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HPLC 6 10/96 1
ANÁLISISCUALITATIVO vs. CUANTITATIVO
1. CUALITATIVO - ¿qué está presente?
• Cromatografía - compare tR 's
• Espectroscopía - MS, IR, UV
2. CUANTITATIVO - ¿Cuánto está presente?
• Altura de pico
• Área de pico
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HPLC 6 10/96 2
Cafeína
TeofilinaTeobromina
"X"
1. Estándar
2. Desconocido
tR(theophylline) = tR(“X”), entonces, se sugiere que “X” es teofilina.Para confirmación positiva, se debe emplear LC-MS
ANÁLISIS CUALITATIVO
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HPLC 6 10/96 3
HPLC 5 10/96 34
ESPECTROMETRÍA DE MASAS / LCEspectrómetro de masas
Sistema de datos
Espectro de masasMuestra concentrada
AlVacío
Solvente
Muestra
Efluente LC
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HPLC 6 10/96 4
EXACTITUD-META ANALÍTICA• Error absoluto:
Diferencia entre valor medido y el valor verdadero.
• Error relativo (%) :(Error / Valor Verdadero) x 100 = % Error
• Ejemplo:Peso verdadero 50.0 gPeso medido 48.0 gError absoluto 2.0 g% Error ( 2 / 50 ) x 100 = 4 %
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HPLC 6 10/96 5
PRECISIÓN1. Mide reproducibilidad
2. Depende de la técnica
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HPLC 6 10/96 6
MEDIDA DE LA PRECISIÓN:DESVIACIÓN ESTÁNDAR
S.D. x x
2
n 1
RSD S.D.
x 100Desviación estándar relativa =
Chemist X Chemist YData Statistics Data Statistics10.0 n = 5 10.2 n = 512.0 = 10.0 10.6 = 10.0 9.0 = 1.58 9.8 = 0.4811.0 RSD = 15.8% 10.1 RSD = 4.8% 8.0 9.3
x x
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HPLC 6 10/96 7
COMPONENTES DE EXACTITUD
CALIBRACIÓN + PRECISIÓN = EXACTITUD
1. Esencial calibración con estándares
2. Precisión (reproducibilidad) necesaria para un procedimiento analítico exacto
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HPLC 6 10/96 8
PROCESO CUANTITATIVO HPLC1. Muestreo
2. Preparación de la muestra
3. Cromatografía
4. Integración
5. Cálculos
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HPLC 6 10/96 9
1. Objetivo – tomar una pequeña muestra representativa de una población grande
2. Problemas
• Contaminación
• La muestra no es representativa
MUESTREO
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HPLC 6 10/96 10
PREPARACIÓN DE MUESTRA
MolerDisolver Filtrar Extraer
Diluir Concentrar Derivatizar
2. Problemas•Pérdida de muestra•Contaminación
1. Procedimiento
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HPLC 6 10/96 11
CROMATOGRAFÍA
Macintosh
Reservorio de solventes
Bomba
Medidor de presión
Inyector
ColumnaDetector
Desecho
Registrador
Sistema dedatos o integrador
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HPLC 6 10/96 12
CONVERSIÓN DIGITAL–ALTURA DE PICO
hh
h
D
A
B
C
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HPLC 6 10/96 13
INTEGRACIÓN – ÁREA DE PICO
Area
Más difícil que medir altura de pico, pero está menos influenciado por cambios en la temperatura de la columna o el flujo.
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HPLC 6 10/96 14
INTEGRADOR DIGITAL ELECTRÓNICO
DETECTOR A / DCONVERTIDOR
MICROPROCESADOR IMPRESORA
REGISTRADOR CINTA
sjhd kahd kjhd kjhd kjhd kjhsd kjhsd kjhs kjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs dkjhs aljd lkjsd lkjsd lkjsd lkjs dljad ljadlj sljd aljd lkjsd iou fijgf oujfjd iuzdshda,adh fiehkjhd audddehfjsiu dSj.jfldu oejalkjd lkjs dlkj djs 2163216 321 6312
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HPLC 6 10/96 15
SISTEMAS DE DATOS
INTEGRADOR. Fácil de usar
. Precio moderado
COMPUTADORA . Flexible/poderosa
. Más caras
1.235
1.235
1.235
1.235
1.235
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HPLC 6 10/96 16
VENTAJAS DE LOS INTEGRADORES1. Sensibilidad
2. Intervalo dinámico3. Exactitud/precisión
4. Corrección de línea base5. Identificación de pico (Computadora)
6. Automatización total (Computadora)
• Programación de temperatura
• Integra, cuantifica
• Auto-calibra
• Introducción de la muestra
• Registro impreso
• Regeneración de la columna
• Repetición del programa
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HPLC 6 10/96 17
LIMITACIONES DE INTEGRADORES
1. Costo de capital
2. Se requiere entrenamiento
3. Picos no resueltos - bajaexactitud
4. Sobreconfianza
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HPLC 6 10/96 18
CÁLCULOS:NORMALIZACIÓN DE ÁREA SIMPLE
1. Cálculos
2. Procedimiento usualmente no válido• Asume que todos los picos responden igual• Asume que la suma de áreas es el 100% de la muestra
Área = 150A 300
B 600C
wgt %A Area A
Total Area100
150150 300 600
100 14.3%
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HPLC 6 10/96 19
CÁLCULOS: FACTOR DE RESPUESTA
A
B
C
Peso = 10 g 10 g 10 g
Área = 150 300 600
Los factores de respuesta difieren
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HPLC 6 10/96 20
CÁLCULOS DEL FACTOR DE RESPUESTA
Área (Cuentas)
300
200
100
Peso (g)
CB
AA
5 10
W FR Cuentas de área [g]B. 30
A. 15
C. 60
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HPLC 6 10/96 21
CÁLCULOS: NORMALIZACIÓN CON CORRECCIÓN DE ÁREA
Area RF Corrected AreaA 150 15 10B 300 30 10C 600 60 10
wgt %A = (10/30) x 100 = 33.3%
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HPLC 6 10/96 22
CÁLCULOS:ESTÁNDAR EXTERNO
Área
Peso (g)
Desconocido
1. Desarrolla una curva de calibración con estándares, y compara con el desconocido
2. Requiere de una inyección reproducible
3. Es más empleado en LC que en GC
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HPLC 6 10/96 23
SELECCIÓN DEL ESTÁNDAR INTERNO
Requisitos:1. Estándar puro2 Picos bien resueltos3. Nunca presente en la
muestra4. En el mismo nivel de
concentración
Muestra sola
Muestra + ISTD
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HPLC 6 10/96 24
CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (1)
1. Prepare e inyecte muestras de estándar interno y del analito de interés.
2. Prepare una curva de calibración de los datos cromatográficos, graficando la relación de áreas contra la relación de pesos de analito y estándar interno.
IS = EST. INTERNOA = ANALITO A
AA
IS IS IS
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
Muestra 1Muestra 2Muestra 3
Área A / Área IS
Peso A / Peso IS
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HPLC 6 10/96 25
CÁLCULOS:ESTÁNDAR INTERNO (2)
Desconocido X
1. Añada con precisión el IS a la muestra desconocida2. Cromatografíe la mezcla3. Calcule la relación de áreas4. Determine la relación de pesos de la curva de
calibración5. Encuentre el peso del analito
Peso A / Peso IS
Área A / Área IS
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HPLC 6 10/96 26
ANÁLISIS CUANTITATIVO HPLC
Component TrueWeight %
MeasuredWeight %
RelativeError (%)
Et Paraben 11.66 11.54 1.0Pr Paraben 16.94 16.91 0.2Bu Paraben 33.14 33.17 0.1