Almacenamiento de microorganismos

JUANDO

Métodos de preservación

Diversidad y evolución, manejo de pacientes, investigación epidemiológica, y docencia.

• Corto tiempo=transferencia directa a subcultivos, inmersión en aceite, congelación a -20°C, secado, agua destilada.

• Largo tiempo= ultra-bajas temperaturas, liofilización.

Cortos periodos

• Transferencia directa subcultivos=Se trata de periódicos subcultivos a medios frescos,

es el mas usado.

Laborioso, puede comprometer el perfil fenotípico de los m.o.

Cada subcultivo aumenta la probabilidad de mutaciones con cambios en el m.o.

Las mutaciones dependen frecuencia almacenamiento y medio usado (2-3 subcultivos)

Cortos periodos

• Mantenimiento del medio: ↓nutrientes↑ mutaciones ↑ grado de nutrientes ↑ mayor replicación. (agua dest., trip. soya, medios nutritivos)

• Condiciones de almacenamiento: transferir a tubos tapa rosca en lugares adecuados sin cambios de temperatura(5-8°C) ↓ metabolismo ↑ viabilidad.

• Frecuencia de transferencia: cada laboratorio debe estandarizar sus técnicas (5-10 colonias)

• Control de calidad: no es necesario en cada transferencia pero debe hacerse periódicamente.

Cortos periodos

• Inmersión en aceite=Método alternativo, añadir aceite mineral debidamente esterilizado al

m.o. hongos y bacterias pueden durar de 2-3 años. No requiere frecuente transferencia. (mutaciones, contaminación)

• Congelación a -20°C=Pueden ser viables por 2-3 años, formación de cristales de

hielo, fluctuación electrolítica.

• Secado= Mohos y bacterias esporulados pueden ser secados. Suspensión 108

UFC/ml m.o inoculados en papel filtro, que se seca y se pone en viales estériles. 4 años. CC

Largos periodos

Pueden ser costosos, menos laboriosos, menos espacio, y reducen las chances de mutaciones.

• Ultra-bajas temperaturas=

Los m.o pueden mantenerse a -70°C, en congeladores electrónicos o con nitrógeno liquido. Chequeo y alarma son esenciales.

• Almacenamiento de los viales: pueden ser usados tubos de plástico (poliuretano) o vidrio (borosilicato).

• Agentes crio-conservantes: protección durante el proceso, almacenamiento y descongelación (hongos, virus y bacterias)

a) Intracelular=glicerol, dimetil sulfoxido DMSOb) Medio externo=skim milk, sorbitol, sacarosa…

Largos periodos

Conservación de micobacterias

M.O Método almacenamiento

Crio-conservante Temperatura Duración

micobacteriasCongelación Skim milk -20°C 3-5 años

Ultra-congelación

Skim milk -70°C ó -196°C 3-5 años

Liofilización Skim milk 4°C 16-30 años

• Preparación del m.o para congelación: se inocula en el medio adecuado, se incuba hasta la fase estacionaria, centrifugar, se retira el pull y se resuspende en 2-5ml caldo, añadir el crio-conservante, luego en la superficie del agar, con pipeta estéril alicuotar 0,2-0,5 ml.

• Método de congelación: se recomienda congelación lenta, 1°C por minuto hasta -30°C. en NL congelar los viales -60°C 1 h antes de introducir el m.o.

• Descongelación: es el puto critico para el daño (-40°C y -5°C) baño maría 35°C, transferir inmediatamente al medio adecuado, cambios de presión pueden producir explosión.

Largos periodos

• Liofilización=método mas efectivo para

bacterias, levaduras, esporulados y virus. Reduce el riesgo de cristales intracelulares. Remoción del agua. ↑ gram

positivos que gram negativos. Hasta 30 años.

Espacio reducido, puede transportarse a temperatura ambiente por largas distancias.

Combina congelación y deshidratación, primero congelación (-60°C) y luego secado ↓ PA con aparato de

vacío.

Largos periodos

• Almacenamiento de viales: se usan viales de vidrio doble ovidrio blando previamente esterilizados. Se pone silica gelen la parte inferior del vial exterior antes de insertar el vialinterior y se acolcha con algodón. Puede ser sellado paramantener la presión atmosférica.

• Agentes crio-conservadores: los mas usados son skim milk(20% v/v) y sacarosa. (24% v/v queda a 12% v/v). Skim milkse alícuota en 5 ml y autoclava a 116°C.

• Preparación del m.o para liofilización: se requiere grancantidad en la fase de crecimiento o estacionaria. ATCC 108

UFC/ml a 1010 UFC/ml.

• Método de congelación-secado: cuando se usa la cámara, los viales con lasuspensión de m.o son colocados en una capa dentro de un recipiente deacero inoxidable. El contenedor se pone en un congelador de bajastemperaturas -60°C por 1 hora.

Se transfiere a la cámara que contiene hielo seco y etil solvente celular(BECTON) y se cubre con sello hermético al vacío, conectado a reservas dehielo seco y bombas de vacío. (30 µm Hg por 18 horas) contaminacióncruzada 0.8-3.3%

• Almacenamiento: deben etiquetarse y guardarse en orden. No serecomienda almacenar a T° Amb, 4°C aceptable, -30 -60°C optimo.

• Reconstitución: se toman los viales de la parte superior, cubren con gazapara evitar explosión al ingreso de aire. Se inyectan 0.1-0.4 ml de medioenriquecido con pipeta Pasteur o jeringa, se agita y se disuelve, luegotransferir a el medio de cultivo adecuado.

Nuevas tecnologías

• Tarjetas FTA para almacenamiento de ADN. Largos periodos, seguros, baratos y rápidos.

• Se impregna la tarjeta con buffer, radicales libres y proteínas desnaturalizadoras que lisan membrana de la cell, atrapan el ADN y protegen de la degradación.

• Viales, cristales de cerámica, crio conservación perlas

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RESUMEN

Bacterias

Transferencias simples: algunos meses

Almacenamiento con aceite mineral: 1-2 años

Congelación a -20°C: 1-3 años

Congelación a -70°C: 1-10 años

N liq y liofilización: hasta 30 años