ANALISIS DE LA PRESENCIA DE LIGANDOS PARA TLR2 Y TLR 4...

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ANALISIS DE LA PRESENCIA DE LIGANDOS PARA TLR2 Y TLR 4 EN LOS EXTRACTOS DIALIZABLES DE LEUCOCITOS HUMANOS (TRANSFERON) DIRECTOR DE PROYECTO: SONIA MAYRA PEREZ TAPIA

Estudio de la presencia de ligandos para TLR2 y TLR4 en el DLE humano (Transferon) 1

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RESUMEN La inmunidad innata es la primera defensa contra agentes patógenos, consta de

elementos humorales y elementos celulares. Una parte importante de la respuesta inmune innata es la presencia de los PRRs codificados en línea germinal, que son capaces de reconocer PAMPs, dentro de los PRRs se encuentran los receptores tipo toll (TLRs). Los TLRs son proteínas que inducen señalización intracelular activando genes para la producción de citocinas pro-inflamatorias e interferón de tipo I ya sea por la vía MyD88 dependiente o MyD88 independiente.

El DLE es la fracción dializable con peso molecular ≤12 Kda que provienen del

rompimiento de leucocitos o de una “buffy coat” (paquete leucocitario). Estos extractos contienen más de 200 distintas especies de moléculas. El DLE por especificidad se puede clasificar como antígeno específico y como antígeno inespecífico.

En este trabajo se analizó si dentro del DLE existen moléculas que pueden funcionar como ligando endógeno de TLR2 o de TLR4, de acuerdo a nuestros resultados obtenidos no se encontraron ligandos para TLR4, en cambio se encontraron ligandos endógenos dentro del DLE para TLR2, con ello se explican algunas propiedades inmunoestimulantes del DLE, por lo que es importante seguir estudiando el estímulo que tiene el DLE sobre las células de la respuesta inmune innata ya que es la primera línea de defensa del organismo y es la conexión con la respuesta inmune adaptativa.


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INTRODUCCION PARTE I. INMUNIDAD INNATA

La evolución ha dotado a los humanos de 2 principales mecanismos de respuesta a agentes patógenos: la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa.

La inmunidad innata proporciona una defensa rápida contra la invasión de microorganismos esta es inmediata, se sabe que sí es específica ya que hay interacción ligando-receptor, no tiene memoria y no requiere del contacto previo con el agente infectante, por otra parte, la inmunidad adaptativa tiene especificidad por antígenos microbianos y no microbianos, tiene una diversidad muy amplia debido a que los receptores son producidos por recombinación somática de segmentos de genes específicos y puede generar memoria (1).

La respuesta inmune adaptativa depende en gran medida de 2 clases de células; Linfocitos T y B, sus receptores específicos de estos son generados somáticamente en respuesta a presencia de antígenos por células profesionales presentadoras de antígenos (células dendríticas de tipo interdigitantes, macrófagos, células B). Esto provoca la expansión clonal antígeno dependiente de linfocitos T y B y da por resultado una memoria humoral y celular de larga duración, la inmunidad adquirida tarda en presentarse, por lo que la respuesta inmune innata es la primera respuesta contra la invasión de un agente infeccioso (4).

Los principales componentes del sistema de la inmunidad innata incluye elementos celulares y humorales (5)

En los vertebrados la inmunidad innata depende en gran medida de las células mieloides, estas células incluyen a fagocitos mononucleares y fagocitos polimorfonucleares. Los fagocitos mononucleares son los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos, también incluye este grupo a las células dendríticas, estas células son altamente eficientes en la presentación de antígeno a células T del sistema inmune adaptativo. Los macrófagos se distribuyen en todo el cuerpo del hospedero, en algunos casos (corazón, cerebro, pulmón e hígado) situados en el parénquima de órganos grandes. Los macrófagos son los responsables de fagocitar y matar a los microorganismos.

Los fagocitos polimorfonucleares (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) juegan un papel importante en la contención de las infecciones. Los neutrófilos particularmente se especializan en destruir a microorganismos invasores, son de corta vida, sobreviven en circulación aproximadamente 6 horas y después sufren apoptosis. Los eosinófilos (2% de leucocitos totales) y basófilos (1% de leucocitos totales) se ocupan en la producción de mediadores para propiciar un ambiente inflamatorio, además de elaborar citocinas para generar respuesta inmune adaptativa. Estas células se encuentran en mucha menor proporción que los neutrófilos (60% de


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leucocitos totales), pero particularmente los eosinófilos se producen en gran número en infecciones parasitarias o como resultado de una hipersensibilidad de tipo I en el sistema inmune adaptativo. Los mastocitos son células que residen en tejidos, son descendientes de la línea mieloide, juegan un papel similar, al igual que los eosinófilos, son importantes mediadores en una reacción alérgica.

Si se eliminaran los elementos celulares de la respuesta inmune innata se ocasionaría en el individuo una severa inmunodeficiencia, mas severa que en la observada por aplasia linfoide (como la observada en el síndrome de Di George) .

Una función vital de la respuesta inmune innata es la presentación de antígeno, sin producción de citocinas de origen inmune innato (IL-12, CD40L, IL-1, IFN tipo I y TNF-α) la respuesta inmune adquirida no se llevaría a cabo. Por ello se dice que la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa van de la mano (5).

Una parte importante de la respuesta inmune innata es su capacidad para reconocer patrones moleculares asociados a patógenos del inglés Pathogen-Associated Molecular

Patterns (PAMPs). El reconocimiento de productos microbianos es mediado por receptores codificados en

línea germinal que son referidos a los receptores de reconocimiento de patrones del inglés Pattern-Recognition Receptors (PRRs) (6).

Los PRRs pueden ser divididos en diferentes categorías, basados en su función y en su localización subcelular; PRRs solubles como las proteínas de fase aguda, MBL (mannan binding

lectin), y la proteína C reactiva (CRP, C-reactive protein), estas proteínas opsonizan y neutralizan a los patógenos, que después se eliminaran los patógenos por activación del complemento o por fagocitosis. El otro grupo de PRRs son los transmembranales incluyendo scavenger receptors, lectinas tipo C y Toll-like receptors (TLR), siendo los dos primeros receptores fagocíticos, en cambio los TLRs son proteínas que inducen señalización intracelular activando genes para la producción de citocinas pro-inflamatorias e interferón de tipo I. (3)

Algunos receptores fagocíticos, como los receptores Fc, disparan respuestas inflamatorias directamente, en tanto que otros, como los receptores del complemento no lo hacen. En muchos casos, la activación de la respuesta inflamatoria durante la fagocitosis es regulada por receptores adicionales, como los receptores TLR que aunque no son fagocíticos son reclutados a los fagosomas, y participan en la señalización de las células modulando su actividad biosintética.


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TLRs Los TLRs son PRRs que se expresan en muchas células, como macrófagos, células

dendríticas, neutrófilos y linfocitos B, además de otras células no fagocíticas (2). Los TLRs son capaces de reconocer PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Patterns),

como la Peptidoglicana (PGN), el Lipopolisacarido (LPS), RNA viral, DNA de doble cadena, aunque también pueden reconocer moléculas endógenas del huésped como la HSP 70, entre otras (mostrados mas adelante en la tabla 2).

En los TLRs el nombre de Toll se debe a la semejanza con las proteínas transmembranales presentes en embriones de la mosca Drosophila melanogaster que les permite mantener la polaridad dorso ventral. Las moscas de la fruta con mutaciones en algunos de los genes de la vía Toll son sumamente susceptibles a infección por hongos y algunos tipos de bacterias (7).

Los TLRs son receptores de señalización transmembranal esenciales del sistema inmune innato de los mamíferos que alertan al hospedero de la invasión de un microorganismo y consta de un dominio intracelular y un dominio extracelular (8).

Actualmente se conocen 11 TLRs en humanos, pero se asegura que en un futuro se descubrirán mas TLRs, esta familia de TLRs humanos se dividen en 5 subfamilias de acuerdo a la secuencia de aminoácidos

Figura 4. Árbol filogenético de TLRs humanos (26)

Tabla 1. Subfamilias de TLRs (4).

Subfamilia Receptores TLR2 TLR1, TLR2, TLR6, TLR10

TLR3 TLR3

TLR4 TLR4

TLR5 TLR5, TLR11

TLR9 TLR7, TLR8, TLR9

Tabla 2. Receptores TLR y sus ligandos más comunes (2, 9 y 15)

Receptor Ligando Origen del ligando Endógeno Exógeno

TLR1 Triacil lipopéptidos Factores solubles Lipoproteína de la superficie externa (OspA)

Bacterias Gram negativas Neisseria meningitidis

Borrelia burgdorferi

TLR2 Lipoproteínas Bacterias Gram-negativas y


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Peptidoglicana y ácidos lipoteicoicos Lipoarabinomanana (LAM) Porinas Modulina soluble en fenol LPS atípico LPS atípico Zimosan (ZN) Fosfolipomanana Manana Glucoronoxilomanana Hemaglutinina Desconocido Glicoinositolfosfolípidos tGPI-mutin Glicolípidos

Gram-positivas Bacterias Gram positivas Micobacterias Neisseria

Staphylococcus epidermidis

Leptospira interrogans

Porphyromonas gingivalis

Levaduras Candida albicans

Cryptococcus neoformans

Virus del sarampion HCMV, HSV1 Trypanosoma cruzi

Treponema

TLR3 RNA de doble cadena Virus

TLR4 HSP60 y HSP70 Fibrinógeno

Lipopolisacáridos Ácido lipoteicoico Lipoarabinomananas Glucoronoxilomanana Proteínas de envoltura

Bacterias Gram negativas Bacterias Gram positivas Micobacterias Cryptococcus neoformans

RSV, MMTV Huésped Huésped

TLR5 Flagelina Bacterias Gram negativas

TLR6 Diacil lipopéptidos Micoplasma

TLR7 RNA de una cadena Virus

TLR8 RNA de una cadena Virus

TLR9 Secuencias específicas del DNA microbiano (CpG) DNA viral Hemozoína

Bacterias y micobacterias Virus Plamodium

TLR10 Desconocido Desconocido

TLR11 Desconocido Profilin-like molecule

Bacterias uropatogénicas Toxoplasma gondii

Se ha observado que TLR1 funcionalmente se asocia con TLR2 para reconocer la

configuración lipídica de las lipoproteínas de micobacterias y tiene una homología alta con TLR6,


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lo que podría compensar una deficiencia en TLR1, la homología de TLR1 con TLR6 es del 69%, TLR2 forma un dímero con TLR6 para reconocimiento de peptidoglicana de bacterias Gram-positivas (en la figura 5 se muestran los diferentes TLRs formando homodímeros o heterodímeros para interaccionar con sus ligandos). También se ha encontrado relación filogenético entre el TLR10 con el TLR1 y TLR6 (4).

Figura 5. Los TLRs pueden reconocer productos derivados de patógenos, incluidas bacterias, hongos, virus,

parásitos y moléculas endógenas del propio hospedero (27).

Después del reconocimiento del ligando se activa un sistema de cinasas citoplasmáticas

que activan factores de transcripción en el citoplasma, este factor pasa al núcleo donde regula la transcripción de genes específicos. En Drosophila el dominio toll muestra una similitud marcada en el mecanismo de transducción de IL-1 en mamíferos (7).

TLR4 Este TLR fue el primero en caracterizarse en mamíferos, este receptor se expresa en

diversos tipos de células, predominantemente en células del sistema inmune, incluyendo células dendríticas y macrófagos. El TLR4 es activado por LPS bacteriano entre otros PAMPs. El reconocimiento de LPS por TLR4 y requiere de moléculas accesorias para que se lleve a cabo. El LPS primeramente se une a la proteína de unión a lipopolisacarido denominada en inglés LPS-Binding protein (LBP) la cual tiene como función transferir el monómero de LPS al receptor CD14, CD14 tiene alta afinidad por el LPS; el LPS es transferido por el CD14 al complejo TLR4-MD-2 (proteína accesoria). MD-2 es una proteína pequeña, es deficiente de región transmembranal y se expresa en la superficie de las células asociado con el dominio de TLR4, aunque la función precisa de MD-2 es desconocida, esta molécula es requerida para el reconocimiento de LPS por TLR4 (10).


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Otra proteína que coopera con TLR4 para el reconocimiento de LPS es RP105, la cual contiene regiones LRR, se expresa exclusivamente en la superficie de los linfocitos B. La región extracelular de RP105 se relaciona con el ectodominio de TLR4, de cualquier modo carece de dominio TIR y en su lugar tiene una corta región citoplásmica con un motivo de tirosina-fosforilada. Similar a TLR4, RP105 tiene una proteína accesoria MD-1, esta es un homologo de MD-2. El daño al gen de RP105 reduce la respuesta de las células B a LPS, la deficiencia de TLR4 en ratón provoca una respuesta totalmente nula a LPS, RP105 y TLR4 aparentemente cooperan para el reconocimiento de LPS y señalización en células B, se desconoce exactamente la naturaleza de su cooperación (10).

TLR4 señaliza a través de MyD88 activando los factores de transcripción; NF-κB, Elk-1 y AP-1, la ruta de señalización de TLR4 es similar a la activación del receptor de IL-1 por la citocina IL-1 (11). TLR2 TLR2 esta involucrado en el reconocimiento de múltiples productos de bacterias Gram-positivas, micobacterias y levaduras. El primer estudio reportaba que el LPS inducía respuesta de TLR2 pero seguramente la respuesta era producida por lipopéptidos presentes en la preparación de LPS (12). TLR2 es conocido por formar heterodímeros con otros TLRs, con ello extiende el rango de PAMPs que puede reconocer TLR2. TLR2 coopera con TLR6 en la respuesta a la peptidoglicana (13) y lipopéptido diacilado de micoplasma, también se asocia con TLR1 para el reconocimiento de lipopéptidos triacilados, el reconocimiento de patógenos por TLR2 es fuertemente incrementada por CD14 (14). Es interesante saber que TLR1 y TLR6 se expresan de manera constitutiva en muchos tipos de células, pero la expresión de TLR2 es regulada y parece que es restringida solo a células presentadoras de antígeno y células endoteliales. El reconocimiento de ligandos por TLR2 y la regulación de su expresión pueden proveer un importante mecanismo de control de la respuesta celular contra productos microbianos (10).

Los ligandos activan una serie de procesos intracelulares que culmina con la activación del factor de transcripción NF-κB (Factor Nuclear Kappa B), la proteína MyD88 activa una cinasa asociada con el receptor de IL-1 (IRAK) que a su vez se asocia con TRAF6, activando 2 vías de señalización; NF-κB y JNK, hay otra vía independiente de MyD88 que activa regiones de Interferon (7).

MyD88 juega un papel crucial en la señalización de TLRs, en una investigación que se realizó en ratones deficientes de MyD88 se observó que los TLRs pueden seguir 2 vías de


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señalización: una MyD88-dependiente primera ruta para producir citocinas proinflamatorias y para la proliferación de esplenocitos, la otra ruta es la MyD88-independiente, esta induce IFN-β y genes inducibles de IFN en señalización de TLR3 y PARTE II EXTRACTOS DIALIZABLES DE LEUCOCITOS HISTORIA

A principios de los años 40’s Landstainer y Chase describieron por primera vez la transferencia de la respuesta inmune celular (RIC) de un donador inmune a uno no inmune, utilizando células de exudado peritoneal de cobayos sensibilizados a tuberculina y cloruro de picrilo (figura 9). Se transferían las células de los animales sensibilizados a los receptores no sensibilizados y estos adquirían la capacidad de expresar RIC de los donadores (22).

Exudado peritoneal

Sensibilizados Adquieren RIC No sensibilizados de los donadores

Figura 9. Experimento de transferencia de RIC (respuesta inmune celular) de Landstainer y Chase 1940

Estudios posteriores en animales indicaron que la transferencia era mejor cuando se

realizaba entre donadores y receptores que tuvieran alguna relación singénica y sólo cuando se usaban células intactas y vivas (22). La transferencia adaptativa antígeno específica mediada por la inmunidad celular en humanos fue demostrada inicialmente por Lawrence en 1949, el utilizó linfocitos viables intactos de un individuo que daba intradermorreacción (ID) positiva a la tuberculina y los transfirió a un individuo ID negativa a la tuberculina, esto propició que el individuo al ser retado con tuberculina diera una ID positiva (18).

Estas observaciones no causaron un gran impacto dentro de la comunidad científica de la época, debido en gran parte a que al linfocito no se le reconocía aún como una célula del sistema inmunológico, sino que era estudiado únicamente desde el punto de vista hematológico (22).

En 1954 Lawrence demostró que la hipersensibilidad de tipo tardío a ciertos antígenos como PPD, toxoide tetánico y la proteína M del estreptococo podían ser transferidas por extractos solubles de leucocitos a personas no reactivas a estos antígenos, los cuales se volverían positivos a las 24 hrs (19).


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Lawrence y sus colaboradores dieron a conocer que el FT podía pasar a través de una membrana de diálisis sin que este perdiera su actividad biológica, en 1955 utilizaron un corte molecular de 20 kda y en 1963 de 10 kda (figura 10), con estos experimentos se desechaba la idea de que el efecto biológico fuera causado por anticuerpos (el más pequeño pesa alrededor de 150 kda) lo cual complico el entendimiento del mecanismo inmunológico involucrado en la transferencia, ya que los científicos no se podían explicar como moléculas tan pequeñas eran capaces de transferir RIC de manera antígeno específica, en ese momento Lawrence pensó que solo había una sola especie molecular por ello se le llamo Factor de Transferencia, hoy en día sabemos que es un conjunto de moléculas llamadas Extracto Dializado de Leucocitos DLE, de las siglas en ingles Dialyzable Leukocyte Extracts (18).

Figura 10. Experimentos de Lawrence y col en 1955 y 1963 demostrando la capacidad de transferir DTH del llamado

”factor de transferencia” hoy conocido como DLE (dializable leukocyte extrac) al hacerlo pasar por una membrana de diálisis de 20 y 10 KDa. (22)

En 1970 Lawrence observó que el DLE podía no solo transferir DTH sino que además podía producir un tipo de reacciones mediadas por inmunidad celular; esta es la inhibición de migración de macrófagos con un antígeno específico en varios estados de inmunodeficiencia (en pacientes con síndrome Wiskott-Aldrich), la transferencia antígeno-específico de CMI (Inmunidad mediada por células) proporcionaba protección por un periodo de aproximadamente de 6 meses (tabla 3), paralelamente había producción de linfocinas antígeno-especificas, semejante al factor de inhibición de migración de macrófagos (MIF) y al factor de inhibición de migración de leucocitos (LIF) por granulocitos. El término generalizado “inhibición de la migración de leucocitos” fue adoptado porque el blanco de las células era desconocido, el blanco de las células fue buscado mas tarde en los granulocitos, el viejo termino LIF, fue desafortunadamente conservado. El DLE puede transferir la habilidad para producir MIF y LIF antígeno-específico de un individuo normal quien transfería la habilidad a un individuo normal o enfermo (el individuo

20,000 Da 1955

Capacidad para transfererir DTH

Extractos leucocitario

10,000 Da 1963


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normal nunca había sido expuesto al antígeno específico, el individuo enfermo no podía producir la respuesta al recibir sobre-exposiciones)(18).

Candida PPD Coccidioidina Streptocinasa- Streptodornasa

Paperas Tricophytina

Donador Sano

+ + - + + + Pacientes Wiskott-Aldrich antes de recibir DLE

- - - - - - Pacientes Wiskott-Aldrich después de recibir DLE

+ + - + + + Tabla 3. La especificidad del DLE en la prueba de MIF usando un donador sano para una prueba de MIF dando positivo en 5 de 6 antígenos. El DLE fue administrado a pacientes Wiskott-Aldrich este era negativo para todos los antígenos de la lista. El donador dio positivas todas las pruebas menos para la coccidioidina, antes de la terapia con DLE el paciente Wiskott-Aldrich era negativo a los 6 antígenos, después de la terapia con DLE el paciente dio positivo para todos los antígenos excepto para la coccidioidina que dio negativo (18).

En 1985, Kirkpatrick CH reforzó el concepto de que la transferencia de DTH con DLE era un

evento inmunológicamente específico, al utilizar antígenos sintéticos para inmunizar ratones, obtener DLE y con éste realizar un estudio de transferencia de DTH. En estos experimentos, los ratones que recibieron el DLE, únicamente reaccionaron con el antígeno para el cual el ratón donador fue sensibilizado (22).

Ese mismo año, Kirkpatrick Ch también demostró que el FT era capaz de unirse específicamente al antígeno que le daba origen. Para ello empleó DLE obtenido de ratones sensibilizados con ferritina, posteriormente incubó los dializados en superficies plásticas cubiertas con el antígeno (ferritina) observando que, al recuperar el sobrenadante, éste perdía su capacidad de transferencia de DTH (22). Esta actividad podía ser recuperada eliminando el sobrenadante anterior y adicionando urea 8M o acetonitrilo a las placas. El fundamento de esta técnica es aún utilizado al día de hoy, para la purificación de FT específico (FTesp), sin embargo, el rendimiento de purificación es muy bajo, por lo que se tiene que partir de lotes muy grandes de DLEs, lo que dificulta enormemente la técnica (22).

Estudios realizados por Kirkpatrick y grupos de la universidad de Leipzig de Alemania, China y Rusia confirman que en el DLE existen sitios que son constantes en las moléculas de Factor de Transferencia y sitios que son hipervariables, se sugiere que los sitios hipervariables


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son antígeno-específicos, se considera que cada Factor de transferencia tiene ≈45 aminoácidos, considerando una posible combinación de los 20 aminoácidos conocidos y que se requieren en el organismo se puede dar como resultados una combinación de billones en la composición estructural de los Factores de Transferencia en su estructura primaria, esto es una especificidad para cada antígeno que existe en el repertorio inmunológico normal (18).

El DLE por su modo de acción y su tamaño molecular es posible distinguir 2 actividades: la primera es que no es específica e incrementa las actividades del sistema inmunológico como un adyuvante: la segunda es específica y como su nombre lo indica, solo aumenta la respuesta contra un antígeno determinado (la clasificación se observa mas adelante en la figura 11). Esto último fue observado por Lawrence y sus colaboradores en 1983 y recientemente se ha caracterizado como un conjunto de polipéptidos con un peso molecular de 5 kd. Esta fracción es la responsable de transmitir la inmunidad de un sujeto sano a uno enfermo y obtener un efecto terapéutico importante (19). DEFINICIONES

El extracto dializado de leucocitos o DLE (dialyzable leukocyte extract) es la fracción

dializable con peso molecular ≤12 Kda que provienen del rompimiento de leucocitos o de una

“buffy coat” (bolsa de sangre). Estos extractos contienen más de 200 distintas especies de moléculas (figura11), algunas de ellas ya han sido identificadas, por ejemplo se mencionan componentes en el DLE como timosina, prostaglandinas, hipoxantinas y nicotinamidas.

Antígeno específica ó antígeno dependiente

Figura 11. Clasificación del DLE por especificidad (18)

DLE

3500-6000 Da FACTOR DE TRANSFERENCIA NATURALEZA PEPTIDICA

3500 6000 Da •PROSTAGLANDINAS • NICOTINAMIDA • ACIDO ASCORBICO • HISTAMINA • SEROTONINA • TIMOSINA •

Antígeno inespecífica ó antígeno independiente

IMREG


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Ciertamente algunos componentes del DLE poseen características de inmunoestimuladoras y otras funcionan como inmunosupresoras (18).

Estos extractos son capaces de transferir la respuesta inmune celular (RIC) de manera antígeno específica. La transferibilidad de la RIC depende de los factores de transferencia (FT), pequeñas moléculas de origen proteico, con PM de 3.5 a 5 Kda (20).

Las preparaciones del DLE han sido utilizados terapéuticamente en diferentes padecimientos, su mecanismo de acción aún se desconoce, infiriéndose que debe de ser directo sobre células del sistema inmune. En las instalaciones de la ENCB/IPN se produce DLE para uso humano con el nombre comercial de Transferon (su preparación se menciona mas adelante en la figura 12). Como se mencionó previamente el DLE esta compuesto de pequeñas moléculas que pesan alrededor de 3.5-6 kDa, el DLE es termolábil pero estable a bajas temperaturas. Estudios realizados en el DLE sugiere que este contiene moléculas péptido-oligoribonucleotido (bases de RNA insertadas en pequeños péptidos)

El DLE usualmente es administrado vía subcutánea o intramuscular por inyección, también se administra de forma oral siendo estas alternativas igualmente efectivas. Para una acción mas rápida se puede administrar de forma intravenosa (18).

Dentro de las ventajas del DLE se encuentra su relativa facilidad de preparación, su bajo costo comparado con otros inmunomoduladores, no lleva microorganismos ni antígenos de histocompatibilidad y no produce efectos secundarios.

Aún no se conoce el mecanismo de acción preciso, se piensa que puede estimular y favorecer la proliferación de linfocitos T responsables de la inmunidad celular, aunque también tiene un claro efecto modulador en enfermedades alérgicas y autoinmunes (19).

PREPARACION DEL DLE Obtención de DLE polivalente: De una “buffy coat” se toma la fracción correspondiente

a leucocitos, después se lleva a cabo lisis de leucocitos mediante choque térmico por cambios bruscos de temperatura (congelando la muestra y descongelándola 10 veces, llevándose así la lisis de estas células), después de este procedimiento prosigue realizar una diálisis con una membrana de diálisis con un corte de 10 kDa, de este procedimiento se obtienen una gran cantidad de DLE que podrán transferir tantas respuestas celulares como las que presente el donador de donde se extrajeron las células, en la figura 11 se ejemplifica el método.


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Figura 12 Obtención de DLE polivalentes (Transferon)(22)

Obtención de DLE antígeno-específicos: Se prepara de leucocitos purificados, estos se incuban con un antígeno específico. Solamente el FT específico al antígeno es liberado al medio de cultivo y las células incubadas pierden la capacidad de transferir DTH al antígeno anterior, por lo que son los sobrenadantes son los que mantienen la capacidad de transferencia (Lawrence HS & Ascher MS 1974). Después se lisan los leucocitos, se hacen pasar por una membrana de diálisis con un corte molecular de 10 kDa y se envasan para su administración terapéutica.

Figura 13 Obtención de DLEs antígeno-específicos. (22)

APLICACIÓN DEL DLE Se han reportado múltiples beneficios en el tratamiento de pacientes tratados con DLE a

algunas enfermedades, es importante especificar que el mejoramiento del paciente depende del tipo de enfermedad a tratar, además que la dosis de ataque en cada enfermedad es diferente, en algunas enfermedades se emplea el DLE sin aplicar otro fármaco, pero otras enfermedades requieren aplicar tratamiento con DLE al mismo tiempo que con fármacos. A continuación en las tablas 5 y 6 se ejemplifican las enfermedades mas importantes en las que hay mejoría al tratar a los pacientes con DLE (22).

Tabla 5. Padecimientos en los se emplea exitosamente el DLE (22)

I.- Inmunodeficiencias severas IV Cáncer (principalmente cuando tiene etiología viral) o para evitar metástasis específicas.

A.- Defectos congénitos

• Síndrome de Wiskott-Aldrich • Ataxia telangiectasia • Síndrome de inmunodeficiencia

severa combinada • Síndrome parcial de Di George • Disgamaglobulinemia con defectos

en inmunidad celular • Síndrome de Behcet

• Melanoma • Cáncer de estómago • Cáncer de próstata • Cáncer de pulmón • Cáncer de colon • Osteosarcoma • Hipernefroma • Cáncer de mama • Carcinoma nasofaringeo

II.- Enfermedades Infecciosas producidas por V Hipersensibilidad

Estimulación con antígeno

FTs en sobrenadantes

Diálisis <10 KDa

Leucocitos de sangre periférica

Dializado Ag-específico


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A.- Hongos • Candidiasis mucocutánea crónica • Histoplasmosis diseminada • Coccidioidomicosis diseminada B.- Virus • Citomegalovirus • Herpes zoster • Sarampión • Varicela • Hepatitis C.- Bacterias • Tuberculosis • Lepra • Micobacteriosis por avium • Brucelosis • Gram positivas • Gram negativas D.- Protozoarios • Leishmaniasis cutánea

• Asma bronquial • Dermatitis atópica • Síndrome de Hiper IgE • Alergias

III.- Enfermedades autoinmunes VI Otros A.- Enfermedades autoinmunes no órgano específico

• Lupus eritematoso crónico discoide

• Síndrome de Behcet

• Síndrome de fátiga crónica • Depresión

Tabla 6. Mejoría clínica observada por la administración de DLE (22)

Año Reportado Padecimiento empleado Mejora clínica

1973 Biggard W.D. Inmunodeficiencia severa combinada

Conversión de respuestas de DTH negativas a positivas.

1978

Spitler et al. Síndrome de Wiskott- Aldrich

Conversión de respuestas de DTH negativas a positivas, mejoría clínica general

1972 Liburd et al. Parasitosis por Eimeria nieschulzi.

La administración de DLE obtenidos de células de ratas inmunes contra este parásito, protegió a animales no inmunes de ser infectados por el mismo

1991 Sumiyama et

al. Hepatitis B crónica en niños

Se observó seroconversión en los pacientes, menor detección del antígeno y no se observaron efectos adversos al compararse con el empleo de interferón alfa.

1995 Estrada-Parra et al.

Hepes SimplexTipo I Reducción en la recurrencia del padecimiento, disminución en la duración de la fase aguda del padecimiento

2001 Martín Sosa et al.

Dermatitis atópica Disminución en la severidad de las lesiones comparado con el tratamiento con talidomida, disminución en el número de eosinófilos, disminución en la concentración de IgE totales, incremento en IL-2 e IFNγ

1996 Pizza et al. Herpes genital y labial Reducción en la recurrencia y prevención empleando DLE


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bovinos específicos para el virus.

1996 Pilotti et al. Cáncer de pulmón Adyuvante en el tratamiento, suprime micrometástasis.

1996 Pizza et a Cáncer de próstata Adyuvante a quimioterapia, dando como resultado remisión total

1998 Estrada-Parra et al.

Herpes zoster Disminución del dolor en 7.85 comparado con los 12.71 del tratamiento convencional con Aciclovir

1997 Cabezas Quiroga et al.

Asma Bronquial extrínseca

Pacientes tratados con DLE no presentaron crisis de broncoespasmo, disminuyeron los valores de IgE totales, se incrementaron rosetas T en el 70% de los paciente

JUSTIFICACION

Se sabe que el DLE es una mezcla heterogenea de moléculas endógenas y que es capaz de regular la respuesta inmune tanto en modelos in vitro, in vivo y ex vivo, sin embargo aun se desconocen los mecanismos que utiliza para llevar a cabo esta regulación, por lo anterior es importante evaluar si el DLE puede inducir una respuesta inflamatoria vía ligandos de TLRs.


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HIPÓTESIS Debido a que el DLE esta formado por una mezcla heterogénea de moléculas, es posible que dentro de él se encuentren ligandos endógenos para TLRs que participen en los efectos biológicos atribuibles a dicho extracto.


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OBJETIVO GENERAL • Analizar si dentro de DLE existen ligandos para TLR2 y TLR4.

OBJETIVOS PARTICULARES • Realizar la transfección de células HEK 293 con plásmidos de TLR4, MD2 y TLR2,

TLR6.

• Analizar la presencia de ligandos para TLR2 y TLR4 en diferentes concentraciones de DLE humano.

• Analizar el efecto de la concentración de DLE en la activación factor de transcripción NF-κB, como consecuencia de la unión del TLR2 y TLR4 a sus respectivos ligandos.


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MATERIAL Y MÉTODOS

De manera general, este trabajo empleó células transfectadas con TLR2 y TLR4, las

cuáles se estimularon con diferentes concentraciones de TRANSFERON (DLE), utilizando como controles de los experimentos los agonistas específicos respectivos para cada TLR. A continuación se esquematiza el diagrama general de trabajo y posteriormente se describe a detalle cada uno de las metodologías empleadas en el desarrollo del mismo.

Figura 14. Diagrama general de trabajo

DESCONGELAR CELS HEK 293

SEMBRARDMEM C/SFB 10%

48 HRS/ 37ºC

PASAR A BOTELLA DE 80 cm2

48 HRS/ 37ºC

CONTAR CELULAS EN CAMARA DE NEUBAUER

AJUSTAR A 100000 CEL/POZO

INCUBAR 24HRS/ 37ºC

TRANSFECTAR E INCUBAR 5 HRS

ESTIMULAR E INCUBAR 24 HRS

LEER EN LUMINOMETRO ACTIVIDAD RELATIVA DE LUCIFERASA

LUCIFERINA + ATP

LISAR CELS


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1. EQUIPO Y MATERIAL UTILIZADO

• Células HEK 293

• Plásmidos de TLR2, TLR4, MD2, TLR6 y de Luc.

• Medio de cultivo DMEM (Medio de eagle modificado por Dulbecco) marca Hyclone o Gibco, suplementado con glutamina 4 mM y 10% de suero fetal bovino.

• Dimetilsulfoxido (para congelar con medio completo DMEM al 10%) Sigma

• Centrifuga.

• Incubadora con CO2.

• Placas de 24 pozos

• Placa de 96 pozos Costar 3596

• Tripsina 0.5% / 5.3mM EDTA marca Gibco.

• Botellas de 25 cm2

• Botellas de 80 cm2

• Cámara de Newbauer

• Microscopio invertido

• Azul tripano

• Puntas y micropipetas de 10, 200 y 1000 ul

• Lipofectamina (Gibco)

• Lipopolisacarido (1mg/ml)

• Peptidoglicana (2.5mg/ml)

• PBS 1x

• Luciferase Assay Reagent

• Cell Culture Lysis Reagent 1x

• Vórtex

• Luminómetro.


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2. METODOLOGIA 2.1 Descongelación de las células

1. Descongelar un vial por inmersión en agua destilada tibia. 2. Desinfectar la parte exterior del vial con etanol al 75%. 3. Vaciar el contenido del vial a un tubo con 5ml de medio de cultivo completo (DMEM con

suero fetal bovino al 10%). 4. Centrifugar 5 minutos a 1500 rpm y 15°C. 5. Decantar, resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo completo y transferir esta

suspensión a una botella con 7 ml de medio completo. 6. Incubar a 37°C y 5% de CO2.

2.2 Pase de células Se hace cada 2 o 3 días, cuando la monocapa alcanza un 80% a 90% de confluencia.

1. Retirar todo el medio de cultivo. 2. Adicionar 1ml de solución al 0.5% de tripsina/ 5.3 mM EDTA (Gibco), y dejar actuar

hasta que las células se desprendan, sin golpear la botella (entre 1 y 2 minutos) 3. Mezclar la suspensión celular varias veces con pipeta y transferir 0.5 ml a una botella

con 7 ml de medio de cultivo completo). 4. Incubar a 37°C y 5% de CO2.

2.3 Congelación de las células A partir de una botella al 80 o 90% de confluencia se obtienen dos viales, cada uno con aproximadamente 5x106 células.

1. Despegar las células (pasos 1 a 3 del apartado “pase de células). 2. Mezclar la suspensión celular varias veces con la pipeta y transferir a un tubo con 5 ml

de medio de cultivo completo. 3. Centrifugar 5 min a 1500 rpm y 15°C. 4. Decantar y resuspender las células en 2 ml de medio de cultivo para congelar frío. 5. Colocar 1 ml de esta suspensión celular en un vial (criotubo) y congelarlo a -70°C (2

años) o en nitrógeno líquido (10 años). 2.4 Transfección de las células con lipofectamina (Gibco, 2mg/ml) Día 1

1. Despegar las células (pasos 1 a 3 de pase de células). 2. Mezclar la suspensión celular varias veces con la pipeta y transferirla a un tubo con 5 ml

de medio de cultivo completo. 3. Decantar y resuspender las células en 0.5 ml de medio de cultivo completo.


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4. Contarlas en cámara de newbauer. 5. Colocar 1 ml de medio de cultivo completo por pozo en una placa de 24 pozos y

adicionar la cantidad correspondiente a 100000 células por pozo. 6. Mezclar el contenido de cada pozo con pipeta. 7. Incubar a 37°C y 5% de CO2.

Día 2 1. Colocar en tubos Eppendorf lo siguiente: Transfección

Tubo A 12.5 µl de DMEM (sin suero) 1.13 µg pTLRX 1.13 µg pX (MD2 en caso de TLR4 y TLR1 o TLR6 en caso de TLR2) 0.25 µg pLuc

Tubo B 12.5 µl de DMEM 2.5 µl de lipofectamina

La mezcla descrita en esta tabla corresponde a una transfección 1x. 2. Mezclar varias veces los tubos con pipeta. 3. Transferir el contenido del tubo A al B. 4. Retirar el medio de cultivo de las células y adicionarles a cada pozo 200 µl de DMEM

(sin aditivo). 5. Adicionarle 150 µl de medio de cultivo completo al tubo B. Mezclar varias veces con

pipeta. 6. Retirar el medio de las células y adicionarles 100 µl de medio de cultivo completo

(células sin transfectar), 100 µl del tubo B (células transfectadas con TLRX) 7. Incubar durante 5 horas a 37°C y 5% de CO2. 8. Retirar el contenido de los pozos y adicionarle 1 ml de medio de cultivo completo, solo

(células sin estímulo) o con 10 µg/ml de agonista correspondiente: lipopolisacarido (LPS) para células transfectadas con TLR4 y peptidoglicana (PGN) o zimosan (ZN) para células transfectadas con TLR2 o TRANSFERON a diferentes concentraciones.

9. Incubar 24 horas a 37°C y 5% de CO2. Día 3

2. Descongelar los viales que se vayan a usar de Luciferase Assay Reagent. 3. Retirar el medio de cultivo de las células. 4. Adicionar 1 ml de PBS y retirarlo. 5. Adicionar 60 µl de Cell Culture Lysis Reagent 1x, dejar actuar durante 1 min, lavar el

pozo varias veces con la misma solución y transferir el contenido a un tubo Eppendorf. 6. Mezclar 15 segundos en vórtex.


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7. Centrifugar 2 min a 4°C y 12000 x g. 8. Colocar 20 µl de lisado por pozo en una placa de 96 pozos Costar 3596. 9. Adicionar 100 µl de Luciferase Assay Reagent a cada pozo más el blanco. 10. Leer antes de 2 minutos en el luminómetro las unidades relativas de luz.


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3.- ESTIMULOS EMPLEADOS

POZO CONDICION DESCRIPCION 1 CELULAS SIN TRANSFECTAR Control 2 SIN ESTIMULO Transfección sin estímulo 3 ESTIMULO + Transfección + estímulo positivo ya

sea LPS para TLR4 y ZN o PGN para TLR2.

4 TRANSFERON 100 μg Transfección + estímulo de DLE de 100µg/ml

5 TRANSFERON 10 μg Transfección + estímulo de DLE de 10 µg/ml

6 TRANSFERON 1 μg Transfección + estímulo de DLE de 1 µg/ml

7 TRANSFERON 0.1 μg Transfección + estímulo de DLE de 0.1 µg/ml

4.- PRESENTACIONES DE TRANSFERON Se utilizaron las siguientes presentaciones de TRANSFERON

PRESENTACION LOTE ADITIVO CONC PROTEINA

PRUEBA LIMULUS

TRANSFERON Inyectable

06B05B Glicina y sacarosa

1197 mg totales

DLE 06B05B NO 987 mg totales

Los reportes de la prueba se Limulus, se muestran en el APENDICE


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RESULTADOS 1. Integridad de los plásmidos utilizados

Los plásmidos que contienen los genes de TLR2 y TLR4 (proporcionados por el Dr. Carsen J. Kirschning) y el gen reportero de luciferasa (Invitro Gen, CA, USA) se propagaron en la cepa de Escherichia coli DH5α, se extrajeron, purificaron y cuantificaron los plásmidos. En las figuras 15 y 16 podemos observar que están presentes los plásmidos integros, no se corto con enzimas de restricción debido a que no se conoce la construcción del pTLR2, pTLR6, pTLR4 y pMD-2, solo se conoce el mapa del pLuc y este se muestra mas abajo en la figura 17, nótese que es un plásmido de expresión y tiene un promotor para que lo reconozca el factor nuclear NF-κB, cuando este factor nuclear se une 5 veces a dicho promotor se transcribe el gen.

Figura 15. Electroforesis para detectar integridad del pTLR2, pTLR4, pTLR6 y pMD-2

Plásmido, dos cortes

PM

1

2

3

4

DNA bacteriano

Plásmido, un corte

Plásmido íntegro

RNA

Carril 1. pTLR2 Carril 2. pTLR4 Carril 3. pTLR6 Carril 4 pMD2


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Figura 16. Electroforésis para detectar integridad del pTLR4 y pLuc

pTLR4 PM pLuc

DNA bacteriano

Figura 17. Mapa del plásmido de Luciferasa

2. Control de la transfección

Las células HEK 293 naturalmente no producen TLRs, en la figura 18 se demuestra lo anterior, además de que se muestra que a las 6 horas después de transfectar las células es el tiempo de incubación óptimo en esta técnica.

Plásmido, dos cortes

Plásmido, un corte

Plásmido íntegro

RNA


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Figura 18. Control de la expresión de TLRs en células HEK 293

TLR2 TLR4 β-actina

+ -+ HEK HEK +

Con (+) y sin (-) SScript II + = cDNA de monocitos humanos de sangre periférica

TLR2

- + ST 6 18

TRANSFECCION EXITOSA

+ = cDNA de monocitos ST = cDNA de HEK sin transfectar 6 = cDNA de HEK / pTLR4, estimuladas por 6h 18 = cDNA de HEK / pTLR4, estimuladas por 18h

A continuación en la figura 19 se muestran resultados de citometria de flujo, en los cuales

se demuestra que los TLRs se están expresando en la superficie de las células HEK 293 después de transfectarlas con los plásmidos de los TLRs, se obtiene una eficiencia máxima de transfección del 30% del total de células expuestas a la transfección.

Figura 19. Expresión de TLRs en células HEK 293 al transfectarlas con TLRs

pTLR2 pTLR4

6.42% 4.81%

29.76% 21.03%


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3. Controles de TLR2 y TLR4 Después de haber demostrado que este sistema en verdad expresa TLRs en la superficie

de las células HEK 293 al transfectarlas con los plásmidos respectivos, se procedió a realizar los experimentos con DLE para buscar ligandos de TLR2 o TLR4 en dicho extracto. Primeramente se procedió a estandarizar la técnica y establecer los controles de esta técnica.

3.1 Control de TLR4 Grafica1. Controles de TLR4

TLR4 Controles

Sin tran

sfecta

r

TLR4 SE

TLR4 LPS

TLR4 Poli I

C

TLR4 LPS si

n suero

TLR4/MD2 S

E

TLR4/MD2 L

PS-505

1015202530354045

AR

L

La gráfica 1 muestra los resultados de los controles analizados para la transfección con

TLR4, en este caso los controles concuerdan con lo descrito en la bibliografía; no se observó actividad relativa de luciferasa utilizando poli I:C que es ligando de TLR3 y era lógico que no se obtuviera señalización al presentarselo a TLR4, así mismo no se observó actividad relativa de la luciferasa (ARL) en la tranfección que se hizo con el vector vacío (plásmido sin TLR4). En esta grafica también se muestran los resultados del estimulo de TLR4 con LPS observándose ARL, sin embargo el sistema que se tenía para esta transfección incluía pTLR4, pMD2 y pLuc, y se modificó la técnica usando solo pTLR4 y pLuc debido a que en un ensayo que se realizó por triplicado se obtuvo mayor ARL sin usar pMD2, en la gráfica aparentemente hay mayor ARL del sistema pTLR4, pMD2 y pLuc pero es debido a que solo se realizó un experimento por triplicado y utilizando el otro sistema pTLR4 y pLuc se realizaron varios experimentos y en cada experimento variaba la ARL al momento de leer la transfección, esto puede deberse a que en cada transfección puede varias la eficiencia de la transfección, este sistema tiene una eficiencia de transfección descrita del 30% del total de las células expuestas a la transfección.


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3.2 Control TLR2 Grafica 2. Controles de TLR2

TLR2 CONTROLES

ST

TLR2 SE

TLR2 PGN

TLR2 ZN

TLR2/6 SE

TLR2/6 PGN

TLR2/6 ZN

0

5

10

15

AR

L

La gráfica 2 muestra los resultados del análisis realizado a los controles para TLR2 dando

lecturas de ARL en ligandos positivos para este receptor como zimosan (ZN) y peptidoglicana (PGN), al momento de analizar la transfección; pTLR2, pTLR6 y pLuc, contra el sistema pTLR2 y pLuc, se obtuvo mayor lectura de ARL en el segundo al estimular ya sea con PGN y con ZN por lo que se decidió realizar los experimentos posteriores con el segundo sistema descrito (pTLR2 y pLuc).

4.- Resultados de ligandos para TLR2 y TLR4 en el TRANSFERON 4.1 Ligandos para TLR4

Gráfica 3. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE sin aditivo

TLR4 FT sin aditivo

Sin tran

sfecta

r

TLR4/MD2 S

E

TLR4/MD2 L

PS

TLR4/MD2 1

00ug FT

TLR4/MD2 1

0ug FT

TLR4/MD2 1

ug FT

TLR4/MD2 0

.1ug FT-5

05

101520253035

AR

L


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Gráfica 4. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE sin aditivo, representación en barras tomando como 100% de actividad relativa de luciferasa al control positivo.

TLR4 DLE SIN ADITIVO

TLR4-MD2 L

PS

TLR4-MD2 1

00ug D

LE

TLR4-MD2 1

0ug D

LE

TLR4-MD2 1

ug DLE

TLR4-MD2 0

.1ug D

LE0

50

100

%

Gráfica 5. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE sin aditivo

TLR4 FT sin aditivo

SE

TLR4 LPS

TLR4 FT0.1

ug

TLR4 FT0.0

1ug

TLR4 FT0.0

01

TLR4 FT0.0

001u

g

TLR4 FT0.0

0001

ug0

10

20

AR

L

Grafica 6. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE sin aditivo, representación en barras tomando como 100%

de actividad relativa de luciferasa al control positivo.

TLR4 DLE

SELPS

DLE 0.1u

g

DLE 0.01

ug

DLE 0.00

1ug

DLE 0.00

01ug

DLE 0.00

001u

g0

25

50

75

100

125

%


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Gráfica 7. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE con aditivo

TLR4 FT CON ADITIVO

ST

TLR4 SE

TLR4 LPS

TLR4 FT10

0ug

TLR4 FT10

ug

TLR4 FT1u

g

TLR4 FT0.1

ug0

10

AR

L

Gráfica 8. Transfección con TLR4 y estimulando con DLE con aditivo, representación en barras tomando como

100% de actividad relativa de luciferasa al control positivo.

TLR4 DLE CON ADITIVO

LPS

DLE 100u

g

DLE 10ug

DLE 1ug

DLE 0.1u

g0

50

100

%

En las gráficas 3 a 8 se muestran los experimentos realizados para evaluar si dentro del extracto dializado de leucocitos (DLE) existen ligandos para TLR4. Se evaluaron 2 lotes de DLE (Transferon), el lote 06B05B de DLE inyectable tenía una concentración de proteínas totales de 1197µg/unidad y no tenía aditivo (glicina y sacarosa), el lote 06BO5A de DLE inyectable tenía una concentración de proteínas totales de 987µg/unidad y tenía aditivo (glicina y sacarosa), y no se obtuvo lectura de ARL para DLE en ninguna de sus concentraciones, por lo que se descarta que dentro del DLE exista algún componente capaz de unirse como ligando a TLR4 por lo menos con el sistema utilizado. Los valores obtenidos se analizaron con el método estadístico de Kruskal Wallis arrojando solo al control positivo (LPS) como estadísticamente significativo, no hubo diferencia estadísticamente significativa al evaluar el DLE con y sin aditivo. Previamente se analizaron los lotes de DLE con la prueba de Limulus poliphemus dando negativa para LPS dentro del DLE.


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4.2 Ligando para TLR2.

Gráfica 9. Transfección con TLR2 con DLE con aditivo

y estimulando


10

0

ST

TLR2 SE

TLR2 FT10

0ug

TLR2 FT10

ug

TLR2 FT1u

g

TLR2 FT0.1

ug

TLR2 ZN

TLR2 PGN

20A

RL

Gráfica 10. Transfección con TLR2 y estimulando con DLE con aditivo, representación en barras tomando como 100% de actividad relativa de luciferasa al control positivo.


100

DLE 100u

g0

DLE 1ug ZN

DLE 10ug

DLE 0.1u

g

200

%


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Gráfica 11. Transfección con TLR2 y estimulando con DLE sin aditivo *Diferencia estadís ntra el control de ticamente significativa comparando el estímulo de DLE de 100µg/ml co

transfección con TLR2 sin estímulo, P<0.05, método de análisis de Kruskal Wallis no paramétrico.


ST

TLR2 SE

TLR2 FT10

0ug

TLR2 FT10

ug

TLR2 FT1u

g

TLR2 FT0.1

ug

TLR2 ZN

0

10

20

30

40

50

*

AR

L

Gráfica 12. Transfección con TLR2 y estimulando con DLE sin aditivo, representación en barras tomando como

100% de actividad relativa de luciferasa al control positivo.


DLE 100u

g

DLE 10ug

DLE 1ug

DLE 0.1u

g ZN0

100

200

300

400

500

%


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En las gráficas 9 a 12 se muestran los resultados en busca de ligandos para TLR2

6. Tablas de resultados TLR2

/PGN TLR2 PGN TLR4 s/LPS TLR4 LPS

dentro del DLE. Se ensayo con lotes de DLE (Transferon), el lote 06B05B de DLE inyectable tenía una concentración de proteínas totales de 1197µg/unidad y no tenía aditivo (glicina y sacarosa), el lote 06BO5A de DLE inyectable tenía una concentración de proteínas totales de 987µg/unidad y tenía aditivo (glicina y sacarosa). Los resultados nos arrojan algunos datos importantes, debido a que algunas concentraciones de DLE dieron lectura de ARL en nuestro sistema de estudio, la concentración de DLE que estadísticamente nos da una diferencia significativa es la de 100µg/ml. Los datos arrojados por estos experimentos se analizaron con el método estadístico de Kruskal Wallis debido a que en este trabajo se obtienen datos no paramétricos, dando como se mencionó mas arriba la concentración de 100µg/ml de DLE estadísticamente significativa. El DLE con y sin aditivo no dieron diferencia estadística significativa entre ellos.

Tabla 7. Controles para TLR4 y Sin transfección TLR2 s

ARL 0.2712 16.5587 20.9587 6.8847 15.2587

0.0216 4.3343 5.3753 2.9133 8.0013

abla 8. Controles para TLR4

n Vector Vacío Poli I:C S/Estimulo LPS S/SFB

ARL 0.014 9 4.9201 5.7791 8.2356 7.0091

ab Controles para TLR2

ST SE TLR2/6 PGN

TLR2/6 ZN

TLR2 ZN

TLR6 ZN

T*promedio de un triplicado

S/Transfecció0.390

T la 9.*promedio de un triplicado

A 0 6 1 RL .0147 .0303 6.9753 8.6189 6.8739 0.7033

abla 10. T con DLE B05B

TLR4/MD2 TLR4/MD2 TLR4/MD2 FT TLR4 TLR4/MD2

T LR4 lote 06 inyectable [1197µg/unidad] sin aditivo *promedio de un triplicado

S/T TLR4/MD2 TLR4/MD2


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Tabla 11. TLR4 con DLE lote 06B05B inyectable [1197µg/unidad] sin aditivo

DLE100ng DLE10ng DLE1ng DLE100pg DLE10pg LPS RL 014 791 56

Tabla 12. TLR4 con DLE lote 06BO5A inyectable

S/T R4 DLE TLR4 DLE TLR4 TLR4 DLE TLR4 TLR4

RL 6 1

Tabla 13. TLR2 con DLE lote 06B05B inyectable [1197µg/unidad] sin aditivo

2 TLR2

TLR2

TLR2 FT1 TLR2 TLR2 ZN

0.0992 6 3 69 5 Tabla 14. TLR2 con DLE lote 06BO5A inyectable 8 d iv sa

SE FT100 FT10 FT1 FT0.1 ZN PGN ARL 0.0143 4.2756 3 5.1157

S/E FT FT 10ug/ml FT 1ug/ml 0.1ug/ml LPS LPS 100ug/ml

ARL 0 6 2 .0534 6.5986 7.251 8.2569 7.6315 14.5876 50.768 36.0548

*promedio de un duplicado ST S/E A 0. 5.7 7.9125 3.824

5.1185 5.5375 5.955 8.23

[987µg/unidad] con aditivo (glicina/sacarosa) *promedio de un triplicado

TL100ug/ml

0.9581 10ug/ml

1.7861 DLE1ug/ml

1.7608 0.1ug/ml

2.1518 S/LPS

3.075LPS

5.134A 0.004

*promedio de un triplicado

ST TLRS/ESTIMULO

16.783FT100ug

34.410FT10ug

21.897µg/un

ug 21.9197

] co

FT0.1ug25.794

o (glicinaARL 22.9397

carosa) [9 ida n adit /*promedio de un triplicado

ST 6.5263 .7253

5.9713 6.6023 7.952


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DISCUSION En el presente trabajo nuestro l fue la búsqueda de ligandos en el

TRAN

so de TLR2 es diferente, ya que pudimos detectar ligandos para TLR2 en el DLE, ya que h

ado en los experimentos de TLR2 con DLE es que al parec

objetivo generaSFERON (DLE) para TLR2 y TLR4, después de analizar los resultados pudimos darnos

cuenta que aparentemente no hay ligandos en el DLE para TLR4 o por lo menos mediante este sistema no detectamos ligandos endógenos para TLR4, es importante mencionar que con estos resultados para TLR4 podemos descartar que el efecto inmunoestimulante mostrado por el DLE en diversas enfermedades no se debe a la presencia de LPS como sospechaban algunos investigadores ya que no se obtuvo un estimulo para TLR4 al agregar DLE, además previamente realizó un análisis de Limulus poliphemus esto para detectar presencia de endotoxina bacteriana en el DLE, dando la prueba negativa, esta prueba es rutinaria en la producción de Transferon (DLE), se lleva un control estricto en cada lote con respecto a la presencia de LPS en el producto.

El caubo diferencia significativa comparando el experimento de DLE con nuestro control sin

estímulo, que en este caso son las células HEK 293 transfectadas con TLR2 pero no estimuladas con Zimosan o Peptidoglicana, con ello podemos pensar que hasta cierto punto son lógicos estos resultados ya que la naturaleza del DLE es muy diversa en cuanto a las especies moleculares implicadas en este extracto, ya que es un dializado que se hace pasar por una membrana de diálisis menor a 10 kDa.

Otro fenómeno interesante mostrer el efecto de TLR2 con DLE es variable de respecto a su concentración de dicho

extracto, debido que al utilizar una concentración de 100µg/ml de DLE se observa un gran estímulo de TLR2 y en la concentración de 10µg/ml disminuye drásticamente el estímulo, sin embargo se observa un aumento de estímulo en las concentraciones de 1µg/ml y 0.1µg/ml de DLE aunque menores comparadas con la concentración de 100µg/ml de DLE, este fenómeno en cierta medida podemos explicarlo debido a que puede que a ciertas concentraciones algunas moléculas presentes en el DLE se vean inhibidas o bloqueadas por otros componentes del DLE y que al variar las concentraciones de DLE puede variar la actividad de estas moléculas.


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PERSPECTIVAS Emplear un sistema de transfección mas eficiente para incrementar el porcentaje

células positivas a la transfec tende disminuir la variabilidad al

reconocidos por TLR2,

•

ción, con ello se premomento de leer nuestros experimentos , ya que esta metodología es dependiente del porcentaje de transfección de cada experimento. Se puede emplear la citometría de flujo para que se seleccionen las células transfectadas empleando un “sorting”, otra salida a este problema es trabajar con la línea celular HEK 293 transfectada permanentemente con los plásmidos que contienen los TLRs.

• Purificar el TRANSFERON (DLE) mediante HPLC, y analizar las fracciones obtenidas para encontrar aquella o aquellas en las se presenten ligandosesto es un trabajo arduo pero que puede darnos información valiosa sobre algún mecanismo probable por el cual el DLE activa células de la inmunidad innata, ya que antes de este trabajo se pensaba que tenía que ver mas que nada con la inmunidad adaptativa; directamente sobre linfocitos T y estos resultados encontrados nos abren otro campo de estudio.

• Evaluar si existen ligandos para otros TLRs en el TRANSFERON o extracto dializado de leucocitos..


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CONCLUSIONES

• El DLE no tiene entre sus c ara TLR4, al no presentar diferencia estadística en comparación con las células sin estímulo.

concentraciones.

omponentes ligandos p

• El DLE tiene aparentemente entre sus componentes moléculas que sirven como ligandos para TLR2 de una manera variable a diferentes


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APENDICE


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ANALISIS DE LA PRESENCIA DE LIGANDOS PARA TLR2 Y TLR 4...

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