en el control del crecimiento de la glándula tiroides (Postiglione et al., 2002). La activación del rTSH induce el acoplamiento de diferentes proteínas G (Laugwitz et al., 1996); sin embargo, muchas de las funciones del rTSH son mediadas por la proteína G estimulatoria (Gs), la cual activa la cascada de la adenilato ciclasa (AC)/AMPc. En tirocitos humanos y de rata, la TSH puede estimular la cascada Gq/PLC y en perro y en tirocitos humanos, también activa la proteína G inhibitoria (Gi), que se opone a la estimulación por Gs (Allgeier et al., 1997). El rTSH induce la disociación de Gs en sus subunidades α y βγ, donde Gαs estimula la AC incrementando los niveles de AMPc. La cascada del AMPc activa la secreción de hormonas y la expresión de genes específicos que codifican proteínas como la Tg, la TPO y la NIS. La importancia de la TSH para la expresión en tiroides de NIS y TPO se confirmó con ratones Knockout privados de TSH o un rTSH funcional, donde a pesar de que la glándula tiroides de estos animales desarrolló un tamaño normal, la expresión de TPO y NIS se redujo significativamente (Postiglione et al., 2002). Además, existe

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evidencia que indica que la TSH no solo regula la expresión de NIS sino que también está involucrada en su maduración y localización intracelular (Riedel et al., 2001). Varios estudios muestran que la Gαs juega un rol importante en la proliferación de los tirocitos. Un mutante activado Gαs reproduce los efectos mitogénicos de la TSH en la línea celular FRTL-5. Más aún, la micro-inyección de un anticuerpo específico de Gαs suprime la síntesis de DNA estimulada por la TSH en células WRT (Meinkoth et al., 1992). Cabe destacar que las subunidades βγ de la Gs modulan señales intracelulares involucradas en el crecimiento y diferenciación celular de otros tipos celulares, aunque el rol preciso de estas subunidades en la proliferación de tirocitos permanece desconocido. Se ha demostrado que la activación constitutiva de la cascada del AMPc causa un incremento en la proliferación de tirocitos tanto in vivo como in vitro, sin embargo, su rol en la transformación de tirocitos es motivo de estudio. Así, ratones transgénicos con activación constitutiva de la cascada del AMPc en tiroides dada por la expresión específica de un mutante Gαs, el receptor adenosin A2, o la subunidad A1 de la toxina del cólera, desarrollan una hiperplasia en la tiroides e hipertiroidismo pero no carcinomas. Por esto, parece que la activación constitutiva de la vía del AMPc no es suficiente para inducir la tranformación de los tirocitos, por lo que debe haber dependencias adicionales de genes reguladores del crecimiento. Sin embargo, ciertas mutaciones en el rTSH pueden inducir transformación neoplásicas (Fournes et al., 1998). Esto sugiere que no todas las señales de proliferación de la rTSH se dan a través de Gαs por lo que deben tenerse en cuenta otras vías de señalización como la via fosfolipasa C/ proteína quinasa C (PLC/PKC) o las inducidas por las subunidades βγ. Tanto en humanos (Yanagita et al., 1996) como en células FRTL-5 (Field et al., 1987), pero no en tirocitos de perro (Mockel et al., 1991), la TSH estimula adicionalmente la isoforma β de la PLC (PLCβ) gracias al acoplamiento del rTSH con miembros de la familia Gq/11 (Figura 1-1) (Allgeier et al., 1994). La hidrólisis del fosfolípido fosfatidilinositol bifosfato (IP2) produce el segundo mensajero 1,2-diacilglicerol (DAG) y el inositol trifosfato (IP3). El DAG activa la proteína quinasa C (PKC) mientras que IP3 facilita un incremento intracelular de Ca2+. En células de rata FRTL-5 se ha visto que la TSH incrementa DAG por la vía de la fosfolipasa D (PLD), en la cual se produce DAG a partir de la hidrólisis de la fosfatidilcolina; esto sugiere un mecanismo alternativo dependiente de la TSH para la activación de PKC (Medina y Santisteban, 2000). También se ha encontrado que en tirocitos humanos de cultivos primarios se requiere 10 veces más TSH para activar PLC-Ca2+ con respecto a la requerida para activar la AC (Yanagita et al., 1996). En células FRTL-5 la activación de la cascada PLC-Ca2+ requiere de 10 a 100 veces la concentración de la hormona con respecto a la requerida para activar la AC (Field et al., 1987). Sin embargo, se ha mostrado que la estimulación con agonistas purinérgicos-P1 (como la adenosina) no sólo incrementa la activación de la cascada de la PLC en células FRTL-5, sino que también inhibe la acumulación de AMPc inducida por la TSH (Sho et al., 1991). Algunos resultados sugieren que junto con la TSH, se requieren estímulos fisiológicos adicionales (como adenosina) o una estimulación repetitiva con la TSH para activar la cascada de la PLC. La activación de esta vía puede contribuir a la proliferación con TSH a través de la movilización de Ca2+, y se ha propuesto como un regulador en varios aspectos de la fisiología de la tiroides en donde la PKC se ha relacionado con un incremento en la proliferación celular. Así, en tirocitos de rata, la activación de PKC por ésteres de forbol tiene un efecto mitogénico. Además, la PKC interfiere con la producción del AMPc, lo cual podría relacionarse con la carencia de diferenciación observada después de la activación de PKC por el tratamiento con ésteres

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de forbol. De manera similar, incrementos en el AMPc parecen interferir con la cascada de la PLC inducida con TSH. Así, el entrecruzamiento entre las dos vías principales de señalización (AMPc y PLC) muestra la complejidad de la señalización en los tirocitos que motivará futuros estudios.

1.4 El I- en la síntesis y secreción de las hormonas

tiroideas: efecto Wolff-Chaikoff

A comienzos del siglo pasado, se reportó que el I- en dosis altas causa un bloqueo en la función de la tiroides in vivo. Posteriormente, Morton describió que el exceso de I- inhibe la síntesis de hormonas tiroideas en trozos de tiroides provenientes de ovejas (Morton et al., 1944). Posteriormente, se caracterizó el fenómeno conocido actualmente como efecto Wolff-Chaikoff, el cual consiste en la inhibición de la organificación del I- y por ende de la síntesis de las hormonas tiroideas en presencia de dosis altas de I- en plasma (Wolff y Chaikoff, 1948). En 1949, se reportó el fenómeno de “escape” del efecto Wolff-Chaikoff en ratas que fueron sometidas a 2 días continuos con dosis altas de I-. Este fenómeno consiste en la recuperación de la síntesis de las hormonas tiroideas hasta niveles cercanos a lo normal al cabo de un tiempo de estar sometidas a concentraciones altas de I- (Wolff et al., 1949). Adicionalmente, Raben et al demostraron que la inhibición de la organificación de I- depende directamente de la acumulación intratiroidea de I- y en menor medida de la concentración en sangre (Raben, 1949). Varios experimentos revelaron que un exceso de I- inhibe numerosos procesos como el transporte de I-, la generación de H2O2, la organificación del I-, la secreción de hormonas, la formación de AMPc, la síntesis de mRNA y proteínas. La mayoría de estos procesos se pueden revertir inhibiendo la organificación del I-, lo que sugiere que están involucrados compuestos yodados. Sin embargo, a pesar de la gran cantidad de investigaciones realizadas, la base molecular del efecto Wolff-Chaikoff no se entiende completamente.

1.4.1 Efecto del I- sobre su captación Braverman e Ingbar (1963) analizaron in vitro la capacidad de captación de I- en tiroides de ratas hipofisectomizadas (control) y de ratas hipofisectomizadas adaptadas al I- in vivo. Se observó que la capacidad de captación es menor en la tiroides adaptadas al I- con respecto al control. Los autores propusieron que esta menor capacidad de captación ocurre durante el escape del efecto Wolff-Chaikoff y así facilitaría una acumulación apropiada de I- en presencia de altas concentraciones de I- en plasma. El grupo de Yamada observó una supresión en la captación de I- en tirocitos de cerdo que crecieron en cultivo con altas concentración de I- (Takasu et al., 1985). En células FRTL-5 se observó que la captación de I- se inhibe bajo un exceso de I-, en donde la disminución en la captación se asoció con una disminución en la velocidad de entrada del I-. Sin embargo, cuando las células se incuban con NaI y metimazol (un inhibidor de la TPO que impide la organificación), no se presenta inhibición en la captación (Grollman et al., 1986).

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Luego de la clonación del gen NIS, se ha estudiado tanto in vivo como in vitro su expresión a nivel del mRNA y de la proteína. En perros tratados con bociógenos y perclorato privados de I-, Uyttersprot y et al (1997) encontraron que la administración de dosis moderadas de I-, correspondiente con la dieta recomendada para humanos, inducen un hipertiroidismo transitorio sin que los niveles de TSH disminuyan antes de las 48h, permitiendo así el estudio directo in vivo de los efectos del I- bajo estimulación constante de la TSH. En este estudio, los niveles de expresión de los mRNAs de Tg y de rTSH no se afectaron, pero los mRNAs de TPO y NIS disminuyeron 48 horas después de la administración de KI. Eng et al (1999) midieron en ratas los niveles de mRNA NIS y de su proteína en respuesta a excesos de I- crónicos y agudos, con el fin de determinar el mecanismo asociado con la disminución del transporte de I-. Tanto el mRNA NIS como la proteína disminuyeron en los días 1 y 6 luego de una ingestión crónica de I-. El mRNA NIS disminuyó a las 6 y 24 h luego de la administración aguda de I-, mientras que la proteína solo disminuyó a las 24 h, lo que permitió concluir que la administración de I- disminuye el mRNA NIS y su proteína por un mecanismo que parece ser, al menos en parte, transcripcional. Estos resultados soportan la hipótesis de que el “escape” del efecto Wolff-Chaikoff es causado por una disminución de la proteína NIS, lo cual resultaría en una disminución en el transporte de I- en la tiroides. Ferreira et al (2005) no encontraron ninguna diferencia en la actividad de captación de la tiroides después de un día en presencia de I- en el agua de beber (a la misma concentración del estudio anterior). Spitzweg et al (1999) también analizaron los efectos de las altas concentraciones de I- sobre las células FRTL-5, encontrando que incrementando la concentración externa de I- a 40 µM se induce después de 48 h una disminución del 50% en la capacidad de captación de I- y en los niveles de mRNA de NIS. Estos resultados difieren de aquellos encontrados por el grupo de Eng, quién observó que el I- a una concentración de 1 mM no tiene efectos en los niveles de mRNA de NIS en células FRTL-5 después de 24-48 h comparado con células cultivadas en ausencia de I-. Este estudio también incluye un análisis por immunoblot el cual mostró una disminución en el nivel de proteína NIS del 50% comparado con los valores control después de 24 h y del 70% después de 48 h (Eng et al., 2001). Adicionalmente, mediante experimentos de pulso y caza se encontró que no hay efecto sobre la síntesis de novo de la proteína NIS aunque la degradación de la proteína es más rápida en presencia de I- (27%) (Eng et al., 2001). Un reporte reciente en ratas (Serrano-Nascimento et al., 2010) muestra que la abundancia de mRNA NIS y la longitud de su cola poli (A) se reduce rápidamente (30 min) de manera significativa con el tratamiento con I-. El perclorato reversa esos efectos indicando que el I- desencadena las modificaciones observadas. Dado que la cola poli (A) está asociada con la estabilidad y eficiencia en la transcipción, los autores plantean que este tipo de regulación post-transcripcional puede participar en la homeostasis temprana de la glándula tiroides luego de la exposición a altas dosis de I-. Los trabajos de Eng muestran que la expresión de NIS está muy regulada en la tiroides a través de la activación por TSH e inhibición por I-. Los eventos post-transcripcionales pueden permitir a la tiroides una repuesta rápida al incremento del I- en plasma, con lo cual se evitaría un aumento “toxico” de los niveles de hormonas tiroides en sangre. Además, los resultados de Ferreira indican que los efectos sobre los niveles del mRNA de NIS ocurren antes que el efecto sobre la capacidad de captación de I-. Los estudios

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apuntan a que la respuesta inducida por altas concentraciones de I- sobre su captación involucra eventos regulatorios post-transcripcionales de NIS. Algunos reportes indican que durante el “escape”, los niveles de la proteína NIS en la membrana plasmática disminuyen con lo cual la captación de I- decrece compensando así una alta concentración de I- en plasma.

1.4.2 Efecto del I- en exceso sobre la organificación del I- y la secreción de las hormonas tiroideas

La enzima TPO, ubicada en la interface célula-coloide, sintetiza residuos de hormonas tiroideas sobre la Tg catalizando la yodación de los residuos de tirosina y el acoplamiento de pares de yodotirosinas formando yodotironinas. La TPO requiere H2O2 como aceptor de electrones para estas reacciones. El H2O2 se genera por la flavoproteína Ca2+-dependiente nicotinamin adenin dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa (Duox2). Braverman e Ingbar mostraron (1963) que dosis elevadas de I- inhiben la organificación in vitro. Esta inhibición es mayor en tiroides de ratas control que en aquellas ratas adaptadas al I- (Braverman y Ingbar, 1963). Adicionalmente, el efecto del I- sobre la organificación se analizó en cultivos primarios de tirocitos de cerdo que crecen en monocapas de manera polarizada sobre filtros porosos cubiertos de colágeno en cámaras de cultivo con doble compartimiento. Se ha mostrado que la concentración de I- en el compartimento basolateral modula la eficiencia de la incorporación de I- a la Tg en el compartimiento apical, obteniendo un máximo de organificación con una concentración 0,5x10-6 M de I-. A concentraciones por encima de este valor, se observa la inhibición en la organificación. Además, también se encontró que altas concentraciones de I- en el medio basal no dan lugar a un aumento de la concentración de I- apical por encima de 1x10-5 M pero si ocurre una disminución de la concentración de la Tg apical (Gruffat et al., 1992). Estudios in vitro sobre preparaciones de membrana plasmática de tirocitos de cerdo con 2-yodohexadecanal (2-IHDA), un potencial mediador del efecto Wolff-Chaikoff, indican que el 2-IHDA inhibe la actividad de la NADPH-oxidasa y la yodación de proteínas catalizada por la TPO, pero no la oxidación del I-. El I- libre no tuvo efecto inhibitorio sobre estas preparaciones (Ohayon et al., 1994). Adicionalmente, Uyttersprot (1997) observó que dosis moderadas de I- inhiben la expresión del mRNA TPO en tirocitos de perro in vivo. Eng et al (1999) utilizando ratas mostraron que el I- induce la disminución del mRNA de la TPO al día 6 bajo una ingestión crónica de I- y a las 24 h luego de una ingestión aguda. Ferreira et al (2005) también reportaron una disminución rápida en la actividad de la TPO. Además, experimentos con folículos de cerdo realizados sugirieren que una forma oxidada de I- inhibe al generador de H2O2 Duox2 a un nivel post-transcripcional reduciendo la disponibilidad de la forma glicosilada madura de la proteína Duox2 en los tirocitos (Morand et al., 2003) Actualmente, se conoce que el I- no solo ejerce un control sobre los procesos de captación y organificación, sino que también afecta la secreción de las hormonas tiroideas tanto in vivo como in vitro. En cultivos de tirocitos de oveja se encontró que un incremento en la concentración de I- por encima de de 1x10-6 M inhibe la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas (Becks et al., 1987). En trozos de tiroides humana, Corvilain et al (1994) reportaron que la TSH, por medio de la activación de la cascada del AMPc, aumenta la secreción y el I- inhibe esta activación. Estos últimos autores sugieren

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que las cascadas fosfatidilinositol-Ca2+ no están involucradas en la activación de la secreción hormonal por la TSH y consecuentemente, en el efecto del I-. Sin embargo, son indispensables más estudios en este campo.

1.4.3 Toxicidad del exceso de I- La administración crónica de altas dosis de I- produce en el hombre tres complicaciones importantes en la tiroides: tirotoxicosis (Fradkin y Wolff, 1983) bocio (Wolff, 1969) y tiroiditis (Hall et al., 1966; Markovic et al., 2010). Debido a la alta incidencia de tiroiditis en humanos en regiones donde la ingesta de I- es elevada, se ha propuesto que el I- puede participar en el desencadenamiento de reacciones autoinmunes en la tiroides (Markovic et al., 2010). In vivo, la exposición crónica a un exceso de I- puede inducir necrosis sobre glándulas tiroides hiperplásicas, las cuales son inducidas experimentalmente por carencia de I- en la dieta. El efecto del I- se ha reportado en varias especies animales, específicamente hamsters (Follis, 1964), perros (Belshaw y Becker, 1973), ratas (Rognoni et al., 1987) y ratones (Mahmoud et al., 1986). En estas glándulas se presenta un elevado estrés oxidativo que está asociado con la producción de 4-hydroxynonenal, así como un incremento en los niveles de proteínas antioxidantes como glutatión peroxidasas y peroxiredoxinas. Sin embargo, estas proteínas antioxidantes no son suficientes para amortiguar completamente las especies reactivas de oxígeno (ROS) en estas glándulas lo que induciría muerte celular y reacciones inflamatorias (Poncin et al., 2008). In vitro, se ha observado que el I- en dosis elevadas puede inducir la inhibición de la proliferación de células FRTL-5 estimuladas con TSH, aunque la adición simultanea de metimazol al medio impide la inhibición (Tramontano et al., 1989). Un aspecto importante es que no se observa inhibición del crecimiento celular con líneas celulares que no sean de origen tiroideo, lo cual sugiere que el I- ejerce su efecto inhibitorio sobre el crecimiento de células de la tiroides en múltiples sitios, que se encuentran relacionados con las vías de regulación mitogénica tanto dependientes de AMPc como independientes. Además, Many et al (1992) reportaron que las dosis altas de I- inducen necrosis en folículos aislados de tiroides humana, en los cuales se observaron alteraciones ultraestructurales relacionadas con citotoxicidad que involucran ataques de radicales libres y peroxidación de lípidos aun en presencia de TSH. Además, estos efectos pueden ser mitigados inhibiendo la organificación (Many et al., 1992). Existen reportes que indican que los efectos del I- varían entre modelos experimentales y entre especies, mostrando que en unos u otros casos las células pueden exhibir las características de 2 fenómenos diferentes que conducen a la muerte celular: apoptosis y necrosis (Golstein y Dumont, 1996). Mediante técnicas moleculares, Zhang et al (2003) infectaron células de cáncer de pulmón con vectores retrovirales que contenían los genes NIS y TPO. Increíblemente, el I- no radiactivo indujo apoptosis únicamente en las células transformadas con ambos genes, así como también limitó el crecimiento de tumores xenotransplantados en ratón. Adicionalmente, se encontró que las especies reactivas de oxígeno juegan un papel importante en la apoptosis inducida por el I- en este modelo. Todos los resultados apuntan a que el I- comienza a ser tóxico luego de ser oxidado por la TPO, sin embargo, se requieren más estudios en este tópico.

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1.4.4 Los efectos del I- son dependientes de su concentración Todos los procesos de inhibición descritos no son inducidos con la misma concentración. Concentraciones de NaI 1x10-6 y 1x10-5M inhiben la captación y organificación respectivamente. En cultivos primarios de tirocitos de ovejas, los efectos inhibitorios del I- sobre la tiroides son modulados con la concentración de I-. Con I- 10-5M, se observa una fuerte inhibición de la secreción de T3 y T4 pero solo hay un efecto leve sobre la formación de yodotironina en la Tg. Por otro lado, con I- 10-4 M ambos procesos se inhiben.

1.4.5 Moléculas potencialmente involucradas en la mediación del efecto Wolff-Chaikoff

Como ya se mencionó, muchos de los efectos inhibitorios del I- se suprimen si la yodación se interrumpe. Además, es esencial su acumulación dentro de los tirocitos para que pueda provocar un efecto. En 1986, Sherwin y Price observaron que se requiere la síntesis de proteínas en el mecanismo de inhibición de transporte de I- en trozos de tiroides incubados con I- 30 µM. Además, los autores obtuvieron evidencia de que la inhibición de la actividad de transporte de I- está asociada con la yodación de una proteína de 8-10KDa. En la útima década, se han realizado algunos estudios de los perfiles de transcripción en tirocitos expuestos a I- en exceso. Utilizando la tecnología de los microarreglos, Yamasaki (2003) intentó identificar los genes regulados positiva y negativamente por la TSH y el I- en cultivos de folículos humanos. En presencia de TSH por 2 días, los genes que se regularon de forma positiva fueron principalmente aquellos que codificaban para enzimas involucradas en el metabolismo de carbohidratos y lípidos, adenilato y guanilato ciclasas, y proliferación celular. Como se esperaba, la TSH indujo la sobreexpresión de numerosos genes involucrados en la regulación de diferentes funciones de la tiroides. Cuando los folículos se cultivaron en un medio que contenía altas concentraciones de I- (10-5M) por 24 h, los autores observaron la regulación positiva de varios genes como Interleuquina-8, IFP53, osteopontina, y la molécula de adhesión intercelular (ICAM-1). Un estudio reciente en células PCCl3 (Leoni et al., 2008) encontró que alrededor de 63 transcriptos son regulados negativamente mientras que 21 son regulados positivamente en respuesta a NaI 1 mM. Los genes regulados en mayor grado negativa y positivamente fueron la dipeptidilpeptidasa 7 y Scarb1 respectivamente, los cuales no han sido relacionados con la función de la tiroides. Varios transcriptos modulados por el I- están relacionados con el catabolismo y anabolismo de proteínas, así como en su plegamiento y transporte. Dentro de las proteínas reguladas negativamente están la Cct2 (chaperonin containing TCP1, subunit 2β) y la Cct5 (chaperonin subunit 5ε), las cuales son esenciales para el plegamiento de proteínas de células eucariotas. Por otra parte, el I- regula positivamente genes relacionados con las defensas antioxidativas como la glutatión peroxidasa 2 y la tioredoxina 1 que pueden tener una relevancia fisiológica en la tiroides. Finalmente, en el estudio de Leoni et al se encuentra que el I- es capaz de modular tanto genes involucrados en la inhibición como en la inducción del ciclo celular , dentro de los que se destaca la regulación negativa del gen del rTSH (Leoni et al., 2008).

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Boeynaems y Hubbard (1980) mostraron que el ácido araquidónico puede ser transformado en 6-yodo-8,11,14-eicosatrienoico-delta-lactona (delta-IL) en tiroides de rata, reacción que puede impedirse con el inhibidor metimazol, por lo que la formación de esta yodolactona debe ser catalizada por la TPO. Además, los autores postularon que esta yodolactona podría participar en la mediación del efecto inhibitorio del I- sobre la adenilato ciclasa o en la limpieza del exceso de I- (Boeynaems y Hubbard, 1980). Adicionalmente, Boeynaems reportó que la síntesis de la delta-IL se estimula por un aumento en el Ca2+ intracelular (Boeynaems et al., 1981). Chazenbalk et al sintetizaron un derivado de yodoaraquidonato, el cual inhibe la captación de I- con concentraciones tan bajas como 10-8 M y la organificación con 10-5 M en trozos de tiroides bovina (Chazenbalk et al., 1984). Drugrillon investigó el efecto de la delta-IL sobre folículos aislados de tiroides de cerdo. Esta yodolactona inhibe de manera dosis-dependiente la proliferación de tirocitos inducida por el factor de crecimiento epidermal (EGF), con concentraciones (0,1-1,0 µM) mucho menores que el KI (4x10-5 µM). El efecto inhibitorio de la delta-IL sobre el crecimiento celular no puede ser abolido con metimazol. Adicionalmente, ni la concentración de AMPc basal ni el inducido con la TSH se alteró por la delta-IL, sugiriendo que esta inhibición no es inducida por una disminución en el AMPc (Dugrillon et al., 1990). Drugrillon y Gartner (1995) mostraron que las yodolactonas disminuyen la proliferación inducida por EGF, la generación de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y aumenta la apoptosis en folículos de tiroides de cerdo. En 1990 se identificó el 2-yodohexadecanal (2-IHDA) como el yodolípido principal sintetizado por la glándula tiroides de caballo en presencia de I- (Pereira et al., 1990). Se encontró que el 2-IHDA inhibe in vitro las enzimas NADPH-oxidasas (con un 50% de inhibición entre 3-5 µM) y la TPO (Ohayon et al., 1994) por lo que se propuso como un mediador del efecto Wolff-Chaikoff. Panneels también encontró que el 2-IHDA inhibe la actividad de AC estimulada por la TSH (Panneels et al., 1994). Adicionalmente, Panneels et al también reportaron la síntesis de 2-IHDA en tirocitos de perro y su conversión a 2-yodohexadecan-1-ol, el cual no inhibe la producción de H2O2 ni la AC. Consecuentemente, los autores propusieron que esta conversión puede representar una vía de inactivación del efecto inducido por el 2-IHDA (Panneels et al., 1996).

1.4.6 La TSH y el I- En ratas hipofisectomizadas y sometidas a una dieta rica en I-, se ha encontrado que se inhibe el incremento del AMPc estimulado por la TSH (Rapoport et al., 1975) y en tiroides de ratón el I- inhibe la formación de AMPc (Hashizume et al., 1976). Sin embargo, la disminución del AMPc intracelular debería conducir a una disminución en la expresión de diferentes genes, tales como TPO y NIS. Esta disminución en la expresión de NIS podría explicar el bajo nivel del transportador durante el escape del efecto Wolff-Chaikoff producto de una dieta crónica de I-. Posteriormente, se encontró que el incremento en la salida de Ca2+ y la generación de IP3, que son inducidas por la TSH, se inhiben con el I- (Hashizume et al., 1984), lo que explicaría la disminución en la generación de peróxido durante el efecto Wolff-Chaikoff (Corvilain et al., 1994).

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2. Materiales y métodos

2.1 Aislamiento de Folículos tiroideos

Las glándulas tiroides de cerdo (Cialto) y rata (Wistar) se obtuvieron del frigorífico San Martín de Porres Ltda y del Bioterio de la Universidad Nacional de Colombia respectivamente; las ratas se manejaron de acuerdo a las exigencias éticas de la legislación colombiana (Resolución 8430 de 1993 Título IV) e internacional (AVMA Guidelines on Euthanasia, 2007). En los cerdos, las glándulas tiroides se extrajeron pocos minutos después del sacrificio de los animales y se sometieron a un lavado con etanol al 70 % por 1 min y 3 lavados con medio COON suplementado con penicilina y estreptomicina. Las ratas fueron inyectadas intraperitonealmente previo a la extracción de la tiroides, con una solución de pentobarbital sódico y difenilhidantoína sódica y se perfundieron con suero fisiológico. El tejido se disecó en fragmentos de 2 mm3 aproximadamente, eliminando la mayor cantidad de tejido conectivo. Los fragmentos se digirieron cada 10 min durante 50 min con una solución que contenía colagenasa tipo II (400 U/mL para cerdo y 250 U/mL para rata; E.C. 3.4.24.3) y DNasa I (0,02 mg/mL; E.C. 3.1.21.1) a 37 °C en medio COON. Los sobrenadantes del medio de disociación se recolectaron cada 10 min, renovando el medio enzimático entre cada disociación. Para favorecer la liberación de los folículos, se realizaron disociaciones mecánicas suaves entre cada ciclo de disociación de 10 min con pipetas de 5 y 10 mL. Los folículos liberados se lavaron 3 veces con medio COON suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 2 % (v/v), centrifugando entre cada lavado a 50 X g por 30 s. Finalmente, se reunió todo el material disociado y se filtró sobre una malla metálica con un tamiz de 300 µm.

2.2 Cultivo en suspensión de folículos aislados

La viabilidad de los folículos obtenidos se evalúo bajo el microscopio invertido por el ensayo de exclusión con azul Trypan, el cual permite evaluar tanto la integridad de la membrana celular como la proporción aproximada de folículos cerrados.

18

Inicialmente los cultivos se mantuvieron en pre-incubación por 12 h en el caso de los folículos de cerdo y 24 h para los folículos de rata. La preincubación se llevó a cabo en cajas de Petri de 75 mm recubiertas con agarosa tipo II al 1% (agar-bearing marine algae type II) en medio COON suplementado con SFB al 0,5% a 37 °C y una atmósfera 95% aire – 5% CO2 y saturada en humedad. Se renovó el medio y se ajustaron los diferentes tratamientos experimentales (Tabla 2-1). Al finalizar cada tiempo de tratamiento, se tomaron alícuotas de folículos para hacer el análisis funcional y morfológico correspondiente. Finalmente, para todos los tratamientos se realizó una evaluación en el microscopio invertido con azul Trypan.

2.3 Análisis de captación y organificación de I-

Para evaluar el efecto del I- y de la TSH sobre su captación y organificación en folículos de cerdo, los folículos se incubaron en medio COON con diferentes dosis de NaI frío (0, 1,0x10-7 y 1,0x10-3 M), sin y con TSH (1 mU/mL) y una dosis fija de Na125I de 5 µCi/mL como trazador por diferentes tiempos como se muestra en la Tabla 2-1. Una vez finalizados los tiempos de incubación, las muestras se sometieron a cuatro lavados con medio COON suplementado con NaI frío cien veces más concentrado con respecto al I- en la muestra, centrifugando a 50 X g por 5 min. El 125I- captado por los folículos se determinó en un contador γ de pozos junto con la radiactividad de 3 patrones de Na125I. Tabla 2-1: Tratamientos experimentales. Los números en las columnas indican las réplicas totales para cada tratamiento.

Yoduro

(M)

Cultivo de

folículos

TSH

(mU/mL)

Tiempo (h)

0.5 3 8 12 24 48

- Rata 0 6 6 6 - - -

1,0x10-7

6 6 6 6 6 6

1,0x10-5

6 6 6 - - -

1,0x10-3

6 6 6 6 6 6

- 0,1 6 6 6 - - -

1,0x10-7

6 6 6 2 2 2

1,0x10-5

6 6 6 - - -

1,0x10-3

6 6 6 2 2 2

- Cerdo 0 3 3 - 3 3 -

1,0x10-7

3 3 - 3 3 -

1,0x10-3

3 3 - 3 4 -

- 1 3 3 - 3 3 -

1,0x10-7

3 3 - 3 3 -

1,0x10-3

3 3 - 3 2 -

19

Los ensayos sobre los folículos de rata se realizaron de manera similar con las siguientes modificaciones: se utilizó una dosis adicional de NaI frío (1x10-5 M) y se cambió la dosis de NaI total 1x10-9 M por 0,2x10-9 M, la dosis de TSH fue de 0,1 mU/mL y se utilizaron dosis de Na125I 1 y 10 µCi/mL en los primeros ensayos pero luego se normalizó a 5 µCi/mL. Una vez determinada la captación, se realizó una precipitación de proteínas con 1 mL de PBS, 100 µL de albúmina (fracción V) al 5 % y 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 20% durante 20 h a 4°C. Se realizaron 3 lavados con TCA al 10 % que contenía NaI frío 100 veces más concentrado con respecto al I- en la muestra, centrifugando a 3000 X g por 10 min. La radiactividad de los precipitados corresponde al I- organificado o unido a proteínas. Los valores funcionales de captación y organificación de I- se normalizaron frente al contenido de DNA de las muestras, dado que es un parámetro proporcional al número de celulas. Se realizó la extracción de ácidos nucleícos por precipitación con etanol al 95 % a 4 °C por 10 min, etanol 95 % a 70 °C por 20 min y éter a 30 °C por 15 min. El éter fue evaporado completamente a 50 °C por unos 30 min. El contenido de DNA se determinó con el método de la difenilamina (Burton, 1956), el cual es un ensayo en el que la difenilamina reacciona específicamente con las desoxiribosas del DNA en ácido perclórico 0,5 M produciendo un compuesto azul medible a 600 nm λ. Para la cuantificación se utilizaron patrones de DNA de esperma de salmón (entre 0 – 20 µg/mL). Basados en la actividad específica, la eficiencia del contador y el contenido de DNA determinado por el método de la difenilamina, la captación y organificación del I- se expresó como picomoles de I- total captado por microgramo de DNA. Adicionalmente, se expresaron las relaciones entre el yodo organificado sobre el captado (O/C).

2.4 Análisis morfológico

Finalizada la incubación con diferentes tratamientos, la fijación de los folículos se realizó con glutaraldehído 2,5% en tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,4) por 1 h y la post-fijación con tetróxido de osmio 1% en tampón cacodilato 0,1 M por 1 h. Dado que los folículos se encuentran en suspensión, se realizaron centrifugaciones a 200 X g por 5 min en cada etapa desde su fijación y deshidratación hasta su impregnación en resina. La deshidratación se realizó con concentraciones ascendentes de etanol (75 – 96 %) y la infiltración con resina Epon 812.

Se realizaron cortes semi-finos de 0,5 μm de espesor que se tiñeron con azul de Toluidina 1% y que se procesaron para autoradografías (Denef et al., 1980; Spinel-Gomez et al., 1990). Los cortes ultra-finos se contrastaron con acetato de uranilo 3% y citrato de plomo 2.5 % y se examinaron por microscopía electrónica de transmisión (EM 109 Zeiss) (Spinel-Gomez et al., 1990).

20

2.5 Inmunofluorescencia indirecta de los folículos

El estudio del cotransportador NIS en folículos de rata se llevó a cabo con un anticuerpo monoclonal anti-NIS hecho en conejo que está dirigido contra un epítope citoplasmático de la proteína NIS de ratón. Cabe destacar que este anticuerpo fue capaz de reconocer la proteína NIS de rata, posiblemente por el elevado porcentaje de identidad entre ambas proteínas (95,5 %) (Dohan et al., 2003).

Inicialmente, el medio de cultivo de los folículos se retiró lavando con PBS 1X a 50 X g por 3 min. Los folículos se fijaron con paraformaldehído 4 % en PBS por 30 min. Se realizaron 2 lavados con PBS y se incubaron las muestras por 30 min con una solución de PBS/NH4Cl (50 mM)/Glicina (100 mM) y por otros 30 min con una solución de PBS/NH4Cl (50 mM) con el fin de eliminar la autofluorescencia inducida por la fijación con formaldehido. Luego de 2 lavados con PBS, las células se permeabilizaron con Triton-X100 0,1 % en PBS durante 10 min y se lavaron de nuevo con PBS. Luego de 1 h con suero de cabra (GS) al 1% en PBS a temperatura ambiente, las células se incubaron con el anticuerpo anti-NIS (1:300)/GS 1 % toda la noche a 4 °C. Las muestras se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario anti conejo-Alexa fluor 488 (1:500)/GS 1 % durante 1 h a temperatura ambiente. Los núcleos se marcaron con DAPI (1:9000) en PBS durante 10 min y se lavaron 2 veces con PBS. Además, se realizaron controles de autofluorescencia (Muestras incubadas únicamente con GS al 1 %) y del anticuerpo secundario (muestras incubadas únicamente con el anticuerpo 2rio). Por último, los folículos se resuspendieron en 50 µL de medio de montaje (Gel mount; Sigma-Aldrich), se montaron sobre laminas con un pozo de 1 mm y se cubrieron con una laminilla. Las láminas se dejaron secar durante al menos 1 h, y las imágenes se adquirieron por microscopía confocal (Nikon Eclipse Ti).

2.6 Análisis estadístico

Con el programa Statgraphics plus 4.0, se realizó una prueba t para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas en las variables de captación y organificación en presencia y ausencia de TSH para cada uno de los días.

21

3. Resultados

3.1 Morfología y viabilidad de los folículos aislados

Experimentos preliminares mostraron que la forma en que se realiza la disociación mecánica en combinación con la disociación enzimática son claves para la obtención de folículos cerrados en ambas especies, en donde los resultados morfológicos y funcionales van de la mano con la proporción de folículos cerrados para un experimento dado. Luego de los ajustes al protocolo de aislamiento fue posible la obtención de folículos cerrados viables en gran proporción (Figura 3-1), los cuales preservan el coloide y excluyen al azul tripan al ser observados por microscopía óptica. Durante todos los tiempos con y sin TSH la arquitectura de los folículos se conserva (Figura 3-2).

Figura 3-1: Cultivo de folículos aislados de rata y cerdo luego del periodo de preincubación. Barras 100 µm.

Las autoradiografías realizadas en presencia de I- 0,2x10-9 M revelan un marcaje de algunos gránulos de plata en el lumen folicular a la media hora (Figura 3-2A), que se intensifica a partir de las 3 h y se mantiene a lo largo del cultivo (Figura 3-2B). La adición de 0,1 mU/mL de TSH no modifica la intensidad del marcaje en el lumen a las 8 h (Figura no mostrada).

CERDORATA

22

Figura 3-2: Autoradiografías de folículos de rata incubados bajo diferentes dosis de I- durante diferentes tiempos. NaI 5,0x10-10 M y 1 µCi/mL de Na125I por 30 min (A) y 8 h (B); NaI 1.0x10-5 M y 10 µCi/mL de Na125I por 8 h (C); NaI 1.0x10-3 M y 10 µCi/mL de Na125I por 8 h (D). Nótese en B que bajo condiciones moderadas de I- hay un marcaje fuerte en el coloide en la mayoría de los folículos. Barras 50 µm.

En presencia de 1,0x10-5 M de NaI no se observó marcaje en las autorradiografías en ninguno de los tiempos; sin embargo, los resultados funcionales que se muestran más adelante, indican que bajo este tratamiento hay organificación a partir de las 3 h, aunque esta fue muy baja (O/C del 3%) y se mantuvo en niveles bajos hasta las 8 h (O/C del 12%). La TSH estimuló muy levemente la organificación (O/C del 5% a las 3 h y O/C del 20% a las 8 h), pero no fue suficiente para precipitar la plata en el marcaje de las autorradiografías en ninguno de los tiempos, razón por la cual no se observa marcaje en los folículos bajo este tratamiento (Figura 3-2C). Adicionalmente, en el tratamiento de 1,0x10-3 M de NaI no hubo marcaje en ninguno de los tiempos (Figura 3-2D). En ausencia de TSH, bajo las diferentes concentraciones de I-, los tirocitos presentan la misma ultraestructura de una glándula in vivo, es decir, el RER rodea el núcleo en la región basal de la célula, el complejo de Golgi se ubica en el centro y las vesículas en inmediaciones de las microvellosidades que están en contacto con el coloide (Figura 3-3 A y C). Cabe resaltar que con I- 1.0x10-3 M se observan vesículas de endocitosis tapizadas (recuadro en la Figura 3-3C).

A

C D

B

23

Figura 3-3: Efecto de la dosis de I- sobre la ultraestructura de tirocitos de rata sin y con TSH. Los

folículos se cultivaron por 8 h en: (A) Na125

I 0,2x10-9

M sin TSH; los tirocitos muestran una ultraestructura similar a las células in vivo (x10720). (B) Na

125I 0,2x10

-9 M con TSH (x12510); las

flechas indican grandes lisosomas secundarios cercanos al núcleo que parecen fusionados con gotas coloidales. En el recuadro se evidencian gotas de coloide ubicadas hacia el polo apical de la célula, típico de una estimulación con TSH (x10720). (C) NaI 1.0x10

-3 M sin TSH (x7430); esta

dosis no inhibe la endocitosis puesto que hay presencia de vacuolas tapizadas (ver recuadro, x10720) y no hay modificaciones en la distribución de los organelos; además, se conserva la ultraestructura de los tirocitos foliculares. (D) NaI 1.0x10

-3 M con TSH (x13450): se observan gotas

de coloide hacia la parte apical de la célula, mostrando que responden a la TSH pero no alcanzan a fusionarse con los lisosomas como en (B).

24

A las 8 h con 0,1 mU/mL de TSH y I- 0,2x10-9 ó 1,0x10-7 M, se observan lisosomas secundarios recién fusionados con gotas de coloide en la posición supranuclear (flechas en la Figura 3-3B) y gotas de coloide apicales (recuadro en la Figura 3-3B). Con I- 1.0x10-

3 M, se observan gotas de coloide hacia el polo apical que no han migrado al interior del tirocito para fusionarse con los lisosomas (Figura 3-3D).

Para todos los tiempos estudiados, sin importar bajo que tratamientos se mantenga el cultivo, los tirocitos conservan los complejos de unión en la región apical separando los dominios de membrana basolateral de la apical. A su vez, las membranas basales están unidas a lo largo del gran eje celular separando el coloide del exterior folicular. Los resultados morfológicos indican que los folículos están cerrados, encontrándose por medio de autoradiografías, que la proporción de folículos cerrados es superior al 75% dado el marcaje presente en el coloide a bajas concentraciones de I- (Figura 3-2B).

A los 6 d de cultivo con NaI 1,0x10-7 M sin TSH, se observa que los tirocitos que componen los folículos son viables al igual que las células que están en la periferia de los folículos (Figura 3-4A). Por otra parte, la viabilidad de folículos cerrados de rata en cultivo se conserva aún en presencia de NaI 1,0x10-3 M y sin TSH hasta los 6 días (Figura 3-4B), pero muchos tirocitos de folículos abiertos así como la mayoría de las células en agregados no son viables dado que se tiñen con azul Trypan. Es importante resaltar que el mismo comportamiento en términos de viabilidad celular se observa en los cultivos hechos con tiroides de cerdo.

Figura 3-4: Efecto de la dosis de I- sobre la viabilidad de tirocitos de rata. Los folículos se cultivaron por 6 días sin TSH en presencia de I- A 1,0x10-7 M y B 1,0x10-3 M. Nótese que los folículos que conservan su estructura cerrada son viables aún en presencia de dosis elevadas de I- mientras que las células de la periferia de los folículos (flechas) se tiñen con azul Trypan en dosis altas de I-. Barras 15 µm.

I-: 1,0 × 10-7 M I-: 1,0 x 10-3 MA B

25

3.2 Función: captación y organificación de I-

En los folículos de rata cultivados en presencia de NaI 0,2x10-9 M, los valores de captación y organificación del I- crecen linealmente hasta las 8 h (Figura 3-5). La relación de organificación sobre captación (O/C) es superior con TSH con respecto a los folículos cultivados sin TSH (Tabla 3-1). Figura 3-5: Efecto de la dosis de I- sobre su captación y organificación en folículos de rata en presencia y ausencia de TSH a corto tiempo. Los folículos de rata se mantuvieron en cultivo por diferentes tiempos (30 min, 3 y 8 h) bajo diferentes dosis de I-

: 0,2x10-9, 1.0x10-7, 1.0x10-5 y 1.0x10-3 M. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes por duplicado. Diferencias entre sin y con TSH *p<0,05 ***p<0,001.

*

***

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0 2 4 6 8

0

1,5

3

4,5

6

0 2 4 6 8

0

20

40

60

80

0 2 4 6 8

0

600

1200

1800

2400

0 2 4 6 8

I-C

apta

do

y O

rgan

ific

ado

(p

mo

les/

µg

DN

A)

Tiempo (h)

I- : 1,0x10-5 M I- : 1,0x10-3 M

I- : 1,0x10-7MI- : 0,2x10-9 M

***

*

26

La función de captación con 1,0x10-7 M se ve estimulada en los folículos cultivados con TSH sólo a los 30 min, después con y sin TSH la captación y organificación sigue la misma tendencia que con 0,2x10-9 M de NaI hasta las 8 h, en donde las relaciones de O/C se mantiene en valores cercanos al 80% (Figura 3-5, Tabla 3-1). Con I- 1.0x10-7 M, la captación y la organificación de I- es aproximadamente 60 veces superior a los valores encontrados con I- 0,2x10-9 M antes de la 8 h. En una incubación más prolongada sin TSH, los valores funcionales alcanzan su máximo a las 12 h y se mantienen en niveles cercanos hasta las 48 h (Figura 3-6), mientras que en presencia de TSH los valores continúan aumentando hasta las 48 h (Figura 3-6). Tabla 3-1: Porcentaje de yoduro captado que es organificado por folículos de rata en cultivo. Los resultados son el promedio de dos réplicas y representativos de 3 experimentos independientes.

NaI (M) 0,2×10-9

1,0×10-7

1,0×10-5

1,0×10-3

TSH (mU/mL) 0 0.1 0 0.1 0 0.1 0 0.1

Tiempo (h)

0.5 48 55 44 61 0 25 0 0

3 75 79 58 80 7 17 0 0

8 83 86 71 78 12 21 0 0

12 – – 68 72 – –

24 – – 89 86 – – 0 0

48 – – 87 84 – – 0 0

En los folículos cultivados con I- 1.0x10-5 M, los valores de captación aumentan en un orden de magnitud respecto a los valores encontrados con I- 1.0x10-7 M (Figura 3-5, Tabla 3-1). Sin TSH, la captación es máxima después de media hora mientras que con TSH se observa un incremento de los parámetros funcionales a las 8 h. Sin TSH, la relación O/C se incrementa a lo largo del tiempo desde un 0% a los 30 min hasta un 12% a las 8 h. En contraste, en presencia de TSH los valores de O/C se mantienen desde los 30 min hasta las 8 h en valores cercanos a un 20 % (Figura 3-5, Tabla 3-1). Con I- 1.0x10-3 M no se observa organificación para ninguno de los tiempos estudiados desde (Figuras 3-5 y 3-6) por lo que las relaciones O/C son nulas (Tabla 3-1). La captación aumenta hasta 3 h y luego se mantiene practicamente constante hasta 8 h (Figura 3-5). En la parte constante, la cantidad de I- captado es 300 veces superior a la observada con la concentración de 1,0x10-7 M. A las 8 h, la cantidad de I- total captado por los folículos es ligeramente superior con TSH que sin TSH (Tabla 3-1). Por otra parte, bajo una incubación prolongada con I- 1,0x10-3 M, los valores de captación sin TSH decrecen luego de las 24 h, mientras que en presencia de TSH disminuyen paulatinamente a partir las 12 h (Figura 3-6). Cabe resaltar que a partir de las 24 h la captación de I- sin TSH es mayor que con TSH (Figura 3-6).

27

Figura 3-6: Efecto de la dosis de I- sobre su captación y organificación en folículos de rata en presencia y ausencia de TSH a largo tiempo. Los folículos de rata se mantuvieron en cultivo por diferentes tiempos (12, 24 y 48 h) bajo diferentes dosis de I-: 1.0x10-7 M y 1.0x10-3 M. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes por duplicado.

En los folículos de cerdo cultivados con I- 1,0x10-9 M, la captación y la organificación de I-

crecen linealmente hasta las 12 h para luego decrecer sin encontrar diferencias significativas entre los tratamientos con y sin TSH (Figura 3-7). A la media hora, la relación O/C es del 30 %. Sin embargo, esta relación aumenta hasta valores comprendidos entre el 70 y el 80 % a las 12 h, manteniéndose en estos valores hasta las 24 h (Tabla 3-2). Con I- 1,0x10-7 M se observa un comportamiento lineal a lo largo de todo el tiempo (Figura 3-7). La cantidad de I- captado y la organificación aumentan entre 10 a 25 veces respecto a los valores funcionales de los folículos de cerdo cultivados con 1,0x10-9 M de I-. Al inicio de la incubación, en ausencia de TSH, la relación O/C es del 30 % al igual que la observada con 1.0x10-9 M de I-. Sin embargo, en presencia de TSH la relación O/C es significativamente mayor a los 30 min (70 %) en comparación con los folículos cultivados en ausencia de TSH (Tabla 3-2). Cabe resaltar que los valores máximos de organificación se alcanzan con una dosis de I- de 1.0x10-7 M; estos resultados funcionales son homologables a los obtenidos con folículos de rata. Con I- 1.0x10-3 M, los valores de captación se incrementan unos 3 órdenes de magnitud en relación con el tratamiento de I- 1,0x10-7 M (Figura 3-7). Sin TSH, la captación aumenta progresivamente hasta las 3 h manteniéndose en valores cercanos hasta las 48 h (Figura 3-7) mientras que con TSH la captación es significativamente mayor luego de

Tiempo (h)

0

0,45

0,9

1,35

1,8

0 12 24 36 48

I- 1,0x10-7 M

I-C

apta

do

y O

rgan

ific

ado

(pm

ole

s/µ

g D

NA

)

0

450

900

1350

1800

0 12 24 36 48

I- 1,0x10-3 M

28

las 3 h. Sin embargo, la organificación y la relación O/C son nulas a lo largo de todo el tiempo aún en presencia de TSH (Tabla 3-2). Cabe resaltar que, en relación con los folículos de rata, los folículos de cerdo no presentan una disminución en los valores de captación luego de las 12 ó 24 h (Figuras 3-6 y 3-7) Figura 3-7: Efecto de la dosis de I- sobre su captación y organificación en folículos de cerdo en presencia y ausencia de TSH. Los folículos de cerdo se mantuvieron en cultivo por diferentes tiempos (30 min, 3, 12 y 24 h) bajo diferentes dosis de I-: 1,0x10-8, 1,0x10-7 y 1.0x10-3 M. (n = 3 - 4) *p<0,05 **p<0,01.

0

2500

5000

7500

10000

0 8 16 24

0

0,004

0,008

0,012

0,016

0 8 16 24

0

0,9

1,8

2,7

3,6

0 8 16 24

Tiempo (h)

*

**

*I-:1,0x10-9 M I- : 1,0x10-7 M

I-C

apta

do

y O

rgan

ific

ado

(pm

ole

s/µ

g D

NA

)

**

I- : 1,0x10-3 M

29

Tabla 3-2: Porcentaje de yoduro captado que es organificado en folículos de cerdo en cultivo. Los resultados son representativos de al menos 3 experimentos.

NaI (M) 1×10-9

1,0×10-7

1,0×10-3

TSH (mU/mL) 0 1

0 1

0 1

Tiempo (h)

0,5 30 35

30 73

0 0

3 67 79

63 74

0 0

12 72 79

52 78

0 0

24 60 69

88 86

0 0

3.3 Expresión y localización subcelular del cotransportador NIS en folículos de rata

En folículos de rata cultivados por 12 h con I- 1,0x10-7 M, se observó un marcaje basolateral fuerte en la periferia de los tirocitos tanto en presencia como en ausencia de TSH (Figura 3-8A y 3-8B). Sin embargo, en ausencia de TSH la intensidad del marcaje es menor (Figura 3-8A) con respecto a los cultivos con TSH (Figura 3-8B). En los folículos cultivados con I- 1,0x10-3 M en ausencia de TSH se observó predominantemente un fuerte marcaje intracelular en algunos tirocitos, aunque también se observa un débil marcaje a nivel de la membrana basolateral en algunos folículos (Figura 3-8C). En presencia de I- 1,0x10-3 M y TSH (Figura 3-8D), se intensifica el marcaje basolateral con respecto al tratamiento sin TSH en los tirocitos de la mayoría los folículos observados, aunque también se puede observar un marcaje intracelular importante.

En folículos de rata cultivados por 48 h con 1,0x10-7 M, se observó predominantemente un marcaje intracelular sin TSH (Figura 3-9A), mientras que bajo la misma dosis de I-, en presencia de TSH, se observa a la proteína NIS principalmente en la membrana basolateral (Figura 3-9B). Por otra parte, en presencia de I- 1,0x10-3 M, la expresión de la proteína NIS a las 48 h de cultivo fue tan baja (aún en presencia de TSH) que se hizo necesario ajustar nuevamente los parámetros del microscopio confocal (intensidad del laser, ganancia del detector, tiempo de escaneo, etc.) con el fin incrementar la intensidad del marcaje. En los folículos cultivados con I- 1,0x10-3 M, la proteína NIS se observa en vesículas sin TSH (Figura 3-9C), mientras que en presencia de TSH se observa adicionalmente un marcaje debil hacia la membrana basal de algunos tirocitos (Figura 3-9D).

30

Figura 3-8: Inmunofluorescencia indirecta de la expresión y localización subcelular del cotransportador NIS. La proteína NIS (verde) se estudió en folículos de rata cultivados por 12 h bajo diferentes tratamientos: NaI 1,0x10-7 M, sin TSH (A) NaI 1,0x10-7 M, con TSH (B); NaI 1.0x10-3 M, sin TSH (C) NaI 1.0x10-3 M con TSH (D). Núcleos marcados con DAPI (Azul). Barras 10 µm.

A B

C D

31

Figura 3-9: Inmunofluorescencia indirecta de la expresión y localización subcelular del cotransportador NIS. La proteína NIS (verde) se estudió en folículos de rata cultivados por 48 h bajo diferentes tratamientos: NaI 1,0x10-7 M, sin TSH (A) NaI 1,0x10-7 M, con TSH (B); NaI 1.0x10-3 M, sin TSH (C) NaI 1.0x10-3 M con TSH (D). Núcleos marcados con DAPI (Azul). Barras 10 µm.

A B

C D

32

4. Discusión

4.1 Efecto del I- en la Morfología de folículos aislados.

Los resultados obtenidos con los ensayos de exclusión con azul tripan muestran que el I- en exceso no induce signos morfológicos de muerte celular en folículos cerrados de rata ni por un periodo de 6 d. Por otra parte, la citotoxicidad del I- si se presenta en folículos abiertos y en células aisladas con una concentración de I- de 1,0 x10-3 M que se evidencia desde las 12 h. In vivo, los signos de necrosis/apoptosis acompañadas de una fuerte respuesta inflamatoria ocurre en glándulas hiperplásicas provenientes de animales carentes de I- en la dieta que son sometidas a fuertes dosis de I-. Estos resultados se han encontrado en varias especies: hamsters (Follis, 1964), perros (Belshaw y Becker, 1973), ratas (Rognoni et al., 1987) y ratones (Mahmoud et al., 1986). En estas glándulas se presenta un elevado estrés oxidativo asociado con especies reactivas de oxígeno (ROS) que es sopesado por un incremento en los niveles de proteínas antioxidantes como glutatión peroxidasas (GPxs) y peroxiredoxinas. Sin embargo, bajo fuertes dosis de I-, estas proteínas antioxidantes no son suficientes para amortiguar completamente las especies reactivas de oxígeno en las glándulas hiperplásicas lo que induciría muerte celular observada (Poncin et al., 2008). Cabe resaltar que en condiciones deficientes de selenio también hay un incremento en el estrés oxidativo dado que algunas proteínas antioxidantes como las GPxs son dependientes de Selenio (Arthur y Beckett, 1999; Arthur et al., 1999). Es importante tener presente que el efecto citotóxico del exceso de I- no se observa en animales no carentes de I- (Mahmoud et al., 1986), incluso si se someten a fuertes dosis de I- durante tres semanas (Wolff et al., 1949). En este punto, nuestros resultados concuerdan con lo descrito in vivo. La cantidad de I- sería decisiva en la citotoxicidad siendo más importante en los animales carentes en I- que en los animales normales (Studer et al., 1974).

In vitro, se ha observado que el I- en concentraciones entre 0,01 y 1,0 mM produce una inhibición dosis-dependiente de la proliferación inducida con TSH en células FRTL-5 (Tramontano et al., 1989). Además, el I- inhibe el crecimiento dependiente del AMPc inducido por forskolina y (Bu)2cAMP y la proliferación inducida por IGF-I, que es independiente del AMPc. Sin embargo, la adición simultanea de metimazol al medio de cultivo impide la inhibición en la proliferación (Tramontano et al., 1989). Varios estudios indican que la susceptibilidad al I- varía entre modelos experimentales y entre especies, mostrando que en unos u otros casos, las células pueden exhibir las características de 2 fenómenos diferentes conduciendo a la muerte celular: apoptosis y necrosis (Golstein y Dumont, 1996).

33

Bajo condiciones experimentales cercanas a las nuestras en folículos humanos, Many et al (1992) observaron alteraciones ultraestructurales relacionadas con citotoxicidad por parte del I-, que involucran ataques de radicales libres y peroxidación de lípidos en folículos sometidos a NaI 1.0x10-3 M por 24 h sin y con TSH. Esta divergencia respecto a nuestros resultados puede deberse a la diferencia en el origen de los folículos o por su estado durante el cultivo. Una mayor sensibilidad al I- en los tirocitos humanos podría estar relacionada con variaciones ligadas a la especie. Por otra parte, cabe anotar que la mayoría de los folículos humanos aislados por Many están abiertos al inicio del cultivo y se ignora la proporción de aquellos que son re-sellados con un día de cultivo (Many et al., 1992); por lo que la susceptibilidad al I- podría estar relacionada con la estructura abierta del folículo, situación que permite al I- incidir directamente sobre el polo apical de los tirocitos.

Ciertas experiencias muestran que el I- presenta efectos diferentes cuando este está en contacto con el polo basal o con el polo apical de las células foliculares. Si la concentración de I- es 10-6 M, en presencia de TSH, folículos normales provenientes de cerdo, pierden su forma redondeada y su potencial de membrana se reduce fuertemente. Si la polarización de los folículos se invierte, bajo las mismas condiciones descritas, el potencial de membrana, reducido a la salida, no disminuye (Takasu et al., 1985). La necrosis provocada por un exceso de I-, en los folículos humanos abiertos, podría provenir de una modificación del pH intracelular por la exposición de los polos apicales al NaI.

La ausencia de endocitosis en los folículos incubados durante 8 h con una concentración de NaI de 10x10-5 M con o sin TSH y su presencia con una concentración de 1,0x10-3 M es difícil de explicar. Con 1,0x10-5 M, puede que exista una molécula yodada inhibitoria, que no puede producirse con 1,0x10-3 M, debido a que la incorporación de I- a las proteínas está completamente bloqueada.

4.2 Efecto del I- y de la TSH sobre la cantidad de NIS y su

distribución subcelular en folículos de rata in vitro.

Con el fin de evaluar el efecto de la TSH y del I- sobre la cantidad y la distribución subcelular de la proteína NIS in vitro, muestras de folículos de rata se incubaron por 12 (Figura 3-8) y durante 48 h (Figuras 3-9) en ausencia y en presencia continua de 0,1 mU/mL de TSH bajo una dosis fisiológica y una excesiva de I-. En los folículos cultivados por 12 h con I- 1,0x10-7 M sin y con TSH, se observó un fuerte marcaje basolateral, siendo de mayor intensidad en presencia de TSH (Figuras 3-8A y 3-8B). Sin embargo a las 48 h, bajo la misma concentración de I-, se observa un débil marcaje intracelular en vesículas de NIS en ausencia de TSH, mientras que en presencia de TSH aún es visible un fuerte marcaje basolateral acompañado de un importante marcaje en vesículas. Los resultados muestran que la TSH es capaz de modular tanto la cantidad relativa de NIS entre tratamientos así como su localización subcelular en los folículos de rata. Los resultados obtenidos son semejantes a los encontrados en células FRTL-5, en donde se demostró que la síntesis de novo (Kogai et al., 1997), el tiempo de vida media, el direccionamiento y/o retención del cotransportador NIS hacia la membrana plasmática y la fosforilación de la proteína requiere de la TSH (Riedel et al., 2001). Sin embargo, cabe anotar que en este tipo de células no se pueden diferenciar dominios de membrana apical ni basal. Por otro lado, el hecho de ser visible un marcaje basolateral de NIS en ausencia de TSH a las 12 h puede deberse a la estimulación natural que recibió la

34

glándula en los animales antes de ser disectada. La proteína NIS posee una vida media de 3 días sin estimulación por TSH y 5 días bajo estimulación (Riedel et al., 2001), por lo que su presencia es de esperarse por unos días luego del sacrificio del animal. Con I- 1,0x10-3 M se observan diferencias entre los tratamientos sin y con TSH. La intensidad de los inmunomarcajes a las 48 h con respecto a los tratamientos con I- 1,0x10-7 M y 1,0x10-3 M a las 12 h son menores. Estos resultados son coherentes con resultados previos realizados en la línea celular FRTL-5, en los que se encontró que el I-

en exceso induce una disminución del 50 y 78 % de la proteína NIS a las 24 y 48 h respectivamente (Eng et al., 2001). En este mismo trabajo, Eng et al encontraron que la disminución de la proteína NIS no está asociada con una diminución en la síntesis de novo de la proteína, sino con un aumento en la velocidad de degradación de NIS. Adicionalmente, se observó que aún bajo un exceso de I-, la TSH tiene incidencia sobre la localización de la proteína NIS a las 12 h con respecto al control (Figura 3-8C y 3-8D). Sin embargo, a las 48 h el efecto de la TSH en la localización basolateral de NIS no es tan notorio si se compara con los resultados encontrados con I- 1,0x10-7M. Varios estudios muestran que en general los efectos de la TSH sobre la fisiología de la glándula tiroides se ven reducidos en presencia de dosis altas de I- llegando a tener roles antagónicos. Así, en ratas hipofisectomizadas se encontró el I- inhibe el incremento del AMPc estimulado por la TSH (Rapoport et al., 1975). En ratones, el I- inhibe la formación de AMPc en la tiroides de ratón (Hashizume et al., 1976), lo cual podría explicar el bajo nivel de NIS durante el escape del efecto Wolff-Chaikoff. Hashizume et al encontraron que el I- inhibe el incremento en el eflujo de Ca2+ inducido por la TSH (Hashizume et al., 1984). Corvilain reportó que el I- disminuye la generación de IP3 estimulada con la TSH y este efecto puede conducir a la disminución en la generación de peróxido durante el efecto Wolff-Chaikoff (Corvilain et al., 1994). Adicionalmente, varios estudios muestran que la organización tridimensional de los tirocitos en folículos ejerce un papel en la regulación de NIS, encontrándose que la expresión de la proteína y de su transcripto es mucho mayor en folículos tiroideos reconstituidos comparado con células en monocapa, lo que sugeriría que en la activación del gen NIS puede estar involucrados, además de otros factores, factores regulatorios cuya síntesis o actividad se dispara por interacciones célula-célula (Bernier-Valentin et al., 2006). Estos estudios justifican la utilización de los modelos de folículos aislados en el estudio de proteínas en cuya regulación se encuentre intrínseca o extrínsecamente relacionada la estructura tridimensional del folículo.

4.3 Efecto del I- y de la TSH sobre las funciones de

captación y organificación en folículos aislados.

Se sabe que la disposición tridimensional de las células en folículos no es necesaria para que se dé la captación de I - dado que está existe aún en la tiroides fetal antes de la formación del lumen folicular (Nagataki, 1964 Sherwin 1974, Egoo 1985 Hrollman 1986) así como se presenta en cultivos de tirocitos primarios (Kogai et al., 2000; Saito et al., 1997) y en células que crecen en monocapa como las FRTL-5 (Grollman et al., 1986; Weiss et al., 1984). Sin embargo, en el proceso de organificación de I-, y por tanto en la producción de las hormonas tiroideas, es indispensable el mantenimiento de la estructura folicular en cultivo. Las relaciones de O/C de los folículos obtenidos que llegan a alcanzar valores cercanos al 80 % en condiciones moderadas de I-, la

35

gran proporción de marcajes en el lumen encontrado en las autoradiografías con I- 0,2x10-9 M, los marcajes basolaterales de la proteína NIS con lo cual se comprueba que es posible conservar separados los dominios membranales apical y basolateral, demuestran que en el proceso de aislamiento es posible preservar folículos cerrados en gran proporción. Sobre folículos de rata, la TSH no altera la relación O/C, salvo a la media hora. Estos valores son comparables con los publicados por Karlsson (Karlsson et al., 1982) y Gartner (Gartner et al., 1985) que observaron bajo condiciones análogas 18 o 15 % de organificacón sin TSH y 31 o 50 % con TSH. In vivo, la duración y la magnitud del efecto Wolff-Chaikoff depende indirectamente de la concentración de I- en la sangre (Wolff y Chaikoff, 1948) y directamente de la concentración intratiroidal de I- (Raben, 1949). Nuestros resultados en rata muestran que el efecto inhibitorio del I- sobre la organificación es total con una concentración de 1,0×10-

3M y parcial 1,0×10-5M. Una observación interesante es el levantamiento parcial de la inhibición por la TSH con una concentración de I- de 1,0x10-5 M. Este resultado confirma hallazgos de modelos in vivo (Rosenfeld y Rosenberg, 1966) e in vitro sobre trozos de tejido (Rosenberg, 1981). Esta inhibición en la organificación, correspondiente al efecto Wolff-Chaikoff, puede estar relacionada con la producción de yodolípidos como el delta-IL (Boeynaems y Hubbard, 1980) y el 2-IHDA (Pereira et al., 1990) entre otros, los cuales han sido postulados como mediadores del efecto del I-. El delta-IL se produce a partir del ácido araquidónico en tiroides de rata in vitro. Esta reacción no se da en presencia de metimazol, por lo que la formación de esta yodolactona debe ser catalizada por la TPO. Además existe evidencia que indica que esta yodolactona podría participar en la mediación del efecto inhibitorio del I- sobre la adenilato ciclasa o en la limpieza del exceso de I- (Boeynaems y Hubbard, 1980). La síntesis de la delta-IL en tiroides in vitro se estimula por un aumento en el Ca2+ intracelular (Boeynaems et al., 1981). En folículos aislados de tiroides de cerdo, la delta-IL inhibe de manera dosis dependiente la proliferación de tirocitos inducida por el EGF con concentraciones muy bajas de la yodolactona (entre 0,1 y 1,0 µM). Además, los autores en este estudio encontraron que la delta-IL no altera la concentración de AMPc basal ni el inducido con la TSH, sugiriendo que esta inhibición no es provocada por una disminución en el AMPc (Dugrillon et al., 1990). Drugrillon y Gartner mostraron que las yodolactonas disminuyen la proliferación inducida por EGF, la generación de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y aumenta la apoptosis en folículos de tiroides de cerdo (Dugrillon y Gartner, 1995).

Por otro lado, el 2-IHDA es uno de los principales yodolípidos identificado en glándulas tiroides de rata, perro y caballo que se produce bajo altas dosis de I- (Pereira et al., 1990). El 2-IHDA es capaz de inhibir in vitro la producción H2O2 por parte de la NADPH oxidasa, así como la organificación del I- proteínas catalizada por la TPO sin inhibir la oxidación de I- por parte de esta enzima (Ohayon et al., 1994). Además, el 2-IHDA también bloquea la cascada de la PLC y la actividad de la adenilato ciclasa estimulada por la TSH (Panneels et al., 1994); vías de señalización importantes en la proliferación, crecimiento y función de la tiroides. Adicionalmente, partiendo de los estudios de Corvilain en los que se encontró que durante el efecto Wolff-Chaikoff existe una inhibición de la generación de H2O2 (Corvilain et al., 1988), Morand y et al encontraron que una especie oxidada de I- inhibe la disponibilidad de la proteína madura Duox2 a un nivel posttranscripcional, con lo cual se inhibiría la generación de H2O2 (Morand et al., 2003).

36

Uno de los resultados más interesantes que se encontró en folículos de rata es la disminución en la acumulación de I- que ocurre a partir de las 12 a 24 h en presencia de I-

1,0x10-3 M, la cual no ocurre en los cultivos con I- 1,0x10-7 M. Esta disminución puede explicarse con las imágenes obtenidas por microscopia confocal para cotransportador NIS, en los que se observó que el I- en exceso induce una disminución tanto en la cantidad misma de la proteína como su localización dentro de la membrana basolateral. Paradójicamente, nuestros resultados indican que esta disminución es más marcada en presencia de 0,1 mU/mL de TSH. Por otro lado, es importante tener presente que la disminución en el transporte de I- no se observó en folículos aislados de cerdo para los tiempos estudiados. Cabe destacar que todos estos resultados son coherentes con experimentos realizados in vivo (Braverman y Ingbar, 1963; Eng et al., 1999). Sin embargo, se requieren otros experimentos funcionales sobre folículos in vitro por tiempos más largos para comprobar si la autoregulación evoluciona hacia una adaptación en el transporte de I- que disminuya la tasa de acumulación intratiroidea de este y que provoque un levantamiento de la inhibición en la organificación.

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5. Conclusiones

El modelo de cultivo de folículos cerrados mantiene las características morfológicas propias de la glándula in vivo para todas las dosis de I- evaluadas, como son la polaridad de los dominios de membrana, la posición relativa de los organelos, la separación del lumen y del exterior del folículo y los fenómenos relacionados con el tráfico vesicular. Adicionalmente, existe evidencia preliminar de que pueden existir alteraciones en la fusión entre las gotas de coloide con los lisosomas. El I- en las dosis evaluadas no indujo signos de muerte celular ni alteraciones ultra-estructurales importantes en folículos cerrados. Sin embargo, parece existir una relación entre los modelos de cultivo “abiertos” (folículos abiertos y tirocitos aislados) con su susceptibilidad al I- en dosis excesivas. Los folículos de rata y cerdo reproducen el efecto Wolff-Chaikoff; adicionalmente, en los cultivos de rata se reproduce la disminución en el transporte de I- asociado con el “escape” de este efecto, tanto en presencia como en ausencia de TSH. Esta disminución in vitro en el transporte de I- probablemente está relacionada con mecanismos de internalización del cotransportador NIS así como con una disminución en la cantidad de dicho transportador. Además, en cultivo, la TSH puede estimular alteraciones en la morfología y función de los tirocitos aún en presencia de I-, de manera similar a como ocurre in vivo.

Por todo lo anterior, el modelo de cultivo de folículos cerrados reproduce varios resultados que han sido reportados en glándulas in vivo, demostrando que la estructura tridimensional de folículos es muy importante en la fisiología de la glándula tiroides; esto hace necesaria una adecuada selección del tipo de modelo a utilizar en un estudio particular.

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