Universidad Austral De Chile Facultad De Ciencias Agrarias Instituto De Ciencia Y Tecnologa De Los Alimentos

Proyecto de Investigacin. Aplicaciones de Bacterias Acido Lcticas en Industria Alimentaria

Profesora: Carmen Brito. Alumno: Ernesto Quezada G.

Valdivia-Chile 2010Indice________________________________________________________________________ 1.- Introduccin 2.- Objetivos 3.- Revisin Bibliogrfica 3.1.- Caractersticas de las Bacterias cido-Lcticas 3.2.- Principales grupos de Bacterias cido-Lcticas 3.3.- Cultivos Estrter 3.4.-Aplicaciones de Bacterias cido-Lcticas en Obtencin de Yogures 3.5.- Aplicaciones de Bacterias Acido- Lcticas en Obtencin de Quesos 4.1.-Muestras utilizadas 4.2.- Determinacin y cuantificacin de aminas biognicas 4.3.- Anlisis Estadstico 4.4.-Control de cepas bacterianas y condiciones de crecimiento 4.5.- Determinacin de Tirosina e histidina mediante el mtodo PCR 4.6.- Anlisis HPLC de la Tiramina y la histamina 5.- Resultados y Discusin 6.- Conclusiones 7.- Recomendaciones 8.- Bibliografa pag 3 pag 3 pag 4 pag 4 pag 4 pag 5 pag 5 pag 6 pag 6 pag 6 pag 6 pag 7 pag 7 pag 7 pag 7 pag 10 pag 10 pag 11

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1.- Introduccin.______________________________________________________________ Las bacterias cido-lcticas tienen una gran importancia en las fermentaciones industriales ya que han sido utilizadas durante dcadas por la industria de alimentos y farmacutica, esta gran relevancia es debido, a gran cantidad de aplicaciones de los cultivos en el procesamiento de productos lcteos fermentados y la incursin de de las empresas en obtener productos lcteos funcionales. Una de las principales aplicaciones de las bacterias cido-lcticas (BAL o LAB por sus siglas en ingls) es para la obtencin de cido lctico, tambin la obtencin de componentes saborizantes, componentes espesantes y bacteriocinas, y adems el gran valor nutritivo que pueden aportar a los productos lcteos y alimenticios debido a su bajo coste energtico de su produccin por otra parte, durante la ltima dcada se ha incrementado el nmero de estudios sobre el rol de que algunas cepas de bacterias cido-lcticas pudieran ser empleadas como cultivos probiticos y Sin embargo, las bacterias cido-lcticas tambin han sido asociadas como bacterias alterantes de alimentos y en mayor medida de productos crnicos. En este proyecto se presenta una revisin bibliogrfica de las aplicaciones de las bacterias cidolcticas en la industria Lctea.

2.- Objetivos__________________________________________________________________ Conocer la caracteristicas d elas bacterias acido lacticas

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3.- Revisin Bibliogrfica________________________________________________________ 3.1.- Caractersticas de las bacterias cido-lcticas Las bacterias cido-lcticas son un conjunto de bacterias de forma de cocos y bastones Grampositivas, son no esporuladas y catalasa negativa, tambin se pueden encontrar en algunos casos una pseudo-catalasa. Adems, las bacterias acido-lcticas tienen un metabolismo fermentativo produciendo su mayor producto que es el cido lctico en la fermentacin de los azcares va Embden-Meyer gluclisis, proceso fermentativo llamado: homofermentacin (figura N 1), bacterias llamadas tambin homolcticas ,Los representantes de las BAL homolcticas incluyen Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus y el grupo Lactobacilli. Por otro lado, proceso llamado Heterofermentacin (figura N 2) se atribuye a la produccin de adems de etanol, tambin acetato y CO2 por la va cido-6-Fosfoglucnico, por lo que as BAL

heterofermentativas incluyen: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, y el grupo Lactobacilli.

Figura N 1: Homofermentacin Fuente: Adaptada de Larpent, 1995

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Figura N 2: Heterofermentacin Fuente: Adaptada de Larpent, 1995 Se puede decir que en los procesos fermentativos hetero y homo fermentativos, la funcin primaria de los cultivos lcticos iniciadores es la produccin de cido lctico a partir de la lactosa, que c produce un cambio en el estado de la leche, produciendo mayor viscocidad, debido a que la casena alcanza un pH de 4.4 a 4.6, llamado punto isoelctrico. El cambio en la acidez produce inhibicin de microorganismos indeseables. Si desde el punto de vista organolptico los cultivos de bacterias acido-lcticas tienen como funcin, proporcionar el sabor, el aroma ocasionado por la produccin de etanol y la actividad proteoltica y lipoltica. Una de las razones del porque estas las bacterias acido-lcticas abundan en medios tan ricos nutricionalmente como la leche, yogurt y los quesos, es porque las bacterias acido-lcticas tienen muchas necesidades de factores de crecimiento tales como; la vitamina B, los aminocidos, pptidos, bases pricas y pirimdicas. En los laboratorios se emplean medios selectivos que posean estas caractersticas para su aislamiento, por ejemplo; caldo o agar MRS. Otra caracterstica de este grupo de bacterias es su tolerancia al pH cido, pH = 5, incluso a veces menores, ejemplo; 4,8, por lo que si el medio se va acidificando, resultan inhibidas un mayor nmero de especies bacterianas. Otra razn importante, por la cual se emplea las bacterias cido lctico en la industria de los alimentos para la conservacin y mejora tecnolgica de los productos lcteos, crnicos, vegetales fermentados, es la tolerancia de las bacterias cido-lcticas al cido lctico Orgnico, y a un pH inferior a 7.

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Por otra parte, Se a estudiado en esta ultima dcada que existe un efecto antimicrobiano de algunas bacteriocinas producidas por diversas cepas de BAL (Bacterias cido lcticas) contra bacterias patgenas y no-patgenas, obtenindose buenos resultados (Tabla N 1), por lo que se puede concluir que la presencia de este grupo de bacterias (produccin de bacteriocinas) en los alimentos lcteos, adems de modificar sus propiedades fsico-qumicas, textura, puede contribuir a un efecto antimicrobiano en los productos lcteos e incrementar su vida til. Tabla N 1: Actividad antimicrobiana de las Bacterias cido-Lcticas frente a bacterias patgenas y no patgenas (Fuente: TOPISIROVIC, 2006)

3.2.- Principales grupos de Bacterias cido-Lcticas La clasificacin principal de las bacterias cido-lcticas, fue realizada por Orla-Jensen en los aos1919-1920, quien fue el primero en clasificar las bacterias basndose principalmente en sus caractersticas fisiolgicas. Las bacterias cido-lcticas las clasific segn sus caractersticas bioqumicas en dos grandes grupos, ya mencionados anteriormente: las homofermentativas y las heterofermentativas. Tambin, Orla-Jensen dividi a las bacterias cido-lcticas en tres grupos de acuerdo con sus caractersticas fermentativas: las heterofermentativas estrictas, las homofermentativas estrictas, y las heterofermentativas facultativas:

Las bacterias cido-lcticas homofermentativas estrictas degradan las hexosas a cido lctico y no fermentan las pentosas o el gluconato. Las bacterias cido-lcticas heterofermentativas estrictas degradan las hexosas a cido lctico, cido actico, etanol y CO2, y las pentosas son degradadas a cido lctico y cido actico.

Las bacterias cido-lcticas facultativas heterofermentativas fermentan las hexosas a cido lctico y puede producir CO2 a partir del gluconato (no de la glucosa). Estas bacterias tambin fermentan las pentosas para producir cido lctico y actico.

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Los gneros mas importantes de bacterias cido-lcticas en la industria de alimentos (Lcteos, crnicos, vegetales) son de los gneros; Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Paralactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus y Weissella Algunas especies de bacterias cido-lcticas homofermentativas encontramos: Streptococcus (St. thermophilus y St. lactis) y Pediococcus (P. acidilactici, P. pentosaceus), y algunas especies debacterias cido-lcticas heterofermentativas importantes en la fermentacin lactea que hablaremos mas adelante encontramos; Lactobacillus (L. brevis y L. buchnerii) y Leuconostoc (L. mesenteroides, L. dextranicum y L. cremoris). El gnero Lactobacillus en la industria lactea es uno de los ms importantes ya que ha sido usado histricamente, ejemplo; en la produccin de leches fermentadas. 3.3.- Cultivos Estrter Los productos lcteos fermentados como el queso, yogurt, mantequilla, y otros subproductos han sido obtenidos durante siglos por la utilizacin de microorganismos (bacterias, mohos, levaduras), por lo cual la principal aplicacin de las bacterias cido-lcticas como cultivos iniciadores o estrter es para la obtencin y produccin de yogurt y quesos. Se les llamas cultivos iniciadores, ya tienen como principal funcin fermentar la lactosa, transformndola en cido lctico, lo cual baja el pH, modificando las protenas de la leche. Adems poseen sistemas proteolticos y lipolticos produciendo compuestos como el diacetilo y el acetaldehido que dan aroma y aspecto diferente a los quesos y yogures. Actualmente las aplicaciones ms importantes de la biologa molecular de los cultivos iniciadores o estrter son; Desarrollo de cultivos resistentes a bacterifagos. Mejorar caractersticas organolpticas como la textura, el sabor de los quesos y yogures. Mejorar la aceleracin de la maduracin de quesos. Mejorar la estabilizacin de genes codificados por plsmidos por integracin cromosmica.

Mejorar e incrementar la produccin de bacteriocinas y otros compuestos antimicrobianos naturales. Por ejemplo de nisina. Mejorar la consecucin de cultivos lcteos que toleren la liofilizacin

3.4.-Aplicaciones de Bacterias cido-Lcticas en Obtencin de Yogurt. Las cepas ms importante es la preparacin de este derivado lcteo son las cepas termfilas, las cuales en el yogurt correponden a mezclas de cepas de Streptococcus salivarius sbsp. thermophilus (llamado S. thermophilus) y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (llamado L. bulgaricus). La etapa de fermentacin de el yogurt se lleva a cabo a 45C y se considera que esta etapa termina

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una vez que el pH de los yogures alcanza un valor por debajo de 4,6 (aproximadamente el 1% de acidez expresada como % de cido lctico). En general el tiempo de fermentacin es aproximadamente entre 2 y 4 horas a 42,6C, este tiempo no es un valor fijo ya que vara constantemente. El por qu? Es debido a que el metabolismo de las bacterias-lcticas depende de demasiados factores, tales como; las caractersticas fsico-qumicas de la leche, tambin de la presencia de sustancias contaminantes que interfieran en la fermentacin, adems de la calidad del cultivo usado (que por lo general se agrega un entre 0,5 y 5% de cultivo lcteo) y entre otros factores. A nivel industrial la fermentacin de la lactosa sigue la siguiente va metablica:

Figura N3: Va Metablica durante la fermentacin industrial de la leche para la obtencin del yogurt. (Fuente: Elaboracin propia en base a la revisin bibliogrfica.). ________________________________________________AQUI VOY BAJAR BORRADOR En la tabla 3 puede observarse mas detalles de la fermentacin de la leche para obtencin de yogurt. La interaccin entre las dos cepas empleadas es de tipo sinergista, ya que el desarrollo de los lactobacilos favorece el crecimiento de los estreptococos y viceversa. La leche contiene aminocidos y protenas utilizables en cantidades limitadas, una vez agotadas estas, gracias a la accin de las proteasas de los lactobacilos se liberan a partir de las protenas de la leche pequeos pptidos que son metabolizados hasta aminocidos, de esta forma el estreptococo puede continuar con el crecimiento. De las dos especies empleadas en la elaboracin de yogurt, los lactobacilos son los nicos que poseen estas proteasas. Por otra parte, el crecimiento de los lactobacilos se ve estimulado por diversos compuestos producidos por el estreptococo, en particular el cido frmico, el CO2 y el cido pirvico. Dependiendo del lugar donde se lleve a cabo la fermentacin se puede obtener un yogurt de consistencia slida o firme (si la fermentacin se lleva a cabo en el recipiente destinado a la

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comercializacin) o como yogurt batido (si se lleva a cabo en tanques de fermentacin); de todas formas el proceso de fermentacin en cuales quiera de los dos casos es idntico. Durante la fermentacin de la leche tiene lugar un marcado descenso del pH que desestabiliza las micelas de casena suspendidas en la fase acuosa, como resultado de la liberacin de las sales de calcio (fosfatos y citratos), lo que da lugar a la formacin del gel. El proceso de fermentacin se detiene enfriando bien los envases (yogurt slido) o en su defecto el yogurt lquido previa agitacin (yogurt batido).

Quesos: Para la obtencin de quesos debe lograrse la coagulacin de la casena, para tal fin se emplea de forma normal la adicin de cuajo natural (renina) o sinttico (enzimas), obteniendo de esta forma una cuajada hmeda, gelatinosa, muy impermeable, que se desuera por calentamiento (queso de pasta cocida), por prensado (quesos de pasta prensada) o cortndola. Pero en algunas ocasiones suele usarse a las BAL como cultivos iniciadores o el cido lctico producido por estas, lo que da lugar a una cuajada frgil, compacta, muy friable, permeable y de la que se separa fcilmente el suero. Dentro de las muchas formas de clasificacin de los quesos (frescos, curados, semi-curados, de pasta blanda, pasta prensada no cocida o semi-cocida, pasta azul, etc.) es claro que un conjunto de BAL intervienen en su elaboracin. En la tabla 4 se presenta un resumen de algunos tipos de quesos y las BAL implicadas en su elaboracin. El mecanismo de la fermentacin de la lactosa es prcticamente el mismo descrito para el yogurt, con excepcin de los productos secundarios obtenidos debido al tipo de cultivo empleado. Lo que est claro es que durante la elaboracin de estos quesos suelen intervenir ms de un grupo de organismos empleados como cultivos estrter: BAL, bacterias propinicas, mohos, levaduras. En cuanto a las BAL estas pueden ser homofermentativas (produccin de cido lctico) como los Streptococcus, o heterofermentativas (cido lctico, cido actico, etanol) como Leuconostoc y Betabacterium. En cuanto a los estreptococos las especies Streptococcus lactis y Streptococcus

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cremoris son esencialmente acidificantes, mientras que Streptococcus diacetylactis es ms aromatizante; por su parte Leuconostoc tambin es acidificante (L. lactis) y aromatizante (L. cremoris). En sntesis, las BAL empleadas en la industria lechera pertenecen a las familias Streptococcaceae y Lactobacillaceae, aunque tambin se pueden emplear bacterias productoras de cido lctico en menor cuanta como Propiobacterium (productor de cido propinico y cido actico, y en menor cuanta de cido isovalrico, frmico, succnico y lctico). A pesar de su utilidad, las BAL tambin suelen causar defectos en tanto en la leche (Yogurt) como en los quesos. Los principales defectos se relacionan con el sabor (cido, amargo, malta), textura, olor y color, en el primer caso se debe a la produccin excesiva de cido lctico, pptidos y aldehdos, respectivamente; con relacin a los defectos de textura se deben principalmente por la formacin de CO2 y polisacridos; el olor puede verse afectado por la formacin de aldehdos (malta), steres (afrutados) o productos de la protelisis (putrefaccin y olor a fenol), y en cuanto al color pueden aparecer puntos de oxidacin o manchas rosadas causada por la presencia de lactobacilos pigmentados o como resultado de procesos oxidativos.

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6.- Conclusiones_______________________________________________________________

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Se detect la presencia de las aminas biognicas triptamina, putrescina, cadaverina, tiramina, histamina, espermina y espermidina en los quesos madurados Manchego, Parmesano y Brie. Ninguno de los tipos y marcas de quesos estudiados excede los lmites establecidos por la FAO/WHO para el contenido total de aminas biognicas. En el queso Brie la concentracin de histamina supera el lmite de 100ppm establecido como mximo por la FAO/WHO para esta amina.

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No se encontraron diferencias significativas en la concentracin de las aminas triptamina, putrescina, tiramina, histamina y espermina para los quesos y marcas analizadas. Se encontr que los grupos bacterianos propios de cada tipo de queso pudieran estar implicados en la produccin de aminas biognicas. La produccin de Tiramina e Histidina se asoci con especies de los gneros Lactobacillus y Enterococcus. La mayora de las muestras tirosina positivas se encontraron en muestras de queso madurados con los cultivos (1.-). La cantidad de tiramina producida fue 5 veces mayor en comparacin con los quesos madurados con los cultivos (2.-).

7.- Recomendaciones___________________________________________________________

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Identificar, a travs de pruebas qumicas, las especies bacterianas de los cultivos iniciadores implicados en la produccin de aminas biognicas. Identificar y cuantificar la produccin de aminas biognicas por Streptococcus y Enterobacteriaceae. Identificar y cuantificar las aminas biognicas presentes en quesos madurados de acuerdo al perodo de almacenamiento. Hacer determinaciones de HACCP en las diferentes plantas procesadoras de quesos madurados Establecer una normativa para los lmites mnimos y mximos de aminas biognicas permitidas en quesos madurados nacionales.

8.- Bibliografa________________________________________________________________ ROGINSKI, H. FUQUAY, J.M.; FOX P.F. (Ed) 2003. Encyclopedia of Dairy Sciences. En: R Maijala and S Eerola. Biogenic Amines. National Veterinary and Food Research Institute, Helsinki, Finland. Pp. 156-162. BURDYCHOVA R, KOMPRDA T. 2007. Biogenic amine-forming microbial communities in cheese. FEMS Microbiology Letters 276(2): 149-155.

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EDWARDS, SUSAN T., SANDINE, WILLIAM E. 1981. Public Health Significance of Amines in Cheese. J. Dairy Sci. 64: 2431-2438. CONTRERAS, MARY,; IZQUIERDO, P,; ALLARA, M,; GARCIA, A,; TORRES, G,; CESPEDES, E. 2007. Biogenic Amines Determination in Ripened Cheeses. FCV-LUZ . 17(1): 89-95.

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