ANÁLISIS GENÉTICO MEDIANTE MARCADORES...

ANÁLISIS GENÉTICO MEDIANTE MARCADORES

MOLECULARES DE LA ESTRUCTURA GENÉTICA E IMPACTO

DE LA REPOBLACIÓN EN POBLACIONES GALLEGAS DE

TRUCHA COMÚN Salmo trutta

Departamento de Genética

Universidad de Santiago de Compostela Campus de Lugo

Análisis de la Estructura Genética en Salmo trutta ___________________________________________________________________________________________

Investigador Responsable:

Paulino Martínez Portela

Investigadores Participantes:

Carmen Bouza Fernández

Jaime Castro Alberto

Técnicos:

Susana Sánchez Darriba

Sonia Gómez Fernández

Lucía Insua Díaz

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1. Introducción

Estructura genética de la trucha común (Salmo trutta L.)

La trucha común se distribuye a lo largo de todo el continente Europeo, desde el Mar Blanco

hasta las costas de Islandia en el Norte, y desde la Península Ibérica y costa del Norte de

África, a lo largo del Mediterráneo, hasta los mares Negro, Aral y Caspio, en el Sur. La

excelente adaptabilidad de esta especie ha determinado que desde finales del siglo pasado

hasta mediados del presente siglo XX, la trucha común haya sido introducida en más de 24

países distintos, estando presente en la actualidad en todos los continentes exceptuando la

Antártida (McCrimmon, 1968; Elliot, 1989).

Junto con Oncorhynchus clarkii, la trucha común es la especie que presenta mayor

estructuración poblacional entre los Salmónidos, e incluso entre los Vertebrados (Krieg y

Guyomard, 1985). Los datos existentes a lo largo de la mayor parte de su área de distribución

demuestran que la diferenciación genética entre poblaciones a nivel microgeográfico es

considerable, detectándose un componente de diferenciación entre poblaciones en torno al

30%. Es decir de la diversidad genética total observada, el 30% se debe a divergencia genética

entre poblaciones (Ryman, 1983; Crozier y Ferguson, 1986; Hansen et al., 1993; Martínez et

al., 1993; Bouza et al., 1999; 2001). Las causas fundamentales de esta microdiferenciación

tienen que ver con la fidelidad en el retorno a los lugares de freza (homing behaviour), con la

notable fragmentación del hábitat en que vive esta especie y con los efectos del avance y

retroceso de los hielos a lo largo del Pleistoceno (Hewitt, 1996; Willis y Whittaker, 2000).

A escala macrogeográfica la divergencia genética observada es también considerable,

reconociéndose la existencia de al menos cinco linajes genéticamente diferenciados a partir de

estudios genético-moleculares a lo largo del continente Europeo, con un nivel global de

estructuración superior al 70% (Ferguson, 1989; Bernatchez et al., 1992; Giuffra et al., 1994;

Bernatchez y Osinov, 1995; García-Marín y Plá, 1996; Laikre et al., 1999; Bernatchez, 2001;

Presa et al., 2002). Una parte importante de esta diferenciación se localiza en la zona

Mediterránea, donde la ausencia de la forma anádroma determina el aislamiento de las

cuencas, y consecuentemente su divergencia debido a procesos de deriva y adaptación a las

condiciones peculiares medioambientales de cada cuenca. Los cambios climáticos y

modificaciones del hábitat consecuencia de las glaciaciones durante el Pleistoceno, han

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resultado en procesos de migración y recolonización, que han contribuido a dibujar la

compleja estructuración genética de esta especie en la actualidad (García-Marín y Plá, 1996;

Apostolidis et al., 1997; García-Marín et al., 1999; Aurelle et al., 2002; Bernatchez, 2001).

Los trabajos iniciales en la región Atlántica sugerían una gran homogeneidad genética

proponiéndose la existencia de un único linaje principal (Bernatchez et al., 1992). Estudios

más recientes han demostrado, sin embargo, la existencia de una mayor complejidad en esta

zona, especialmente en relación con la Península Ibérica donde se han localizado los

principales refugios glaciares durante el Cuaternario (Hewitt, 1996; Willis y Whittaker, 2000).

Según éstos, existirían al menos tres grandes regiones en el Atlántico definidas por el límite

de la forma anádroma por debajo del paralelo 42ºN y por la Bretaña Francesa (Atlántico

Norte, Cantábrico y Atlántico Sur; Bernatchez, 2001; Presa et al., 2002). Sin embargo, la

región SurAtlántica ha evidenciado una enorme heterogeneidad existiendo diferentes linajes

coexistiendo en alo y parapatría (Bouza et al., 1999, 2001; Weiss et al., 2000; Machordom et

al., 2000; Martínez et al., enviado).

Los estudios previos de la trucha común en Galicia realizados con marcadores isoenzimáticos,

han demostrado la existencia de una importante heterogeneidad genética (Martínez et al.,

1993; Bouza et al., 1999, 2001), tanto por representar el límite de distribución de la forma

anádroma (Hamilton et al., 1992), como por el contacto entre linajes genéticamente

diferenciados, especialmente en la cuenca del Miño (Castro et al., 2001; Presa et al., 2002).

La aplicación de marcadores genéticos más resolutivos como los microsatélites, debería

permitir una definición mucho más precisa de las diferentes subregiones genéticas de la trucha

común en Galicia, información indispensable para identificar las unidades operativas de

conservación (OCUs, “Operational Conservation Units”).

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Gestión y conservación de recursos en la trucha común

El conocimiento de la estructura genética de la trucha común es un elemento esencial a tener

en cuenta en la aplicación de programas de gestión y conservación de recursos teniendo en

cuenta la elevada subdivisión genética existente. En consecuencia, los estudios dirigidos a

conocer la ubicación en términos filogeográficos de las poblaciones de un área determinada

dentro del contexto Europeo, así como a estimar los niveles de estructuración existentes a

nivel microgeográfico, constituyen un punto de partida indispensable en el desarrollo de

cualquier programa de gestión (Ryman, 1981; Allendorf et al., 1987; García-Marín et al.,

1991; Martínez et al., 1993). Desde el punto de vista de la gestión, las tres principales

actividades humanas que afectan a la conservación de recursos biológicos: alteración del

hábitat, sobreexplotación pesquera, y repoblación, afectan también a las poblaciones de

trucha. La degradación ambiental implica tanto destrucción física directa del medio en que se

desenvuelve la trucha, por ejemplo por la construcción de centrales hidroeléctricas que

impiden el ascenso de los reproductores a los lugares de freza o las modificaciones del curso

para la regulación del régimen hídrico, como modificaciones indirectas del mismo a través de

diversas formas de contaminación.

La explotación de las poblaciones naturales de trucha mediante la pesca, tiene esencialmente

un componente recreativo, aunque en algunas regiones y países de Europa se mantiene la

comercialización de la misma, lo cual agrava el problema. El desconocimiento de la estructura

genética y diferenciación de las poblaciones de trucha puede determinar la erosión de recursos

a través de la pesca, ya que las poblaciones proporcionalmente menos representadas pueden

llegar a desaparecer si no existe una regulación específica de los recursos genéticos (Utter y

Ryman, 1993; Ryman et al., 1995; Polikansky y Magnuson, 1998; Laikre et al., 1999).

Igualmente, se ha demostrado que la actividad pesquera lleva aparejada componentes

selectivos diferenciales que devienen en cambios genéticos importantes de las poblaciones

explotadas. En este sentido se ha observado frecuentemente en las pesquerías sobreexplotadas

una tendencia a la disminución de tamaño de los individuos, así como una mayor precocidad

en la maduración sexual (Larkin, 1977; Nelson y Soulé, 1987). En relación con la gestión de

recursos, existe cada vez un consenso más amplio respecto de la necesidad de mantener

reservorios genéticos específicos dentro de cada región. Esta práctica supondría además de un

seguro para el futuro de la especie, el necesario análisis para la evaluación y priorización de

los recursos a conservar, y además tendría un aconsejable componente de concienciación

social (Moritz et al., 1995; Petit et al., 1998; Laikre et al., 1999).

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La pérdida de recursos genéticos dentro de la especie puede producirse de manera drástica por

la eliminación de poblaciones diferenciadas, pero también la propia disminución del tamaño

efectivo poblacional puede tener efectos negativos sobre la viabilidad y futuro de las

poblaciones (Frankel y Soulé, 1981; Lande y Barrowclough, 1987). Esta disminución

conlleva inevitablemente la pérdida de diversidad genética por deriva, y el apareamiento entre

parientes que puede determinar la aparición de fenómenos de depresión consanguínea. En

ambos casos la viabilidad de las poblaciones se ve seriamente comprometida, ya que la

variabilidad genética representa el seguro adaptativo frente a la impredicibilidad ambiental, y

la depresión consanguínea es responsable de una disminución de la eficacia biológica como

consecuencia de una mayor susceptibilidad a enfermedades, menor viabilidad, etc., de las

poblaciones afectadas (Lande, 1994; Frankham, 1995).

La introducción de especies o stocks foráneos puede también afectar seriamente a los recursos

genéticos de una especie por extinción de las poblaciones nativas, hibridación que rompa los

complejos genéticos que permiten la adaptación a las peculiaridades del medio, o

introducción de parásitos y enfermedades con los que no han tenido contacto previo las

poblaciones nativas (Hindar et al., 1991; Ryman y Laikre, 1991; Ryman et al., 1995). En

relación con esta cuestión, es importante que los programas de repoblación se apliquen en

aquellas áreas realmente deterioradas, dentro de un modelo de gestión autosostenible.

Igualmente, es necesario evaluar la cantidad de individuos a liberar en relación con el tamaño

efectivo y el grado de diferenciación de las poblaciones repobladas para evitar cambios

genéticos en dichas poblaciones (Ryman, 1991). Por esta misma razón, la reproducción

asistida (“supportive breeding”), considerado un medio de gestión inocuo, puede alterar la

composición genética de las poblaciones en función del número de reproductores utilizados

(Hansen, 2002). Por otro lado, los stocks usados para repoblar un área deberían ser

genéticamente representativos de las poblaciones nativas. En este sentido, cobra gran

importancia la caracterización de las unidades operacionales de conservación (OCUs), pues

con ello se intenta delimitar la existencia de recursos genéticamente diferenciados que serán

tratados como una unidad desde el punto de vista de la gestión y conservación (Moritz, 1994).

Finalmente, es necesario hacer hincapié también en el mantenimiento en el tiempo de las

características genéticas de los stocks utilizados para la repoblación, tratando de evitar los

cambios producidos por deriva (efectos fundadores, tamaño efectivo poblacional),

consanguinidad (depresión por apareamiento entre parientes), y selección en las nuevas

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condiciones de cautividad (Ryman y Stähl, 1980; Stähl, 1983; Leary et al., 1985; Meffe,

1990; Skaala et al., 1990), introduciendo de forma regular reproductores desde las

poblaciones naturales.

Cuando se decide repoblar, además de utilizar un stock apropiado, tal como se comentó

anteriormente, es necesario monitorizar el impacto y el éxito de la repoblación. La existencia

de marcadores genéticos diagnóstico en la trucha común entre el stock Centroeuropeo

utilizado durante años para la repoblación en la península Ibérica y las poblaciones nativas,

facilita la evaluación y seguimiento de esta práctica de gestión. Así, el locus LDH-C* se

encuentra fijado para el alelo *100 en las poblaciones nativas, mientras que lo está para el

alelo *90 en los stocks, constituyendo un excelente marcador diagnóstico. Este marcador se

ha utilizado para evaluar el impacto de las repoblaciones en la península Ibérica (Morán et al.,

1991; García-Marín et al., 1991; Arias et al., 1995). Los resultados obtenidos demuestran que

tras años de repoblación las poblaciones Cantábricas y Gallegas apenas muestran presencia de

repobladores, incrementándose la incidencia de ésta conforme nos aproximamos a la zona

Mediterránea donde se encuentran valores de impacto promedios entre el 10-20% (Sanz et al.,

2000; Bouza et al., 2001). La utilización de stocks híbridos, y más recientemente procedentes

de poblaciones nativas, hace necesario la utilización de marcadores más resolutivos como los

loci microsatélite para hacer un seguimiento de las repoblaciones. Estos marcadores muestran

tal variación genética que es posible asignar los individuos muestreados a sus poblaciones de

origen o incluso identificar los sus progenitores, caso de que exista información de los

mismos (Hansen et al., 2000; Hansen, 2002).

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2. Material y Métodos

I. Metodología aplicada

Toma de muestras

Las 46 muestras analizadas en el presente estudio (Tabla 1; Fig. 1) fueron recolectados

mediante pesca eléctrica por el personal responsable de Medio Ambiente de las distintas

Delegaciones Provinciales. Esta memoria recoge el trabajo global previsto en el convenio

establecido. Así, se han analizado 38 poblaciones naturales de 8 cuencas agrupadas en 6

regiones de drenaje: Región Cantábrica, Arco Ártabro, Atlántica, Miño, Limia y Duero. La

cuenca del Miño se ha subdividido en tres subregiones principales atendiendo a su dimensión

geográfica: curso alto, Sil y curso bajo. Se han analizado también muestras de cuatro

capturaderos seleccionados (Ximonde, Goo, Invernadeiro y Freixa), así como de los cuatro

stocks de repoblación (Sobrado, Veral, Carballiño y Carballedo). Las poblaciones naturales se

han seleccionado siguiendo diferentes criterios con el fin de poder obtener la información

suficiente para la definición de las unidades de gestión y evaluar el impacto de la repoblación

con el stock Centroeuropeo: 1) zonas de cabecera no repobladas; 2) cotos de pesca

repoblados; 3) principales cuencas fluviales (Tabla 1, Fig. 1).

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Tabla 1.- Características de las poblaciones de trucha común (Salmo trutta) analizadas en el presente estudio. N: tamaño muestral. Región POBLACIONES Río Cuenca Provincia N

NV Navia Navia Lugo 30 EO Eo Eo Lugo 30 MS Masma Masma Lugo 30

Cantábrica

LA Landro Landro Lugo 30 EU Eume Eume Lugo 30 XU Xubia Xubia A Coruña 30 MEN Mendo Mandeo A Coruña 30 MAN Mandeo Mandeo A Coruña 30 AN Anllóns Anllóns A Coruña 30

Ártabra

LAG Do Lago Do Lago A Coruña 30 XA Xallas Xallas A Coruña 30 TN Tines Tines A Coruña 30 SAM Samo Tambre A Coruña 30 U Ulla Ulla Pontevedra 30 RO De Rois Ulla Pontevedra 30 PE Pereiro Ulla Pontevedra 30

MT Coto Pesca Monteporreiro Lérez Pontevedra 16

Atlántica

PV-VE Coto Pesca Ponteverdugo Verdugo-Oitavén Pontevedra 32

LE Lea Miño - Alto Lugo 30 MG Magdalena Miño - Alto Lugo 30 NA Narla Miño - Alto Lugo 30 CH Chamoso Miño - Alto Lugo 30 NE Neira Miño - Alto Lugo 30 FE Ferreira Miño - Alto Lugo 30 BU Bubal Miño - Alto Lugo 30 MA Mao Miño - Sil Lugo 30 LO Lor Miño - Sil Lugo 30 ET Etoma Miño - Sil Ourense 21 BB Bibei Miño- Sil Ourense 30 VI Viñao Miño - Bajo Ourense 30 AR Arnoia Miño - Bajo Ourense 30 DV Deva Miño - Bajo Ourense 30 AL Coto Pesca Lougares Miño - Bajo Pontevedra 30

Miño

TEA Coto Pesca A Fillaboa Miño - Bajo Pontevedra 30 MN Montaña Limia Ourense 30 Limia SL Salas Limia Ourense 30 ME Mente Duero Ourense 30 Duero BL Bubal Duero Ourense 30 CXI Capturadero Ximonde Ulla A Coruña 30 CGO Capturadero Goo Miño Lugo 30

CIN Capturadero Parq. Nat. Invernadeiro Miño Ourense 30

Capturaderos

CFR Capturadero A Freixa Miño Pontevedra 30 PS Stock Sobrado A Coruña 30 RV Stock Veral Lugo 30 RCR Stock Carballiño Ourense 30

Stocks

RCA Stock Carballedo Pontevedra 45

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Análisis de la Estructura Genética en Salmo trutta ________________________________________________________________________________________

Figura 1.- Localización de las poblaciones naturales muestreadas. Códigos de colores en Tabla 1

Análisis de microsatélites

En el presente estudio se han seleccionado 10 loci microsatélite (Str58, Str60, Str73, Str85,

Str543, Str591, Ssa85, Ssa171, Ssa197, y Ssosl.438; Tabla 2) recomendados en estudios

previos por su nivel de polimorfismo, ausencia de alelos nulos y fiabilidad técnica en la

trucha común, entre los más de 100 caracterizados en esta especie por diferentes autores

(Laikre et al., 2000; TROUTCONCERT; EU FAIRCT97-3882;

http://www.qub.ac.Uk/bb/prodohl/TroutConcert/TroutConcert.htm).

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http://www.qub.ac.uk/bb/prodohl/TroutConcert/TroutConcert.htm


La extracción de ADN se realizó según el procedimiento descrito por Walsh et al. (1991) a

partir de aleta adiposa. La amplificación de cada locus microsatélite se realizó siguiendo un

protocolo específico (Tabla 2), y se valoró mediante electroforesis en gel de agarosa. Una

vez estimada la cantidad de ADN obtenida por PCR, se procedió al análisis de los

fragmentos en un secuenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems) para el

genotipado de los loci microsatélite. Tabla 2.- Condiciones de amplificación y características de los loci microsatélite utilizados en el presente estudio. Se indica también la variación (número de alelos y rango alélico) observada en estudios previos (TROUTCONCERT; EU FAIR CT97-3882; http://www.qub.ac.Uk/bb/prodohl/TroutConcert/TroutConcert.htm)

Locus Temp. annealing

Nº alelos observados

Rango (pb) Rep. Secuencia Primer

Str15INRA 58oC 10 193-225 CT 5'-TGCAGGCAGACGGATCAGGC-3' 5'-AATCCTCTACGTAAGGGATTTGC-3'

Strutta 58 56oC 38 102-190 GT 5'-AACAATGACTTTCTCTGAC-3' 5'-AAGGACTTGAAGGACGAC-3'

Str60INRA 60oC 9 87-111 GT 5'-CGGTGTGCTTGTCAGGTTTC-3' 5'-GTCAAGTCAGCAAGCCTCAC-3'

Str73INRA 58oC 11 138-162 GT 5'-CCTGGAGATCCTCCAGCAGGA-3' 5'-CTATTCTGCTTGTAACTAGACCTA-3'

Str85INRA 55oC 19 146-200 CT 5'-GGAAGGAAGGGAGAAAGGT-3' 5'-GGAAAATCAATACTAACAA-3'

Str543INRA 55oC 24 119-169 CT 5'-ATTCTTCGGCTTTCTCTTGC-3' 5'-ATCTGGTCAGTTTCTTTATG-3'

Str591INRA 55oC 22 146-198 CT 5'-CTGGTGGCAGGATTTGA-3' 5'-CACTGTCTTTCGTTCTT-3'

Ssa 85 60oC 6 104-114 CT 5'-AGGTGGGTCCTCCAAGCTAC-3' 5'-ACCCGCTCCTCACTTAATC-3'

Ssa197 60oC 18 107-177 GTGA (+GT)

5'-GGGTTGAGTAGGGAGGCTTG-3' 5'-TGGCAGGGATTTGACATAAC-3'

SsoSL438

5 x 54oC to 48oC with 1

degree interval

7 103-115 GT 5'-GACAACACACAACCAAGGCAC-3' 5'-TTATGCTAGGTCTTTATGCATTGT-3'

Las condiciones de amplificación utilizadas para los 6 loci empleados son las descritas por

Laikre et al. (1999). El programa de amplificación se ha llevado a cabo en termocicladores

MJ RESEARCH PTC-100 usando tubos de paredes ultrafinas según el siguiente protocolo:

1)Desnaturalización inicial de 94ºC durante 5 minutos. 2) Treinta y cinco ciclos de

amplificación: a) Desnaturalización: 94ºC durante 50 segundos. b) Temperatura de

anillamiento durante 35 segundos. c) Extensión: 72ºC durante 45 segundos. 3) Extensión

final de 72ºC durante 10 minutos.

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http://www.qub.ac.uk/bb/prodohl/TroutConcert/TroutConcert.htm


La estimación del tamaño alélico de los fragmentos de ADN microsatélite se ha realizado

mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución en un secuenciador

automático ABI 3100 (APPLIED BIOSYSTEMS) y el software GENOTYPER, específico

para análisis de fragmentos. Para la estimación del tamaño de los fragmentos se utilizaron

marcadores internos de tamaño conocido, y escaleras alélicas específicas para cada locus

como estándares externos de tamaño. Los alelos se nombraron según el tamaño del

fragmento en pares de bases, obteniéndose dos alelos en los individuos heterozigotos y uno

en los homozigotos.

Análisis del locus LDH-C*

Para analizar el impacto de la repoblación en las 42 poblaciones naturales muestreadas,

incluyendo los cuatro capturaderos, se utilizó inicialmente el marcador diagnóstico LDH-

C*, que se encuentra fijado para el alelo *100 en las poblaciones nativas del Sur de

Europa, Galicia, y para el alelo *90 en el stock Centroeuropeo. Este análisis se realizó

mediante RFLPs de la región diferencial de este locus siguiendo el protocolo descrito por

McMeel et al (2001). En la Figura 2 se presenta una foto del gel de agarosa donde se

muestran los distintos genotipos para LDH-C* detectados usando esta técnica.

Figura 2.- Genotipos para el locus diagnóstico LDH-C* en una muestra de 38 individuos. Los carriles 1 y 21 son estándares de tamaño, que permiten posicionar las bandas de interés entre 300 y 400 pb. Los individuos con una sola banda son homozigotos *90/90 (la inferior; por ejemplo 5, 33, 34) o *100/100 (la superior; 3, 4, 6), mientras los individuos con dos bandas son heterozigotos *90/100.

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Análisis estadístico

Impacto de la repoblación y potencial diagnóstico de los loci utilizados

Habitualmente, se ha utilizado el locus diagnóstico LDH-C* para evaluar el impacto de las

repoblaciones, al estar fijado para el alelo 100* en las poblaciones nativas del sur de

Europa y para el 90* en los stocks de repoblación (Martínez et al., 1993). Sin embargo, la

ulización de stocks mixtos en los últimos años en Galicia, hace necesario por un lado el

análisis de los stocks existentes, y por otro, la utilización combinada de marcadores

genéticos resolutivos. En consecuencia, en el presente estudio se analizaron en primer

lugar los stocks de repoblación existentes en Galicia. Esto permitió conocer el grado de

diferenciación genética entre los stocks y las poblaciones nativas, y estimar en

consecuencia el valor diagnóstico de los marcadores genéticos utilizados.

Los stocks gallegos resultaron todos introgresados en mayor o menor medida por

poblaciones nativas de diferente origen, por lo que el locus LDH-C* no era suficiente por

sí solo para la evaluación de las repoblaciones. Teniendo en cuenta esto, y que la mayor

parte de la repoblación en Galicia se ha realizado históricamente con el stock de origen

Centroeuropeo se consideró esencial el análisis de una muestra Centroeuropea pura. Este

stock se ha podido analizar gracias a la muestra cedida por el Gobierno de Castilla-León

procedente de Burgos (HBU), y ha sido una referencia esencial para evaluar el impacto de

las repoblaciones. Esta opción es la más apropiada, tanto por carecer de un stock de estas

características en Galicia, como por la escasa diferenciación genética existente entre los

stocks de origen Centroeuropeo en la Península Ibérica (García-Marín et al., 1991;

Martínez et al., 1993).

Mediante comparación de cada población o región (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Miño y

Duero) con el stock Centroeuropeo se pudieron identificar los alelos diagnóstico

(exclusivos o privados de los stocks de repoblación) que se usaron para monitorizar el

impacto de la repoblación en cada población y/o región considerada. Únicamente en las

poblaciones del Limia, ambas introgresadas, no fue posible identificar los alelos

diagnóstico al no disponer de ninguna población nativa pura, por lo que se utilizó

únicamente el locus diagnóstico LDH-C* para estimar el grado de introgresión. En

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cualquier caso, teniendo en cuenta la utilización de stocks mixtos en Galicia en los últimos

años, los valores obtenidos representan una infraestima del impacto real de las

repoblaciones. El conocimiento detallado de las repoblaciones realizadas en los últimos

años con los stocks mixtos gallegos sería esencial para obtener una imagen más precisa del

impacto de las repoblaciones en Galicia.

En función de las frecuencias alélicas en cada región en comparación con el stock

Centroeuropeo, se evaluó el potencial diagnóstico de cada locus microsatélite en cada

región utilizando el estimador de Ayala y Powell (1972). Según estos autores, el potencial

diagnóstico de un locus es la probabilidad de clasificar correctamente un individuo en las

dos poblaciones o grupos considerados en función de las frecuencias génicas de los loci

empleados (en nuestro caso nativos o repobladores). Este valor oscila entre 0 y 1, siendo

tanto mayor el potencial diagnóstico cuanto más nos aproximemos a 1, en cuyo caso se

tratara de un locus diagnóstico completo.

Para conocer el grado de introgresión de las poblaciones nativas hemos considerado la

presencia de alelos diagnóstico en cada una de las regiones y tenido en cuenta únicamente

los alelos diagnóstico de repoblación a frecuencia superior a 0,1 para evitar los errores de

muestreo asociados a los alelos presentes a baja frecuencia. Por otro lado, la presencia de

valores aberrantes por exceso en algunos alelos (superiores a 1), siempre a baja frecuencia

en el stock de repoblación, se corrigió considerando máxima la introgresión (1) para dichos

alelos. De esta forma hemos calculado el grado o porcentaje de introgresión como la

proporción de alelos de repoblación en la muestra analizada promediada sobre los loci

estudiados (10 loci microsatélite y LDH-C*).

Cuantificación de la diversidad genética.

Los alelos detectados en este estudio son codominantes, de manera que a partir de los datos

genotípicos individuales observados (Apéndice I) se obtuvieron las frecuencias alélicas o

génicas (Apéndice II) mediante el programa FSTAT (Goudet, 1995). Para la cuantificación

de la diversidad genética se estimaron el número medio de alelos por locus (A) y la

heterozigosis media esperada por locus o índice de diversidad genética (He; Nei, 1987).

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Para el ajuste a las frecuencias de equilibrio Hardy-Weinberg (H-W), que supone la unión

al azar de los gametos en la población analizada y en consecuencia el apareamiento

aleatorio entre los individuos de dicha población, se utilizaron tests exactos de

probabilidad usando el método de la cadena de Markov (Guo y Thompson, 1992) del

programa GENEPOP (Raymond y Rousset, 1995). Se rechaza la hipótesis nula de

equilibrio H-W cuando la probabilidad obtenida es menor que el valor crítico del 5%

(α=0,05). La corrección secuencial de Bonferroni se aplicó para obtener el valor crítico

para múltiples test sobre los 10 loci por población (P<0.005; Rice, 1989). Para conocer el

sentido y la magnitud de la desviación respecto a las condiciones de equilibrio H-W en

cada locus (exceso o defecto de heterozigotos) se utilizó el índice de fijación F que se

corresponde con el Fis de Wright (1969), y obtenido en este estudio mediante el método

descrito por Weir y Cockerham (1984) en el programa GENEPOP, versión 3.1 (Raymond

y Rousset, 1995).

Análisis de estructura y diferenciación entre poblaciones

Para el análisis de estructuración poblacional se utilizaron los índices de fijación o

estadísticos F (Wright, 1969), que descomponen la diversidad genética total en sus

componentes intra (HS/HT) e interpoblacional (GST; Nei,1973; 1977). Este último

estadístico, GST, denominado coeficiente relativo de diferenciación interpoblacional

proporciona una estima de la diferenciación entre las poblaciones analizadas (oscilando

entre un mínimo de 0 y un máximo de 1). Para el cálculo de la distancia genética entre

todos los pares de poblaciones se ha utilizado el estimador DA (Nei, 1987), recomendado

para el análisis de diferenciación a partir de microsatélites (Takazaki y Nei, 1996),

utilizando el programa DISPAN (Ota, 1993).

Para visualizar las relaciones genéticas entre las poblaciones analizadas se construyeron

dendrogramas para el total de las poblaciones analizadas, así como para las poblaciones

nativas y, dentro de éstas, para las de la principal cuenca fluvial analizada (Miño). Los

dendrogramas se obtuvieron mediante el algoritmo matemático Neighbor-Joining (NJ;

Saitou y Nei 1987) utilizando el programa DISPAN, a partir de la matriz de distancias

genéticas entre los pares de poblaciones correspondientes a los distintos grupos muestrales

considerados.

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II. Resultados Impacto de la repoblación Para analizar el impacto de la repoblación en las 42 poblaciones muestreadas en Galicia

(nativas+capturaderos), correspondientes a 18 cuencas fluviales (Tabla 1) y englobadas en

6 regiones de drenaje principales (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Miño, Limia y Duero) se

utilizó inicialmente el marcador diagnóstico LDH-C*, que se encuentra fijado para el alelo

*100 en las poblaciones nativas del Sur de Europa y para el alelo *90 en el stock

Centroeuropeo. En la Figura 2, se presenta una foto del gel de agarosa donde se muestran

los distintos genotipos para LDH-C* detectados usando esta técnica. En 11 de las poblaciones naturales analizadas se detectó la presencia del alelo LDH-C*90

(Apéndices I y II), 5 de ellas pertenecientes a la cuenca del Miño, incluyendo el

capturadero de Goo (LE, MG, FE, LO, CGO), una a la del Eume (EU), una a la del Xallas

(XA), una a la del Duero (BL), así como las dos analizadas en la cuenca del Limia (MN,

SL). Las frecuencias del alelo diagnóstico LDH-C*90 oscilaron entre 0.033 y 0.321

(Apéndice II). La presencia del alelo nativo LDH-C*100 en los stocks de repoblación analizados

evidenció una mezcla del stock original centroeuropeo puro con poblaciones nativas en

distinto grado durante más de una generación (ausencia de desequilibrios H-W en todos los

casos). El componente genético de origen nativo fue muy variable, siendo en dos de ellos,

RCR y PS (Apéndices I y II) de aproximadamente un 15%, mientras RV y RCA mostraron

valores muy superiores (84% y 95%, respectivamente). Este hecho planteó dificultades de

cara a identificar individuos de repoblación en las poblaciones analizadas utilizando

únicamente el locus LDH-C*. Los loci microsatélite analizados, especialmente RCR y PS, mostraron una importante

diferenciación genética respecto a las poblaciones naturales, por lo que fueron utilizados

para una evaluación del impacto de la repoblación. Sin embargo, teniendo en cuenta que la

mayor parte de la repoblación en Galicia se ha realizado históricamente con el stock de

origen Centroeuropeo se decidió utilizar como control una muestra Centroeuropea pura

(HBU; muestra cedida por el Gobierno de Castilla-León) utilizando tanto la información de

LDH-C* como la de los loci microsatélite. Mediante comparación poblacional de este

16


stock HBU utilizando las 35 poblaciones nativas no introgresadas (Apéndice II) se

identificaron alelos diagnóstico exclusivos o privados de los stocks de repoblación para

cada una de las regiones (sombreados en el Apéndice II). Únicamente en las poblaciones

del Limia, ambas introgresadas, no fue posible identificar alelos diagnóstico al no disponer

de ninguna población nativa pura de referencia. En este caso se utilizó únicamente el locus

diagnóstico LDH-C* para estimar el grado de introgresión. En la Tabla 3 se indican las frecuencias promedio de los alelos diagnóstico en los grupos

nativos poblacionales considerados (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Miño, Duero, Galicia

–todas las nativas-) respecto a los stocks de repoblación. En base a dichas frecuencias

génicas fue analizado el potencial diagnóstico de los distintos loci mediante el estimador

de Ayala y Powell (1972). Los 10 loci estudiados resultaron ser diagnóstico parcial (Tabla

4A), algunos con muy elevado potencial de diagnosis (>90%: Str15, Str58, Str85, Str543,

Sso438), y la combinación de varios de los loci más discriminantes resultó en un potencial

de identificación de los repobladores del 100%. Por otro lado, la capacidad de asignación

de parentesco de estos mismos loci resultó próxima a 1 con todos los loci o combinando

los más resolutivos, tanto cuando se conoce uno de los progenitores como cuando no se

tiene información de ninguno de ellos (Tabla 4B).

CAPT LI DU MIÑO AT ART

Introgresión media

1,000

0,900

0,800

0,700

0,600

0,500

0,400

0,300

0,200

0,100

0,000

RCA RCR RV PS CGO SL MN BL LO FE MG LE U XA EU

Figura 3.- Valores medios de introgresiólas 15 muestras introgresadas (11 poblacgallegas analizadas. Se han tenido en repoblación que estuvieran a frecuenciapresentan agrupadas en función de la reAtlántico, Miño, DU: Duero, LI: Limia,

STOCKS

n por población sobre 10 loci microsatélite y el locus LDH-C* eniones naturales y 4 stocks) detectadas en el total de 46 poblacionescuenta para su cálculo los alelos diagnóstico de los stocks des superiores a 0,10 (ver Material y Métodos). Las poblaciones segión muestral de procedencia (Tabla 1, Fig. 1; ART: Ártabro, AT:CAPT: Capturaderos y Stocks).

17


El análisis de introgresión (I) reveló la presencia de alelos diagnóstico de repoblación en

11 de las 42 poblaciones naturales analizadas, incluyendo los cuatro capturaderos

estudiados, con un rango de valores de I que osciló entre el 2% en la muestra del Ferreira,

FE, hasta un máximo del 49% en la muestra del Xallas, XA (Tabla 5; Figs. 3 y 4).

Figura 4. Valores de introgresión detectada en las poblaciones gallegas de trucha común en el presenteanálisis genético (año 2004), obtenidos combinando la información genética para 11 loci diagnóstico (10microsatélites y LDH-C*). En los diagramas circulares para cada población se representa en blanco lafracción de introgresión detectada.

18


En total se detectaron 46 individuos de repoblación sobre 1.260 analizados (<4%). El

análisis por regiones reveló, excluyendo la cuenca del Limia, bajos valores promedio de

introgresión (Cantábrica, 0%; Ártabra, 2,8%; Atlántica 6,5%; Miño, 4,6%; Duero, 2,2%;

Limia, 28%). Entre éstas, el Miño (promedio: 4,6%; 5/17 poblaciones introgresadas: LE,

MG, FE, LO, CGO; todas ellas en las subregiones Miño Alto y Sil) y la región Atlántica

(promedio: 6,5%; 2/9 poblaciones introgresadas: XA, U) evidenciaron valores algo

superiores a los restantes grupos muestrales considerados. La causa de esta diferencia está

en la elevada introgresión de unas pocas poblaciones, I>27% (XA, MG, CGO; Tabla 5;

Figs. 3 y 4). Cuando se excluyen estas muestras, los valores promedio de introgresión en la

región Atlántica y Miño se reducen drásticamente (2% y 1% respectivamente).

En cinco de las poblaciones introgresadas (EU, XA, MN, SL y CGO) se encontraron

desequilibrios H-W significativos en distintos loci (con defectos de heterozigotos) así

como globales (Tabla 6A), sugiriendo ausencia de apareamiento aleatorio en dichas

poblaciones. Esto podría explicarse por la presencia de repobladores de sueltas recientes, o

por una menor capacidad reproductiva de los repobladores, tal como había sido descrito

previamente en poblaciones gallegas introgresadas (Arias et al., 1995). La ausencia de

desequilibrios H-W en la mayor parte de las poblaciones introgresadas (exceptuando LE y

MG; Tabla 6B) sugiere la existencia de apareamiento aleatorio, y por tanto, que los

repobladores se han incorporado y reproducido con los individuos nativos.

Diversidad genética por locus y población A la hora de valorar la composición genética de las poblaciones nativas, hemos excluido

los repobladores detectados siguiendo un criterio conservativo, de forma que aquellos

individuos que mostraron alelos diagnóstico de repoblación en dos o más loci han sido

eliminados del análisis de poblaciones nativas (Apéndice I: Indicados los alelos en rojo y

en sombreado los individuos). Esta aproximación no pudo ser aplicada en cinco muestras

con alto nivel de introgresión (EU, XA, MN, SL, CGO), dado el elevado número de

repobladores encontrados, por lo que han sido excluidas en los subsiguientes análisis de

diversidad genética para caracterizar las poblaciones nativas, que finalmente engloba 37

puntos de muestreo, incluyendo 3 de los capturaderos.

19


De los 10 loci microsatélite analizados, los loci Str58 y Ssa197 fueron los que mostraron

índices de diversidad superiores en las poblaciones nativas analizadas (He: heterozigosis;

A: número medio de alelos), siendo el primero también altamente polimórfico en los stocks

de repoblación (Tablas 6A). Entre los loci menos variables, tanto en las poblaciones

naturales como en los stocks, se encuentran Str15, Str60, Str73 y Str591 (Tablas 6A y 6B).

El resto de los loci presentaron valores intermedios de diversidad por locus, mostrando las

poblaciones nativas valores ligeramente superiores a los stocks (Tablas 6A, 6B y 7). Los

valores de diversidad de los loci microsatélite resultaron muy superiores a los detectados

para loci isoenzimáticos en estudios previos (Martínez et al., 1993; Bouza et al., 1999), lo

cual proporciona una potencia superior para estudios de diversidad y diferenciación como

el presente. Por la misma razón, los loci microsatélite han evidenciado una capacidad

superior a los isoenzimas para la monitorización de la repoblación (Tabla 4A) y

especialmente, para la identificación de parentescos (Tabla 4B), tanto más alta cuanto

mayor es el polimorfismo de los loci en cuestión.

Se han calculado los valores medios de diversidad para los estimadores A y He en cada una

de las poblaciones (Tablas 6A y 6B; Figs. 5, 6 y 7) y en los distintos grupos poblacionales

considerados (Tabla 7).

20

9,000 8,000 7,000

6,000

5,000 Media 5,72

4,000 He media

3,000 A media

2,000

1,000 0,614

0,585 0,598 0,505 0,000 0,562 0,599 0,653 PS 0,677 RV 0,687 RCR RCA

He media A media HBU CXI

CGO STOCKS CIN CFR

CAPTURADEROS

Figura 5.- Valores promedio de diversidad genética (A: número de alelos y He: heterozigosis) por poblaciónsobre 10 loci microsatélite en los 4 stocks de repoblación y 4 capturaderos analizados. Se presentan tambiénlos datos correspondientes al stock utilizado como control centroeuropeo puro (HBU: Recuadrado enamarillo). Con una barra azul se señala la diversidad alélica media sobre el total de stocks y capturaderosestudiados. Códigos muestrales en Tabla 1 y Figura 1.


Media: 6,13

He media A media

9,000

8,000

7,000

6,000

5,000

4,000

3,000

2,000

1,000

0,000

0,594 0,700 0,609 0,607 0,615 0,592 0,622 0,578 0,480 0,549 0,639 0,564 0,565 0,589 0,604 0,592

He media A media

VE MT PE RO U SAM TN LAG AN MAN MEN XU LA MS EO NV

ART CANT

ART

Figura 6.- Valores promedio de diversidad genética (A: número de alelos y He: heterozigosis) por poblaciónsobre 10 loci microsatélite en 16 poblaciones nativas genéticamente englobadas dentro del Grupo Atlántico(CANT: Cantábrico, ART: Ártabro, AT: Atlántico). Con una barra azul se señala la diversidad alélica mediasobre el total de poblaciones nativas estudiadas. Los códigos muestrales aparecen en la Tabla 1 y Figura 1.

Figura 7.- Valores promedio de diversidad genética (A: número de alelos y He: heterozigosis) porpoblación sobre 10 loci microsatélite en 16 poblaciones nativas de la cuenca del Miño, agrupadas según lasubregión de procedencia (Miño-Alto, Miño-Sil y Miño-Bajo). Con una barra verde se señala la diversidadalélica media sobre el total de poblaciones nativas estudiadas. Códigos muestrales en Tabla 1 y Figura 1.

BAJO SIL

ALTO

Media: 6,13

He medi aA media

9,000

8,000

7,000

6,000

5,000

4,000

3,000

2,000

1,000

0,000

0,690 0,690 0,683 0,500 0,475 0,662

0,149 0,683 0,643

0,199 0,715 0,696 0,668 0,643 0,670 0,741

He media A media

TEA AL DV AR VI BB ET LO MA BU FE NE CH NA MG LE

21


Varias poblaciones del Miño y las dos analizadas del Duero mostraron valores de

diversidad reducidos (A<5; He<0.6), sobre todo atendiendo al estimador de diversidad

alélica, más sensible en la detección de pérdidas de variabilidad en marcadores

hipervariables. Estos valores fueron particularmente bajos en las tres poblaciones de la

cuenca del Miño: Bubal (BU; A: 2,8; He: 0.20), Viñao (VI; A: 3.3; He: 0.48), y

especialmente, en el caso de Entoma (ET; A: 1.6; He: 0.15). En esta población se

encontraron hasta 5 loci fijados para un único alelo (Str58*, Str60*, Str543*, Str591*,

Ssa197*), siendo los datos obtenidos compatibles con una única pareja de progenitores

muy emparentada. Estos resultados son indicativos de aislamiento y de procesos de deriva

genética que han determinado la consiguiente pérdida de diversidad.

El rango de valores de diversidad poblacional observado en las restantes poblaciones

resultó ser de 5,8 a 8,1 alelos por locus, y de 0.480 a 0.740 de heterozigosis, aunque

mayoritariamente reveló valores de diversidad genética por población similares (A

promedio 7; He promedio: 66%). Una observación similar se pudo constatar cuando se

compararon los valores medios de diversidad entre regiones (Tabla 7). Este resultado

contrasta con lo observado previamente con isoenzimas, donde las poblaciones del Miño

mostraban niveles de diversidad genética significativamente menores que las Cantábricas

(Bouza et al., 1999; 2001). En cualquier caso los valores observados en la mayor parte de

poblaciones estudiadas, se encuentran dentro del rango de diversidad observado con

marcadores microsatélite en otras poblaciones Atlánticas de trucha común (Carlsson et al.,

1999; Hansen et al., 2000), lo que sugiere el buen estado genético de las mismas.

Los stocks de repoblación mostraron por otro lado, valores ligeramente inferiores a las

poblaciones nativas (Tabla 7). Este resultado contrasta con lo observado previamente con

isoenzimas, que mostraban niveles claramente superiores de diversidad en los stocks

centroeuropeos puros (García-Marín et al., 1991; Martínez et al., 1993; Bouza et al.,

1999). Este hecho no parece determinado por el carácter mixto de los stocks gallegos

estudiados debido a mezcla con individuos nativos (ver Apartado Incidencia de

repoblación), ya que presentaron una diversidad genética similar a la del control

centroeuropeo puro analizado (HBU). Esto podría apuntar por un lado a un distinto

comportamiento evolutivo de los dos conjuntos de marcadores comparados (alozimas vs.

microsatélites), y por otro a la existencia de pérdida de diversidad por procesos de deriva

22


genética asociados al manejo de los stocks en piscifactoría (reproductores en bajo número,

proporción desigual de sexos, variación en los tamaños de familiares...).

Estructuración genética y diferenciación

Se detectaron en total 27 desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg en las 37

poblaciones nativas estudiadas una vez eliminados los repobladores (7% del total de tests

aplicados; Tabla 6B), la mayor parte circunscritos a las poblaciones introgresadas y al

locus Str543 (13 desviaciones), y casi siempre asociados a valores positivos de Fis (defecto

de heterozigotos). A pesar de haber eliminado los individuos de repoblación de las

poblaciones introgresadas, el criterio seguido no excluye la posibilidad de que sigan

presentes alelos de repoblación, siendo ésta probablemente la causa de los desequilibrios

observados en estas poblaciones. Por otro lado, la cantidad de desequilibrios asociados al

locus Str543 (siempre defecto de heterozigotos), que genera en la mayor parte de los casos

desequilibrios globales por población, apunta muy probablemente hacia la presencia de

alelos nulos a moderada frecuencia en las cuencas atlánticas. Considerando las poblaciones

naturales no introgresadas de las diferentes regiones analizadas, la proporción de

desviaciones significativas por locus se hace casi nula, y la mayor parte de los casos de

desequilibrios globales por población se deben a desequilibrios asociados al locus Str543,

sugiriendo que esencialmente existe apareamiento aleatorio dentro de dichas poblaciones.

Caso aparte debe considerarse la población del Mendo (MEN). Esta población presentó

una elevada proporción de desequilibrios H-W (50%) y de ligamiento (48%), estando muy

probablemente constituida por dos subpoblaciones genéticamente diferentes. Estudios

posteriores deberían confirmar si la muestra de este punto está constituida por una mezcla

de dos poblaciones distintas, o si existe un aislamiento reproductivo entre dos grupos

poblacionales genéticamente diferenciados.

Para el análisis de la diferenciación genética hemos aplicado por una lado, el análisis de

diversidad genética de Nei (1987), que descompone la diversidad genética total en sus

diferentes componentes (dentro y entre poblaciones). Este análisis se ha aplicado a todas

las poblaciones nativas y a las regiones poblacionales consideradas (Tabla 8), así como

teniendo en cuenta en un mismo análisis los diferentes componentes jerárquicos de la red

23


hidrográfica (Tabla 9). Igualmente se ha aplicado a todos los pares de regiones

consideradas (Tabla 10A y B),

Gst

0,350

0,300

0,250

0,200

0,150

0,100

0,050

0,000

Nativas Miño sil Miño bajo Miño alto Miño Atlántico Ártabro Cantábrico

Figura 8. Valores promedio del coeficiente relativo de diferenciación poblacional (Gst) sobre 10 loci microsatélite dentro de cada una de las regiones hidrográficas consideradas (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Miño), dentro de cada subregión considerada en del Miño (Alto, Bajo y Sil), así como para el total de las 37 poblaciones nativas analizadas. El valor mostrado representa la fracción de la diversidad genética total debida a diferencias genéticas entre poblaciones dentro de cada grupo muestral considerado.

El método utilizado permite descomponer la diversidad genética total observada (HT) en

sus componentes intra (HS/HT) e interpoblacional (GST). Este último nos da una estimación

de la diferenciación entre las poblaciones analizadas (rango de GST: 0-1). A su vez, el GST

puede desglosarse en un componente intrarregional (GSC) y otro interregional (GCT;

análisis jerarquizado). Por otro lado, hemos obtenido la distancia genética DA (Tabla 11;

Nei, 1987), recomendada para el análisis de diferenciación a partir de microsatélites

(Takazaki y Nei, 1996), entre todos los pares de poblaciones estudiadas. A partir de la

matriz obtenida, hemos representado las relaciones genéticas entre poblaciones mediante

varios dendrogramas utilizando el método de Neighbour-Joining (NJ; Saitou y Nei, 1987;

Figs. 9, 10 y 11), que analizan la diferenciación existente en el total de poblaciones

analizadas, en el conjunto de las nativas y dentro del Miño, respectivamente.

24


El análisis global de diferenciación para las 37 poblaciones nativas estudiadas demostró un

valor importante de diferenciación interpoblacional (GST: 0.203; Tabla 8), que pone de

manifiesto la existencia de diferenciación genética significativa en el área muestreada. Un

20% de la diversidad genética observada en el total de poblaciones nativas se debe por

tanto, a diferencias genéticas entre poblaciones. De este componente, un 14% se debe a

diferencias genéticas entre poblaciones dentro de regiones, mientras que el casi 6%

restante se debería a diferencias genéticas entre regiones (Tabla 9). La diferenciación

genética resultó igualmente significativa dentro de cada región por separado (Tabla 8; GST:

0.092, 0.112, 0.060; 0.229 y 0.279, respectivamente en Cantábrico, Artabro, Atlántico,

Miño y Duero). Los mayores valores se detectaron dentro de las regiones Miño y Duero

(Fig. 8), mientras que la menor diferenciación interpoblacional se ha encontrado en la

región Atlántica. El análisis de diversidad dentro del Miño reveló una menor

diferenciación genética dentro de la subregión Miño Alto (GST: 0.167), respecto a Miño

Bajo y Miño-Sil (GST: 0.216 y 0.318, respectivamente), particularmente alta en este último

caso. La importante heterogeneidad genética interpoblacional detectada en esta última, se

debe en parte a la inclusión de poblaciones aisladas con síntomas de erosión genética como

evidencian sus reducidos niveles de diversidad (Tabla 6B).

En las Tablas 10A y 10B se presentan los resultados del análisis de diferenciación entre

pares de regiones muestrales consideradas, en base a las frecuencias alélicas promedio. La

máxima diferenciación genética se observó entre las regiones Miño y Duero respecto a las

demás regiones analizadas (Cantábrico, Ártabro y Atlántico; GST>17% en todos los pares

de regiones comparados; Tabla 10A). La comparación entre las subregiones del Miño

(Tabla 10B) muestra una mayor diferenciación genética de la región Sil respecto a los

tramos Alto y Bajo (GST: 22% y 24%, respectivamente), aunque la divergencia genética

entre éstos dos últimos sea también importante (GST=18%). Estos valores son similares a

los descritos en trabajos previos con microsatélites en áreas de tamaño similar (Estoup et

al., 1998; Hansen et al. 2000), sin embargo son inferiores a las encontradas en el mismo

área de estudio con marcadores alozímicos (Martínez et al., 1993; Bouza et al. 1999;

2001). Conviene reseñar que este tipo de análisis, al descomponer en valores relativos la

diferenciación total observada, se ve limitado cuando la diversidad genética

intrapoblacional es elevada como es en el caso de los microsatélites (Hedrick, 1999). Es

por ello que en estos casos, este análisis se debe combinar con medidas absolutas de

25


diferenciación, como el cálculo de distancias genéticas entre todos los pares de

poblaciones, tal como se muestra en las Tablas 10A y 10B, así como en las Figuras 9, 10 y

11.

Figura 9.- Relaciones genéticas entre las 46 poblaciones de trucha común analizadas en la Comunidad de Galiciaobtenidas mediante el método de Neighborg-Joining (Saitou y Nei, 1987) a partir de las distancias genéticas DAentre todos los pares de poblaciones estudiadas, incluyendo un stock adicional como control centroeuropeo puro(HBU). La longitud de las ramas es proporcional a la diferenciación genética y los valores de las bifurcacionesindican la consistencia del agrupamiento (“bootstrap”: 1000 réplicas). Los códigos muestrales se indican en la Tabla1. Con corchetes externos se indican de modo aproximado los cuatro agrupamientos genéticos principalesdetectados: Stocks + Introgresadas, Grupo Atlántico (que engloba a poblaciones de las regiones muestralesCantábrico, Ártabro y Atlántico), Miño-Bajo (muy relacionado con el grupo Atlántico), Miño-Sil y Miño-Alto.

26


Figura 10. Relaciones genéticas entre las 37 poblaciones nativas de trucha común analizadas en la Comunidad de Galicia obtenidas mediante el método de Neighborg-Joining (Saitou y Nei, 1987) a partir de las distancias genéticas DA entre todos los pares de poblaciones nativas estudiadas. La longitud de las ramas es proporcional a la diferenciación genética y los valores de las bifurcaciones indican la consistencia del agrupamiento (“bootstrap”: 1000 réplicas). Los códigos muestrales se indican en la Tabla 1. Con corchetes externos se indican de modo aproximado los dos agrupamientos genéticos principales detectados: Grupo Atlántico (que engloba a poblaciones de las regiones muestrales Cantábrico, Ártabro, Atlántico y Miño-Bajo) vs. Miño (Miño-Sil y Miño-Alto)

Figura 11. Relaciones genéticas entre las 16 poblaciones nativas de trucha común analizadas en la cuenca del Miño obtenidas mediante el método de Neighborg-Joining (Saitou y Nei, 1987) a partir de las distancias genéticas DA entre todos los pares de poblaciones nativas estudiadas. La longitud de las ramas es proporcional a la diferenciación genética y los valores de las bifurcaciones indican la consistencia del agrupamiento (“bootstrap”: 1000 réplicas). Los códigos muestrales se indican en la Tabla 1. Con corchetes externos se indican de modo aproximado los tres agrupamientos genéticos principales detectados: Miño-alto, Miño-Sil y Miño-Bajo).

27


Las distancias genéticas absolutas DA entre todos los pares de poblaciones muestra una

concordancia general con los valores de diferenciación relativos (GST) obtenidos en los

análisis de diversidad previos (Tabla 11). Sin embargo, se corrigen al alza casi todos los

valores obtenidos por las causas que se indicaron a final del párrafo anterior. Así, las

diferencias genéticas en el total de poblaciones nativas resultaron notablemente superiores

a los valores del análisis de diversidad (DA mínima: 0.06 entre AL y TEA; DA máxima:

0.83, afectando a la muestra aislada ET; promedio DA: 0.37), reflejando de una forma más

coherente lo esperado en función de la diferenciación genética existente entre los grupos

poblacionales considerados. Dentro del grupo del Miño, BU, ET y VI mostraron elevados

valores de distancia genética respecto al resto, como corresponde a su carácter aislado y

reducida diversidad. Por otro lado, las poblaciones del Miño-Alto mostraron escasa

diferenciación entre ellas, y notable divergencia de las de los afluentes del Sil. Ambas

regiones (Miño-Alto y Sil) aparecen claramente diferenciadas de las del Miño Bajo, que a

su vez presentan similitud genética con poblaciones de otras regiones atlánticas. La

correlación significativa entre las matrices de distancias genéticas y geográficas apoya la

existencia de aislamiento por distancia en el área de estudio, a nivel inter e intracuenca

(Miño) (r=0.395; P=0.001**; r=0.249; P=0.013*, respectivamente), aunque con valores de

correlación bajos. Estos valores indican que como tendencia general los migrantes entre

poblaciones o entre cuencas tienden a hacerlo hacia las poblaciones o cuencas más

próximas.

De forma gráfica, estos valores de DA entre todos los pares de poblaciones analizados han

sido utilizados para representar las relaciones genéticas entre las poblaciones en los

dendrogramas de las Figuras 9, 10 y 11. En primer término se observa la gran

diferenciación entre los stocks con mayor componente centroeuropeo (RCR y PS),

enraizados al stock control HBU, respecto a las poblaciones nativas, pero también la

divergencia entre las regiones poblacionales muestreadas (Fig. 9). Las poblaciones

introgresadas, incluyendo uno de los capturaderos analizados (CGO), así como los

restantes stocks con elevado componente nativo (RV, RCA), aparecen a medio camino

entre el cluster centroeuropeo y las poblaciones nativas. Los tres capturaderos restantes

analizados aparecen íntimamente ligados a las poblaciones naturales más próximas dentro

de su cuenca de origen, revelando características genéticas nativas comunes (CXI-PE,

28


CFR-AL-TEA, CIN-BB; Figs. 9 y 10). En las poblaciones nativas no introgresadas se

detectó la existencia de dos grandes grupos: por un lado el que hemos denominado grupo

Atlántico, que incluye a las regiones Cantábrica, Ártabra y Atlántica, y algo más

distanciada pero en el mismo agrupamiento el Miño Bajo; y por otro, el grupo Miño, que

incluye a Miño-Alto, Sil y Duero. Dentro de este último fue posible diferenciar dos

agrupamientos: por un lado, el Miño-Alto y, por otro, un grupo Miño-Sil constituido por

las subpoblaciones estudiadas del Sil y Duero (Figs. 9 y 10). Las distorsiones más

llamativas dentro de este esquema, son la posición de las poblaciones aisladas del Miño,

Bubal (BU), Entoma (ET) y Viñao (VI). Estos resultados están condicionados, en parte,

por el propio tipo de análisis realizado que siempre “obliga” a la formación de

agrupamientos por pares de poblaciones, pero también por las propias características

genéticas de las poblaciones implicadas (aisladas, con procesos aleatorios de

diferenciación y/o características genéticas específicas).

29


III. Conclusiones

30


1. EVALUACIÓN DEL PANEL DE MARCADORES MICROSATÉLITES UTILIZADOS:

Los 10 loci microsatélite analizados en el presente estudio mostraron una diversidad

genética muy superior a la detectada con isoenzimas en estudios previos, lo que posibilitó,

tanto el análisis del impacto de la repoblación, como el estudio más detallado de la

estructuración genética en el área de muestreo. La probable presencia de alelos nulos en el

locus Str543 sugiere su exclusión de análisis posteriores. El resto de los loci constituyen

por tanto en un panel de marcadores idóneos para realizar análisis genéticos a partir de

muestreos no invasivos de las poblaciones naturales. Estos incluyen el análisis de

estructura genética y monitorización de las repoblaciones, así como el estudio de la

estructura familiar, debido al elevado potencial de estos marcadores para el análisis de

parentesco.

2. ANÁLISIS DE LOS STOCKS DE REPOBLACIÓN:

El carácter mixto de dos stocks analizados (Centroeuropeo/nativo) dificultó la

monitorización de la repoblación mediante la utilización exclusiva del locus LDH-C*. El

componente genético de origen nativo resultó muy variable entre los stocks estudiados,

siendo en dos de ellos, PS (A Coruña) y RCR (Ourense) de aproximadamente un 15%, en

contraste con RV (Lugo) y RCA (Pontevedra) con valores muy superiores (84% y 95%,

respectivamente). En consonancia, los dos primeros stocks (PS y RCR) aparecieron

genéticamente relacionados con el stock centroeuropeo puro control (HBU), y muy

diferenciados respecto a las poblaciones nativas gallegas, mientras RV y RCA aparecieron

más relacionadas con las nativas. La detección de un gran número de alelos diagnóstico en

los loci microsatélite tomando como referencia el stock centroeuropeo puro resultó acorde

con el elevado potencial de los microsatélites para la monitorización de la repoblación

(100%), por lo que el uso combinado de éstos con el locus LDH-C* permitió estimar la

introgresión e identificar los individuos de repoblación en las poblaciones nativas. Este

hecho es particularmente importante hacia el futuro, donde la monitorización de las

repoblaciones requerirá de este tipo de marcadores capaces de asignar individuos a

31


poblaciones de la misma cuenca o río, e incluso identificar sus progenitores en un stock de

repoblación de origen nativo.

3. ANÁLISIS DE LA INCIDENCIA DE LA REPOBLACIÓN:

El uso combinado de los marcadores diagnóstico permitió la identificación de repobladores

e híbridos en las poblaciones estudiadas. Únicamente se detectó presencia de repobladores

en 9 de las 42 poblaciones naturales analizadas (19%) representando un total de 46

individuos de repoblación sobre 1.260 analizados (<4%). El análisis por regiones reveló los

siguientes valores en cuanto al número de poblaciones introgresadas y la proporción de

individuos de repoblación, respectivamente: Cantábrica (0, 0%), Ártabra, (1, 2.8%),

Atlántica (2, 6.5%), cuenca del Miño –cursos Alto y Sil- (5, 4.6%), Duero (1, 2.2%), Limia

(2, 28%). Las poblaciones del Eume, Xallas y Magdalena presentaron los mayores de

introgresión por población (I>15%). El gran número de repobladores presentes en cinco de

las poblaciones introgresadas (EU, XA, MN y SL), determinó su exclusión final de los

subsiguientes análisis genéticos de poblaciones nativas. Los valores de introgresión

obtenidos en el presente estudio representan una infraestima del impacto real de las

repoblaciones al haberse tomado como referencia el stock Centroeuropeo. El conocimiento

detallado de las repoblaciones realizadas con los stocks mixtos permitiría una evaluación

más precisa del impacto de las mismas.

4. ANÁLISIS DE CAPTURADEROS:

El análisis de incidencia de repoblación mostró en primer lugar un nivel de introgresión

importante (34%) en el capturadero de Goo, en la cuenca Miño-Sil, en consonancia con

estudios previos isoenzimáticos. Los tres capturaderos restantes, que no aparecen

introgresados, han sido incluidos en el análisis genético de poblaciones nativas. En todos

los capturaderos nativos se encontraron niveles moderados-altos de diversidad genética,

que evidencian una adecuada representatividad de las muestras capturadas. En el análisis

de diferenciación genética, los tres capturaderos nativos aparecen íntimamente

relacionados a las poblaciones naturales más próximas dentro de su cuenca de origen, con

32


las que comparten características genéticas comunes (CXI-PE, CFR-AL-TEA, CIN-BB), y

confirmando el potencial de los marcadores utilizados para la asignación de individuos a

poblaciones de la misma cuenca. Las características genéticas de los capturaderos sugieren

su utilización para la recuperación de poblaciones en la misma cuenca o, caso de ser

imprescindible en la misma Unidad Operativa de Conservación.

5. ANÁLISIS GENÉTICO DE POBLACIONES NATIVAS:

Para el análisis de las características genéticas (diversidad genética y diferenciación) de las

poblaciones nativas fueron excluidos todos aquellos individuos que se consideraron de

repoblación. La cuantificación de la diversidad genética evidenció valores similares entre

la mayoría de las poblaciones nativas estudiadas, y ligeramente superiores a los stocks de

repoblación analizados, a diferencia de estudios previos con isoenzimas. Esto podría

apuntar a un distinto comportamiento evolutivo de los dos conjuntos de marcadores

(alozimas vs. microsatélites) asociado con efectos de pérdida de diversidad por deriva

genética relacionados con el manejo de los stocks en piscifactoría. Varias poblaciones de la

cuenca del Miño (Bubal, Viñao y Entoma) mostraron valores de diversidad reducidos,

particularmente bajos en ET. Estos datos parecen indicar aislamiento genético y procesos

de deriva genética que han determinado la consiguiente pérdida de diversidad. No se

detectaron diferencias significativas en los valores promedio de diversidad entre regiones,

en contrate con estudios previos con isoenzimas que mostraban una menor diversidad en el

Miño. Los valores observados en la mayoría de las poblaciones nativas se encuentran

dentro del rango descrito con microsatélites en otras poblaciones Atlánticas de trucha, lo

que soporta el buen estado genético de las poblaciones nativas.

33


6. ANÁLISIS DE DIFERENCIACIÓN GENÉTICA INTERPOBLACIONAL:

Las poblaciones nativas analizadas mostraron en conjunto una diferenciación genética

altamente significativa, lo cual sugiere la existencia de un potencial adaptativo

estructurado, cuya conservación debería ser prioritaria. Existen al menos cuatro grupos

principales altamente diferenciados acorde con la estructura hidrográfica y las

subdivisiones muestrales inicialmente consideradas (Fig. 12):

a) Un grupo de poblaciones pertenecientes a diferentes cuencas con drenaje Atlántico

que englobaría las regiones muestrales Cantábrica, Ártabra, Atlántica y Miño Bajo,

aunque con cierta diferenciación genética entre ellas.

b) Las poblaciones del Miño-Alto, muy homogéneas en la región de cabecera,

presentaron una importante divergencia genética respecto a las restantes del Miño,

así como a las de las regiones de drenaje atlántico.

c) Las poblaciones del Miño-Sil, que aparecen altamente diferenciadas dentro de

Miño y respecto a las demás regiones analizadas. Dichas poblaciones parecen exhibir

cierta similitud genética con las dos analizadas en el Duero, por lo que podrían

considerarse englobadas dentro de un grupo Miño-Sil.

d) Las poblaciones de Bubal, Viñao y Entoma con reducida diversidad genética y

notablemente diferenciadas, que podrían constituir reservorios genéticos específicos

o poblaciones erosionadas genéticamente.

34


Figura 12. Análisis de regiones genéticamente diferenciadas de Salmo trutta en Galicia en base al presenteanálisis poblacional. Los resultados aparecen acordes con las principales regiones hidrográficas analizadas. Concolores en la gama del verde se señalan las regiones de drenaje Atlántico, genéticamente relacionadas(Cantábrico, Ártabro, Atlántico y Miño Bajo), mientras que en azul se marca la región Miño, diferenciada a suvez en dos subregiones (Alto y Sil, asociada esta última con poblaciones del Duero). En rosa se marcan laspoblaciones introgresadas del Limia y encuadradas las poblaciones con síntomas de aislamiento genético.

35


7. PROPUESTA PARA LA GESTIÓN Y CONSERVACIÓN DE RECURSOS

GENÉTICOS DE LA TRUCHA COMÚN EN GALICIA:

a) Consideraciones generales sobre gestión autosostenible y repoblación.

La conservación de recursos genéticos requiere una serie de actuaciones y

orientaciones de aplicación práctica para los gestores. Tras la evaluación de los

recursos genéticos existentes en el área gestionada es posible la identificación de las

Unidades de Significación Evolutiva (ESUs), que representan unidades

genéticamente diferenciadas de la especie con potencial adaptativo o evolutivo en el

área de gestión. Estas constituyen una propuesta de máximos a conservar y gestionar.

A partir de las ESUs es posible definir las Unidades Operativas de Conservación

(OCUs), atendiendo a limitaciones socioeconómicas, y que constituyen una

propuesta de gestión y conservación más realista. Una vez establecidas, resulta

importante analizar su viabilidad para, en función del resultado, diseñar planes de

gestión, recuperación y repoblación según sea necesario (Fig. 13).

b) OCUs de Salmo trutta en Galicia: Propuesta en base al presente análisis

genético (Fig. 14).

A la hora de establecer las unidades operativas de gestión en trucha con los datos

genéticos disponibles se podrían considerar diferentes niveles relacionados en gran

medida con la jerarquía fluvial. En un extremo, dada la importante diversidad

genética interpoblacional detectada en Galicia, las OCUs podrían estar constituidas

por cada una de las subpoblaciones dentro de cada una de las cuencas consideradas.

Este criterio obligaría a un modelo de gestión autosostenible estricto. El siguiente

nivel de máximos lo constituirían cada una de las cuencas analizadas, excepto el

Miño donde se incluirían un mínimo de tres OCUs (Miño Alto, Bajo y Sil).

En un modelo más realista, las OCUs podrían constituir cada una de las regiones

hidrográficas analizadas (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Limia y Duero), salvo en el

Miño donde se incluirían al menos tres OCUs (Miño Alto, Bajo y Sil).

Adicionalmente, se considerarían los reservorios genéticos con características

genéticas diferenciadas. En el otro extremo, la propuesta más conservativa

36


englobaría la presencia de 3 OCUs principales (Grupo Atlántico, Miño-Alto y Miño-

Sil), más los reservorios genéticos.

Figura 13. Esquema ideal de actuaciones y orientaciones prácticas para la gestión y conservación de recursosgenéticos (ESUs: Unidades de significación evolutiva vs. OCUs : Unidades operativas de conservación).

Detener el impacto y diseñar plan recuperación

Valorar modelo de repoblación

Evaluación en el tiempo de los programas de gestión y conservación

Extinguida Amenazada Vulnerable Riesgo

Determinar el estatus de

riesgo

Inviable

Implementar un plan para su gestión

Viable

Viabilidad de las OCUs

Identificación OCUs

Evaluación factores socio-

económicos

Recolección datos para identificación

ESUs

37


Grupo Sil

Grupo Atlántico

Miño Alto

Figura 14. Propuesta de Unidades Operativas de Conservación (OCUs) de Salmo trutta en Galicia en baseal presente análisis genético. En un modelo realista, las OCUs podrían constituir cada una de las regioneshidrográficas analizadas (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Limia y Duero), salvo en el Miño donde seincluirían al menos tres OCUs (Miño Alto, Bajo y Sil). La propuesta más conservativa englobaría lapresencia de 3 OCUs principales (Grupo Atlántico, Miño-Alto y Grupo-Sil). Adicionalmente, seconsiderarían los reservorios genéticos con características genéticas diferenciadas.

c) Fundación y gestión de stocks de repoblación.

Una vez establecida la necesidad de repoblar, un primer paso esencial constituye la

elección de las poblaciones nativas e individuos a utilizar para la fundación de los

stocks en cada OCU. Ésta se realizaría atendiendo a criterios genéticos: i) Robusted

genética / ausencia de síntomas de erosión genética, ii) representatividad de las

38


características genéticas generales y peculariares de cada OCU, iii) control del

tamaño efectivo poblacional (número de reproductores, proporción de sexos, tamaño

de familia).

Una vez determinada la localización y el modo de estabulación de los reproductores,

sería necesario diseñar un esquema de cruzamientos para la obtención de progenies

representativas genéticamente de la OCU, evitando la pérdida de diversidad, la

consanguinidad, y minimizando los efectos de la selección en un medio diferente

como es una piscifactoría. Esto se lograría en gran medida mediante la utilización de

un censo efectivo poblacional de reproductores elevado (Ne>50) y mediante

aportaciones familiares equiproporcionales en las progenies de cada generación.

Además, sería necesaria la renovación genética del stock con individuos de las

poblaciones naturales específicas de cada OCU cada cierto tiempo. Para garantizar

estos objetivos sería necesario realizar un seguimiento temporal de las características

genéticas del stock.

En la práctica, el número y tipo de stocks de repoblación a fundar dependería, en

definitiva, del número de OCUs consideradas. Por tanto, y atendiendo al apartado

anterior, se necesitarían desde un mínimo de 3 stocks, para repoblar en cada una de

las tres OCUs principales (Grupo Atlántico, Miño Alto, Grupo Miño-Sil), hasta un

máximo de 6 (Cantábrico, Ártabro, Atlántico, Miño-Bajo, Sil, Miño-Alto).

Utilizando las instalaciones existentes actualmente se podrían fundar cuatro stocks

para repoblación en el Miño-Alto (Veral), Grupo Sil (Carballiño), Miño-Bajo

(Carballedo) y Grupo Atlánttico (Sobrado).

d) Reproducción asistida a partir de capturaderos.

Las características genéticas nativas de tres de los capturaderos analizados sugieren

su posible utilización para la recuperación de poblaciones en la misma cuenca o, caso

de ser imprescindible en la misma Unidad Operativa de Conservación (Ximonde:

Cuenca Umia-Grupo Atlántico, Freixa: Región Miño Bajo, Invernadeiro: Región

Miño-Sil). La aplicación de este sistema de reproducción asistida en poblaciones

naturales no está exento de problemas de mantenimiento temporal de la variabilidad

genética poblacional. Por tanto, se requeriría adoptar una serie de criterios genéticos

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básicos para garantizar la representatividad genética de los reproductores utilizados,

evitando pérdidas de tamaño efectivo poblacional, así como realizar una

monitorización genética temporal del proceso para detectar posibles pérdidas de

diversidad.

e) Monitorización de las repoblaciones: éxito e impacto sobre las poblaciones

nativas.

La utilización combinada del locus LDH-C* y de los loci microsatélite más

resolutivos revelados en este estudio permitiría evaluar el impacto de la repoblación.

Estos marcadores genéticos, que posibilitan muestreos no invasivos de las

poblaciones naturales, permiten la evaluación en el tiempo, tanto de la introducción y

adaptación de los repobladores, como de la introgresión generada sobre las

poblaciones nativas. El elevado potencial de los marcadores microsatélites en la

asignación de parentesco posibilita su aplicación para la trazabilidad familiar de los

stocks de repoblación en medio natural, permitiendo la identificación de los

progenitores en casos particulares, o en el seguimiento de supervivencia diferencial

entre familias de repobladores.

f) Análisis de nuevas poblaciones nativas para una mejor definición de regiones

de interés.

• Análisis de la fundación de capturaderos alternativos, por ejemplo en la

región Miño-Alto y Sil, dado el elevado nivel de introgresión del capturadero

de Goo.

• Región Miño-Sil, que aparece altamente diferenciada respecto a las demás

regiones analizadas, y con una elevada diferenciación interpoblacional.

• Poblaciones aisladas por fragmentación del hábitat.

• Poblaciones deterioradas: Entoma. Sería importante confirmar los resultados

obtenidos en la muestra analizada, compatibles con una única pareja de

progenitores muy emparentada, lo cual obligaría a restaurar mediante

repoblación.

• Mezcla de poblaciones con aislamiento reproductivo: Mendo. El análisis

genético de esta población, con pequeño tamaño muestral, ha revelado ausencia

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de apareamiento aleatorio entre dos grupos de individuos con características

genéticas diferenciadas.

Agradecimientos: A la Delegación de Medio Ambiente de la Junta de Castilla y León, por

facilitar el stock HBU como control centroeuropeo puro. A todo el personal de la

Delegación de Medio Ambiente de la Xunta de Galicia implicado en el muestreo, toma de

datos e informaciones muestrales utilizadas en el presente análisis genético.

41


IV. Bibliografía

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