Análisis de la función mitocondrial y localización durante Embrionarias Humanas Diferenciación de Células Madre En Vitro

Andrew Prowse BJ 1 *, Fenny Chong 1 , David A. Elliott 2 , Andrew G. Elefanty 2,4 , Edouard G. Stanley 2,4 , Peter P. Gray 1 , Trent Munro P. 1 , Geoffrey W. Osborne 1,3 1 El Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología de la Universidad de Queensland, Santa Lucía, Australia, 2 de Monash Inmunología y Stem Cell Laboratorios, Universidad de Monash, en Clayton, Australia, 3 de Queensland Brain Institute, la Universidad de Queensland, Santa Lucía, Australia, el Instituto de Investigación de Niños Murdoch 4, La Real Hospital de Niños, Parkville, Australia Abstracto De células madre de embriones humanos derivados (células madre) son prometedores como viables las opciones de terapia celular para múltiples trastornos en diferentes tejidos. Los avances recientes en la biología de células madre han llevado a la producción fiable y detallada molecular caracterización de una gama de tipos de células. Sin embargo, el papel de las mitocondrias durante la diferenciación todavía tiene que ser completamente dilucidado. Las mitocondrias median unas células que responden a exigencias alterados de energía (por ejemplo, la contracción de los cardiomiocitos) y, como tal, el fenotipo mitocondrial es probable que cambie durante el proceso dinámico de hESC diferenciación. Demostramos que la manipulación de la biogénesis mitocondrial altera compromiso mesendoderm. Para investigar la localización mitocondrial durante la especificación de linaje temprana de hESCs hemos desarrollado una línea reportero mitocondrial, KMEL2, en el que las secuencias que codifica la proteína verde fluorescente (GFP) están dirigidos a la mitocondria. La diferenciación de las líneas KMEL2 en los tres capas germinales mostraron que las mitocondrias en estos progenie diferenciada son GFP positiva. Por lo tanto, hESCs KMEL2 facilitar el estudio de las mitocondrias en una gama de tipos de células y, sobre todo, permitir el análisis en tiempo real a través de las mitocondrias la etiqueta GFP. Cita: Prowse ABJ, Chong F, Elliott DA, Elefanty AG, Stanley EG, et al. (2012) Análisis de la función mitocondrial y localización durante Embrionarias Humanas Diferenciación de células madre in vitro. PLoS ONE 7 (12): e52214. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214 Editor: Yao Liang Tang, de la Universidad de Cincinnati, Estados Unidos de América Recibido 16 de agosto 2012; Aceptado 09 de noviembre 2012; Publicado 19 de diciembre 2012 Copyright: SS 2012 Prowse et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Financiación: Los autores desean agradecer a El Consejo Australiano de Investigación (ABJP, PPG, EDAD, EGS), el Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología (http://www.aibn.uq.edu.au/), la Salud y el Consejo Nacional de Investigación Médica (NHMRC) de Australia (DAE, EDAD, bienes y servicios ambientales) y la de Qatar Fondo Nacional de Investigación (DAE, EDAD, EGS) para su financiación. AGE y bienes y servicios ambientales son mayores becarios de investigación de la NHMRC. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos y análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen conflictos de intereses. * E-mail: a.prowse@uq.edu.au Introducción Las células madre embrionarias humanas (hESCs) son células pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples tipos de células de la cuerpo de un adulto. Estas poblaciones de células diferenciadoras tienen una amplia

gama de perfiles metabólicos y los requisitos de energía. Condrial dria, como las centrales eléctricas de energía responsables de la producción de ATP, desempeñar un papel fundamental suministrar la energía requerida durante la producción y la especificación de todos los linajes celulares. Caracterización de diferentes tipos de células basados en las propiedades y mitocondriales localización [1,2] indica el fenotipo mitocondrial es una consideración importante en el análisis de células madre diferenciadas progenie. Sin embargo, estudios recientes sugieren que los embriones fecundados in vitro utilizados para derivar hESCs frecuentemente contienen ADN mitocondrial múltiple mutaciones [3,4,5]. En este contexto, cabe destacar que mitocondrias trastornos drial como Ataxia de Friedreich [6] o autosómica ataxia espástica recesiva de Charlevoix-Saguenay [7] son a menudo celular tipo específico. Dada esta asociación de la disfunción mitocondrial con la enfermedad humana, conocimiento del fenotipo mitocondrial puede ser importante para todas las aplicaciones basadas en células madre en el futuro la medicina regenerativa. Las mitocondrias se heredan por vía materna orgánulos intracelulares con un genoma 16,6 kB [8]. Los codifica el genoma mitocondrial para 13 de las 80 subunidades de la cadena de transporte electrónico (ETC) responsable de la producción de ATP en el punto final de oxidativo fosforilación. El genoma mitocondrial también codifica 22 ARNt y ARNr 2 que, en un bucle de autorregulación, están involucrados en la síntesis de las 13 subunidades derivadas mitocondrial de la ETC (revisado en [9]). Replicación mitocondrial, herencia, mantenimiento y funcionamiento son controlados por un estimado de 1.500 genes codificados nucleares [10]. Dos proteínas codificadas nucleares en gamma en particular, la ADN polimerasa (POLG) y mitocondrial Un factor de transcripción (TFAM) están involucrados en el ADN mitocondrial la replicación y la transcripción [11]. Cambios en los niveles de expresión de TFAM y POLG pueden estar directamente relacionados con las variaciones en la biogénesis mitocondrial y se ha demostrado que estar presente en niveles diferentes dependiendo del tipo de célula, etapa de diferenciación y tejido de origen [12,13]. Células madre embrionarias humanas tienen relativamente pocas mitocondrias y tienen mal crestas desarrollados [14,15] con las células predominantemente depender de glucólisis para la producción de energía [16,17]. Las mitocondrias en hESCs aparecerá punteada, están localizados en la periferia del núcleo (Perinuclear) y tiene una capacidad oxidativa restringido [15,18,19]. A principios de diferenciación, las mitocondrias se someten extensa distribución y ramificación a lo largo de la celda [15,18,20] con una PLOS ONE | www.plosone.org 1 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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cambiar de la glucólisis a la fosforilación oxidativa [15,18,21]. Este fenotipo de localización mitocondrial se aplica a múltiples madre categorías de células incluyendo adultos, embrionario o inducida Las células madre pluripotentes [5,13,15]. Esta redistribución de las mitocondrias dria en hESCs desde una localización peri-nuclear a un ramificado red precede en la regulación de los marcadores de células madre típica tales como Oct-4 [20]. Se ha sugerido que las características de mitocondrias células madre y el metabolismo, como perinuclear localisa- ción, bajo contenido de ATP y una alta tasa metabólica podrían ser utilizados como un marcador de '' stemness '' [3]. De hecho, cada vez hay más pruebas que las mitocondrias y sus patrones asociados de metabolismo y

localización son, de hecho, inexorablemente ligada a mantenimiento pluripotencia miento [17] y que hESCs indiferenciadas pueden suprimir la actividad mitocondrial [13,21]. La inhibición de la función mitocondrial ción, o más específicamente la promoción de la glucólisis, mejora o mantiene la pluripotencia con o sin bFGF, respectivamente, y impide la diferenciación temprana [20,22]. Además, informes recientes sobre las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) muestran que durante la reprogramación, las propiedades de las mitocondrias y metabolismo también revertir a las de un fenotipo más células madre similares. Esto incluyó la localización alterada de las mitocondrias, mitochondri- nivel de expresión de genes asociados aliado, el contenido de ADN mitocondrial, Niveles de ATP, los niveles de lactato y el daño oxidativo [13,16,21]. Mientras que la evidencia de importante el papel de la mitocondria y juego glucólisis en el mantenimiento de células madre de pluripotencia está emergiendo, en la actualidad existe poco sabe sobre el papel mitocondrias juegan en diferenciación hESC. Se sabe que los niveles varían en las mitocondrias diferentes tipos de células [23,24] y de manera similar a su papel en la diferenciación se ha implicado en múltiples linajes incluyendo humanos células mesenquimales madre [25,26], mesangioblasts cardíacos [27] y células madre embrionarias [20]. Con base en la evidencia reciente, que Indica que el estado de pluripotencia células madre puede ser influenciada por los cambios en la fosforilación oxidativa y la glucólisis, se analizó el cambios moleculares en los genes asociados mitocondrial en respuesta a los agentes de la biogénesis mitocondrial. Por otra parte, nos muestran que la promoción activa de la biogénesis mitocondrial y fosfato oxidativo fosforilación mejora la diferenciación de las células madre hacia una primitive- racha como población mesendoderm. Por último, hemos desarrollado un línea de células madre en el que las etiquetas de las buenas prácticas agrarias fluorescencia de las mitocondrias biogénesis inicial a la madurez, allanando el camino para la futura detallada estudio de los cambios mitocondriales como hESCs diferencian hacia tipos de células maduras específicas. En conjunto, nuestros estudios reafirman la papel fundamental que desempeñan las mitocondrias en el compromiso linaje temprano y proporcionar nuevas herramientas para la investigación de este orgánulo crítica durante hESC diferenciación. Materiales y métodos Declaración de Ética Línea HESC mel2 fue derivado anteriormente en embriones de ratón capas alimentadoras de fibroblastos (MEF) en virtud de la aprobación de la australiana Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica (Licencia No. 309709). Tissue Culture Todos los reactivos de cultivo de tejidos de mamíferos descritas aquí eran de Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) a menos que se indique lo contrario. La línea reportero MIXL1 se ha descrito [28]. Todas las líneas eran proporcionado por Stem Core Queensland (Centro de Células Madre de Australia) y rutinariamente mantenida culturas pases como de forma manual en el MEF capas de alimentación como se describió previamente [29]. Antes de los experimentos, las células fueron cultivadas en cultivo a granel o adaptados para una sola célula pasaje como se describe anteriormente [30,31]. La inmunofluorescencia Las células se fijaron en etanol y se tiñeron durante la noche a 4uC para marcadores de diferenciación y pluripotencia de acuerdo con [32]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron IgG de ratón 1 anti-mitocondria (Clon 113-1, 2 m g / ml), IgG de ratón 1k anti-Oct-4 (2 m g / mL), IgG de ratón 3 anti-SSEA-4 (2 m g / ml), IgG de ratón 1 anti-Tra-2-49 (2 m g / ml), IgG de ratón 2a anti-TG30 (1 m g / ml), IgG de ratón 2a anti- a-fetoproteína (AFP, 2 m g / ml), IgG de conejo anti-nestina (5 m g / mL) y IgG de ratón 1 anti-MAP-2 (5 m g / ml), IgG de ratón 1 anti-B3 tubulina, (todos de Merck Millipore).

Isotipo específico secundaria anticuerpos fueron utilizados conjugados con Alexa Fluor 488, 568, 633 o 647. Secundaria anticuerpos fueron utilizados en 1 m g / mL. Los núcleos se contador manchado con DAPI en 1 m g / mL. La fluorescencia se visualizado utilizando un EVOS Florida microscopio invertido (Avanzada Microscopía Grupo) o un invertido LSM 510 Meta (Zeiss Microscopía, Alemania). Las imágenes y los datos del perfil de fluorescencia se generaron utilizando la imagen J (v1.41). Para imágenes de células vivas, núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (1 m g / ml) y las mitocondrias con LDS-751 (0,2 m g / ml), Mitotracker profundo rojo (vida Tecno- gías, de acuerdo con las instrucciones del fabricante) durante 15 minutos a 37uC. MitoSOX rojo se utilizó a 5 m M durante 30 minutos a 37uC. La citometría de flujo Expresión de TG30 se determinó por citometría de flujo usando una BD LSRII citómetro de flujo, tal como se describe anteriormente [32]. Las células muertas fueron discriminados utilizando 10 m g / ml de yoduro de propidio y la célula dobletes y cúmulos utilizando adelante y características de dispersión lateral [33]. Flujo se analizaron en Ecléctico y Lucid (Versión 2.0, Walter y Eliza Hall Institute para la Investigación Médica) o Cflow Sampler (v1.0.264.15, Accuri Citómetros). Imágenes de células vivas de LDS-751 manchado células madre fueron tomadas utilizando un flujo de imágenes Amnis Citómetro. Mesendoderm diferenciación específica Detección de linaje mesendoderm se realizó utilizando el MIXL1 línea reportero [28] con protocolos previamente demostrado promover la formación de mesodermo cardíaco [34]. En pocas palabras, el día antes diferenciación, las células fueron cosechadas con TrypLE SELECT y sembraron a 60-80% de confluencia en un matraz recubierto con 1610 4 / Cm 2 MEFs irradiados. El día siguiente, las células se cosecharon y se sembraron a 3000 células / pocillo de una de 96 pocillos, sin tratar de U placa inferior (Nalge Nunc International) en APEL medios con factores de crecimiento, BMP4 (20 ng / ml, R & D Systems), activina A (20 ng / ml), VEGF (40 ng / ml), SCF (30 ng / ml) y Wnt3a (100 ng / ml, todos de PeproTech) y establecer como cuerpos embrionarios giro [34]. MIXL1 relativa la expresión se midió en el día 3 basado en la fluorescencia de GFP mediante citometría de flujo en un citómetro de Accuri C6. Tabla 1. secuencias de cebadores qPCR. Cartilla Secuencia Tamaño del producto (base pares) TFAM Fwd-115 CCG AGG TGG TCT TTT TCA GT 203 TFAM Rev-317 TCC CCG CTA TAA GCA TCT TG POLG Fwd-1490 CCC ATG AGG TTT TCC AGC 127 POLG Rev-1616 AGG TAA CGC TCC CAG TTC doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.t001 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 2 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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Biogénesis mitocondrial Para probar el efecto de los agentes de la biogénesis de las mitocondrias, SNAP (S- nitroso-N-acetilpenicilamina), AICAR (5-aminoimidazol-4-car- carboxamida 1-BD-ribofuranósido) y metformina se añadieron a MIXL1 cuerpos embrionarios o alimentadoras culturas libres 2D (Geltrex TM revestimiento de la superficie y StemProH medios de comunicación) en 0-500 m M y se cultivaron durante 3 días. Antes de la extracción de RNA, células madre fueron

cosechadas con TrypLE SELECT y se sembraron a 100.000 células por pocillo de una de 24 pocillos placa recubierta con Geltrex TM en medios StemProH. Las células se crecido durante 2 días en la presencia de SNAP, y AICAR La metformina 0-500 m M antes de la cosecha para el ARN de la siguiente manera. PCR cuantitativa (qPCR) El protocolo completo usado de cerca se adhiere a las directrices recientes la realización y presentación de informes sobre los resultados qPCR [35]. Brevemente, el ARN se extraído de células madre como cultivos de células individuales utilizando el Qiagen Kit de extracción de ARN RNeasy (Qiagen). El ADN genómico se eliminado utilizando el kit de ADN libre de Turbo de acuerdo con el manufacturero instrucciones de er (Life Technologies). Un microgramo de ADN libre El ARN se convirtió en ADNc usando Super- de Life Technologies guión ADNc III kit de síntesis y oligo (dT) 20 cebadores. CDNA se 01:10 diluido antes de qPCR. Las secuencias de cebadores utilizados para la qPCR puede se encuentran en la Tabla 1. QPCR se realizó utilizando un Applied Biosystems 7500 termociclador rápido y SYBRH Verde Maestro Mezclar con 1 paso de 95uC durante 20 segundos seguido de 40 ciclos de 95uC durante 3 segundos / 60uC durante 30 segundos. Primer producto- especificidad fue confirmada por la presencia de un pico en un paso análisis de la curva de fusión en sabio y la visualización de las bandas en el 1,5% geles de agarosa. Culturas Standard StemProH se utilizaron como control de la muestra y todos los genes referenciados a mRNA b-actina humanos utilizando el método Pfaffl [36] para POLG y TFAM. b-actina se utilizó como el gen de referencia [32]. Todos los experimentos y se ejecuta qPCR fueron llevado a cabo por triplicado. La transfección El protocolo de transfección completa se puede encontrar en Métodos S1. Brevemente, las células mel2, p32 (disección manual) 3 (cultivo en masa) 11 (células individuales) fueron tratados con inhibidor de Rock (Y27632, 10 m M concentración final, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) para 1 hora antes de la transfección. Independiente células se resuspendieron a 1610 6 células / 100 m L en la solución de NucleofectorH células madre humanas 2 (Lonza) que contiene 2 ug / 100 m L de la disponible comercialmente ADN plásmido pEF / myc / mito / GFP (Life Technologies). Aparte a partir de un casete de selección de neomicina, el plásmido contenía un GFP secuencia etiquetada a una secuencia de importación mitocondrial bajo la control del promotor EF1a. Las células fueron transfectadas usando el programa B-016 en un dispositivo cubeta NucleofectorH II (Lonza). La eficacia de transfección usando este conjunto programa se midió para ser aproximadamente el 50% con 78% de células viables después de la transfección (no se muestra). Las células transfectadas se transfirieron a un pocillo de un pozo 12 placa pre-recubierto con Geltrex TM y se cultivaron en StemProH. Las células transfectadas se dejaron recuperar durante 24 horas antes la selección en G418. La línea reportero mitocondrial fue designado KMEL2. HESC en la diferenciación in vitro Para evaluar la capacidad de KMEL2 para diferenciar, los medios de KSR era intercambiado por DMEM sin bFGF y complementado con Suero bovino fetal al 10% (FBS). Las células también fueron tratados con El ácido retinoico (10 m g / ml, Sigma Aldrich), BMP4 (40 ng / mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) o activina A (40 ng / ml, PeproTech) durante un máximo de 10 días para promover la capa germinal específica diferenciación. Para la diferenciación específica neural, células KMEL2 se cultivaron alimentador libre en Geltrex TM a 60% de confluencia. Medios de comunicación se cambió a KSR suplementado con 100 ng / ml de bFGF, 5 m M dorsomorphin, 10 uM SB431542 y se cultivaron durante 6 días con los medios de comunicación cambiado cada dos días. Grupos de células fueron tratados con colagenasa IV para

formar cuerpos embrioides y se transfiere a cultivo en suspensión en KSR con bFGF, SB431542 y dorsomor- phin durante 3 días. Cuerpos embrionarios, donde luego cultivan para hasta 30 días antes de la siembra en la laminina de ratón (10 m g / cm 2 , Sigma-Aldrich) recubierto platos para permitir la derivación neural. Análisis Cariotipo Cariotipo análisis se llevó a cabo en KMEL2 a paso 7 después de la transfección como se describe anteriormente [37]. 15 metafases por Se analizó la muestra y las imágenes tomadas con una resolución de 400bphs. Cariotipo análisis fue realizado por Sullivan Nicolaides patología gía, Taringa, Australia. Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando dos colas emparejado pruebas t de Student o ANOVA de dos vías con la replicación. Los valores de P , 0,05 se consideraron significativos. Todos los experimentos se per- formado con un mínimo de 3 réplicas biológicas y un mínimo de 3 réplicas entre experimento. Resultados Agentes Biogénesis mitocondrial Impacto en células madre Diferenciación Atenuación de la función mitocondrial y la promoción de la glucólisis se ha utilizado para promover el aumento de expresión de marcadores de pluripotencia y inhibir la diferenciación [20]. Por el contrario, hemos tratado de investigar si la promoción de la mitocondria la biogénesis (y posteriormente un aumento en phosphor- oxidativo ilación) influiría en la diferenciación de las células madre hacia principios mesodermo. Se investigaron tres agentes químicos, SNAP, AICAR y metformina con efectos conocidos sobre la biogénesis mitocondrial y la diferenciación celular en especies de mamíferos humanos y otros [25,38,39,40]. Para determinar si el aumento de biogen- mitocondrial ESIS tuvo ningún impacto en la diferenciación, independiente de los factores de promover la diferenciación, las células se cultivaron MIXL1 durante 3-4 días en Geltrex placas en medio de mantenimiento hESC StemProH recubierto con o sin agentes de la biogénesis. En el día 4, 18.763.2% de las células tratadas con 250 m M SNAP fueron positivos para la expresión MIXL1 (Figura 1a, p, 0,05, n = 3, en comparación con los controles no tratados) y demostrado en la regulación de la TG30 marcador de pluripotencia (Figura 1b) y SSEA-4 (no mostrado). Las concentraciones de SNAP en Figura 1. Agentes biogénesis mitocondrial mejorar la expresión en la diferenciación de células madre MIXL1. (A) puede inducir la expresión de SNAP en MIXL1 Culturas StemProH 2D independientes de la adición de BMP4 (p, 0,05, n = 4). (B) El marcador de pluripotencia TG30 está regulado en las células positivas para MIXL1 marcador mesendoderm en el puesto day3 250 mM tratamiento SNAP. (C) La diferenciación de mesodermo temprano (día 3) se ve reforzada en cultivos 3D de Además de los agentes de la biogénesis mitocondrial. Las barras de escala son 200 mM. (D) mM SNAP 250 puede rescatar parcialmente expresión MIXL1 en la eliminación de activina A o BMP4. Las muestras de control fueron tratados de acuerdo a ([44], las barras negras) o cultivadas sin BMP 4 (barras rojas) o sin activina A (barras azules). (E) La expresión de genes asociados mitocondrial es muy variable después de SNAP y AICAR tratamiento. S, SNAP; A, AICAR; M, la metformina; POLG, la polimerasa gamma; TFAM, factor de transcripción mitocondrial A; números representan las concentraciones de los reactivos utilizados mM; D, DMSO sin agentes biogénesis se añadió como controles en volúmenes iguales a las muestras tratadas. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g001 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 4 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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Figura 2. Generación de una línea reportero mitocondrial, KMEL2. Las células fueron transfectadas con GFP de un plásmido que codifica orientado mitocondrialmente expresado bajo el control de un promotor EF1a. (A) Localización subcelular de GFP orientado mitocondrialmente se superpone con las estructuras detectadas por una anticuerpo anti-mitocondrial. Intensidades de fluorescencia para cada fluoróforo se midieron a lo largo de la línea de 160 mm se muestra en la imagen de superposición. (B) La expresión del marcador de pluripotencia no se efectúa por GFP orientado mitocondrialmente. GFP localizado en la mitocondria es co-expresada con la pluripotencia marcadores Oct-4 y SSEA4. Las imágenes son de 150 mm de ancho. Co-expresión de marcadores de pluripotencia GFP y se confirmó por citometría de flujo. Los histogramas mostrar células positivas GFP también expresan Oct-4 y SSEA-4. (C) la intensidad de GFP no se pierde durante la regulación hacia abajo de la superficie celular marcador de pluripotencia TG30. Células (d) KMEL2 tienen un cariotipo normal. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g002 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 5 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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Figura 3. LDS-751 manchas mitocondrias de células madre embrionarias humanas basadas en el potencial de membrana. (A) LDS-751 es co-localizada con las buenas prácticas agrarias en la línea de reportero mitocondrias KMEL2 y no se superpone con el núcleo. Intensidades de fluorescencia para cada fluoróforo se midieron a lo largo la línea de 160 mm se muestra en la imagen de superposición y trazado como distancia vs intensidad. (B) Las mitocondrias tinción específica se pierde cuando se trata con una valinomicina agente despolarizante membrana mitocondrial. Análisis del perfil de la línea demuestra LDS-751 ya no se localiza en la mitocondria después el bloqueo de potencial de membrana mitocondrial. El perfil de la línea en la imagen superpuesta representa 140 mm. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g003 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 6 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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250 m M o superior tenían efectos perjudiciales en el número de células y potencial de membrana mitocondrial según la evaluación de JC-1 tinción (Figura S1). Ni AICAR ni metformina aumentaron el porcentaje de células positivas MIXL1 por encima de los controles no tratados Figura 4. mitocondrial localización durante la diferenciación de linaje neural. Diferenciación específica linaje neuronal mostrando KMEL2 positivo para (a) Nestin y (CE) b-III-tubulina. células positivas b-III-tubulina muestran expandido localización de mitocondrias a través de excrecencias dendríticas (C y E). bIIIT, b-III-tubulina. Las barras de escala en (b) son de 1000 mm. Todas las demás imágenes son de 150 mm de ancho. Imágenes ampliadas en (e) se muestran en las regiones en caja de (c) y (D). doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g004 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 7 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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(Figura 1a). Para determinar si alguno de los agentes de la biogénesis podrían aumentar MIXL1 células positivas durante la inducción del mesodermo cardiogénico, Spin cuerpos embrionarios fueron diferenciadas utilizando medio APEL [34] y factores de crecimiento BMP4, activina A, VEGF y SCF. El aumento de las concentraciones de tanto SNAP y AICAR aumentó el porcentaje de células positivas MIXL1 17.33611.72 (P, 0,05) y 13.41613.4% (P.0.05), respectivamente, por encima de los controles (Figura S2) como así como el nivel relativo de expresión MIXL1 dentro de las células (Figura 1c). Con el fin de determinar un impacto positivo de la biogénesis agentes sobre la expresión MIXL1, cuerpos embrionarios se formaron en el presencia de agentes de la biogénesis diluye en DMSO con y sin los factores de crecimiento clave para la diferenciación, BMP4 y activina A. Como eliminación esperada de cualquiera de BMP4 o activina A significativamente impactado en la expresión MIXL1 (Figura 1d). Sin embargo, MIXL1 expresión fue parcialmente restaurada en las culturas que carecen de BMP4 o Activina A por 250 m M SNAP, pero no el control DMSO o AICAR muestras tratadas (Figura 1D y S2 y 3). Mitocondrial la biogénesis en células madre se midió por la expresión de POLG y TFAM, genes codificados nucleares requeridos para el ADN mitocondrial la replicación y la transcripción, respectivamente (para una revisión ver [11]). No tratamiento produjo un cambio significativo en la expresión de POLG o TFAM (P.0.05). Sin embargo metformina y el DMSO controles mostraron una tendencia en la regulación hacia abajo de cada gen (Figura 1e). En contraste, SNAP y AICAR tenían una muy variable efecto sobre la expresión génica y una tendencia hacia el aumento de expresión de TFAM y POLG. Figura 5. Variable de localización mitocondrial durante la diferenciación de linaje específico. (A) Las mitocondrias en células madre están localizadas cerca de la núcleo. (B) Las mitocondrias en las células de linaje endodermo positivo AFP. Las mitocondrias en células positivas AFP muestran un granular, dispersa a través de la localización toda la célula. (C y d) Las mitocondrias en MIXL1 células positivas (mesendoderm) mostrar un densamente poblado, localización perinuclear basado en MitoTracker rojo lejano (c) y LDS-751 (d) la tinción. AFP, alfa fetoproteína. Imágenes (ac) son de 150 mm de ancho. Línea perfil en (d) representa 120 mm. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g005 Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 8 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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Generación de un Células Madre Embrionarias Humanas mitocondrial Línea Periodista: KMEL2 HESCs mel2 transfectadas con pEF / myc / Mito / GFP eran seleccionado usando G418 durante un período de tres semanas. La resultante GFP línea hESC positivo fue designado KMEL2. El condrial drial localización de GFP en las células KMEL2 se confirmó con una anti-anticuerpo mitocondrial (Figura 2a) y la tinción con MitoSOX rojo (Figura S5). La medición de la intensidad de fluorescencia a lo largo de una línea de perfil muestra una superposición precisa de la GFP y mitocondrial señales de anticuerpos que indican la co-localización (Figura 2A). La línea celular transgénica retuvo la expresión de la pluripotencia marcadores, Oct-4, SSEA-4 (Figura 2b), TG30 y Tra-2-49 (Figura S4) entre 5 y 10 pasajes después de la transfección. Adicionalmente, KMEL2 células mantienen un cariotipo normal (Figura 2d). Flujo Análisis de citometría mostró que la expresión de GFP se mantuvo robusta en días (d) 4 de la diferenciación mientras que la expresión de la

pluripotencia marcadores TG30 (Figura 1c) y SSEA-4 (no mostrado) se redujeron regulado. Por lo tanto, la expresión de GFP se mantiene durante hESC temprana diferenciación. El Fluorocromo LDS-751 localiza a mitocondrias en hESC A fin de validar el uso de KMEL2 en el seguimiento en vivo de células madre mitocondrias, se utilizó el análisis de imágenes basada en el flujo para confirmar GFP localización mitocondrial. Se utilizó inicialmente LDS-751 como una contador de tinción nuclear, porque no tiene ningún solapamiento espectral significativa con GFP. Sin embargo, en 751 células LDS-KMEL2 manchadas, significativa se observó co-localización de LDS-751 con GFP (Figura S5). Esto sugiere LDS-751 no mancha el núcleo en células madre. Este se confirmó en un formato de 2 dimensiones utilizando DAPI como nuclear mancha. LDS-751 no co-localizar con la tinción nuclear DAPI y, en cambio, LDS-751 se superponen exclusivamente con GFP importado a la mitocondria (Figura 3a). Además, LDS-751 co-localizada exclusivamente con MitoSOX rojo (Figura S5). Despolarización de membranas mitocondriales con valinomyocin inhibieron la localización de LDS-751 a la mitocondria (Figura 3b). Condrial localización drial de LDS-751 ha sido previamente reportado en fibroblastos de ratón y monocitos y, como de células madre, era depende de las membranas mitocondriales polarizadas [41]. Por lo tanto, LDS-751 se puede utilizar como una herramienta para el seguimiento de las mitocondrias en las células cultivadas. Localización mitocondrial durante la diferenciación de todos Tres capas germinales Durante la diferenciación de células madre ocurren cambios significativos en mitocondrial metabolismo, la morfología y la producción de energía (oxidasa fosforilación dativo vs. glucólisis) [15,18,20]. Sin embargo, poco se dispone de información sobre la localización y la morfología de mitocondrias durante la diferenciación de linaje específico. Se utilizó el Línea reportero KMEL2 y SUD-751 para realizar un seguimiento durante las mitocondrias ácido retinoico impulsado diferenciación neuroectodermo. Consistente con los datos anteriores [2,15], las mitocondrias en células madre antes de diferenciación estaban estrechamente localizada en la periferia de la núcleo en racimos densos muestra con tanto KMEL2 y SUD-751 (Figura 2b, 3b y 5a). En contraste, KMEL2 deriva y Nestin MAP2C células positivas se habían dispersado por toda la mitocondria de células en forma granular y los patrones de hilo (Figura 4A y Figura S4), como se informó anteriormente en células adultas del linaje neuronal [42,43]. Cuerpos embrionarios chapada en laminina después de 30 días de neural diferenciación espectáculo GFP específica (a través de anti-GFP unión de los anticuerpos) para la localización de las mitocondrias en b-III-tubulina células positivas (Figura 4b-e) confirmados por co-tinción con un anti- anticuerpo mitocondrial (no mostrado). Además, mitocondrial grupos podrían ser identificados en excrecencias dendríticas positivas para b-III-tubulina (Figura 4c y e). La diferenciación al linaje endodérmico fue identificado con AFP y la tinción FOXA2 (Figura 5b y S4). Similar a mitocondrial localización en células Nestin positivas, las células positivas para AFP contenía mitocondrias dispersado por toda la célula en un granular formación con una cantidad limitada de perinuclear mitocondrial agrupación. Con el fin de observar las mitocondrias durante la formación de mesodermo una línea reportero competente cardíaca para la mesendoderm marcador MIXL1 [28] se utiliza en conjunción con publicado protocolos para conducir la inducción de mesodermo cardiogénico [44]. Las células se tiñeron positivas para MIXL1 en d3-d4 de diferenciación para las mitocondrias, ya sea utilizando LDS-751 o Mito-tracker de color rojo oscuro. La localización mitocondrial en las células positivas es similar MIXL1 de células madre indiferenciadas con mitocondrias densamente localizados a la periferia

nuclear (Figura 5c) .La línea de análisis del perfil de fluorescencia cencia intensidades de LDS-751 y DAPI confirmaron un apretado la agrupación de las mitocondrias alrededor del núcleo (Figura 5d). Discusión Con el fin de investigar el papel de las mitocondrias desempeñan en la regulación de el equilibrio entre la pluripotencia y compromiso linaje nosotros desarrollado un reportero mitocondrial línea celular que expresa una hESC mitochondrially localizada GFP, KMEL2. Es importante destacar que Deming trar que la expresión de GFP se mantiene en los derivados de todo capas germinales cuando KMEL2 células madre se diferencian. El KMEL2 línea de células madre también facilitó la identificación de la mitocondria biogénicas reactivos que promueven la diferenciación de primitiva mesendoderm. Herramientas para el análisis in vivo Mt En este estudio, hemos desarrollado dos enfoques para la identificación y el seguimiento de localización mitocondrial en células madre y su diferenciación progenie ATED. En primer lugar, hemos desarrollado un reportero mitocondrial línea celular de células madre que producen una construcción GFP etiquetados a un secuencia de importación mitocondrial como se ha demostrado para celular múltiple tipos [45,46]. La línea de reportero, apodado KMEL2, mostró co- localización de GFP con anticuerpos específicos a las mitocondrias (Figura 2a), expresado marcadores de pluripotencia octubre-4 y SSEA-4 (Figura 2b) y retenido un puesto cariotipo normal de la transfección (Figura 2d). KMEL2 es particularmente útil para el seguimiento de mitocondrias localización drial y alteraciones estructurales durante la diferenciación. Seguimiento mitocondrial puede ser importante en la aplicación terapéutica ciones, por ejemplo, el agrupamiento de las mitocondrias en el celular prolongaciones durante hESC diferenciación neural es una caracterización istic fenotipo de los trastornos mitocondriales tales como ARSACS [7]. En segundo lugar, se demuestra que en células madre, SUD-751 co-localizados específicamente con las buenas prácticas agrarias en la línea KMEL2 y no mostró coincidencia significativa con la tinción DAPI nuclear (Figura 3a). Mientras LDS-751 ha sido utilizado previamente como un marcador nuclear [47] que muestran que localización mitocondrial en hESCs depende de mitocondrias polarización de la membrana drial como el tratamiento con la despolarizante agente valinomicina bloqueado tinción específica mitocondrial (Figura 3b). Promoción de la fosforilación oxidativa Mejora Diferenciación La biogénesis mitocondrial es controlado por proliferación de peroxisomas rador activado del receptor c-coactivador-1a (PGC-1a), NRF-1 y TFAM [11]. La metformina y AICAR son activadores de conocidos AMP-activated proteína quinasa (AMPK) [39], que a su vez aumenta la producción de PGC-1a. PGC-1a co-activa el Seguimiento de las mitocondrias durante hESC diferenciación PLOS ONE | www.plosone.org 9 12 2012 | Volumen 7 | Número 12 | e52214

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transcripción de TFAM [48], un regulador directo de la mitocondrial La transcripción del ADN y la replicación. SNAP es un óxido nítrico (NO) donante, también sabe que aumenta la expresión de la mitocondria genes biogénesis como TFAM y POLG sin embargo su modo de acción es activar directamente PGC-1a [49] por lo tanto indirectamente el aumento de la biogénesis mitocondrial. Los cambios veces (1,5 a 3) se observó en la biogénesis mitocondrial y reguladores TFAM POLG, although variable, concurred with published results [15,21,39,50]. In addition, SNAP and AICAR displayed a trend of increasing levels of TFAM and POLG suggesting increased mitochondrial

biogenesis. We observed that SNAP induced mitochondrial biogenesis in cytokine free StemPro media lead to an increased production of MIXL1 + las células. In contrast, neither Metformin nor AICAR induced expression in these conditions. Conversely, in differenti- ating embryoid bodies both SNAP and AICAR increased the number of MIXL1 positive cells by approximately 15% compared to untreated controls (Figure S2). Furthermore, in the absence of the key differentiation factors BMP4 or ACTIVIN A, SNAP was able to partially restore MIXL1 expression in embryoid bodies. However, AICAR could not substitute for these cytokines in the embryoid body assay. This suggests that SNAP and AICAR may have different modes of action in promoting differentiation. Para example, SNAP may induce differentiation [38] through either mitochondrial biogenesis or an as yet unknown pathway, while AICAR may not induce differentiation but may inhibit pluripo- tency thereby improving the general differentiation of the cells regardless of lineage. A possible confounding factor is that embryoid bodies without BMP4 and ACTIVIN A were smaller compared to controls (Figure S3). Nevertheless, further testing of differentiation efficiency in combinatorial titrations of AICAR or SNAP in lineage specific differentiation protocols is needed to precisely define the role of mitochondria in differentiation. Conclusión Normal cell function requires coordinated communication between the nucleus and mitochondria for efficient transcription of ETC components. An essential part of this communication is the localisation of intracellular ''messengers'' to particular areas of the cell, as is evident with peri-nuclear localisation of mitochondria in hESC prior to differentiation. We have generated novel methods for the visualization of mitochondria in hESC during differentiation and investigated the role of mitochondria in lineage specific differentiation to mesoderm. These traceable mitochon- dria provide a powerful means of investigating the changes in mitochondria during differentiation of varying cell lineages and facilitate the analysis of the impact of biogenesis on differentiation trajectories. Finally, mitochondrial characteristics may provide a means of further classifying differentiated stem cell progeny for use in therapeutic applications. Información de Apoyo Figure S1 Treatment with SNAP lowers hESCs numbers and mitochondrial membrane potential. a) MIXL1 cells were seeded into 24 well plates and treated for 24hrs with biogenesis agents indicated or DMSO as control. Cells were grown feeder free on Geltrex coated plates. On day 3 cells were harvested and counted using a standard haemocytometer. Error bars are +/ 2SD of n =3 biological replicates. b) MIXL1 and Nkx2.5 cells were seeded into 24 well plates and treated for 24hrs with biogenesis (50 or 250uM) agents indicated or DMSO as control. Cells were grown feeder free on Geltrex coated plates. On day 3 cells were harvested and treated with 5uM JC-1 for 15mins at RT. Bars represent relative cell numbers with low membrane potential. Error bars are +/2SD of n = 3 biological replicates. S = SNAP, A =AICAR, M =Metformin. (PDF) Figure S2 MIXL1 expression post treatment with biogenesis agents. a) AICAR and SNAP at 500 m M in the presence of BMP4 and Activin A increase MIXL1 expression relative to controls. b) Individual replicate data represented in part ''a'' expressed as MIXL expression relative to control. c) Raw data of MIXL expression expressed as percentage positive for MIXL expresión. n/a = test not performed, Dead = cell death prohibited analysis, A = AICAR, S = SNAP, concentrations listed as A50, A250 etc represent m M, S = SNAP, A = AICAR, M =Metformin. (PDF) Figure S3 MIXL expression in hESCs treated with biogenesis agents in the absence of Activin A or BMP4. C = control (all growth factors VEGF, SCF, BMP4 and Activin A), A- = Differentiation without Activin A, B- = Differentiation with- out BMP4, A50 and

A250= AICAR concentrations of 50 and 250 m M, S50 and S250 = SNAP concentrations of 50 and 250 m M. (PDF) Figure S4 Lineage specific marker expression in KMEL2. a) KMEL2 cells express embryonic stem cell marker Tra-2-49. b) KMEL2 cells express embryonic stem cell marker TG30. Histograms represent flow cytometry data demonstrating GFP positive cells express pluripotency markers (blue line) above negative controls (black line). c) Mitochondria show a dispersed localisation in MAP2C positive cells. d) KMEL2 cells differenti- ated towards the endoderm lineage express FOXA2. (PDF) Figure S5 Mitochondria visualisation in KMEL2. a) LDS- 751 (pink) co-localises with GFP in KMEL2 cells (green). Imágenes taken on an Amnis image stream. b) GFP, LDS-751 and Mitosox red co-localise in KMEL2 cells. c) Profile analysis of fluorescence intensity for each mitochondrial marker demonstrates overlapping of peak signals. Line of profile is shown in overlay image from ''b''. (PDF) Methods S1 Early images of KMEL2 selection post transfección. MEL2 hESCs were transfected to label mitochon- dria as described in Supplementary Method S1. Scale bars are 200 m m. (PDF) Agradecimientos We would like to thank the StemCore Facility of Stem Cells Australia (ABJP, PPG, AGE, EGS) and Luke Hammond of the Queensland Brain Institute for assistance with confocal microscopy (ABJP, GWO). Autor Aportes Conceived and designed the experiments: AP FC TM DE AE ES GO. Performed the experiments: AP FC GO. Analyzed the data: AP FC GO DE AE ES. Contributed reagents/materials/analysis tools: AP AE ES PG GO. Wrote the paper: AP DE GO TM. Tracking Mitochondria during hESC Differentiation PLOS ONE | www.plosone.org 10 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52214

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