1

Análisis comparativo del sistema inmune de los anfibios, con especial atención a la

respuesta inmune a la quitridiomicosis

Maria Paula Rueda Mejía

1. Introducción

Durante las últimas décadas se ha presentado un declive en las poblaciones de anfibios alrededor del

mundo, donde alrededor del 40% de las especies presenta una disminución en sus poblaciones, llevando a

muchas especies al riesgo de extinción (Stuart et al., 2004), entre las razones se ha propuesto la pérdida

de hábitat y los cambios climáticos. Otro de los motivos importantes para este declive es la

quitridiomicosis, una enfermedad infecciosa causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis

(Berger et al., 1998; Lips et al., 2006) .

Para muchas especies y poblaciones de anfibios la mortalidad a causa de este patógeno es muy alta,

llegando a diezmar poblaciones o desaparecerlas en pocos años (Lips et al., 2006), en estudios donde se

han realizado un conteos de individuos antes y después de la detección de Bd en el área se observa un

declive de varios miles de individuos en especies susceptibles en una localidad a solo decenas en cuestión

de 4-5 años (Vredenburg et al., 2010 ). Bd tiene un propágulo flagelado llamado zoospora (Longcore et

al., 1999), este ataca las células epidérmicas de los anfibios, se interna en la piel queratinizada de las

ranas, se enquista y allí se reproduce y produciendo más zoosporas. Estas son liberadas al medio y pueden

reinfectar al mismo individuo o propagarse a individuos cercanos. Al enquistarse en la piel produce

hiperqueratosis, pérdida de las funciones de la piel, como la osmoregulación y finalmente la muerte

(Voyles et al., 2009).

El conocimiento de la cantidad de especies que presentan alta mortalidad y declives poblacionales

causados por Bd ha llevado a entender la importancia de conocer mejor las dinámicas de esta enfermedad.

Se han reportado especies de anfibios resistentes y susceptibles a la infección; algunas especies que no

presentan signos de infección, otras presentan signos pero no síntomas de enfermedad, algunas presentan

una enfermedad pero no se da un declive poblacional y otras presentan altas tasas de mortalidad (Alford

& Richards, 1999; Parker et al., 2002; Kriger & Hero, 2006; Woodhams et al., 2007).

Se han propuesto varias hipótesis para explicar este fenómeno, algunas relacionadas con los hábitos

predominantemente terrestres o acuáticos de las diferentes especies, y otras con la virulencia de las

diferentes variedades del patógeno (Berger et al., 2005) y/o diferencias en la respuesta inmune del

2

hospedero. Es posible que todas estas interactúen para crear la variación en la susceptibilidad ante la

infección por Bd.

Para evaluar la importancia de la respuesta inmune del hospedero se han realizado estudios comparativos

de la respuesta inmune entre especies resistentes y susceptibles en estado de infección por Bd, con el

objetivo de encontrar los factores que afectan la sensibilidad a la infección. La mayoría de estos se

concentran en el aislamiento y comparación de la actividad de péptidos antimicrobianos frente al hongo ,

otros estudian de la misma forma la actividad de lisozimas y algunos en la respuesta mediada por

linfocitos, usando radiación para eliminar esta respuesta y comparando la eficacia de la defensa con y sin

actividad de linfocitos (Ramsey et al., 2010).

A partir el desarrollo de las nuevas tecnologías de secuenciación se han empezado a realizar estudios de

expresión genética diferencial frente a la infección por Bd, secuenciando el proteoma o transcriptoma de

los tejidos involucrados en la respuesta inmune. Tras obtener las secuencias de todas las proteínas o

transcritos presentes en la muestra en la mayoría de los casos se realiza una búsqueda en bases de datos de

estas secuencias, con el objetivo de identificar la secuencia por similaridad con otra ya identificada y

caracterizada en bases de datos. En la mayoría de los casos no hay otro análisis que se realice con las

secuencias que no fueron identificadas y estas quedan fuera del análisis.

Al realizar una búsqueda en bases de datos a partir de transcritos obtenidos en la piel de anuros se observa

que solo entre un 5% y 10% de los transcritos con homología, relacionados con el sistema inmune,

corresponden a proteínas caracterizadas en anfibios. Esto es claramente un efecto de la extensiva

investigación sobre el sistema inmune humano y los modelos animales usados en investigación médica, la

rata parda (Ratus novergicus) y el ratón doméstico (Mus musculus), las tres especies más representadas en

estas búsquedas en bases de datos. Esta situación plantea el problema de saber hasta que punto las

secuencias de aminoácidos en bases de datos representan los genes expresados por el sistema inmune de

la piel de una especie de anfibio estudiada.

Este documento revisa la información existente hasta el momento sobre el sistema inmune de los anfibios,

cuáles proteínas de que funciones del sistema están caracterizadas y secuenciadas y, de aquellas funciones

no estudiadas a profundidad en anfibios, las diferencias que existen dentro de los vertebrados y entre

mamíferos y anfibios en el sistema inmune. Esto para conocer si hay una posibilidad real de identificación

de las proteínas de una función inmune a partir de una muestra de piel de un anfibio así no estén

caracterizadas dentro de este grupo.

3

2. Sistema inmune innato

El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra organismos infecciosos, este tiene

mecanismos que reconocen patrones generales de estos organismos, no responden específicamente frente

a cada patógeno, y la mayoría de sus componentes están presentes, aunque algunos en conformación

inactiva, desde antes de que ocurra la infección (Goldsby, 2002).

Este sistema está compuesto por células fagocíticas que introducen material extracelular, que puede ser

patógenos o partes de ellos, y lo degradan y varias sustancias antimicrobianas.

2.1.Células fagocíticas y presentadoras de antígenos

La fagocitosis es el proceso de ingestión de material extracelular por parte de una célula, durante este

proceso la membrana de la célula fagocítica se extiende alrededor del material que será fagocitado, que

puede ser un patógeno o partes de el, lo engolfa y forma una vesícula que incluye el material, llamada

fagosoma (Goldsby, 2002). Estas células no solo se caracterizan por esta acción sino por la presentación

del antígeno fagocitado en la membrana, por medio de una molécula de membrana llamada MHC. Tras la

fagocitosis, dentro del fagosoma, la célula procesa el antígeno degradándolo, al unirse a un lisosoma que

contiene enzimas hidrolíticas. La mayoría de los productos de esta degradación del antígeno son

expulsados de la célula por exocitosis, pero algunos pueden formar un complejo con un MHC de clase II

y ser expuestos en la membrana para activar células del sistema inmune adaptativo (Goldsby, 2002). Las

células dendríticas y los macrófagos tienen esta función presentadora, mientras que los neutrófilos,

eosinófilos y basófilos solo realizan el proceso de fagocitosis.

Estas células están presentes en peces teleósteos y se han encontrado células con actividad fagocítica, así

como células con moléculas MHC en membrana y morfologías celulares similares a las observadas en

mamíferos de estas células en las especies estudiadas de todos los grupos de vertebrados.

Dentro de los anfibios, en Xenopus laevis y el género Rana se han identificado células presentadoras de

antígeno, que expresan en su membrana MHC de clase II, con morfología dendrítica, similares a CDs y a

las denominadas en mamíferos como células de Langerhans (Du Pasquier & Flajnik, 1990; Carrillo-Farga

et al., 1990). Se ha observado que los procesos de maduración y las células progenitoras son similares a

los que ocurren en mamíferos. Igualmente se han encontrado macrófagos en la piel de renacuajos de

Xenopus (Lehman, 1953)

4

2.2. MHC

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por su siglas en inglés) es una familia de proteínas de

membrana cuya función es presentar un antígeno procesado al interior de la célula que lo expresa

(Goldsby, 2002). Estas se dividen en dos grupos, los MHC de clase I, expresadas por casi todas las

células somáticas del organismo cuando están infectadas por un microorganismo, y los MHC de clase II,

expresadas por un grupo de células llamadas presentadoras de antígeno, que incluyen, pero no se limitan,

a células dendríticas (CDs), macrófagos y células o linfocitos B (Carvalho et al., 2009).

Ambos tipos de MHC están presentes en todos los vertebrados mandibulados (Flajnik & Kasahara, 2001).

Los genes que codifican para estas proteínas son similares y están conservados al comparar grupos, sin

embargo hay diferencias en la organización de estos. Se cree que hubo un rearreglo de los genes

involucrados en el procesamiento de antígeno y la expresión de MHC, bastante ligados en el genoma. En

mamíferos placentarios los genes encargados del procesamiento de antígenos de clase I al interior de las

células están físicamente entre los que codifican para el mismo proceso en clase II y para el MHC de

clase II como tal, mientras que el gen de MHC clase I se encuentra separado (Kaufman, 1999). En los

demás grupos de vertebrados, incluyendo anfibios, los genes de procesamiento de antígeno y expresión de

MHC de clase I están ligados entre si, al igual que los de clase II, se puede decir que el estado primitivo

de esta organización es el que presentan peces, anfibios y reptiles, y que en mamíferos se dio esta

translocación de genes de procesamiento clase I (Ohta et al., 2006).

En Xenopus el MHC está muy bien caracterizado (Flajnik & Du pasquier, 1990), este funciona igual al de

mamíferos, los genes que codifican para los distintos componentes de estas proteínas, clase I y clase II, en

otros vertebrados fueron buscados en el genoma de Xenopus y se encontraron 110 genes con alta

similaridad, así que se puede decir que el MHC y los genes relacionados con su producción y regulación

son conservados y funcionan en anfibios igual que en otros vertebrados (Ohta et al., 2006).

2.3.Respuesta innata molecular: Sistema complemento y lisozimas

El sistema complemento es una función del sistema inmune innato compuesta por más de 30 proteínas

séricas solubles con capacidad de unión a membrana celular, estas se encuentran en un estado inactivo,

distintos mecanismos activan el sistema, haciendo que estas proteínas tengan la capacidad para dañar las

membranas biológicas e intercalarse en ellas; destruyendo o facilitando la eliminación del patógeno por

5

medio de células fagocíticas (Goldsby, 2002). Además estas proteínas interactúan para dirigir la

activación de los demás procesos inmunes, tanto innatos como adaptativos, donde estos existen (Goldsby,

2002).

Las proteínas del sistema complemento pueden actuar como mediadores en la cascada de regulación del

sistema o ser parte de un complejo de ataque a las membranas de los microorganismos patógenos. Tanto

los mediadores como las proteínas del complejo están identificadas y su secuencia y función dentro de la

formación del complejo son conocidas.

El sistema complemento puede ser activado por la unión entre un antígeno y un anticuerpo, o

directamente por proteínas características de las membranas de los patógenos (Goldsby, 2002) y regula

otras funciones del sistema inmune como la inflamación y la acción de linfocitos B y T (Carroll, 2004).

Al comparar las proteínas de este sistema con las de otros organismos se ha encontrado que el sistema

complemento está presente en organismos con sistemas inmunes rudimentarios, en los que no hay

presencia de sistema inmune adaptativo. El gen codificante para la proteína C3, componente central del

sistema complemento, está presente en todos los deuterostomados (Miyazawa, 2001), dada la importancia

de esta proteína se la puede considerar un buen indicativo para la presencia de sistema complemento en

cualquier organismo en que se encuentre. Las proteínas del sistema complemento son entonces bastante

conservadas, así como la forma en la que interactúan.

Al realizar búsquedas de estos genes, caracterizados en mamíferos, en los genomas de pollo, Xenopus,

peces óseos y algunos invertebrados se ha encontrado que los vertebrados comparten un set de genes del

sistema complemento prácticamente igual, con alta homología entre grupos (Nonaka & Kimura, 2006).

En Xenopus varios de los componentes del sistema han sido identificados, aislados y caracterizados,

aunque no todos los componentes se han encontrado se asume que están presentes dado que es un proceso

altamente conservado dentro de los vertebrados (Mo et al., 1996).

Las lisozimas son una familia de proteínas solubles hidrolíticas presentes en secreciones mucosas y en las

lágrimas (Goldsby, 2002), estas tienen la capacidad de romper enlaces específicos en los peptidoglicanos

de la pared celular de las bacterias (Nonaka & Kimura, 2006). Las lisozimas están presentes en todos los

grupos de organismos, en animales se han identificado tres tipos de lisozimas, que difieren en secuencia

de aminoácidos y propiedades bioquímicas y enzimáticas: la tipo-c, cuyo modelo es la presente en claras

6

de huevo de pollo, la tipo-g, descrita en claras de huevo de ganso y la tipo-i, encontrada en insectos y

presente en varios grupos de invertebrados, no se encuentra en cordados (Callewaert & Michiels, 2010).

Dentro de los vertebrados la investigación se ha enfocado a la identificación y caracterización de

lisozimas de mamíferos y aves únicamente, la información disponible sobre otros grupos se limita a

comparaciones con estos.

El conocimiento de los patrones de expresión de lisozimas en anfibios es muy limitado, ya que la

información está basada en reconocimiento de proteínas identificadas previamente en otros grupos de

organismos, una lisozima tipo-c fue aislada en Bufo andewsi (Zhao et al., 2006), no se han identificado

lisozimas tipo-g en anfibios. En Rana pipiens y Bufo boreans se han encontrado indicios de presencia de

lisozimas en secreciones, para esto se han aislado proteínas que tienen alta homología con lisozimas

identificadas de otros organismos (Zhao et al., 2006), sin embargo no se han realizado estudios donde se

aíslen proteínas de secreciones mucosas en busca de actividad microbiana y potenciales lisozimas

específicas de anfibios. Teniendo en cuenta que hay una homología baja entre las clases de lisozimas que

se han encontrado en la naturaleza, y que dentro de cada clase hay una alta variabilidad, es posible que la

identificación por medio de búsqueda de homología con proteínas descritas en organismos de otros

grupos deje otras clases de lisozimas sin encontrar y se esté perdiendo potencial información específica

sobre el componente humoral de la respuesta inmune innata en las secreciones mucosas de los anfibios.

Tanto los componentes receptores de sistema complemento como las lisozimas tienen capacidad de

reconocimiento de patrones moleculares generales de los microorganismos patógenos.

2.4. Receptores tipo Toll (TLRs)

Los TLRs son una familia de proteínas de membrana que reconocen patrones moleculares generales

conservados en microorganismos, estos patrones pueden ser lipoproteínas, lipopolisacáridos, flagelina y

ácidos nucléicos (Miyake, 2007). Estos receptores se encuentran en células presentadoras de antígeno,

células dendríticas y macrófagos, y activan en estas una cascada de regulación que activa la producción

de varios mediadores de la respuesta inmune innata: citoquinas, quimioquinas, interferones, o que regulan

la respuesta adaptativa (Kawai & Akira, 2007).

Los TLRs son un mecanismo conservado en animales, estos cambian dentro de los vertebrados de

acuerdo con los ligandos de los microorganismos patógenos que los afectan. Por esto las regiones

7

intermembranal y citoplasmática del receptor son conservadas entre los grupos de vertebrados, pero los

sitios de unión extracelulares son variables (Zhu et al., 2013).

En mamíferos se han identificado seis tipos de TLRs en vertebrados, en la mayoría de las especies

estudiadas se ha encontrado por lo menos un representante de cada uno de los tipos, donde algunos de los

seis son más conservados y otros tienen gran cantidad de modificaciones en cada especie (Roach et al.,

2005).

El funcionamiento de los TLRs no ha sido estudiado en anfibios, pero se han realizado búsquedas de

genes que codifican para TRLs en humanos en el genoma de Xenopus tropicalis, alrededor de 20 tuvieron

un alta homología, incluyendo 9 péptidos con actividad antifúngica en la piel de mamíferos (Ishii et al.,

2007). Por lo demás no hay información suficiente para saber si los TLRs presentes en anfibios tienen

homología con las secuencias en bases de datos ya que es posible que los anfibios tengan TLRs

específicos con estructuras significativamente diferentes a los descritos hasta el momento en otros grupos.

2.5. Péptidos antimicrobianos (AMPs)

Los péptidos antimicrobianos son usualmente moléculas hidrofóbicas y catiónicas que, en un ambiente de

membrana biológica pueden formar hélices α y romper estas membranas de los microorganismos

patógenos (Yeaman & Yount, 2003).

Aparte de estas características generales no hay muchas similaridades en los AMPs presentes en la piel de

los anfibios. Al comparar especies cercanamente relacionadas hay semejanzas en el grupo de AMPs

presentes en la piel y otras mucosas, en general comparten familias de proteínas, pero no se ha encontrado

el mismo péptido en dos especies diferentes (Conlon et al., 2004). Esto implica que lo más probable es

que los AMPs de una muestra no sean detectados si se realiza una búsqueda basada en bases de datos, a

menos que los péptidos particulares de la especie estudiada estén aislados, caracterizados y secuenciados.

8

Tabla 1: Cantidad de péptidos antimicrobianos de la piel de anfibios descritos por especie.

Algunos de los AMP s de la piel se han aislado y caracterizado en los géneros Bombina, Xenopus, Rana,

Amolops, Hylarana, Phyllomedusa, Litoria, Limnonectes, Leptodactylus, Pseudis, Bufo e Hyla (Ver tabla

1) , hay una cobertura filogenética mayor en la caracterización de estos péptidos que de cualquier otra

función inmune en anfibios, la demás funciones solo se han estudiado en los géneros Xenopus, Bufo y

Rana. Al mismo tiempo esta es la función para cuyas proteínas están menos conservadas, lo cual hace

que, a pesar de la cobertura a nivel taxonómico, sea muy poco probable que los péptidos de la piel de un

anfibio sean identificado a partir de una búsqueda en bases de datos.

9

Tabla 1: Continuación

En los últimos años, con el desarrollo de la secuenciación de nueva generación se ha empezado a utilizar

la peptidómica para encontrar nuevos péptidos antimicrobianos (He et al., 2013), esto ha producido una

gran cantidad de datos en poco tiempo, y cada vez más péptidos nuevos se descubren con una sola

muestra de tejido.

Para enfrentar este problema al tener datos transcriptómicos se podría realizar una búsqueda

disminuyendo el porcentaje de identidad mínimo, o hacer un análisis diferente, buscando genes

candidatos.

3. Sistema inmune adaptativo

El sistema inmune de los vertebrados mandibulados es bastante complejo, tiene la capacidad de reconocer

patógenos y activar una respuesta específica para cada uno de ellos. Además este sistema genera una

memoria, que permite una eliminación de un patógeno específico más efectiva y rápida.

El sistema inmune adaptativo depende directamente de la capacidad de generar una gran diversidad de

receptores de antígenos, llamados inmunoglobulinas, expresados en la membrana celular de los linfocitos.

Cada uno de estas inmunoglobulinas es específica para un antígeno particular, cuando lo detecta, la célula

10

que lo expresa dispara la respuesta adaptativa donde más inmunoglobulinas específicas para el antígeno

se producen (Burnet, 1959), pero ya no como receptores de membrana sino en forma de secreción, en esta

conformación las inmunoglobulinas tienen el nombre de anticuerpos.

El mecanismo principal por medio del cuál se produce la gran diversidad de inmunoglobulinas es la

recombinación (Tonegawa, 1976), el mecanismo de recombinación que se ha descrito en mamíferos es

compartido y se ha encontrado en todos los grupos de vertebrados mandibulados. Un mecanismo de

recombinación diferente, que parte de genes distintos y es mediado por moléculas diferentes, se ha

encontrado en agnatos, pero no hay algo similar en los demás metazoos. Estos únicamente cuentan con un

sistema inmune innato. Se cree los sistemas de recombinación presentes en vertebrados mandibulados y

agnatos surgieron de forma independiente y son una convergencia evolutiva (Cooper & Alder, 2006).

3.1. Los anticuerpos

Las inmunoglobulinas, llamadas anticuerpos cuando son secretadas en su forma soluble, son moléculas

compuestas por dos cadenas pesadas y dos livianas. Las últimas tienen un sitio de unión al antígeno en el

extremo amino terminal, que es el que interactúa con la molécula del patógeno o sustancia para la cuál es

específico dicho anticuerpo.

Las inmunoglobulinas, tanto secretadas como en forma de receptor de membrana en linfocitos, son una

innovación de los vertebrados (Manning, 1979), presente en peces teleósteos, anfibios, reptiles, aves y

mamíferos.

El mecanismo por el cuál se produce el gran repertorio de inmunoglobulinas, la recombinación de genes

VSJ y VJ mediada por RAG, está presente en todos los vertebrados mandibulados (Litman et al., 1999;

Flajnik and Kasahara, 2001). Un mecanismo similar se encuentra en vertebrados no mandibulados, donde

se produce una gran diversidad de linfocitos, cada uno expresando un receptor con especificidad para un

antígeno diferente, pero los genes que codifican para estos receptores son diferentes, así como la

estructura del receptor (Pancer et al., 2004; Alder et al., 2005).

Hay varias clases de inmunoglobulinas llamadas isotipos (Ver Fig. 1), que difieren entre sí en la

estructura de la cadena pesada. El isotipo más común y con mayor concentración en suero es el IgM, su

acción es sistémica y se encuentra en suero de todos los vertebrados. En mamíferos y aves encontramos el

isotipo IgA, posteriormente se encontró en otros reptiles (Flajnik & Kasahara, 2010), de bajo peso

11

molecular, principalmente en secreciones mucosas, se cree que precisamente el peso molecular es la razón

evolutiva para la existencia de este isotipo, ya que esto facilitaría el movimiento hacia las mucosas y fuera

del sistema vascular en vertebrados terrestres, que tienen mayor presión hidrostática y osmótica en las

venas y arterias (Manning & Turner, 1976).

En sangre en vertebrados en general se ha observado que al aumentar la cantidad de anticuerpos hay una

mejoría en la asimilación de productos extraños, estos desaparecen de la sangre más rápida y

eficientemente.

En peces teleósteos se han identificado tres isotipos de inmunoglobulinas: IgM, IgD e IgT/Z (Fletcher &

Grant, 1969), con gran prevalencia de IgM en plasma y piel, la función de IgD en peces es poco conocida

y no se ha identificado en piel, IgT, por otro lado parece tener una función importante en la respuesta

inmune en la mucosa intestinal, análogamente al IgA de mamíferos, siendo IgM encargado de inmunidad

de forma sistémica. IgT parece ser el isotipo de inmunoglobulina más antiguo encargado particularmente

de inmunidad en mucosas. El tejido linfoide asociado a la piel en peces es más similar al asociado al

intestino en mamíferos, por su condición de mucosa (Turner & Manning, 1974).

Solo un reptil no ave ha sido estudiado en busca de inmunoglobulinas, Anolis carolinenesis, en este se

encontraron tres isotipos IgM, IgD e IgY (Wei et al., 2009).

En Xenopus se han identificado cuatro isotipos: IgM, IgD, cuya función no está bien entendida, pero es

más similar, en cantidad de dominios, a el IgD de peces que al de mamíferos, IgX, presente en

secreciones mucosas (Hsu & Du Pasquier, 184; Amemiya et al., 1989) e IgY, análogo al IgG de

mamíferos, este se expresa en el vaso y solo como consecuencia de la respuesta mediada por linfocitos T.

En mamíferos se han identificado seis isotipos, 1)IgM, 2)IgD, cuya función, al igual que en peces, no está

bien entendida, pero es un isotipo antiguo cuya estructura ha variado entre grupos y se cree que también

lo ha hecho su función, a diferencia de IgM algunos grupos de vertebrados han perdido este tipo de

anticuerpo (Flajnik & Kasahara, 2010). 3)IgG, encargada de respuestas de memoria e IgE, presente en

funciones inflamatorias en epitelio. El origen de estos dos isotipos está en una proteína similar al IgY de

anfibios. 4)IgA, presente en mucus, y un IgG de cadena sencilla presente, hasta donde se sabe, solo en

camélidos.

12

3.2 Células linfoides

En todos los vertebrados mandibulados se han identificado dos tipos de linfocitos con funciones

claramente diferenciadas (Manning et al., 1979): Las células T,encargadas de inmunidad celular, y las

células B, encargadas de síntesis de anticuerpos.

Los progenitores celulares de los linfocitos, células madre hematopoyéticas, también se han identificado

en los diferentes grupos de vertebrados mandibulados y los genes que codifican para sus receptores,

receptor de células T (TCR, por sus siglas en inglés) y receptor de células B (BCR, por sus siglas en

inglés) (Cooper & Alder, 2006). En Xenopus el TCR se encuentra caracterizado (Haire et al., 2002).

Fig 1: Diferencias en el sistema inmune adaptativo entre las clases de vertebrados. Izquierda: Isotipos de

inmunoglobulinas representados con el número de dominios y clasificadas por función y similitud. Derecha:

Órganos linfáticos primarios y secundarios presentes en cada grupo.

13

Los BCR son inmunoglobulinas de membrana, por lo tanto tienen la estructura de dos cadenas livianas y

dos pesadas de los anticuerpos. En humanos hay dos tipos de cadena livianas, λ y κ, codificadas por dos

genes diferentes cada una, el κ en el cromosoma 2 y el λ en el cromosoma 22, en otros organismos se

identifican por la secuencia de aminoácidos de la proteína o de nucleótidos en el genoma. Estos dos tipos

de cadena se han encontrado en genomas de organismos modelo todos los grupos de vertebrados

(Criscitiello & Flajnik, 2007). En anuros se identificó otro tipo de cadena ligera, la σ, está presente en

peces y reptiles, se cree que los mamíferos y aves perdieron secundariamente este gen (Schwager et al.,

1991).

Las cadenas pesadas de los BCR generan una alta variabilidad con la capacidad de detectar

específicamente patrones proteicos de microorganismos patógenos para generar anticuerpos específicos y

una respuesta inmune adaptativa muy eficaz. Esta variabilidad se genera por medio del mecanismo de

recombinación mediado por RAG, este mecanismo funciona de la misma manera en todos los vertebrados

mandibulados, solo hay diferencias en la organización de los genes que codifican para las cadenas

pesadas de los BCR dentro del genoma entre los grupos de vertebrados, pero estos genes son muy

similares en secuencia al comparar entre taxa (Flajnik & Kasahara, 2010).

En cuanto a los receptores de células T (TCR) existen dos tipos con distinta función, que definen dos

tipos de linfocito T, según la clase de receptor que tengan. Un tipo, el más común, son los receptores αβ

que reconocen el complejo formado por un MHC y el antígeno que presenta en otra célula (Kozbor et al.,

1990). La estructura, de traslocón, posición y regulación de los genes que codifican para este tipo de

receptor son conservados desde peces óseos hasta mamíferos (Deng et al., 2013). En Xenopus se

comprobó que, al igual que en los demás grupos de vertebrados la respuesta de los linfocitos T con

receptor αβ depende de la detección de un MHC unido a un antígeno (Harding & Flajnik, 1993).

El otro tipo son los receptores γδ, son menos abundantes y se han encontrado principalmente en la

mucosa del sistema digestivo, también están presentes en otras mucosas, en muy bajas cantidades (Morita

et al., 1995). No está claro que tipo de moléculas son detectadas por estos receptores, pero se cree que son

capaces de reconocer antígenos solubles, de una forma similar a la de los anticuerpos, pero de una forma

menos específica, reconociendo patrones generales de los microorganismos, se diferencian del otro tipo

de TCR en que son independientes de MHC (Sciammas & Bluestone, 1999). Su organización de genes es

diferente a la que se presenta en los receptores αβ, pero la organización básica de los genes γδ es

conservada en gnatostomados (Flajnik & Kasahara, 2010).

14

3.3 Órganos linfoides

Tradicionalmente se conoce que en mamíferos las células linfoides son producidas en el timo, y la médula

ósea y, en aves, en la bursa de Fabricio (Cooper et al., 1965). De este conocimiento derivan los nombres

de los linfocitos T, por provenir del timo (thymus en inglés) y los linfocitos B, por provenir de la bursa de

Fabricio o médula ósea (bursa of Fabricius y bone marrow en inglés, respectivamente) (ver fig.1).

En la médula ósea de mamíferos también se producen las demás células hematopoyéticas, que circulan

por la sangre, eritrocitos, plaquetas y células NK entre otras.

La médula ósea ocurre irregularmente, y usualmente está ausente en peces y anfibios urodelos, mientras

que en anuros, reptiles, aves y mamíferos está presente de forma consistente (Manning, 1979). Se

desconoce donde se encuentran las poblaciones de células madre progenitoras de linfocitos en los

vertebrados que no tienen médula ósea. Sin embargo en Xenopus adultos la médula ósea no es la

productora de linfocitos B, esta produce neutrófilos, un tipo de célula fagocítica y presentadora de

antígeno (Hadji-Azimi et al., 1987).

Si bien las células progenitoras de los linfocitos son invariables a lo largo de vertebrados mandibulados ,

existen variaciones en los órganos donde se producen y maduran estas células.

El timo está presente en todos los vertebrados mandibulados, y en su epitelio se da la diferenciación de

linfocitos T, en Xenopus se demostró la función de este órgano por medio de una timectomía, que produjo

un daño general en las respuestas mediadas por linfocitos T, pero no en las mediadas por linfocitos B

(Tochinai & Katagari, 1975).

El bazo es en todos los grupos de vertebrados el principal centro de actividad linfoide, allí los antígenos

que se encuentran en sangre son filtrados y se transportan al sitio germinal del órgano, donde se sintetizan

anticuerpos IgM específicos para los antígenos filtrados. Además, en este órgano se producen moléculas

involucradas en la ayuda al proceso de fagocitosis. Las mismas funciones ocurren en este órgano en todos

los vertebrados mandibulados, las diferencias están en la complejidad de la compartimentalización y

arquitectura del órgano, ligeramente más desarrollada en mamíferos (Diener & Bryan, 1974). Este es un

órgano bastante conservado en estructura y función a lo largo de vertebrados mandibulados.

15

El riñón es un lugar donde ocurren las reacciones inmunes, un órgano linfoide secundario, por lo cuál

presenta acumulaciones de linfocitos, en el riñón de anuros y peces hay acumulaciones sencillas de

linfocitos localizadas cerca de los vasos sanguíneos y lugares donde las células pueden responder a la

presencia de un antígeno (Turner, 1973). En amniotas la actividad inmune en el riñón disminuye

considerablemente, aunque se siguen presentando acumulaciones de linfocitos, igualmente se observa que

hay desarrollo de otros órganos linfoides secundarios que no son activos inmunológicamente en anfibios

y peces.

Estos órganos linfáticos secundarios que encontramos en amniotas, altamente desarrollados en aves y

mamíferos, son llamados nódulos linfáticos y se encuentran distribuidos por el cuerpo del animal. Los

nodos linfáticos de aves y mamíferos se caracterizan por estar asociados con canales linfát icos que

transportan eficientemente las células. Los reptiles no aves tienen nódulos linfáticos repartidos, pero sin

estos canales (Manning, 1979). En los anuros donde se ha estudiado no hay presencia de nodos linfáticos

(Manning & Horton, 1982), en Xenopus y en la salamandra Pleurodeles waltlii se ha descrito la presencia

de estructuras similares a nodos linfáticos, sin embargo en ningún anuro se han observado acumulaciones

linfoides organizadas por fuera de los órganos principales ya descritos. En peces se observa presencia de

estructuras similares a nodos linfáticos a lo largo del tracto digestivo únicamente.

Es importante tener en cuenta que aquellos vertebrados que no poseen nódulos dos linfáticos verdaderos,

peces, anfibios y reptiles dependen más de otros órganos linfáticos secundarios, como el riñón y, sobre

todo, el bazo.

4. La piel como mucosa en anfibios

La piel de todos los vertebrados presenta una estructura similar compuesta de dos capas, la dermis y la

epidermis, con el mismo origen embrional a través de todos los taxa. En peces la epidermis actúa como

una mucosa, con las células epiteliales en directo contacto con el medio externo y no presenta

queratinización. En otros grupos vemos un desarrollo de estructuras protectoras, plumas, escamas o

pelaje, como adaptaciones al medio terrestre. En mamíferos la piel tiene adaptaciones como pelaje y

glándulas sudoríparas, por la adaptación al medio terrestre la piel ha perdido su función de mucosa.

La respuesta relacionada con células B y anticuerpos en peces es muy similar entre la piel y el intestino,

se podría sugerir un funcionamiento similar en las mucosas de la piel de los anfibios (Xu et al., 2013). IgT

está presente de forma similar que en el intestino, sobre todo en polímeros y está en mayor cantidad

respecto a IgM que en suero, pero IgM sigue siendo más abundante en esta mucosa, a diferencia del

16

intestino de mamíferos, donde el isotipo IgA es el más abundante. En peces el rol de IgT en la piel sería el

de ejercer control sobre la microbiota de la piel, el mismo patrón se observa con las células B (Salinas et

al., 2011) .

En anfibios la piel está queratinizada, pero, al igual que en los peces, esta cumple funciones de mucosa.

Las mucosas, además de actuar como barreras físicas, son sitios con respuesta inmune activa, tanto celular

celular como humoral, más compleja a nivel anatómico y molecular que la respuesta en el resto del

sistema (Brandtzaeg, 2009; Cerutti and Rescigno, 2008; Fagarasan, 2008; Macpherson et al., 2008). Es

importante tener esto en cuenta a la hora de estudiar la respuesta inmune de los anfibios frente a la

quitridiomicosis, ya que la repuesta de la piel será más parecida a la que se da en la mucosa gástrica que

en mamíferos.

Las inmunoglobulinas llevan a cabo su función entonces bajo unos principios que parecen conservados a

lo largo de todos los vertebrados. Y en general se observa que se requiere un tipo particular de

inmunoglobulina para regular la microbiota de las mucosas, diferente a la que trabaja a nivel sistémico.

5. Efecto de la quitridiomicosis en es sistema inmune

Los síntomas principales de la quitridiomicosis son hiperqueratosis, hiperplasia de la epidermis y

descamación excesiva de la piel (Parker et al., 2002). Usualmente no está asociada con lesiones severas o

inflamación considerable y si se ha encontrado que hay una disminución en la cantidad de neutrófilos y

eosinófilos en sangre (Woodhams et al., 2007).

En estudios de expresión genética se ha visto que en Silurana tropicalis 157 genes inmunes fueron

identificados en el hígado, al comparar individuos infectados con no infectados la respuesta frente a Bd

fué muy débil, presentándose una disminución en la transcripción de la mayoría de estos, algunos de los

que presentaron un aumento fueron identificados como genes supresores, por ejemplo genes reguladores

de apoptosis, y otros como genes que regulan la respuesta a estrés crónico (factores de crecimiento,

conexina y colágeno). Por otro lado, se observó un aumento en el gen que codifica para la queratina I

(Rosenblum et al., 2009).

Esto hace pensar que Bd tiene un efecto supresor sobre el sistema inmune, lo cuál puede ser una razón

para el avance rápido de la enfermedad en los individuos susceptibles. Se propone entonces que aquellos

17

anfibios resistentes a la infección no son los que tienen una respuesta inmune más efectiva sino los que

tienen un mecanismo que impide la inhibición del sistema por parte de Bd.

Habría que estudiar a fondo entonces las interacciones moleculares que ocurren entre productos

secretados por Bd y el sistema inmune de los anfibios enfocándose en la búsqueda de un posible

mecanismo de interferencia. Los estudios realizados hasta ahora comparando transcriptomas de

individuos infectados y no infectados se podrían revisar buscando cuáles funciones son suprimidas o

disminuidas y desde qué punto basal en las rutas metabólicas ocurre esta regulación negativa.

6. Conclusiones

La mayoría de las funciones del sistema inmune de los vertebrados están bastante conservadas, y están

descritas en muy pocos géneros de anfibios (Rana, Bufo y Xenopus), las respuestas celulares encontradas

en mamíferos son muy similares en todos los vertebrados, se han encontrado células con morfologías y

funciones iguales en todos los demás grupos. Los órganos linfoides varían en función específica y

organización, además no están presentes en todos los grupos de vertebrados, sin embargo las funciones de

estos órganos están cubiertas de algún modo en cada grupo y los productos de estas se mantienen

conservados.

La respuesta inmune humoral, mediada por compuestos extracelulares presenta una mayor variación. Por

un lado las inmunoglobulinas tienen una región que es la más variable de cualquier proteína en

vertebrados, y otra región, de mayor tamaño que es conservada dentro de los isotipos y hace posible una

identificación de anticuerpos si hay una secuencia del mismo isotipo, a pesar de esto sería recomendable

al analizar expresión de inmunoglobulinas en una muestra realizar varias búsquedas disminuyendo la

identidad mínima necesaria para homología y compararlas para no perder información, además de

asegurarse de que todos los isotipos identificados para el grupo trabajado estén caracterizados en alguna

de las bases de datos usadas.

Por otro lado los péptidos antimicrobianos (AMPs), a pesar de tener la mayor representación filogenética

de todas las funciones inmunes en anfibios, también es la más variable, los AMPs comparten unas pocas

características pero sus estructuras y secuencias de aminoácidos cambian de una especie a otra, para hacer

una búsqueda que incluya los AMPs presentes en la muestra sería recomendable, además de disminuir la

identidad mínima como con las inmunoglobulinas, realizar otros análisis con los transcritos sin homología

en bases de datos buscando genes candidatos para péptidos antimicrobianos, observando una predicción

18

de estructuras secundarias, especialmente con transcritos de menos de 200 pares de bases. También es

importante tener en cuenta tamaño de los péptidos antimicrobianos, que pueden tener menos de 20

aminoácidos, por lo que al ensamblar los transcritos hay que disminuir también la longitud mínima.

Los receptores tipo Toll están muy pobremente estudiados en anfibios, según estudios en otros grupos,

mamíferos y peces, de los 6 tipos identificados en mamíferos, algunos están presentes en todos los

vertebrados donde se ha buscado, incluyendo en el genoma de X. laevis, pero otros son excusivos a

mamíferos o no están presentes en todos los grupos. Los TLRs identificados en Xenopus solo están

identificados a partir de las secuencias de otros caracterizados en diferentes grupos, por esto no hay

certeza de que no exista un tipo de TLR con estructura particular en anfibios que no esté presente en bases

de datos. Esta sería otra función para la que valdría la pena realizar otro tipo de análisis aparte de la

búsqueda de homólogos, pero lo más importante es caracterizar mejor y directamente los receptores de

anfibios.

Es importante tener en cuenta al realizar las búsquedas las características de la piel de los anfibios, que

inmunológicamente actúa como una mucosa, así que es de esperar homología con productos del sistema

inmune característicos del tubo digestivo u otras mucosas en otros vertebrados terrestres.

Igualmente, dado que Bd puede tener un efecto supresor en el sistema inmune, es necesario realizar

análisis enfocados también en la interacción hospedero-patógeno, así como en una posible regulación

negativa por parte de Bd.

La transcriptomica es una herramienta útil, que nos permite obtener grandes cantidades de información

sobre el metabolismo de un organismo en un momento y bajo una circunstancias específicas, pero muchos

investigadores restringen su análisis a la búsqueda en bases de datos, sin saber si estas contienen

suficiente información para cubrir la función de interés en su organismo de estudio. Es muy importante

entonces conocer las limitaciones del método, entender la fisiología del organismo y saber cuál es la

cobertura pueden tener las secuencias de las bases de datos de la función o funciones de interés para el

organismo estudiado, así como hacer uso de otras herramientas informáticas que nos ayudan a plantear

genes y proteínas candidatos a partir de las secuencias no identificadas por homología en bases de datos.

7. Agradecimientos

Agradezco a Andrew Crawford por su apoyo y buenas recomendaciones para realizar este trabajo, y a

Pilar Rodríguez y Luisa Castellanos por su apoyo con bibliografía e ideas.

19

8. Bibliografía

Alder, M.N., Rogozin, I.B., Iyer, L.M., Glazko, G.V., Cooper, M.D., and Pancer, Z. (2005). Diversity and function of adaptive

immune receptors in a jawless vertebrate. Science 310, 1970–1973.

Alford, R, R., S.J. (1999). Global Amphibian Declines: A Problem in Applied Ecology. Annual Review of Ecology and

Systematics 30, 133–165.

Ali, M.F., Lips, K.R., Knoop, F.C., Fritzsch, B., Miller, C., and Conlon, J.M. (2002). Antimicrobial peptides and protease

inhibitors in the skin secretions of the rawfish frog, Rana areolata. Biochim. Biophys. Acta 1601, 55–63.

Amemiya, C.T., Haire, R.N., and Litman, G.W. (1989). Nucleotide sequence of a cDNA encoding a third distinct Xenopus

immunoglobulin heavy chain isotype. Nucleic Acids Res. 17, 5388.

Basir, Y.J., Knoop, F.C., Dulka, J., and Conlon, J.M. (2000). Multiple antimicrobial peptides and peptides related to bradykinin

and neuromedin N isolated from skin secretions of the pickerel frog, Rana palustris. Biochim. Biophys. Acta 1543, 95–105.

Batista, C.V., da Silva, L.R., Sebben, A., Scaloni, A., Ferrara, L., Paiva, G.R., Olamendi-Portugal, T., Possani, L.D., and Bloch,

C., Jr (1999). Antimicrobial peptides from the Brazilian frog Phyllomedusa distincta. Peptides 20, 679–686.

Berger, L., Speare, R., Daszak, P., Green, D.E., Cunningham, A.A., Goggin, C.L., Slocombe, R., Ragan, M.A., Hyatt, A.D.,

McDonald, K.R., et al. (1998). Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain

forests of Australia and Central America. PNAS 95, 9031–9036.

Berger, L., Marantelli, G., Skerratt, L., and Speare, R. (2005). Virulence of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium

dendrobatidis varies with the strain. Diseases of Aquatic Organisms 68, 47–50.

Bevier, C.R., Sonnevend, A., Kolodziejek, J., Nowotny, N., Nielsen, P.F., and Conlon, J.M. (2004). Purification and

characterization of antimicrobial peptides from the skin secretions of the mink frog (Rana septentrionalis). Comp. Biochem.

Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 139, 31–38.

Brand, G.D., Leite, J.R.S.A., de Sá Mandel, S.M., Mesquita, D.A., Silva, L.P., Prates, M.V., Barbosa, E.A., Vinecky, F., Mart ins,

G.R., Galasso, J.H., et al. (2006). Novel dermaseptins from Phyllomedusa hypochondrialis (Amphibia). Biochem. Biophys.

Res. Commun. 347, 739–746.

Brandtzaeg, P. (2009). Mucosal immunity: induction, dissemination, and effector functions. Scand. J. Immunol. 70, 505–515.

Callewaert, L., and Michiels, C.W. (2010). Lysozymes in the animal kingdom. J. Biosci. 35, 127–160.

Carrillo-Farga, J., Castell, A., Pérez, A., and Rondán, A. (1990). Langerhans-like cells in amphibian epidermis. J. Anat. 172, 39–

45.

Carroll, M.C. (2004). The complement system in regulation of adaptive immunity. Nature Immunology 5, 981–986.

Carvalho, L., Sun, J., Kane, C., Marshall, F., Krawczyk, C., and Pearce, E.J. (2009). Review series on helminths, immune

modulation and the hygiene hipothesis: mechanisms underlying helminth modulation of dendritic cell function.

Immunology 126, 28–34.

Carver, S., Bell, B.D., and Waldman, B. (2010). Does Chytridiomycosis Disrupt Amphibian Skin Function?

Cerutti, A., and Rescigno, M. (2008). The biology of intestinal immunoglobulin A responses. Immunity 28, 740–750.

Conlon, J.M., Sonnevend, A., Patel, M., Camasamudram, V., Nowotny, N., Zilahi, E., Iwamuro, S., Nielsen, P.F., and Pál, T.

(2003). A melittin-related peptide from the skin of the Japanese frog, Rana tagoi, with antimicrobial and cytolytic

properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 496–500.

Conlon, J.M., Kolodziejek, J., and Nowotny, N. (2004). Antimicrobial peptides from ranid frogs: taxonomic and phylogenetic

markers and a potential source of new therapeutic agents. Biochim. Biophys. Acta 1696, 1–14.

20

Conlon, J.M., Abraham, B., Sonnevend, A., Jouenne, T., Cosette, P., Leprince, J., Vaudry, H., and Bevier, C.R. (2005).

Purification and characterization of antimicrobial peptides from the skin secretions of the carpenter frog Rana virgatipes

(Ranidae, Aquarana). Regul. Pept. 131, 38–45.

Conlon, J.M., Al-Ghaferi, N., Abraham, B., Jiansheng, H., Cosette, P., Leprince, J., Jouenne, T., and Vaudry, H. (2006).

Antimicrobial peptides from diverse families isolated from the skin of the Asian frog, Rana grahami. Peptides 27, 2111–

2117.

Cooper, M.D., and Alder, M.N. (2006). The evolution of adaptive immune systems. Cell 124, 815–822.

Cooper, M.D., Peterson, R.D., and Good, R.A. (1965). DELINEATION OF THE THYMIC AND BURSAL LYMPHOID

SYSTEMS IN THE CHICKEN. Nature 205, 143–146.

Criscitiello, M.F., and Flajnik, M.F. (2007). Four primordial immunoglobulin light chain isotypes, including lambda and kappa,

identified in the most primitive living jawed vertebrates. Eur. J. Immunol. 37, 2683–2694.

Deng, L., Luo, M., Velikovsky, A., and Mariuzza, R.A. (2013). Structural insights into the evolution of the adaptive immune

system. Annu Rev Biophys 42, 191–215.

Du Pasquier, L., and Flajnik, M.F. (1990). Expression of MHC class II antigens during Xenopus development. Dev. Immunol. 1,

85–95.

Fagarasan, S. (2008). Evolution, development, mechanism and function of IgA in the gut. Curr. Opin. Immunol. 20, 170–177.

Flajnik, M.F., and Kasahara, M. (2001a). Comparative genomics of the MHC: glimpses into the evolution of the adaptive

immune system. Immunity 15, 351–362.

Flajnik, M.F., and Kasahara, M. (2001b). Comparative genomics of the MHC: glimpses into the evolution of the adaptive

immune system. Immunity 15, 351–362.

Flajnik, M.F., and Kasahara, M. (2010). Origin and evolution of the adaptive immune system: genetic events and selective

pressures. Nat. Rev. Genet. 11, 47–59.

Flajnik, M.F., and Du Pasquier, L. (1990). The major histocompatibility complex of frogs. Immunol. Rev. 113, 47–63.

Fletcher, T.C., and Grant, P.T. (1969). Immunoglobulins in the serum and mucus of the plaice (Pleuronectes platessa). Biochem.

J. 115, 65P.

Gibson, B.W., Tang, D.Z., Mandrell, R., Kelly, M., and Spindel, E.R. (1991). Bombinin-like peptides with antimicrobial activity

from skin secretions of the Asian toad, Bombina orientalis. J. Biol. Chem. 266, 23103–23111.

Goraya, J., Wang, Y., Li, Z., O’Flaherty, M., Knoop, F.C., Platz, J.E., and Conlon, J.M. (2000). Peptides with antimicrobial

activity from four different families isolated from the skins of the North American frogs Rana luteiventris, Rana berlandieri

and Rana pipiens. European Journal of Biochemistry 267, 894–900.

Hadji-Azimi, I., Coosemans, V., and Canicatti, C. (1987). Atlas of adult Xenopus laevis laevis hematology. Dev. Comp.

Immunol. 11, 807–874.

Haire, R.N., Kitzan Haindfield, M.K., Turpen, J.B., and Litman, G.W. (2002). Structure and diversity of T-lymphocyte antigen

receptors alpha and gamma in Xenopus. Immunogenetics 54, 431–438.

Harding, F.A., Flajnik, M.F., and Cohen, N. (1993). MHC restriction of T-cell proliferative responses in Xenopus. Dev. Comp.

Immunol. 17, 425–437.

He, W., Feng, F., Huang, Y., Guo, H., Zhang, S., Li, Z., Liu, J., Wang, Y., and Yu, H. (2012). Host defense peptides in skin

secretions of Odorrana tiannanensis: Proof for other survival strategy of the frog than merely anti-microbial. Biochimie 94,

649–655.

Hou, F., Li, J., Pan, P., Xu, J., Liu, L., Liu, W., Song, B., Li, N., Wan, J., and Gao, H. (2011). Isolation and characterisation of a

new antimicrobial peptide from the skin of Xenopus laevis. Int. J. Antimicrob. Agents 38, 510–515.

Hsu, E., and Du Pasquier, L. (1984). Ontogeny of the immune system in Xenopus. Differentiation 28, 109–115.

saacson, T., Soto, A., Iwamuro, S., Knoop, F.C., and Conlon, J.M. (2002). Antimicrobial peptides with atypical structural

features from the skin of the Japanese brown frog Rana japonica. Peptides 23, 419–425.

Ishii, A., Kawasaki, M., Matsumoto, M., Tochinai, S., and Seya, T. (2007). Phylogenetic and expression analysis of amphibian

Xenopus Toll-like receptors. Immunogenetics 59, 281–293.

21

Jin, L.-L., Li, Q., Song, S.-S., Feng, K., Zhang, D.-B., Wang, Q.-Y., and Chen, Y.-H. (2009). Characterization of antimicrobial

peptides isolated from the skin of the Chinese frog, Rana dybowskii. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol.

154, 174–178.

Kaufman, J. (1999). Co-evolving genes in MHC haplotypes: the “rule” for nonmammalian vertebrates? Immunogenetics 50,

228–236.

Kawai, T., and Akira, S. (2007). Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors. Trends Mol Med 13, 460–469.

Kim, J.B., Halverson, T., Basir, Y.J., Dulka, J., Knoop, F.C., Abel, P.W., and Conlon, J.M. (2000). Purification and

characterization of antimicrobial and vasorelaxant peptides from skin extracts and skin secretions of the North American

pig frog Rana grylio. Regul. Pept. 90, 53–60.

Kindt, T.J., Goldsby, Osborne, B.A., and Kuby, J. (2002). Kuby immunology. (New York: W.H. Freeman).

Kriger, K.M., and Hero, J.-M. (2006). Survivorship in Wild Frogs Infected with Chytridiomycosis. EcoHealth 3, 171–177.

Kozbor, D., Cassatella, M.A., Lessin, S., Kagan, J., Finver, S., Faust, J. et al. (1990) Expression and function of cd - and ab -T

cell receptor heterodimers on human somatic T cell hybrids. J Immunol 14, 3677–3683

Kückelhaus, S.A.S., Leite, J.R.S.A., Muniz-Junqueira, M.I., Sampaio, R.N., Bloch, C., Jr, and Tosta, C.E. (2009). Antiplasmodial

and antileishmanial activities 50.of phylloseptin-1, an antimicrobial peptide from the skin secretion of Phyllomedusa azurea

(Amphibia). Exp. Parasitol. 123, 11–16.

Lai, R., Liu, H., Hui Lee, W., and Zhang, Y. (2002). An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima. Biochemical

and Biophysical Research Communications 295, 796–799.

Lee, W.-H., Zhang, J., Zhang, Y.-X., Jin, Y., Lai, R., and Zhang, Y. (2005). Maximin 9, a novel free thiol containing

antimicrobial peptide with antimycoplasma activity from frog Bombina maxima. FEBS Lett. 579, 4443–4448.

Lehman, H.E. (1953). OBSERVATIONS ON MACROPHAGE BEHAVIOR IN THE FIN OF XENOPUS LARVAE. Biol Bull

105, 490–495.

Li, J., Xu, X., Xu, C., Zhou, W., Zhang, K., Yu, H., Zhang, Y., Zheng, Y., Rees, H.H., Lai, R., et al. (2007). Anti-infection

peptidomics of amphibian skin. Mol. Cell Proteomics 6, 882–894.

Lips, K.R., Brem, F., Brenes, R., Reeve, J.D., Alford, R.A., Voyles, J., Carey, C., Livo, L., Pessier, A.P., and Collins, J.P. (2006).

Emerging infectious disease and the loss of biodiversity in a Neotropical amphibian community. PNAS 103, 3165–3170.

Litman, G.W., Rast, J.P., and Fugmann, S.D. (2010). The origins of vertebrate adaptive immunity. Nat Rev Immunol 10, 543–

553.

Liu, X., Liu, R., Wei, L., Yang, H., Zhang, K., Liu, J., and Lai, R. (2011). Two novel antimicrobial peptides from skin secretions

of the frog, Rana nigrovittata. J. Pept. Sci. 17, 68–72.

Longcore, J.E., Pessier, A.P., and Nichols, D.K. (1999). Batrachochytrium Dendrobatidis gen. et sp. nov., a Chytrid Pathogenic

to Amphibians. Mycologia 91, 219.

Lu, Y., Ma, Y., Wang, X., Liang, J., Zhang, C., Zhang, K., Lin, G., and Lai, R. (2008). The first antimicrobial peptide from sea

amphibian. Mol. Immunol. 45, 678–681.

Macpherson, A.J., McCoy, K.D., Johansen, F.-E., and Brandtzaeg, P. (2008). The immune geography of IgA induction and

function. Mucosal Immunol 1, 11–22.

Manning, M.J. and Horton, J.D. (1982) RES structure and function of the amphibia. In: N. Cohen and M. M. Siegel, eds., The

Reticuloendothelial System A Comprehensive Treatise 3. Phylogeny and Ontogeny. New York. Plenum Press

Manning, M.J. (1979). Evolution of the vertebrate immune system. J R Soc Med 72, 683–688.

Miyake, K. (2007). Innate immune sensing of pathogens and danger signals by cell surface Toll-like receptors. Semin. Immunol.

19, 3–10.

Miyazawa, S., Azumi, K., and Nonaka, M. (2001). Cloning and characterization of integrin alpha subunits from the solitary

ascidian, Halocynthia roretzi. J. Immunol. 166, 1710–1715.

Mo, R., Kato, Y., Nonaka, M., Nakayama, K., and Takahashi, M. (1996). Fourth component of Xenopus laevis complement:

cDNA cloning and linkage analysis of the frog MHC. Immunogenetics 43, 360–369.

22

Morita, C.T., Beckman, E.M., Bukowski, J.F., Tanaka, Y., Band, H., Bloom, B.R., Golan, D.E., and Brenner, M.B. (1995). Direct

presentation of nonpeptide prenyl pyrophosphate antigens to human gamma delta T cells. Immunity 3, 495–507.

Nonaka, M., and Kimura, A. (2006). Genomic view of the evolution of the complement system. Immunogenetics 58, 701–713.

Ohta, Y., Goetz, W., Hossain, M.Z., Nonaka, M., and Flajnik, M.F. (2006). Ancestral organization of the MHC revealed in the

amphibian Xenopus. J. Immunol. 176, 3674–3685.

Pancer, Z., Amemiya, C.T., Ehrhardt, G.R.A., Ceitlin, J., Gartland, G.L., and Cooper, M.D. (2004). Somatic divers ification of

variable lymphocyte receptors in the agnathan sea lamprey. Nature 430, 174–180.

Parker, J.M., Mikaelian, I., Hahn, N., and Diggs, H.E. (2002). Clinical Diagnosis and Treatment of Epidermal Chytridiomycosis

in African Clawed Frogs (Xenopus tropicalis). Comparative Medicine 52, 265–268.

Prates, M.V., Sforça, M.L., Regis, W.C.B., Leite, J.R.S.A., Silva, L.P., Pertinhez, T.A., Araújo, A.L.T., Azevedo, R.B., Spisni,

A., and Bloch, C., Jr (2004). The NMR-derived solution structure of a new cationic antimicrobial peptide from the skin

secretion of the anuran Hyla punctata. J. Biol. Chem. 279, 13018–13026.

Ramos, R., Moreira, S., Rodrigues, A., Gama, M., and Domingues, L. (2013). Recombinant expression and purification of the

antimicrobial peptide magainin-2. Biotechnol. Prog. 29, 17–22.

Ramsey, J.P., Reinert, L.K., Harper, L.K., Woodhams, D.C., and Rollins-Smith, L.A. (2010). Immune Defenses against

Batrachochytrium dendrobatidis, a Fungus Linked to Global Amphibian Declines, in the South African Clawed Frog,

Xenopus laevis. Infect. Immun. 78, 3981–3992.

Rinaldi, A.C. (2002a). Antimicrobial peptides from amphibian skin: an expanding scenario: Commentary. Current Opinion in

Chemical Biology 6, 799–804.

Rinaldi, A.C. (2002b). Antimicrobial peptides from amphibian skin: an expanding scenario: Commentary. Current Opinion in

Chemical Biology 6, 799–804.

Roach, J.C., Glusman, G., Rowen, L., Kaur, A., Purcell, M.K., Smith, K.D., Hood, L.E., and Aderem, A. (2005). The evolution

of vertebrate Toll-like receptors. 78.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9577–9582.

Rollins-Smith, L.A., Reinert, L.K., Miera, V., and Conlon, J.M. (2002a). Antimicrobial peptide defenses of the Tarahumara frog,

Rana tarahumarae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 297, 361–367.

Rollins-Smith, L.A., Reinert, L.K., Miera, V., and Conlon, J.M. (2002b). Antimicrobial peptide defenses of the Tarahumara frog,

Rana tarahumarae. Biochem. Biophys. Res. Commun. 297, 361–367.

Rosenblum, E.B., Poorten, T.J., Settles, M., and Murdoch, G.K. (2012). Only skin deep: shared genetic response to the deadly

chytrid fungus in susceptible frog species. Molecular Ecology 21, 3110–3120.

Salinas, I., Zhang, Y.-A., and Sunyer, J.O. (2011). Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish. Dev. Comp. Immunol.

35, 1346–1365.

Schwager, J., Bürckert, N., Courtet, M., and Du Pasquier, L. (1991). The ontogeny of diversification at the immunoglobulin

heavy chain locus in Xenopus. EMBO J. 10, 2461–2470.

Sciammas, R., and Bluestone, J.A. (1999). TCRgammadelta cells and viruses. Microbes Infect. 1, 203–212.

Simmaco, M., Mignogna, G., and Barra, D. (1998). Antimicrobial peptides from amphibian skin: What do they tell us? Peptide

Science 47, 435–450.

Sousa, J.C., Berto, R.F., Gois, E.A., Fontenele-Cardi, N.C., Honório, J.E.R., Jr, Konno, K., Richardson, M., Rocha, M.F.G.,

Camargo, A.A.C.M., Pimenta, D.C., et al. (2009). Leptoglycin: a new Glycine/Leucine-rich antimicrobial peptide isolated

from the skin secretion of the South American frog Leptodactylus pentadactylus (Leptodactylidae). Toxicon 54, 23–32.

Stuart, S.N., Chanson, J.S., Cox, N.A., Young, B.E., Rodrigues, A.S.L., Fischman, D.L., and Waller, R.W. (2004). Status and

Trends of Amphibian Declines and Extinctions Worldwide. Science 306, 1783–1786.

Tochinai, S., and Katagiri, C. (1975). COMPLETE ABROGATION OF IMMUNE RESPONSE TO SKIN ALLOGRAFTS AND

RABBIT ERYTHROCYTES IN THE EARLY THYMECTOMIZED XENOPUS. Development, Growth and

Differentiation 17, 383–394.

Tonegawa, S. (1976). Proceedings: Determination of the number of antibody structural genes by DNA-RNA hybridization.

Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 357, 617.

23

Turner, R.J., and Manning, M.J. (1974). Thymic dependence of amphibian antibody responses. Eur. J. Immunol. 4, 343–346.

Villa-Hernández, O., Hernández-Orihuela, L., del Carmen Rodríguez, M., Zamudio-Zuñiga, F., Castro-Franco, R., Pando, V., and

Batista, C.V.F. (2009). Novel antimicrobial peptides isolated from skin secretions of the Mexican frog Hyla eximia. Protein

Pept. Lett. 16, 1371–1378.

Voyles, J., Young, S., Berger, L., Campbell, C., Voyles, W.F., Dinudom, A., Cook, D., Webb, R., Alford, R.A., Skerratt, L.F., et

al. (2009). Pathogenesis of Chytridiomycosis, a Cause of Catastrophic Amphibian Declines. Science 326, 582–585.

Vredenburg, V.T., Knapp, R.A., Tunstall, T.S., and Briggs, C.J. (2010). Dynamics of an emerging disease drive large-scale

amphibian population extinctions. PNAS 107, 9689–9694.

Wang, G., Wang, Y., Ma, D., Liu, H., Li, J., Zhang, K., Yang, X., Lai, R., and Liu, J. (2013). Five novel antimicrobial peptides

from the Kuhl’s wart frog skin secretions, Limnonectes kuhlii. Mol. Biol. Rep. 40, 1097–1102.

Wang, M., Wang, Y., Wang, A., Song, Y., Ma, D., Yang, H., Ma, Y., and Lai, R. (2010). Five novel antimicrobial peptides from

skin secretions of the frog, Amolops loloensis. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 155, 72–76.

Wei, Z., Wu, Q., Ren, L., Hu, X., Guo, Y., Warr, G.W., Hammarström, L., Li, N., and Zhao, Y. (2009). Expression of IgM, IgD,

and IgY in a Reptile, Anolis carolinensis. J Immunol 183, 3858–3864.

Woodhams, D.C., Ardipradja, K., Alford, R.A., Marantelli, G., Reinert, L.K., and Rollins-Smith, L.A. (2007). Resistance to

chytridiomycosis varies among amphibian species and is correlated with skin peptide defenses. Animal Conservation 10,

409–417.

Wu, Y., Wang, L., Zhou, M., Ma, C., Chen, X., Bai, B., Chen, T., and Shaw, C. (2011). Limnonectins: a new class of

antimicrobial peptides from the skin secretion of the Fujian large-headed frog (Limnonectes fujianensis). Biochimie 93,

981–987.

Xu, B., Che, H., Kang, L., Zheng, S., Mu, S., and Wan, F. (2012). Molecular cloning and functional characterization of novel

antimicrobial peptides from the skin of brown frog, Rana zhenhaiensis. Zool. Sci. 29, 553–558.

Xu, Z., Parra, D., Gómez, D., Salinas, I., Zhang, Y.-A., von Gersdorff Jørgensen, L., Heinecke, R.D., Buchmann, K., Lapatra, S.,

and Sunyer, J.O. (2013). Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proc. Natl. Acad.

Sci. U.S.A. 110, 13097–13102.

Yeaman, M.R., and Yount, N.Y. (2003). Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol. Rev. 55, 27–55.

Zhao, Y., Jin, Y., Lee, W.-H., and Zhang, Y. (2006). Purification of a lysozyme from skin secretions of Bufo andrewsi. Comp.

Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 142, 46–52.

Zhou, J., McClean, S., Thompson, A., Zhang, Y., Shaw, C., Rao, P., and Bjourson, A.J. (2006). Purification and characterization

of novel antimicrobial peptides from the skin secretion of Hylarana guentheri. Peptides 27, 3077–3084.

Zhu, Z., Sun, Y., Wang, R., and Xu, T. (2013). Evolutionary analysis of TLR9 genes reveals the positive selection of extant

teleosts in Perciformes. Fish Shellfish Immunol. 35, 448–457.