Amebiasis

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AMEBEASIS Es una infección intestinal causada por el parásito Entamoeba histolytica. Entamoeba histolytica Entamoeba histolytica Quiste de Entamoeba histolytica Clasificación científica Reino: Protista Filo: Amoebozoa Clase: Archamoebae Orden: Entamoebida Familia: Entamoebidae Género: Entamoeba Especie: Entamoeba histolytica

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Entamoeba histolytica.- es un protozoo parásito anaerobio con forma ameboide, como su nombre lo indica, dentro del género Entamoeba. Es patógeno para el humano y para los cánidos, causando amebiasis incluyendo colitis amébica y absceso hepático.

Morfología

La Entamoeba Histolytica Se pueden distinguir varias formas o fases de desarrollo en esta especie, presentes durante varias etapas de su ciclo de vida:

Trofozoíto: es la forma activamente móvil de la especie. Se caracteriza por tener un núcleo con una concentración de cromatina puntiforme y generalmente concéntrica llamado cariosoma central; así como la formación de cromatina en la periferia del núcleo.

o Forma magna: tipo de trofozoíto muy patógeno, causante de la disentería amebiana. Mide de 20 a 30 μm e ingiere glóbulos rojos. Vive en los tejidos del intestino. Está rodeada por la emisión de notables pseudópodos que le permiten motilidad continua. La presencia de pseudópodos es una de las maneras de distinguir E. histolytica con otra especie común en el hombre, Entamoeba coli, que carece de pseudópodos.

o Forma minuta: trofozoíto no patógeno, forma natural de Entamoeba histolytica, que mide de 10 a 20 μm y no ingiere glóbulos rojos. Vive en la luz intestinal como comensal. Tiene pseudópodos, aunque más cortos y delgados que la forma magna.

Quiste: forma infectante. Contiene de 1 a 4 núcleos, dependiendo de la madurez del quiste. Son de forma redondeada, refringente con una membrana claramente demarcada. En el citoplasma se pueden ver con frecuencia de 1 a 3 inclusiones de glucógeno oscuras llamadas cuerpos cromatidales.

Metaquiste: tienen las mismas características que los quistes, por derivarse de estos durante el proceso de desenquistamiento en la luz del colon proximal. Son los metaquistes los que darán origen a los trofozoítos, por lo que tienen una membrana más irregular y delgada que un quiste.

QUISTE TROFOSOITO

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Fisiología

Entamoeba histolytica se alimenta del bolo alimentario, bacterias intestinales, líquidos intracelulares de las células que destruye y además, a veces fagocita eritrocitos. Tiene proteínas membranales capaces de formar poros en las membranas de las células humanas, destruyéndolas por choque osmótico, y adhesinas que le permite fijarse a las células de la mucosa, de modo que no sean arrastradas por la diarrea. Además, producen enzimas proteasas de cisteína, que degradan el medio extracelular humano, permitiéndole invadir otros órganos.

Este es la forma de resistencia y multiplicación, pasa ileso por la ácida barrera del estómago, pasa sin sufrir modificaciones a través del duodeno y el resto del intestino delgado, en donde ocurre desenquistamiento en el que la cubierta de quitina del quiste se rompe liberando cuatro células, las cuales se dividen inmediatamente originando a las formas infectantes.

Hay varias estirpes, la mayoría prácticamente inocuas, pero algunas son altamente patógenas, la infección generalmente no genera imunidad posterior.

Trofozoíto

•5-15 x 9-12um.•Aspecto Piriforme.

•2 núcleos.•4 pares de flagelos.

•Ventosa o disco ventral.•Movimiento natatorio con impulso de los flagelos posteriores.

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Quiste

6-10 x 8-12um.•Oval, pared lisa.

•Cuerpos medianos en forma de garfios prominentes

Ciclo de Vida

Ciclo de vida de la Entamoeba histolytica.

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El hábitat de Entamoeba histolytica es la pared y la luz del :

colon, en especial el

ciego, ascendente y el

rectosigmoide, lugar donde por lo general ocurre la

estasis fecal.

Los quistes, con 15 µm, son formas esféricas, resistentes excretadas con las heces por personas infectadas. Tras ingerir agua o alimentos contaminados, pasa sin modificación por el ambiente ácido del estómago, hasta la porción inicial del colon, el ciego, donde se induce a su transformación en metaquistes, los cuales rápidamente se divide en ocho trofozoítos (de 50 µm), también amébicos. Los trofozoítos se adhieren fuertemente a la mucosa del colon, multiplicándose y pudiendo causar muchas dolencias. Algunos metaquistes se transforman en formas quísticas, que no se adhieren a la mucosa y son expelidas en las heces.

La disentería amebiana o amebiasis es la forma de diarrea, infecciosa con sangre y moco, causada por Entamoeba histolytica. Además de ello la ameba puede atacar el hígado causando un abceso hepático amebiano.

Epidemiología

Según la OMS, hay 50 millones de nuevas infecciones por año y 70.000 muertes. La disentería amébica se presenta frecuentemente en países tropicales aunque también se presentan casos en las zonas templadas y frías. En África, Asia tropical y América latina, más de dos tercios de la población presenta estos parásitos intestinales, a pesar de que la mayoría de las infecciones pueden ser prácticamente asintomáticas. En Europa y Estados Unidos menos del 5% de la población es portadora. Entamoeba histolytica afecta a los primates; los casos en perros y gatos son relativamente raros.

Modo de transmisión: ruta fecal-oral o por contacto sexual/anal. Fuente de infección: el hombre infectado, esté enfermo o asintomático (portador

sano). Hospedador susceptible: cualquier individuo sano, en especial los niños menores

de dos años y preescolares en condiciones socio-económicas desfavorables.

La infección ocurre por la contaminación del agua, vegetales, frutas u otros alimentos crudos mal lavados o mal cocinados con quistes infecciosos provenientes de heces contaminadas. Es posible que moscas y cucarachas transporten quistes, desde las heces hasta los alimentos. La contaminación fecal-oral por algunas prácticas sexuales también es una fuente de infecciones importante. Los quistes son resistentes, sobreviviendo varias semanas, pero mueren a alta temperatura o con agua caliente.

Condiciones de baja higiene aumentan la incidencia y prevalencia de disentería amebiana.

Forma parasitaria de eliminación: los trofozoítos mueren con rapidez en el medio ambiente, mientras que los quistes son la forma de resistencia al medio externo e infectante para el hombre susceptible.

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Medio de eliminación: las heces de personas infectadas a través de la puerta de salida, que es el ano.

Forma parasitaria de infección: los quistes maduros (tetranucleados) ingeridos por la vía oral pasiva y mucho más raramente por intimidad sexual entre seres humanos.

La prevalencia de la amebiasis al igual que casi todas las enfermedades entéricas, varía según el grado de sanidad, y en general es mayor en las regiones tropicales y subtropicales que en los climas templados. Así mismo tanto la gravedad del padecimiento como la frecuencia de complicaciones son mayores en los trópicos.

La amebiasis es común en las zonas rurales y en los grupos socioeconómicos más bajos, Sin embargo, tratándose de cualquier región, este padecimiento es más frecuente en los sitios dónde predomina el hacinamiento y puede alcanzar proporciones epidémicas en orfanatos, prisiones y asilos.

Desde un punto de vista epidemiológico, es importante diferenciar entre las etapas de infección aguda, crónica y asintomática (o de portador de quistes). La disentería amibiana aguda no tiene importancia en lo que se refiere a transmisión de la enfermedad, ya que los trofozoítos no pueden sobrevivir durante mucho tiempo fuera del huésped. Los sujetos con infección crónica eliminan trofozoítos o quistes en diferentes momentos, en tanto que los pacientes asintomáticos suelen producir sólo quistes, los cuales tienen la mayor importancia para la transmisión del padecimiento, así como una resistencia rela tiva aunque se destruyen con técnicas de secado, temperaturas superiores a 55 °C y cloración de adición de yodo al agua potable. En tanto que en muchas regiones la fuente primaria de infección es el agua contaminada, también lo son las personas que manejan alimentos. En otras regiones el “riego nocturno” con excremento humano para fertilizar, la contaminación de alimentos a partir de moscas y, tal vez, cucarachas tienen importancia epidemiológica para la transmisión.[1]

QUISTE EN MATERIAS FECALES

Patogenia

Gran parte del armamento enzimático que se estima que emplea Entamoeba histolytica y que probablemente le confiere su modo de acción patogénica lo coloca entre los organismos llamados Zimodemo II [] Se piensa que la presencia en el organismo o la capacidad de uso mayor o menor de dicho armamento enzimático confieren a las

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diferentes cepas sus características virulentas, siendo mas dañinas las que combinen el mayor número de estos componentes. En efecto, el uso de ese repertorio enzimático del

grupo Zimodemo II es el método más común para diferenciar entre un organismo patógeno o no patógeno de Entamoeba histolytica.[] Algunos de los factores patogénicos principales que aumentan la capacidad de causar daño al hospedador humano, son:

Actividad colagenasa. Los trofozoítos tienen propiedades secretoras bioquímicas con actividad de proteasas, que degradan el colágeno, como en el tejido hepático,[4] pudiendo ser ese uno de los métodos para la formación de los abscesos hepáticos.

Enzimas proteolíticas. Además de colagenasas, se ha demostrado la acción de una enzima citotóxica muy parecida a la catepsina B llamada EhCP112,[5]

implicada en la disolución de la matriz intercelular que mantiene unidas las células de la mucosa epitelial. Tiene también un efecto destructivo en contra de ciertas células en el cuerpo leucocitarias.

Proteínas formadoras de poros. La producción de estas moléculas ocasionan lisis en la célula diana por medio de cambios osmóticos.

Sustancias neurohormonales. Se les ha culpado de conferir a ciertas cepas la facultad de crear disturbios en el transporte intestinal de electrolitos, cualidad de las diarreas perdedoras de volumen.

Patología

Las lesiones por E. histolytica pueden ser intestinales o extraintestinales potencialmente involucrando a varios órganos.

Lesiones intestinales

La patología intestinal ocurre principalmente en cualquier parte del colon, en particular el ciego, sigmoides y el recto. La interacción inicial del trofozoíto conlleva a lisis de las células diana, probablemente por acción proteolítica de lectinas.[6] Una vez atravesado el epitelio intestinal, penetra por la capa de la muscularis mucosae e instala hábitat en la submucosa, formando una apertura pequeña de entrada con un fondo ancho, que tiene la apariencia histológica de un botón de camisa o en matraz. La reacción inflamatoria resultante en el tejido intestinal producen nódulos que progresan a úlceras y subsecuente necrosis localizada como resultado de trastornos del riego sanguíneo. La resistencia del parásito al ataque del sistema del complemento, hace que pueda sobrevivir en medio de una sobrepoblación infiltrativa de células linfocitarias (células plasmáticas, linfocitos, eosinófilos, etc).[7]

Lesiones extraintestinales

1. Localización pulmonar, generalmente originada por contigüidad de las lesiones hepáticas, observándose con más frecuencia en el pulmón derecho. Se caracteriza por necrosis del parénquima pulmonar con posible infección bacteriana secundaria.

2. Localización cerebral, causada por diseminación sanguínea. Es una complicación bastante rara.

3. Localización en la piel, causando úlceras dérmicas, viéndose con más frecuencia en la región perianal, peneal y la pared abdominal.

4. Absceso hepátic

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Causas

La Entamoeba histiolytica puede vivir en el intestino grueso (colon) sin causar daño; sin embargo, algunas veces invade la pared del colon y causa colitis, disentería aguda o diarrea prolongada (crónica). La infección puede también diseminarse a través de la sangre al hígado y, rara vez, a los pulmones, el cerebro o a otros órganos.

Esta afección se presenta en todo el mundo, pero es más común en áreas tropicales donde hay condiciones de hacinamiento y salubridad deficiente. África, México, partes de Suramérica e India tienen problemas de salud significativos asociados con esta enfermedad.

La Entamoeba histiolytica se disemina a través de agua o alimentos contaminados con heces. Esta contaminación es común cuando los excrementos humanos se utilizan como fertilizantes. Esta enfermedad también puede diseminarse de una persona a otra, particularmente por contacto con el área bucal o rectal de una persona infectada.

Los factores de riesgo para la amebiasis grave abarcan:

Alcoholismo Cáncer Desnutrición Edad avanzada o temprana Embarazo Viaje reciente a una región tropical Uso de corticoesteroides para inhibir el sistema inmunitario

En los Estados Unidos, la amebiasis es más frecuente entre personas que residen en instituciones o personas que han regresado de un viaje a un área donde esta enfermedad es común.

Síntomas

La mayoría de las personas con esta infección no tienen síntomas. Si se presentan, se observan de 7 a 28 días después de estar expuesto al parásito.

Síntomas leves:

Cólicos abdominales Diarrea

o paso de 3 a 8 heces semiformadas al díao paso de heces blandas con moco y ocasionalmente con sangre

Fatiga Gases excesivos Dolor rectal durante la defecación (tenesmo) Pérdida de peso involuntaria

Síntomas graves:

Sensibilidad abdominal Heces con sangre

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o paso de heces líquidas con franjas de sangreo paso de10 a 20 heces al día

Fiebre Vómitos

Pruebas y exámenes

La exploración del abdomen puede mostrar hepatomegalia o sensibilidad abdominal.

Los exámenes abarcan:

Examen de sangre para amebiasis Exploración de la parte inferior del intestino grueso (sigmoidoscopia) Examen coprológico Examen microscópico de muestras de materia fecal, por lo general durante

varios días

Diagnóstico y Tratamiento

El diagnóstico logra mediante exámenes de laboratorio de la materia fecal con microscopio óptico. En algunos casos se requiere tomar imágenes del hígado con TAC, o detección del ADN del parásito mediante PCR o serología con detección de anticuerpos específicos.

El tratamiento depende de la gravedad de la infección. Generalmente, se administra metronidazol por vía oral durante 10 días, seguido de paromomicina o diloxanida.

Si usted está vomitando, puede necesitar medicamentos a través de una vena (intravenosos) hasta que pueda tomarlos por vía oral. Por lo general, no se prescriben medicamentos antidiarreicos, ya que pueden empeorar la afección.

La afección se trata por prescripción médica de

1metronidazol, 2iodoquinol 3paromomicina 4 furoato de diloxanida 5inidazol.

.TABLA TRATAMIENTO

Posibles complicaciones

Absceso hepático Efectos secundarios del medicamento, incluyendo náuseas Diseminación del parásito a través de la sangre hacia el hígado, los pulmones, el

cerebro u otros órganos

Expectativas (pronóstico)

El pronóstico generalmente es bueno con tratamiento. La enfermedad por lo regular dura aproximadamente dos semanas, pero puede reaparecer si no se administra tratamiento.

PREVENCION

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ANEXOS

Enlaces externos

Referencias

1. Markel y Voge. Parasitología: Diagnóstico, Prevención y Tratamiento. Ed. Manual moderno, pag 33-34.

2. Amador, F., Jimenez, E. & Kumate J. 1986. Correlación clínica del zimodemo de Entamoeba histolytica en pacientes de un hospital psiquiátrico. Seminario sobre amibiasis. 10, INCONNU, vol. 17, suppl., nº 1, pp. 331-334 (11 ref.) ]

3. Sistema Bibliotecario y de Información de la Universidad del Zulia.4. Sociedad Mexicana de Bioquímica. 5. Quintas Granados, et al. Activación del precursor de la EhCP112 de Entamoeba

histolytica e inhibición específica con su región PREPRO. 6. Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico

Nacional. 7. Universidad de las Américas Puebla.

8 Petri WA Jr, Haque R. Amebiasis. In: Goldman L, Schafer AI,eds. Cecil Medicine. 24th ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2011:chap 360.

9.-Petri WA Jr, Haque R. Entamoeba species, including amebiasis.In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. Philadelphia, Pa: Elsevier Churchill Livingstone; 2009:chap 273.

 

Artículo 1

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Diferenciación de Entamoeba histolytica / entamoeba dispar y  los nuevos hallazgos en la patogénesis de la amibiasis intestinal

 

 Resumen

La introducción de nuevas metodología moleculares ha permitido la diferenciación de Entamoeba histomica de la ameba comensal Entamoeba dispar, morfológicamente idéntica a E. histolytica. Entre los mecanismos de patogenicidad en Entamoeba histolytica se encuentra la presencia de la lecitina de galactosa-galactosamina en la superficie de los trofozoito, responsables de la adhesión a las células intestinales. También se han identificado polipéptidos solubles denominados ameboporos, los que se insertan en la membrana de fa célula blanco e inducen la lisis celular. Además se han caracterizado proteasas de cisteína, capaces de degradar distintos componentes de la matriz extracelular. Las proteasas de cisteína están también involucradas en la evasión de la respuesta inmune por cuanto degradan inmunoglobulinas IgA e IgG, y las anafilotoxinas C3a y C5a. En E. dispar se ha demostrado la

presencia de ameboporos y proteasas de cisteína en menor concentración y con menor actividad biológica lo que se cree tiene un impacto en la carencia de patogenicidad de esta especie.

Se revisan los nuevos hallazgos en cuanto la epidemiología en distintos países del mundo, utilizando las técnicas moleculares de diferenciación para E. histolytica. En Costa Rica la seroprevalencia por E. histolytica en pacientes con heces positivas por quistes de E. histolyticale / E. dispar fue de 7,3%, por lo que se considera que la mayoría de los pacientes en cuyo examen al fresco se observan quistes se trata verdaderamente de E. dispar, por cuanto la

presencia de anticuerpos se utiliza para diferenciar una infección por E. histolytica de una causada por E. Dispar.

El referencia al diagnóstico el hallazgo de trofozoitos con eritrocitos fagocitados en heces frescas o biopsias se correlaciona con la presencia de E. histolytica. Por el contrario los quistes de ambos protozoarios son indistinguibles. En la actualidad se dispone de variadas técnicas inmunológicas, algunos comercialmente disponibles, para la detección de antígenos en heces y anticuerpos en suero, para ambos casos la técnica más utilizada es el ELISA.

Palabras clave

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Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, patogénesis, epidemiología, diagnóstico diferencial.  

Abstract

The introduction of molecular techniques allowed the differentiation of Entamoeba historic from E. dispar, a comensal ameba morphologically indistinguisable from E. histolytica. Pathogenic mechanisms of E. histolytic inciudes the presence of a galactosa binding lectin that attachs trophozoites to intestinal epithelial cells. Also pore-forming peptides termed amebopores have been demonstrated, this peptides oligomerize after insertion in the cell membrane and form waterfilled channels through which ions and other molecules can pass, causing cell lysis. Cysteine proteasas have also been characterized as a viruience factor responsable of the degradation of the extracellular matrix and the evasion of the immune response by degradation of IgA, disruption of IgG, and degradation of anaphylotoxins C3a and C5a.

The new epidemiological findings around the worid by the use of molecular technics are also discussed. In Costa Rica seroprevalence of 7,3% in E.histoyica / E.dispar cysts positive patients is taken an indication that the majority of the infections are caused by E. dispar. Antibody are present only in E. histoyica infection.

As far as diagnosis, the finding of trofozoites with enguifed eritrocytes in fresh fecal samples or biopses correlates with E. histoyica. On the other hand, cysts of both protozoa are indistinguisable. Several immunological technics are available for the determination of antigen in stool samples or antibodies in sera.

Key words

Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, pathogenesis, epidemiology, diferencial diagnosis.

Introducción

La aplicación de las técnicas de biología molecular ha permitido la diferenciación de Entamoeba histolytica , agente etiológico de la amibiasis intestinal, de una ameba comensal, morfológicamente idéntica denominada Entamoeba dispar.

En el año 1875 el médico ruso Fedor Lösch describe el caso de un granjero que había sido admitido a su clínica en St. Petersburgo. Este joven presentaba un cuadro de disenteria crónica y al observar las heces Lösch encontró gran cantidad de amebas a las que denominó con el nombre de Amoeba coli y cuya descripción concordaba con la morfología típica de Entamoeba histomica Sin

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embargo, Lösch no consideró que las amebas fueran causantes de la diarrea, sino que ayudaban a mantener el proceso inflamatorio

Durante los años siguientes se presentó una serie de discrepancias entre los distintos investigadores, principalmente en cuanto a los aspectos taxonómicos, lo cual se refleja en la gran cantidad de nombres que este parásito recibió (Amoeba coli, Amoeba dysenteriae, etc) . El 1903 el zoólogo alemán Fritz Schaudinn, diferenció Entamoeba coli ameba comensal del intestino, de la ameba patógena capaz de destruir tejido, característica por lo que la llamó por primera vez Entamoeba histolytica (. Schaudin murió en el año 1906 a la edad de 35 años de complicaciones secundarias a una amibiasis adquirida de manera experimental .

En el año 1925 Emil Brumpt parasitólogo francés describió una especie de Entamoeba similar morfológicamente Entamoeba histolytica, con cuatro núcleos en su forma quística, y la denomina Entamoeba dispar , considerándola no patógena. Sus conclusiones se fundamentaron en tres argumentos: primero, el seguimiento por un período de ocho años de individuos infectados que nunca desarrollaron síntomas; segundo la infección de gatos, un método muy sensible para la producción experimental de amibiasis intestinal, que con E . dispar nunca llevó a la producción de síntomas y por último estudios epidemiológicos que demostraban altas tasas de infección por E. histomica en países en los que no se reportaban casos de amibiasis. Brumpt concluye con estos datos

que las infecciones en países de zonas templadas eran debidas a una especie distinta aunque morfológicamente idéntica a E. histolytica y la denominó E. dispar . Todos estos argumentos fueron rechazados por la comunidad científica internacional principalmente por considerarse en ese momento que el concepto de especie representaba una idea morfológica y no debería basarse en aspectos patológicos .

La resurrección de E. dispar como una especie diferente a E. histolytica ocurrió muy lentamente. En 1978 Sargeunt y Williams utilizando los patrones de migración electroforética de tres isoenzimas (glucosa fosfato isomerasa, fosfoglucomutasa y malato oxidoreductasa) lograron establecer cuatro diferentes zimodemas, uno de los cuales es relacionado con la forma invasora y los otros con la forma no invasora o comensal . Con la inclusión de hexokinasa y su respectivo patrón electroforético, se demostró que aislamientos derivados de casos sintomáticos presentan una banda de hexokinasa de rápida migración (banda á) y por el contrario, los aislamientos de pacientes asintomáticos bandas de lenta migración . Finalmente, se establece la presencia de veintiún zimodemas, de los cuales nueve corresponden a zimodemas no patogénicos, actualmente identificados para E. dispar y los restantes doce a zimodemas patogénicos que corresponden a E. histolytica .

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En los años posteriores además de las diferencias en los patrones de migración electroforética, se desarrollaron anticuerpos monocionales contra varios antígenos que permiten diferenciar las cepas invasoras de las no invasoras. Dentro de estos se encuentran: la lectina de adherencia Gal/GalNac (GIAP) , un antígeno de superficie de 96 kDa , un antígeno proteínico interno de , una proteína hidrofílica de membrana de 29 kDA/30 kDa , así como el antígeno aislado de los gránulos electrodensos (EDG) producidos al interactuar trofozoitos del parásito con colágeno "in vitro" .

Con el advenimiento de mejores técnicas para el análisis del ADN, los procesos de hibridación y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se establecieron diferencias no sólo a nivel bioquímico y antigénico sino también desde el punto de vista genético principalmente en secuencias altamente repetitivas de¡ ADN circular extracromosomal , así como diferencias en genes codificantes para la actina , la cisteina proteinasa (, la superóxido dismutasa .

De acuerdo a esta evidencia inmunológica, bioquímica y genética, en 1993 Diamond y Clark ,confirman la validez de Entamoeba dispar Brumpt, 1925 como una especie diferente a la E. histolytica, Schaudinn 1903. La Organización Mundial de la Salud en 1997 reconoce que la diferenciación ha sido universalmente aceptada y recomienda el reportar el hallazgo de quistes y trofozoitos de la forma comensal como E. histoyica / E. dispar .

La presente revisión trata de difundir los hallazgos más relevantes para la diferenciación, epidemiología y diagnóstico de la amibiasis intestinal.

Patogénesis

La patología en amibiasis se inicia por la adherencia de E. histoyica a las células intestinales. Dentro de los principales factores de adherencia encontramos la lectina denominada lectina gal/N-acetil galactosamina (GIAP), que se une a residuos de galactosa-galactosamina en las glicoproteínas de la célula blanco. Este receptor es un heterodímero formado por una cadena pesada y una liviana, siendo codificado por cinco genes . La cadena pesada es además, una proteína integral de membrana que une 8 y 9 y bloquea la formación de complejo de membrana en la cascada del complemento. Se ha descrito además una molécula de 37kDa que puede servir como receptor de la fibronectina .

El principal factor de virulencia presente en E. histolytica es su capacidad de citotoxicidad, proceso que está mediado por una serie de factores y sustancias producidas por la ameba dentro de las cuales destacan los ameboporos y las proteasas de cisteína .

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La familia de los ameboporos comprende tres isomorf os, el ameboporo A, B y C, que se encuentran en una proporción aproximadamente de 35:10:1 respectivamente y presentan un 35-57% de identidad en sus secuencias de aminoácidos Los ameboporos son polipéptidos solubles que se insertan en la membrana de la célula blanco por la unión con fosfolípidos aniónicos a bajo pH, oligomerizan, proceso mediado por la interacción péptido-péptido, difunden en la membrana y forman un canal a través de¡ cual se produce la salida de iones y otras moléculas pequeñas. En consecuencia el medio interno celular cambia y esto resulta en muerte por lisis . Se ha demostrado que los ameboporos presentan homología con el polipéptido de las células NK y de los linfocitos citotóxicos de cerdos, con la saponina y con el surfactante de la proteína B , todas estas sustancias producen un efecto lítico similar a los ameboporos.

Se ha postulado que los trofozoitos de E. histolytica son resistente a la actividad del ameboporo por cuanto su membrana celular posee fosfolípidos neutros que impiden la unión de los polipéptidos . La principal función de los ameboporos es la eliminación de las bacterias fagocitadas principal fuente de alimento de los trofozoitos .

En E. dispar se ha demostrado la presencia de ameboporo A y B, en menor concentración y con menor actividad biológica lo que se cree tiene un impacto en la carencia de patogenicidad de esta especie .

Por su parte, las proteasas de cisteína son las enzimas proteolíticas encontradas en mayor concentración en los lisados de Entamoeba histolytica Un total de ocho tipos diferentes han sido descritos, de los cuales EHCP 1, EHCP 2, y EhCP 3, con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa, comprenden un 90% del total de la actividad de proteasa hallada en el protozoario . Estas enzimas han sido asociadas a la degradación de la matriz extracelular (fibronectina, laminina, colágeno) y a la evasión de la respuesta inmune al digerir la IgA, , IgG y la inactivación de las anafilotoxinas (C3a y C5a). Por su parte, en aislamientos de E. dispar estas proteasas se han encontrado en menores concentraciones lo cual se ha relacionado con su falta de virulencia

Epidemiología

E. histolytica causa a nivel mundial de 50100 millones de casos de colitis invasiva o abscesos hepáticos y aproximadamente 70 000 muertes al año, colocándose en el segundo lugar dentro de las parasitosis que causan más muertes a nivel mundial, superada únicamente por la malaria con un estimado para el año 2 000 de

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entre 1,1 millones de muertes. En cuanto a la incidencia para el año de 1997, la amibiasis ocupa un tercer puesto antecedido por malaria y tricomoniasis .

Áreas altamente endémicas por E. histolytica incluyen la India, el oeste y surdeafrica, así como ciertas regiones de Sur y Centro América en donde más del 50% de las poblaciones de alto riesgo pueden estar infectadas . Uno de los países latinoamericanos más afectados es México en donde, de acuerdo a un estudio del año 1 994, la prevalencia de anticuerpos contra E. histolytica en una muestra de 67 668 personas y representativa de la población general, fue de 8,4% (. Por otro lado en Nicaragua se ha informado una seropositividad en personas asintomáticas excretoras de quistes de aproximadamente de 7,3% con el uso de un ELISA para la detección de IgG, encontrándose además un pico de prevalencia en el grupo de edad de los 5 a 16 años (. Estudios en la región norte de las Filipinas, utilizando PCR, muestran una prevalencia del 0,96% de infección por E. histolytica y del 7,16 % por E. dispar en la población genera. En Bangladesh se ha informado una prevalencia de 4,2% por E. histomica y de 6,5% por E. disparen niños del área urbana con diarrea y una prevalencia de 1 % por E. histolytica y 7% por E. dispar en niños asintomáticos del área rural . En Brasil, Braga et al reporta un 24,7% de positividad en 335 individuos con un promedio de edad de 14 años (Cuadro).

 PrevalenciaenCostaRica En nuestro país Reyes et al informan una prevalencia de 16% de E. histolytica / E. dispar en niños de guarderías del Cantón Central de San José utilizando examen directo, concentración y tinción con hematoxilina férrica . Otro estudio realizado por Morales et al encuentran una prevalencia del 2,9% en el año de 1989 y del 1,08% en 1994, en ambos casos en la comunidad de Torremolinos en Desamparados. En la provincia de Limón se ha demostrado una prevalencia por E. histolytica / E. dispar en la zona central y alrededores es del 7,5 % En pacientes HIV seropositivos se ha demostrado 9,3% de positividad por E. histolytica / E. dispar en heces por método directo (59).

En referencia a la prevalencia de anticuerpos contra E. histolytica, León y Reyes realizaron un estudio en 41 pacientes positivos por quistes de E.histolytica / E dispar en heces. Se demostró la presencia de anticuerpos utilizando la técnica de ELISA (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) en 3 de las 41 muestras de suero analizadas (7,3%). La mayoría de los pacientes fueron asintomático (n 29), dentro de los cuales se encontró un único caso serológicamente positivo (3,4%). De los pacientes con algún tipo de sintomatología asociada con amibiasis (n 12) se demostró seropositividad en 2 casos (1 6%) (59). En conclusión, este estudio demostró que la gran mayoría de los pacientes del área metropolitana de San José, en cuyo examen al fresco se observan quistes de E. histolytica / E. dispar, se tratan de E. dispar, esto por cuanto la presencia de anticuerpos se utiliza para diferenciar una infección por E. histoyica de una provocada por E. dispar .

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Si estimáramos en promedio en nuestro país una prevalencia de E. histolytica / E. dispar de aproximadamente 7% y si consideramos que un 7% de estos pacientes a su vez presentan anticuerpos, se podría extrapolar una prevalencia de E. histolytica en la población general cercana al 0,5%. Estas estimaciones parecen corresponder con el bajo número de casos clínicos observados en nuestro país.

Los distintos indicadores de salud, por ejemplo el nivel de cobertura por agua potable, el porcentaje de hogares con servicio sanitario, la disponibilidad de atención médica, pueden explicar las diferencias en la prevalencia de amibiasis entre nuestros país y otros países subdesarrollados .

  Diagnóstico

El diagnóstico parasitológico de la amibiasis intestinal está basado en la demostración de trofozoitos de E. histomica en las heces por medio del análisis directo en solución salina, lugol o tinción (hematoxilina férrica o tinción tricrómica), o su demostración en biopsias de la mucosa intestinal o hepáticas. El examen microscópico de una única muestra de heces lleva a una

sensibilidad del 50 al 70%, por lo que se requiere de al menos el análisis de tres muestras diferentes para lograr una sensibilidad del

90% .La eficacia de muchas de estas técnicas diagnostibásicamente la observación directa de las heces así como las tinciones, está determinada por la habilidad y experiencia del microbiólogo para detectar y diferenciar a los trofozoitos de E. histolytica de otras amebas comensales, de leucocitos, etc. Además como ya se indicó la observación directa de los quistes no permite diferenciar entre E. histolytica y E. dispar. El hallazgo de trofozoitos con eritrocitos fagocitados en heces frescas u otros especimenes y trofozoitos en biopsia tisular están en ambos casos fuertemente correlacionados con la presencia de E. histolytica y enfermedad invasiva .

Acuña-Soto et al, informan que no hay diferencias estadísticas significativas en cuanto al diámetro de los quistes entre las dos especies, demostrando un promedio para E. histomica de 12,27 ±

1,29 u y de 1 1,63 ± 0,81 para E. dispar, por lo anterior es imposible hacer la diferenciación con la simple observación de quistes al microscopio.

Por estas razones en los últimos años se han realizado considerables esfuerzos en desarrollar técnicas inmunológicas para una fácil detección de E. histolytica. De esta forma existen en la actualidad métodos inmunológicos, algunos comercialmente disponibles, que pueden detectar tanto antígenos en heces como anticuerpos en suero y para ambos casos la técnica más utilizada es el ELISA .

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Entre estas tenemos: el empleo de antígenos solubles de una cepa patógena , principalmente la denominada HM1:IMSS, los cuales se obtienen a partir de un cultivo de la ameba y un proceso de sonicación. Con este tipo de antígeno podría esperarse que la especificidad nos sea la apropiada, sin embargo partiendo deshecho de que únicamente la infección por E. histolytica va a generar una respuesta inmune humoral detectable , este aparente inconveniente no representa un gran problema.

Otros métodos más específicos que utilizan la lectina denominada GIAP. Esta lectina de 260 kDa presenta dos subunidades: una pesada de 170 kDa unida por puentes disulfuro con otra subunidad liviana de 35 kDa. La subunidad de 170 kDa es antigénicamente conservada y además es inmunogénica, por el contrario la de 35 kDa no desarrolla una respuesta inmune . Por lo anterior, el antígeno de 179 kDa ha sido utilizado tanto para la detección de anticuerpos, como para el desarrollo de anticuerpos monocionales que permiten su identificación directamente en las heces Se ha desarrollado anticuerpos monoclonales contra esta subunidad y establecido la presencia de al menos 6 epitopos importantes como posibles herramientas para la diferenciación de E. Histolytica / E. dispar. Dos de estos anticuerpos monoclonales reconocen dos

epitopos presentes en ambas especies y los cuatro restantes reconocen epitopos que se encuentran sólo en la especie patógena .

El empleo de antígenos recombinantes como es el caso de la subunidad de 170 kDa o del antígenos denominado proteína de E. histomica rica en residuos de serina (SREHP) , ofrecen una serie de ventajas: pueden ser producidos en grandes cantidades con relativa facilidad, se evita la necesidad de mantener cultivos de E. histolytica y además el uso de un antígeno recombinante puede ayudar al desarrollo de un ensayo bien estandarizado . Otro posible beneficio es la aparente capacidad que tienen los ELISA basados en este tipo de antígenos, para diferenciar un cuadro agudo de crónicos . Esto sería muy útil principalmente en zonas altamente endémicas en donde el número de individuos seropositivos por infección anterior es muy elevado . Estos estudios han establecido que pacientes con absceso hepático amibiano se tornan seronegativos a estos antígenos a partir de los 120 días posteriores a la aparición de los síntomas . Recientemente se han desarrollado anticuerpos monocionales que reconocen específicamente los quiste en muestras no fijadas y trofozoitos en muestras preservadas . Estos hallazgos podría constituir una importante herramienta ya que eventualmente acoplados a un ELISA, permitirían diferenciar directamente en las heces los quistes y/o trofozoitos de E. histomica de los de E. dispar. En la actualidad la diferenciación de los quistes de E. histolytica y E. dispar directamente de las heces y sin recurrir al cultivo, únicamente se puede realizar empleando PCR .Las pruebas serológicas son de gran importancia principalmente en áreas no endémicas ya que en estos sitios un 90% de los individuos con amibiasis invasiva poseen anticuerpos anti-E. histolytica . En

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estas áreas la serología es una prueba diagnóstico sensible debido a la predominancia de individuos seronegativos. Otra técnica que se ha venido desarrollando desde los inicios de los años 90, es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la cual ha demostrado ser muy eficaz para la diferenciación de ambas especies pero cuyo empleo se haya limitado a estudios epidemiológicos o experimentales pero no a nivel diagnóstico rutinario .

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P 23A 2002L COSTARRICAE Revista Costarricense de Ciencias MédicasT Diferenciación de Entamoeba histolytica / entamoeba dispar y los nuevos hallazgos en la patogénesis de la amibiasis intestinalA L Reyes 1 , R León 2

ARTÍCULO 2

Detección y diferenciación de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar mediante reacción en cadena de la polimerasa en individuos de una comunidad del Estado Zulia, Venezuela

 Detection and differentiation of Entamoeba histolytic and Entamoeba dispar by polymerase chain reaction in a community in Zulia State, Venezuela

 Zulbey Rivero; Ángela Bracho; Marinella Calchi; Iris Díaz; Ellen Acurero; Adriana Maldonado; Glenis Chourio; Nailet Arráiz; Gilbert Corzo†

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ABSTRACT

Differential identification of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar is essential for both appropriate patient treatment and epidemiological purposes. To determine the prevalence of these amoeba infections in Santa Rosa de Agua (Maracaibo, Zulia State, Venezuela), a PCR assay using specific primers for each species was standardized and applied. 204 stool samples were analyzed through direct microscopic examination with SSF (0.85%) and lugol, formol-ether concentration, and PCR. Under direct microscopy, 42 individuals (20.58%) presented the E. histolytica/E. dispar complex. Meanwhile PCR showed 47 positive cases for these amoebas: 22 E. histolytica (10.78%), 16 E. dispar (7.84%), and 9 (4.41%) mixed infections. There was no significant difference in the presence of E. histolytica and/or E. dispar according to either gender or age. There were no cases of these amoebas in children under 2 years of age. Observed frequency of E. histolytica (31/204) shows the endemic nature of amoeba infection in this community.

Entamoeba; Parasites; Feces; Microscopy; Polymerase Chain Reaction

RESUMEN

La identificación diferencial de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar es esencial para un tratamiento adecuado del paciente y con fines epidemiológicos. Para determinar la prevalencia de E. histolytica y E. dispar se estandarizó y aplicó un ensayo de PCR, utilizando oligonucleótidos específicos para cada especie. 204 muestras de heces de individuos de la comunidad de Santa Rosa de Agua (Municipio Maracaibo, Estado

Zulia, Venezuela), fueron analizadas a través del examen directo con SSF (0,85%) y lugol, concentrado de formol-éter y PCR. Al examen microscópico, 42 individuos (20,58%) presentaron formas evolutivas del complejo E. histolytica/E. dispar; mientras que la técnica de PCR evidenció un total de 47 casos positivos a estas amibas; de los cuales 22 eran portadores de E. histolytica (10,78%), 16 (7,84%) de E. dispar y 9 (4,41%) presentaron infección mixta. No hubo diferencia significativa al relacionar las variables sexo y presencia de E. histolytica y/o E. dispar, ni con los grupos etarios. No existieron casos de estas amibas, en los menores de 2 años. La frecuencia observada de E. histolytica (31/204), demuestra el carácter endémico de la amibiasis en esta comunidad.

Entamoeba; Parásitos; Heces; Microscopía; Reaceión en Cadena de la Polimerasa

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 Introducción

El término amibiasis define todos los casos de infección humana por Entamoeba histolytica, independientemente de la presencia o ausencia de manifestaciones clínicas en el individuo. A lo largo del tiempo, se acumularon múltiples incógnitas relacionadas con las variaciones de casos sintomáticos y asintomáticos en los pacientes infectados

con esta amiba. Esto generó la propuesta de la existencia de cepas patógenas y no patógenas de E. histolytica 1,2,3, así como la existencia de dos especies diferentes, pero con idénticas características morfológicas 4. Múltiples estudios bioquímicos, inmunológicos y genómicos permitieron que finalmente en el año 1997, durante el XIII Seminario sobre la Amibiasis en la Ciudad de México, los expertos reconocieran la existencia de dos especies diferentes de Entamoeba: E. histolytica como la especie causante de enfermedad invasiva y extra-intestinal y E. dispar como la especie no patógena 5. La aceptación de la existencia de E. dispar cambia drásticamente la epidemiología de la amibiasis y conlleva a que las estimaciones sobre la prevalencia real de E. histolytica a nivel mundial sean reinterpretadas.

A pesar de haberse esclarecido esta situación, permanecen en la actualidad una serie de problemas relacionados con el diagnóstico de la amibiasis. Por un lado, el desconocimiento de la nueva clasificación por parte de muchos profesionales del área de la salud, y por otro, la metodología de laboratorio que ahora es necesaria para la diferenciación de E. histolytica y E. dispar. El diagnóstico rutinario de amibiasis se realiza mediante examen coprológico, generalmente con la observación microscópica de quistes y/o trofozoítos característicos en las heces o con menos frecuencia en la biopsia de tejido mucoso 6. Sin embargo, el examen microscópico del material fecal tiene varias limitaciones, la más importante de ellas es la incapacidad de distinguir entre E. histolytica y E. dispar, debido a que son morfológicamente idénticas, y sólo puede confirmarse la presencia de E. histolytica cuando las heces presentan trofozoítos hematófagos 7. Además, el examen microscópico es sumamente subjetivo, dependiendo en alto grado de la pericia del observador en diferenciar la morfología del protozoario de la morfología de otras especies de amibas comensales tales como: E. coli, E. hartmanni, Iodamoeba butschlii o Endolimax nana, así como de otros elementos como leucocitos y macrófagos y no dar lugar a sobre-diagnósticos de amibiasis. Por todo lo anteriormente expuesto, es imperativo reconocer que deben realizarse pruebas especiales, como las técnicas de detección de antígenos específicos de E. histolytica o técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para poder discriminar la presencia de E. histolytica y/o E. dispar en las heces de un paciente determinado.

Lamentablemente las deficientes infraestructuras y bajos presupuestos existentes en los centros de salud públicos regionales, limitan la aplicación de dichas técnicas en los laboratorios. Esta dificultad ha impedido establecer la verdadera prevalencia de la amibiasis en el estado y en el país. Esta investigación pretende estandarizar una técnica de PCR que permita identificar y diferenciar E. histolytica y E. dispar en individuos de una comunidad del municipio Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela, como estudio pionero en la determinación exacta de la prevalencia de estas amibas en nuestra región.

 Materiales y métodos

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Población

Fue realizado un estudio descriptivo, no experimental en individuos de la comunidad de Santa Rosa de Agua, en el periodo comprendido desde enero hasta julio de 2006. Santa Rosa se ubica en la región nor-este del municipio Maracaibo; dicha comunidad está dividida geográficamente en dos sectores: tierra y agua, esto significa que algunas viviendas están construidas sobre tierra firme y otras sobre el agua (palafitos). Los factores que influenciaron la elección de esta comunidad fueron, la dimensión de la

misma, sus precarias condiciones higiénico-sanitarias y la proximidad a la Universidad del Zulia. Como criterio de inclusión se exigió el no haber ingerido medicamentos antiparasitarios como mínimo, seis meses antes de la toma de la muestra. Se obtuvo el consentimiento escrito de los padres, representantes o jefes de familia de la comunidad, lo que permitió que 204 individuos aceptaran participar en el estudio y cumplieran con los requerimientos del mismo. Cada familia fue entrevistada por un miembro del equipo de investigación, así mismo le fue explicado el propósito del estudio, el tipo de muestra requerida y su correcta recolección.

Como colaboración a la comunidad, los individuos parasitados recibieron tratamiento antihelmíntico de forma gratuita, posterior al diagnóstico parasitológico y clínico, que fue realizado por dos médicos de la Universidad del Zulia.

Muestras y procedimiento parasitológico

Se recolectó un espécimen fecal por individuo, en un envase plástico grande, nuevo, limpio, de boca ancha y tapa de rosca. Estas muestras se mantuvieron refrigeradas (4°C) y sin tratamiento químico alguno, hasta su procesamiento en el Laboratorio de Parasitología de la Escuela de Bioanálisis de la Universidad del Zulia. Cada muestra fue dividida en dos partes, una de ellas se congeló a -20°C, para su posterior análisis molecular (PCR) y la otra porción se mantuvo sin congelar para el análisis parasitológico. Este consistió en el montaje al fresco con SSF y lugol, así como el método de concentración de formol-éter 8, para identificar la presencia de alguna forma evolutiva de Entamoeba.

Caracterización molecular de E. histolytica y E. dispar

La extracción de ADN genómico de Entamoeba sp. a partir de muestras de heces, se llevó a cabo a través de un procedimiento estandarizado en el laboratorio que incorporó algunos pasos de protocolos de lisis enzimática, choque térmico y mecánico, descritos previamente 9,10,11. Se transfirió aproximadamente de 0,5 a 0,7g de heces a un tubo Eppendorf de 2mL, se resuspendió en 1mL de PBS (0,1M Na2HPO4, 0,1M NaH2PO4, pH 7,5) y se filtró a través de doble malla de gasa estéril. El homogeneizado fue centrifugado a 10.000rpm y el sedimento resultante fue lavado tres veces con 1,5mL de

PBS para eliminar contaminantes solubles. El sedimento resultante se lavó con 1mL de NaCl 0,15M tres veces o hasta que el sobrenadante quedó claro. El sedimento se resuspendió en 600μL de buffer de lisis (Tris-Cl 100mM pH 8, 25mM EDTA, 0,25% SDS) y se sometió a 5 ciclos de congelación-descongelación, incubando el tubo en hielo seco-alcohol isopropílico por 5 minutos y descongelando a 37°C por tres minutos. Después del último tratamiento, se agregó 10μL de proteinasa k de 20mg/mL y se

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incubó a 55°C durante toda la noche. Al día siguiente, se agregó 60mL de CTAB-NaCl (0,7M NaCl, 1% CTAB) y se incubó a 65°C por una hora. Se hizo una extracción con 500μL de cloroformo, luego con fenol-cloroformo y cloroformo. Se recuperó la fase acuosa en otro tubo Eppendorf y el ADN se precipitó con 600μL de isopropanol, incubándolo a temperatura ambiente durante 45 minutos y luego centrifugando durante 30 minutos a 14.000rpm. El sedimento se resuspendió en 50μL de buffer TE. Se utilizó 10mL de la muestra para ensayos de amplificación. El mismo tratamiento fue seguido para la extracción de ADN genómico a partir de cultivos de E. histolytica IULA:1092:1.

En estos casos se utilizó 2,5μL de ADN para los ensayos de amplificación por PCR de los controles.

Se preparó una mezcla de reacción para un volumen final de 50μL, consistiendo en 10μL de buffer Go taq DNA polimerasa 10X (Promega), 2,5mM MgCl2, 200μM cada desoxirribonucleótido (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1μL de cada oligonucleótido (primers) 50μM (1μM cada oligonucleótido). Se utilizó 0,5μL de Taq DNA polimerasa 5U/μL para cada reacción. Esta mezcla de reacción se utilizó para amplificación por PCR de secuencias del gen SRPEh 5\'-> CTT GAA AAG CTT GAA GAA GCT G 3\'; 3\'AAC AAT GAA TGG ACT TGA TGC A -<5\'; y SRPEd 5\'-> GTA GTT CAT CAA ACA CAG GTG A 3\'; 3\' CAA TAG CCA TAA TGA AAG CAA -<5\´; incluyendo los oligonucleótidos específicos para cada reacción. Para la amplificación de secuencias del genoma de E. histolytica y E. dispar, se utilizaron dos pares de oligonucleótidos dirigidos a la secuencia del gen SREHP, cuya especificidad ha sido reportada previamente 10. El gen SREHP codifica para una proteína antigénica rica en serina en ambas especies 12 y la identidad de los oligonucleótidos utilizados fue confirmada por alineamiento de sus secuencias, utilizando el programa Blast y las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de los Estados Unidos 13,14. Los oligonucleótidos fueron sintetizados por Maxim Biotech (Rockville, Estados Unidos).

Para los oligonucleótidos SRPEh5/3, específicos de E. histolytica, el programa de amplificación definitivo fue modificado del protocolo previamente reportado 15, consistió en una desnaturalización inicial de 10 minutos a 96°C y 35 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94°C (desnaturalización), 1,5 minuto a 64°C (alineamiento de los oligonucleótidos) y 2 minutos a 72°C (polimerización). Se incluyó un paso final de extensión a 72°C por 8 minutos.

Para los oligonucleótidos SRPEd5/3, específicos de E. dispar, se utilizó un programa equivalente al anterior (SRPEh5/3), pero cambiando la temperatura de alineamiento de los oligonucleótidos a 60°C, a partir del protocolo descrito por Ramos et al. 10.

Los oligonucleótidos SRPEd5/3 son específicos de E. dispar y generan un fragmento de 567bp, mientras que los oligonucleótidos SRPEh5/3 específicos de E. histolytica generan un fragmento de 553pb.

La preparación de las mezclas de PCR se llevó a cabo en un área de trabajo estéril y para las reacciones de amplificación se utilizó un termociclador MJ Research PTC-100 (GMI Inc.). En todos los ensayos se incluyeron controles negativos y positivos. Como

control negativo, se utilizó la mezcla de reacción sin el ADN blanco. Como controles positivos se utilizaron 2,5μL del ADN extraído a partir del cultivo de E. histolytica

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IULA:1092:1 (según el mismo protocolo anteriormente descrito) y como control positivo de E. dispar se utilizaron 2,5μL del ADN genómico que nos fue donado por el Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de los Estados Unidos.

Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa en cámaras horizontales (Bio-Rad Laboratoires). La concentración de agarosa utilizada fue de 1%. Como buffer de corrida se utilizó TBE (Tris-Borato 89mM, EDTA 2mM pH 8). La corrida se llevó a cabo a 40v/cm por 2-3 horas. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio, visualizados en transiluminador ultravioleta y fotografiados con sistema de

fotodocumentación DigiDoc UVP. Se incluyó marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder de Promega.

Análisis estadístico

Para el análisis se utilizó el paquete estadístico Statgraphics Plus versión 5.1 para Windows (Statistical Graphics Corp., Herndon, Estados Unidos). Para analizar las prevalencias de E. histolytica y E. dispar se calculó la diferencia de porcentajes, mediante la prueba Z. La relación entre las variables edad, sexo y prevalencia de E. histolytica y E. dispar se determinó mediante el estadístico Ji cuadrado de Pearson. Un valor de p < 0,05 fue considerado como el nivel crítico de significación 16.

Resultados y discusión

La evaluación de infecciones parasitarias en la comunidad, demostró que la población está altamente infectada por enteroparásitos: (177/204) 86,77% de prevalencia general (Tabla 1). Los parásitos más frecuentemente observados fueron protozoarios, algunos patógenos para el humano y otros relacionados con el fecalismo.

La prevalencia de E. histolytica/E. dispar detectada por examen microscópico fue de 20,58% (42/204). Otros estudios realizados en comunidades indígenas e instituciones educativas del Estado Zulia reflejan valores similares, que oscilan entre 7,3% y 27% 17,18,19. No se observaron trofozoítos hematófagos, por lo que en ningún caso pudo concluirse la presencia deE. histolytica mediante este procedimiento.

El reconocimiento de E. histolytica como especie patógena y E. dispar como especie no-patógena, y su clasificación como especies separadas, pero microscópicamente indistinguibles, han inducido a la Organización Mundial de la Salud (OMS) a recomendar el desarrollo y aplicación de métodos específicos para el diagnóstico de E. histolytica 20. Diversas publicaciones han reseñado al PCR como el método más sensible y específico para el diagnóstico de la amibiasis 15,21,22,23,24 y lo han propuesto como la "prueba de oro" para determinar esta infección.

La técnica de PCR descrita aquí, demostró una segura detección y diferenciación de las dos especies que componen el complejo E. histolytica/E. dispar, mediante la extracción del ADN directamente de las muestras fecales sin efectuar cultivos previos (Figura 1). La sensibilidad y especificidad del PCR para el diagnóstico de E. histolytica fue del 87% y 91% respectivamente; mientras que paraE. dispar fue del 92% y 89%.

Los resultados del ensayo de PCR aplicado a las muestras estudiadas se muestran en el Tabla 2. La especie E. histolytica fue detectada en 22 de 204 muestras fecales (10,78%),

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E. dispar fue observada en 16 muestras (7,84%) y ambas especies de Entamoeba fueron detectadas en 9 muestras (4,41%). La prevalencia total de infección porE. histolytica [(Eh+(Eh+Ed)] en la comunidad estudiada, 31 casos (15,19%) fue mayor que la infección por E. dispar [(Ed+(Eh+Ed)], 25 casos (12,25%). La ocurrencia de infecciones mixtas entre E. histolytica y E. dispar ha sido reportada previamente 9. Los resultados de la prueba Z (p < 0,01) demostraron que la frecuencia de E. histolytica es significativa para esta población. Aunque muchos autores 9,10,11,21,25,26,27,28,29,30 señalan una mayor prevalencia de E. dispar con relación a E. histolytica, el hallazgo de un

mayor número de casos de esta última (15,19%) no resulta sorprendente para esta comunidad, en virtud de las deplorables condiciones de higiene y salubridad observadas, y alerta sobre el potencial problema de salud de la amibiasis, como factor de morbilidad y mortalidad en esta parroquia. La mayoría de los individuos que viven en palafitos, acostumbran arrojar sus excretas al agua, bañarse en ellas y luego reutilizar estas mismas aguas en sus viviendas. En Venezuela, sólo existe un reporte previo que refiere la utilización de técnicas discriminatorias entre ambas amibas. Mora et al. 31

estudiaron mediante nested-multiplex PCR, 428 pacientes con síntomas gastrointestinales, encontrando una prevalencia de E. histolytica de 6,31%, 4,44% deE. dispar y 4 casos de infección mixta.

Aunque otros autores han referido la presencia de sangre en las muestras con E. histolytica 32,33; en la presente investigación, sólo un paciente infectado con E. histolytica (1/31), presentó sangre en la muestra fecal al momento del examen macroscópico, por lo que no se pudo efectuar correlación entre estas variables. Es posible justificar la ausencia de sangre en las heces de los pacientes incluidos en este estudio, si para el momento en que los individuos entregaron su muestra, el parásito todavía no hubiere invadido la mucosa intestinal.

En general, se observó un elevado número de infecciones múltiples (poliparasitismo) entre los individuos de la comunidad (66,17%). Cuando se analizan los casos que resultaron positivos por PCR, los protozoarios más frecuentemente asociados a E. histolytica fueron Blastocystis hominis (74,19%), E. coli (41,93%) y Giardia lamblia (22,58%). En los individuos con E. dispar se presentó asociación con las mismas especies parasitarias y además con E. nana.

Algunas publicaciones refieren a E. coli como uno de los principales organismos asociados a infecciones por E. histolytica y han sugerido que debe existir un mecanismo común de transmisión o una susceptibilidad específica para estas parasitosis 9. Rivera et al. 11 estudiaron la distribución de E. histolytica y E. dispar en el norte de Filipinas y detectaron una fuerte asociación entre E. coli y la infección con E. histolytica/E. dispar.

No se observó diferencia significativa entre los porcentajes globales de las amibas estudiadas y el grupo de edad al que pertenecían los individuos (p > 0,05). Resultados similares fueron obtenidos por Povoa et al. 34, al estudiar la prevalencia de E. histolytica en Brasil, mediante la detección de coproantígenos (ELISA). A pesar no existir diferencias importantes por grupo etario, se observó la ausencia de casos de amibiasis en lactantes menores y mayores, lo que se relaciona con reportes previos. Silva et al. 35

encontraron una mayor prevalencia de E. histolytica en el grupo de individuos mayores de 14 años, al estudiar una población en Brasil, mediante diversas técnicas.

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Es importante destacar la ausencia de casos de amibiasis en los menores de dos años de edad, ya que ninguno estuvo parasitado con E. histolytica, E. dispar o ambas (Tabla 3). Es posible que en este grupo efectivamente haya una baja prevalencia de infección, pero el escaso número de individuos estudiados no permite obtener resultados concluyentes para este grupo de edad. Por otro lado, esta situación puede explicarse por los cuidados maternos que generalmente reciben los niños desde recién nacidos hasta aproximadamente los 20 meses de edad. Posteriormente, los niños llegan a tener un mayor contacto con el medio ambiente contaminado y por tal motivo se incrementa la probabilidad de adquirir la infección. Este señalamiento es importante, porque en nuestro medio se aprecia con preocupación, un elevado reporte de casos de amibiasis en los niños menores de dos años de edad. El Anuario de Mortalidad del año 2005 36

señala 114 muertes por amibiasis en el país, de las cuales 23 ocurrieron en menores de dos años. La realización de técnicas más sensibles y específicas para el diagnóstico de la amibiasis colaborará significativamente en el esclarecimiento de esta situación. El mayor número de individuos parasitados con E. histolytica y E. dispar se presentó en el grupo de 7-12 años. Rivera et al. 11 obtuvieron resultados similares, ya que, tampoco observaron diferencias entre los grupos etarios, pero sí una mayor prevalencia de estas amibas en los individuos de 5-14 años de edad.

De los 204 individuos estudiados, 94 pertenecían al sexo masculino y 110 al sexo femenino. De las 47 muestras que resultaron positivas para las amibas mediante PCR (34,04%), 31 (65,96%) especímenes pertenecían a individuos del sexo femenino y 16 al sexo masculino. En el sexo femenino la prevalencia de las amibas fue la siguiente: 13 portadoras de E. histolytica, 12 con E. dispar y 6 presentaban infección mixta. En el caso de los hombres, 9 muestras amplificaron para E. histolytica, 4 para E. dispar y 3 para ambas especies de amibas. El análisis estadístico demostró que no había diferencia significativa entre la frecuencia de las amibas y el sexo. Al igual que otros estudios que reportan una prevalencia de infecciones por E. histolytica equivalente entre hombres y mujeres 11.

La diferenciación de especies por PCR es una herramienta necesaria y de gran valor para el diagnóstico de la amibiasis, pues le permite al clínico discriminar las verdaderas infecciones por E. histolytica y evitar los tratamientos innecesarios cuando E. dispar está presente.

 Colaboradores

Z. Rivero participó de la redacción del artículo, recolección y procesamiento parasitológico de las muestras. A. Bracho participó de la redacción del artículo, recolección, procesamiento parasitológico de las muestras y procesamiento PCR. M. Calchi e I. Díaz contribuyeron en la recolección y procesamiento parasitológico de las muestras. E. Acurero, A. Maldonado y G. Chourio realizaron el procesamiento parasitológico de las muestras. N. Arráiz participó del procesamiento PCR y de la redacción del artículo. G. Corzo contribuyó en el cálculo de n y análisis estadístico de los datos. Todos los autores revisaron, aportaron y aprobaron la versión final.

 Agradecimientos

Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES, Venezuela) por el financiamiento del programa (VAC-CONDES-CC-0216-05). Además, a la Dra. Ivonne Qvamstrong del Centers for Disease Control and Prevention

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(Estados Unidos), por la donación del ADN de Entamoeba dispar; así como a la Dra. Haydee Urdaneta (Instituto de Inmunología Clínica, Universidad de los Andes, Venezuela) por proveernos de la cepa de Entamoeba histolytica. A Gilbert Corzo por el cálculo de n y análisis estadístico de los datos.

 

Referencias

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P 2 5

Page 32: Amebiasis

A 2008

L Maracaibo, Venezuela.

E Escuela de Bioanálisis Facultad de Medicina Universidad del Zulia Urb. La Rotaria, Av. 87 #82-36,

T Detección y diferenciación de Entamoeba histolytica y Entamoeba dispar mediante reacción en cadena de la

A Zulbey Rivero; Ángela Bracho; Marinella Calchi; Iris Díaz; Ellen Acurero; Adriana Maldonado; Glenis Chourio; Nailet Arráiz; Gilbert Corzo†

CUESTIONARIO DE

AMEBIASIS ENTAMOEBA HYSTOLYTICA

1) ¿TIPOS DE ASOCIACIONES?

R,-Inquinilismo Comensalismo Metalismo Simbiosis Depredación Hiperparasitismo

2) ¿QUE TIPOS DE HUESPEDES PUEDE MENCIONAR?

R.- Intermediario Definitivo Accidental Reservorio Transmisor

3) ¿QUE ENTIENDE POR FUENTE DE INFECCION?

R.-Son aquellas fuentes que a partir de los cuales el hombre adquiere la enfermedad, y entre ellas podemos nombrar alimentos contaminados, insectos hematófagos, animales domésticos y silvestres.

4) ¿ENUMERE LAS PUERTAS DE ENTRADA DE LOS PARASITOS?

R.-Inhalación Vía subcutánea (piel) Contacto sexual Vía transplacentaria Trasfusiones sanguíneas

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5) ¿REALIZA UN CUADRO COMPARATIVO ENTRE ENTAMOEBA HISTOLYTICA Y ENTAMOEBA GINGIVALIS?

R.-

6) ¿COMO SE PREVIENE UNA PARASITOSIS?

R.-Usando medidas preventivas:

- Potabilización de las aguas

- Evitar caminar descalzo en campos rurales

- Desparasitación de animales domésticos

- Eliminación de los insectos y roedores

- Servicios sanitarios adecuados adecuada cocción y conservación de los alimentos

7) ¿ENFERMEDADES PARASITARIAS DE INTERES ORAL LEISHMANIASIS MUCOSA?

R.-Causada por Leishmania braziliensis) se observa lesiones en el paladar blando, la úvula y los pilares de paladar.

8) ¿EJEMPLOS DE ECTOPARÁSITOS?

R.- -Piojos - Garrapatas - Pulgas - Ácaros

9) ¿EJEMPLO DE HUESPED ACCIDENTAL?

R.- - Hombre – Perro

10) ¿EJEMPLO DE HUESPED RESERVORIO?

R.- - Hombre - Plantas - Animales - Animales domésticos

11) ¿EJEMPLO DE TRASNMISOR?

R.- - Hombre - Hombre - Animal – Hombre - Animal – Animal

12) ¿Qué es la Amibiasis?

R.-La Amibiasis es una enfermedad causada por un parásito llamado Entamoeba Histolytica, se transmite por alimentos o aguas contaminadas y por contacto de persona a persona, produciendo pequeñas ulceraciones intestinales, por lo cual el paciente presenta diarrea, con moco, sangre y mucho dolor.

13) ¿La amibiasis siempre tiene Sintomas?

Entamoeba hystolytica Entamoeba Gingivalis

Puede ser patógena o no Puede ser patógena o no Tropozoito es móvil Tropozoito es móvil Se ven glóbulos rojos en el interior del No parásito. Aparece como quiste No Si Transmisión indirecta Seudópodos

Transmisión directa

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R.-Sí, muchas personas están infectadas pero permanecen asintomáticas.

14) ¿Es peligrosa la Amibiasis?

R.-Sí, en los niños puede producir deshidratación importante por la diarrea. Además se puede diseminar la enfermedad y formar abscesos ( el más común es el Hepático), que se presenta con fiebre, dolor abdominal y distensión.

15) ¿Cómo se diagnóstica la enfermedad?

R.-Se debe realizar un examen de heces, donde se puede ver la presencia del organismo causal. También se puede diagnosticar mediante biopsia de las lesiones ulcerosas, o de tejido de absceso hepático. Si se sospecha de absceso hepático se debe realizar un Ecosonograma.

16) ¿Qué tratamiento se recomienda?

R.-Lo primero, evitar la contaminación de las aguas, alimentos, manos. En cuanto a tratamiento médico se recomienda el Metronidazol, y el Yodoquinol; siempre previa evaluación de cada paciente particular.

17) ¿Qué es la Giardiasis?

R.-Es una enfermedad producida por un protozoario "la Giardia lamblia" que se ubica en el duodeno (intestino), se transmite de persona a persona (fecal - oral). Por ingesta de agua o comidas contaminadas.

18) ¿Cómo se manifiesta?

R.-Puede la persona estar asintomática, presentar diarrea explosiva, líquida, mal oliente, distensión abdominal, nauseas y falta de apetito, o presentarse con una diarrea crónica con expulsión de gases, distensión y dolor abdominal que puede durar meses.

19) ¿Cómo se diagnostica?

R.-Realizando exámenes seriados de heces para ver el organismo causal.

20) ¿Cómo se trata?

R.-Varios medicamentos se pueden usar Furazolidona, Quinacrina o Metronidazol, previa evaluación del caso, por su médico.

21) ¿Cómo se contrae la amebiasis intestinal?

R.-Esta se contrae cuando una persona ingiere alimentos que están contaminados con heces fecales o en relaciones sexuales anales. Esta enfermedad es común en países tropicales donde las condicione de salubridad son precarias.

22) ¿Qué es la amebiasis intestinal?

R.-La amebiasis también conocida como disentería amebiana es una enfermedad infecciosa, parasitaria causada por el parásito Entamoeba Histolytica. Es una enfermedad que afecta el 10% de la población mundial.

23) ¿Cuáles son los síntomas de esta enfermedad?

R.-Las personas infectadas suelen sufrir de los siguientes síntomas:

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-Diarrea -Heces fecales

-Cólicos abdominales -Fatiga

-Cefalea -Vómito

-Gases excesivos -Fiebre

24) ¿Consejos para prevenir la amebiasis intestinal?

R.- Para prevenir esta enfermedad lo más recomendable:

- Lavar bien los alimentos antes de ingerirlos.

- Cocinar bien los alimentos antes de ingerirlos.

- Lavarse bien las manos antes de cocinar o ingerir los alimentos.

- Evitar relaciones sexuales con personas infectadas.

25).- ¿Cómo se movilizan Entamoeba Histolytica y Entamoeba Gingivalis?

R: Por medio de seudópodos.

26)- ¿Qué produce Entamoeba Histolytica?

R: Es patógena y produce Amebiasis o disentería amebiana.

27).- ¿Cuándo es móvil Entamoeba Histolytica?

R: Cuando está en estado de trofozoíto.

28).- ¿Cómo se reproduce?

R: por fisión Binaria.

29).-Nombre características de E. Histolytica en un preparado coloreado.

R: => el núcleo es granular y presenta cariosoma.

=> Endoplasma granular

. => Pueden haber glóbulos rojos en el interior del parásito.

=> en su evolución a quiste aparece redondeado e inmóvil. Recubierto por el prequiste y

=> Barras Cromatoideas: unión de ribosomas que forman barras

=> Continúa su progreso a quiste.

30).- ¿Qué caracteriza al estado de quiste?

R: Se caracteriza por tener 4 núcleos pequeños e idénticos.

31).- ¿Cuál es la morfología de Entamoeba Gingivalis?

R.- Como trofozoito es la misma que E. Histolytica

32).- ¿Cuál es la diferencia con E. Histolytica?

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R: No se ven glóbulos rojos en el interior del parasito.

33)- ¿Qué ocurre con su forma quística?

R.- No se ha podido encontrar en esta forma.

34).- ¿Dónde se ha identificado este parásito?

R.- => En materiales obtenidos de bocas en mal estado periodontal y escasa higiene. => En criptas amigdalinas.

35).- ¿Cuál es la incidencia en estos casos?

R: Aprox. 75%13.-

36).-¿Cuál es la incidencia en boca sanas?

R: MENOR DEL 50%

C.E.F.E

AMEBEASIS PARASITOLOGIA

DOCTORA: MARIANA

EXPOCITORA: GENESIS CORTEZ

Page 37: Amebiasis

SONIA MICHEL SEMESTRE; 3º SEMESTRECARRERA; ODONTOLOGIA

AÑO; 2013 LA PAZ -BOLIVIA