Silenciamiento génico para el control del hongo causal de escoba de bruja

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

Ana Cristina Caribé dos Santos, DSc

Guayaquil

25 a 28 de agosto, 2014

QUE ES RNAi

Conjunto de procesos mediados por pequeños

RNAs regulatorios conservado entre eucariotas

Protege el genoma de patógenos y transposones

Regula el programa celular de expresión génica y desenvolvimiento

Previene el acumulo de mRNAs não funcionales

COMO FUNCIONA

APLICACIONES DE RNAi EN LA

CIENCIA

Control de la expresión génica experimentalmente

Defensa contra patógenos

Estudio funcional de genes

POR QUE UTILIZAR RNAi -

VENTAJAS

PTGS

Degradación del mRNA, por tanto,

no altera la estructura del gen

endógeno

Su eficiencia no es comprometida

por la presencia de núcleos no

transformados o de genes

multicópias

Silenciamiento

de alta especificidad

Silenciamiento simultáneo

de secuencias conservadas

(familias multigénicas)

POR QUE UTILIZAR

RNAi - VENTAJAS

Silenciamiento sistémico

Plamodesmatas

Plantas

Diliporo

Basidiomicetos

Proteínas transmembranas

C. elegans

POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS

Amplificación del silenciamiento POR QUE UTILIZAR RNAi - VENTAJAS

Determinación de la

operacionalidad del

silenciamiento génico

por RNAi en

M. perniciosa, usando o

gen gfp, como modelo

LO QUE YÁ HICIMOS

Gene Organismo c/ Proteína Valor E

homologia

Qde-1 N. crassa RdRP 2e-04

QDE3 N. crassa qde-3 6e-15

(RecQ DNAhelicase)

CAF Arabidopsis CAF 3e-12

(endoribonuclease dicer homolog)

SDE3 Arabdopsis RNA helicase 4e-24

Secuencias identificadas en el banco de dados del genoma de

M. perniciosa que tienen homología con genes vinculados al

mecanismo de RNAi

PROYECTO DE SECUENCIAMIENTO DEL GENOMA DE Moniliophthora perniciosa (http://www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)

Cerca de 39 Mbp y 14.000 genes predichos

hph

Vector usado en la transformación

de M. perniciosa

Dra. Regine Kahmann, Munchen, Germany

pHSP70-SG (Spellig et al. 1996)

Producción de una linaje transgénica de M. perniciosa

que expresa el gen heterólogo gfp

Transfixión del vector pHSP70-SG para protoplastos de M.

perniciosa por el método PEG/CaCl2

A. Protoplastos, micrografía de fase de contraste 400X. B Hifa parecida con

tubo de germinación saliendo directamente de una simple célula esférica. C e

D. Algunos protoplastos agregados en el proceso de regeneración,

contribuyendo para la formación de micelio. E. Desenvolvimiento de hifas en

un estado mas avanzado.

E D C

B A

Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp

Expresión de gfp - linajes control y transformante

Transformación de M. perniciosa con el gen repórter gfp

Expresión de gfp – linaje transformante

Expresión de gfp – linaje transformante

Transformación de M. perniciosa con el gen

repórter gfp

Plasmid Template - Estrategia para obtención de gfp (Plasmid Template)

en las orientaciones senso y antisenso para síntesis de gfpdsRNAs,

usando o MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.

Estrategia para síntesis de dsRNAs

lacZ ddt T7 promoter ddt gfp sense

NcoI MCS MCS

lacZ ddt T7 promoter ddt gfp antisense

NcoI MCS MCS

EcoRI

EcoRI

SILENCIAMIENTO DEL GEN gfp POR RNAi

CT

.

T5. T4

T1

T2

T6

T3.

A

B

Silenciamiento del gen repórter gfp por RNAi

Diagnóstico del silenciamiento usando RT-qPCR. Expresión relativa de gfp

en linajes transgénicas de M. perniciosa tratadas con gfpdsRNA (51 – 97%).

LO QUE YÁ HICIMOS

Silenciamiento de genes

endógenos de M. perniciosa

por RNAi, visando análisis

funcional

SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyD DE M.

perniciosa POR RNAi PARA ESTUDIO FUNCIONAL

SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd

Estrategia para síntesis de dsRNAs

SalI

lacZ T7 promoter Sp6 MpHYD3 sense

MCS MCS

lacZ T7 promoter Sp6 MpHYD3 antisense

MCS MCS

SalI

SalI

SalI

SalI

SalI

Plasmid Template - Estrategia para obtención de MpHyd en las orienta-

ciones senso y antisenso para la síntesis de MpHyddsRNAs usando o

MEGAscript RNAi Kit transcription reaction.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Hd

1

Hd

1

Hd

1

Hd

1

Hd

1

Hd

2

Hd

2

Hd

2

Hd

2

Hd

2

Hd

4

Hd

4

Hd

4

Hd

4

Hd

4

Hd

5

Hd

5

Hd

5

Hd

5

Hd

5

CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CT T1 T2 T3 T10 CP T1 T2 H3T10

Lines M. perniciosa

RQ

SILENCIAMIENTO DEL GEN MpHyd

Expresión relativa de MpHyd en linajes control y tratadas con

MpHyddsRNA vía PEG/CaCl2 (18 a 97%)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Hd

1

Hd

1

Hd

1

Hd

1

Hd

2

Hd

2

Hd

2

Hd

2

Hd

4

Hd

4

Hd

4

Hd

4

Hd

5

Hd

5

Hd

5

Hd

5

CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6 CT T2 T4 T6

Lines M. perniciosa

RQ

Expresión relativa de MpHyd en

linajes control y tratadas con

MpHyddsRNA vía electroporación

(89 a 97%)

Fenotipo

SILENCIAMENTO DO GENE MpHyd

Estrategia para obtener MpPrix1 (PCR Template) en las

orientaciones senso y antisenso para síntesis de

MpPrix1dsRNAs, usando MEGAscript RNAi Kit transcrip-

tion reaction.

PDNR-LIB PDNR-LIB

T7 MpPRIX1 sense

Estrategia para síntesis de dsRNAs

SILENCIAMENTO DO GENE MpPrix1 POR RNAi

T7

MpPRIX1

MpPRIX1 antisense

Silenciamiento del gen MpPrix1 por RNAi

Expresión relativa de MpPrix1 en linajes

control y tratadas con MpPrix1dsRNA (23

a 87%).

Curva de sobrevivencia de linajes con-

trol y tratadas con MpPrix1dsRNA ex-

puestas a H2O2

Actividad de la enzima 1 cys-peroxidase en

linajes control y tratadas con MpPrix1dsRNA

LO QUE ESTAMOS HACIENDO

Proyecto “Rede Cacau Renorbio – Vassoura de Bruxa”

Proyecto interinstitucional (FINEP, FUNPAB, CEPLAC,

UESC, CENA-USP, CENERGEN-EMBRAPA, UNICAMP)

Coordinador: Dr. José Luis Pires (CEPLAC)

Vice-coordinador: Dr. Raúl René Valle (CEPLAC)

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopa-

tógeno Moniliophthora perniciosa por RNAi

Coordinadora: Dra. Ana Cristina Caribé (UESC)

Investigadores:

Dres. Raúl René Valle (CEPLAC), Carlos Pirovani (UESC);

Dras. Karina Gramacho (CEPLAC), Acássia Pires (UESC),

Virginia Soares (UESC), Fátima Alvim (UESC)

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y

control del fitopa-tógeno Moniliophthora

perniciosa por RNAi

Producir biofungicida a base de moléculas

de RNA duplo filamento (dsRNAs)

homólogos a genes esenciales a procesos

relacionados al desenvolvimiento y

patogenicidad de M. perniciosa

Gen Organismos Función probable

Sintase de quitina (CHS3) Pleurotus, Agaricus Síntesis de quitina - pared

celular de fungos

Septina (SEP/CDC/SPR) Laccaria, Coprinopsis Formación de septos

Trehalose fosfato sintase

(TPS1/TPS2) Pleurotus, Grifola

Síntesis de trehalose - azúcar

que regula turgencia.

Catalasa (CTA1/CTT1) Aspergillus Previene la acumulación de

niveles tóxicos de H2O2

Moniliolisinas (Mp-AaPri1

e MpPri2) Pleurotus, Agrocybe Formación del hongo

Glucanasa (EGT) Coprinopsis, Postia Degradación de celulosa

Hidrofobinas (CoH1) Coprinopsis,

Lentinula

Formación de película

hidrofóbica en la superficie

de hifas

Genes candidatos a silenciamiento por el método dsRNA.

Acción de Pesquisa 1. Realizar identificación y silenciamiento por RNAi

de genes de M. perniciosa esenciales a: infección, crecimiento, nutrición,

reproducción y patogenicidad

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-

geno Moniliophthora perniciosa por RNAi

1. Síntesis de microesferas de quitosana:

Síntesis de microesferas de quitosana utilizando el

método de coacervación (ARAL et al., 2000; BERTHOLD et al.,

1996).

2. Síntesis de liposomas:

Síntesis de vesículas unilamelares grandes (LUVs), a

partir de la extrusión de la dispersión lipídica del lipidio

catiónico bromato de dioctadecildimetilamonio

(DODAB) en solución acuosa conteniendo el dsRNA

albo.

Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y

entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-

geno Moniliophthora perniciosa por RNAi

3. Síntesis de cápsides virales: técnica de VIGS

(vírus-induced gene silencing)

Vectores virales - El genoma viral será modificado

removiendo genes de patogenicidad y insiriendo genes o

secuencias que codifiquen moléculas de dsRNA

correspondientes a los albos a ser silenciados

Acción de Pesquisa 2. Síntesis de vehículos para protección y

entrega de dsRNAi en el hongo Moniliophthora perniciosa, in vivo

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-

geno Moniliophthora perniciosa por RNAi

Producción de la formulación del biofungi-

cida, suspensión concentrada(SC)

Establecimiento del procedimiento para apli-

cación del biofungicida a base de dsRNAs:

por aspersión o inyección (concentración del

fungicida; equipo para aplicación; período y

condiciones climáticas para aplicación, etc.)

Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de dsRNAs

homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento o patogeni-

cidad de M. perniciosa

Sub-proyecto: Silenciamiento génico y control del fitopató-

geno Moniliophthora perniciosa por RNAi

Prueba de eficiencia del fungicida en inverna-

dero con clones de cacao con padrones de

resistencia y susceptibilidad e inoculados con

basiodiosporas de M. perniciosa (1,0X105 basio-

diosporas viables/mL)

Observación y análisis del desenvolvimiento

del hongo y síntomas producidos

Acción de Pesquisa 3. Elaborar biofungicida a base de

dsRNAs homólogos a genes esenciales al desenvolvimiento

o patogenicidad de M. perniciosa

GRACIAS