Algas Especial Bioindicadores Espanha

ALGAS NÚMERO ESPECIAL 2005 Bioindicadores y monitorización

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La aprobación de la Directiva Marco del Agua ha abierto interesantes debates y nos brinda la oportunidad de afrontar estimulantes retos. Parece que, al menos por un tiempo, los oralismos (su estudio, su identificación) van a ocupar un lugar central en la determinación de la calidad biológica de los sistemas acuáticos. Esto supone una revalorización de un tipo de trabajo en el que los ficólogos tienen mucho que decir. Esta es la idea que impulsó la publicación de este número especial de nuestro boletín. En él encontrareis distintos tipos de aportaciones: desde artículos de opinión, hasta recomendaciones o recopilaciones, que agradecemos enfáticamente a todos los autores. Encontrareis también en este número una recopilación de protocolos que pensamos pueden ser de gran utilidad. A diferencia de lo que ha ocurrido en otros países, en España las sociedades científicas han estado al margen, de forma involuntaria evidentemente, de todo el proceso de implementación de la DMA. Sirva este número al menos como muestra de la opinión que los ficólogos tienen de cómo debería abordarse el proceso, con una perspectiva de futuro y pensando en el largo plazo.

Espero que el esfuerzo realizado y el resultado que tenéis entre manos sean de vuestro agrado.

El editor

www.sefalgas.org

Junta Directiva

Presidenta: Marina Aboal Sanjurjo Vicepresidenta: Ángela Noguerol Seoane

Secretaria: Conxi Rodríguez Prieto Tesorera: Mª Carme Barceló i Martí

www.sefalgas.org/boletin.htm

Editor: J. Eduardo Linares Cuesta

Editorial e índice....................................................................3 Aspectos generales

Transferring methods and indicators among assessment programs, por R. Jan Stevenson...........................................4 Le phytoplancton et la Directive cadre. Intérêt d'une approche fonctionnelle basée sur les pigments, por Jean Prygiel....................................................................................10 Uso de las comunidades de algas en la categorización y seguimiento de masas de agua continentales. Algunas potencialidades y limitaciones, por Sergi Sabater..........12 Las algas y la implantación de la Directiva Marco del Agua en España, por Marina Aboal..................................14 Perspectiva de algunos paises europeos

Use of diatoms to monitor eutrophication in UK rivers, por Martyn Kelly..................................................................19 Redes de control biológico en Francia. Algo de historia y situación actual, por Jean Prygiel......................................29 Use of algae for monitoring of rivers and some matters of special importance in Norway, por Eli-Anne Lindstrøm..............................................................................33 Phycological surveys and monitoring in Portugal – a summary, por A.J. Calado, S.F.P. Almeida y S.C. Craveiro.................................................................................36 Resultados en España

Muestreo del fitobentos en ríos, lagos y humedales: requisitos y recomendaciones para la Directiva Marco del Agua, con especial enfoque a los trabajos desarrollados sobre diatomeas en la Cuenca del Duero, por Saúl Blanco, Luc Ector y Eloy Bécares.......................41 La Directiva Marco del Agua y las diatomeas como indicadoras de los humedales mediterráneos, por Rosa Trobajo Pujades....................................................................47 Protocolos

Protocolo para la evaluación de la calidad biológica de los ríos mediante las diatomeas. Aplicación de la Directiva Marco en política de aguas de la Unión Europea (2000/60/EU)........................................................50 Metodología para el estudio taxonómico y ecológico del fitoplancton de las aguas continentales, por Pedro Sánchez Castillo...................................................................56 Metodología para el estudio taxonómico y ecológico de picoplancton y plantas de las aguas continentales, la elaboración de catenas vegetales y la estimación de la biomasa, por Miguel Álvarez Cobelas..............................59

Editorial

Indice, nº especial – 2005

Sociedad Española de Ficología (S.E.F.)

ALGAS Boletín informativo de la S.E.F.


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Developing biological assessment programs for new regions, different groups of organisms, or in different ecosystems can present many challenges. However, those challenges can be resolved by recognizing that many ecological assessments have the same basic objective, to determine the deviation in observed condition at a site from an expected condition. Because many assessments have this same basic objective, we can borrow many concepts, study designs, methods, indicators, and analytical tools from established assessment programs for use in new programs. In this paper, I will address issues related to using standard algal assessment methods and indicators among many regions with different climates, geologies, and habitat types.

My comments will be directed primarily to

assessments of the biotic and abiotic condition of habitats where relations to natural or reference conditions are emphasized, such as assessments mandated of water quality by the US Congress and the Water Framework Directive (US Clean Water Act, European Commission 2000). These comments will be put in the context of a framework that relates the many activities in ecological assessments such as selecting methods and indices, sampling and sample analysis, and organizing information to interpret results. This framework was developed at a meeting of US and European scientists (Stevenson et al., 2004 a, b). The framework highlights 4 stages in an assessment and management framework: design, characterize condition, diagnose causes and threats, and compare management options (Fig. 1).

Transferring methods and indicators among assessment programs R. Jan Stevenson

Department of Zoology - Center for Water Sciences Michigan State University - East Lansing, Michigan 48824

USA [email protected]

Fig 1. The protocols for ecological assessment related in a framework. Three major steps are emphasized, study design, analysis, and integration.


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The design stage of assessments includes developing objectives, conceptual models, and sampling plans. Objectives usually include protecting and restoring ecological integrity (Frey, 1977; Karr & Dudley, 1981; European Commission, 2000) biodiversity, ecosystem services (Costanza et al., 1991), and water quality. Tradeoffs may exist between different objectives for managing ecosystems for these different valued goals. For example, floods may be controlled with dams and fisheries production may be increased with nutrient enrichment, but dams and nutrient enrichment threaten abundances of native taxa and stimulate algal blooms. One of the reasons that algae are used in assessments is they are important elements of ecological integrity, microbial biodiversity, and ecosystem services, and they cause problems with water quality. So algal condition in habitats affects many valued ecological attributes (VEAs).

Conceptual models should be developed to guide indicator selection and analysis. The models should clearly relate three kinds of indicators:

1) VEAs that respond more or less directly to stressors; stressors which are defined as contaminants and habitat alterations caused by human activities; and human activities that cause or mediate stressors, which often are indicated by land use attributes (Fig. 2).

These 3 categories of variables are emphasized because of their use in management. Sustaining VEAs is the ultimate goal of management. VEAs respond more or less directly to stressors, for which water quality criteria can be developed to protect and restore VEAs. Human activities (farming, forestry, residential development, industry) are then managed to minimize stressors through use of best management practices (waste lagoons, buffer strips, minimizing fertilizer application, storm water retention basins) and thereby, optimize support of VEAs and human uses of the watershed (Stevenson et al., 2004b).

Fig 2. A conceptual model of human activities that produce contaminants and alter habitats that then affect the physical, chemical and biological integrity of stream ecosystems. The elements of the model are separated into three categories of variables should be considered in ecological assessments: land use, stressor, and response

variables. This model was modified from a figure by Bryce et al. (1999) and Stevenson et al. (2004a).


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These categories of variables are also emphasized because biological indicators, especially algal indicators, are used both to assess VEAs and to infer stressors and human activities causing stressors. Historically, algae have been most often used to infer stressors (e.g. nutrient condition, organic pollution, pH, and low oxygen) using on species composition of all taxa and their autecological characteristics. With slight changes to the way we have historically used indicators, we can use autecological information for algal indicators of stressors to construct indicators of VEAs. For example, protecting sensitive species of algae from stressors such as nutrient enrichment, reduced oxygen, or increased salinity and sedimentation could be an important goal of environmental management. Preventing non-native taxa that are tolerant to stressors is also an important goal. Thus, high relative abundances of sensitive taxa that are commonly found at sites with very low levels of human disturbance (Hughes, 1995) and low abundances of stressor-tolerant taxa are VEAs. Thus, we could modify autecological indices such as those commonly used (Slàdecek, 1973; Charles, 1985; Van Dam et al., 1994) for just sensitive or tolerant taxa. Autecological indices based on just the most sensitive or tolerant taxa can respond as significantly (precisely) to indicators of human disturbance as indices based on all autecological categories (sensitive, indifferent and tolerant). In addition, similarity of species composition to reference condition and natural diversity are also VEAs. However, inference models of stressors with algae are also valuable, but not as indicators of VEAS. They should be used to infer stressor condition and to help diagnose which stressors are threatening or impairing valued attributes. Stressor inference models complement actual measurement of stressor conditions, especially highly variable conditions like nutrients, and thereby help managers monitor progress in stressor control or reduction during either protection or restoration efforts.

Developing a sampling plan, the last step in the design stage, requires selection of indicators, sites, sampling methods, and the regional and temporal scale of assessment. At this stage, decisions will need to be made about using: all algae or just diatoms; plankton or periphyton; targeted habitat sampling or multihabitat sampling; qualitative or quantitative sampling; and which sampling methods. Assessing species composition of all algae in assessments versus just diatoms is important for characterizing algal biomass and therefore, ecosystem services and potential problems with water quality (e.g. taste, odor, toxicity, deoxygenation). Assessing just

diatoms is less expensive and they are highly sensitive indicators of ecological condition, but using all algae may extend the range of response to ecological conditions (Leland & Porter, 2000).

Methods should be selected based on objectives of the assessment. Richest-targeted habitat sampling involves selecting a specific (target) habitat that is expected to have the most species-rich assemblage of living algae, relatively common in the site sampled, and likely important in ecosystem function. This habitat may be plankton or periphyton on rocks, plants, wood, sand, or fine sediments in either moderate-fast or slow current environments. The richest-targeted habitat would surely vary among lakes, streams, wetlands, and coastal habitats. It also varies among streams in regions. Thus, the habitat sampled will be a factor in refining expected indicator values (condition) at a site, which will be described later in the paper. Richest-targeted sampling is probably good for decreasing variability in assessments of water quality conditions and inferring stressors and land use, but it is probably not the best method for assessing biodiversity because the targeted habitat may contain only half or less of the diversity. Multihabitat sampling (sampling all habitats in relative proportion to occurrence and thus varying from site to site) is probably best for assessing biodiversity and ecosystem services, but produce less precise indicators of water quality. In a recent stream study, we used a hybrid approach, which assumed that algae on rocks, plants, and wood are relatively similar compared to fine sediments. If rocks, wood, and plants were common in streams, we sampled those habitats in a single composite sample; if they were not common, we sampled finer sediments in relatively stable depositional zones. This approach could be extended to lakes, Denicola et al. (2004) recently showed how periphyton could be used in lake assessment. Quantitative sampling is more time consuming in the field than qualitative sampling, but it is important for assessing ecosystem services and potential problems from nuisance blooms. Visual biomass assessments (Secchi depth in lakes and rapid periphyton surveys in streams, e.g. Stevenson & Bahls, 1999; Stevenson et al., accepted) can be used rapidly to characterize biomass in the field and thereby complement qualitative sampling.

Characterizing condition, the second stage of the assessment/management framework (Fig. 1), calls for comparing observed and expected conditions to assess effects of humans on ecological condition (VEAs and stressors). Expected conditions can be defined many ways. They may be desired conditions such as large abundant fish, no filamentous algae, high


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diversity, aerobic conditions, or clear water. These kinds of endpoints (management goals) may be appropriate for drainage ditches and other non-natural habitats. Alternatively, expected conditions may be related to ecological integrity by using natural, best attainable, or minimally disturbed conditions depending upon historical, current, and planned levels of human activities in the watershed and region. Frequency distributions, predictive models, and thresholds in stressor-response relationships can be used to define expected conditions when they are related to either desired conditions or ecological integrity (Stevenson et al., 2004b). Without comparison to expected condition, variation due to natural factors and human activities can not be distinguished accurately. For example, we might expect low biomass and species adapted to low nutrients, low organic enrichment, and low conductivity in natural conditions of forested headwater streams, but not in low gradient streams draining wetlands (Fig. 3).

In large-scale, ecologically diverse regions, our characterization of expected condition needs to be refined for regional and site-specific characteristics. We need to refine expected condition for the habitats sampled in streams. We should also refine characterizations of expected biomass, species composition, and function of algae depending on factors that ultimately control these attributes, such as climate, geology, hydrology, and landscape attributes and position.

Expected algal indicator values can be refined for natural variation in conditions among sites by using basic principles of algal ecology and best professional judgment or by using multivariate analyses with data from sites with low human activities in watersheds or all sites. For example, we could a priori classify sites and expected condition based on habitats sampled within them and other natural features known to affect algae, if those features are not affected extremely by humans at local scales. For example, regional geology, climate, and landscape features should affect water chemistry, temperature, size of the habitat, current, and flood and drought frequency, intensity, and duration. These attributes are known determinants of planktonic and benthic algal biomass, species composition, and function. Based on best professional judgement, we could develop different a priori expectations for algae in lakes, streams, wetlands, and marine coastal regions – and this approach could be extended to habitats with different size, hydrogeomorphic characteristics, and climates. Study designs and site selection should be based on these a priori expectations. However, it could be argued that this is not a scientifically defensible approach because of these a priori assumptions.

Multivariate analyses of data accounting for effects of natural variability and human disturbance provide more scientifically defensible methods for refining characterizations of expected condition. Two contrasting multivariate approaches involve categorical classification or continuous predictive models of expected conditions in different natural or reference conditions (Wright et al., 1984; Wright et al., 1993; Wiley et al., 2002). RIVPACs methods exemplify the former approach, in which sites with low levels of human disturbance are clustered in groups based on similarity in biological attributes. Then discriminant function models are used to determine which naturally varying abiotic factors affected little by humans (e.g. climate, geology, latitude, longitude, size, slope, hydrology) can predict site membership in groups and thereby predict expected condition at sites. This approach is valuable for situations in which dependent variables, e.g. multiple species, are the VEA being

% Agriculture Land Use in Watershed

% In

divi

dual

s of

Low

Nut

rient

Spe

cies

Low High

High

Wetland Streams

Upland Streams

% Agriculture Land Use in Watershed

% In

divi

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s of

Low

Nut

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Spe

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Low High

High

Wetland Streams

Upland Streams

Fig. 3. Hypothetical relationships between % low nutrient species and human disturbance in high

gradient upland streams (solid line) and low gradient streams draining wetlands (dashed line) illustrate the importance of refining expected condition based on

natural variability among habitats. We might find that relative abundances of low nutrient species would be higher in upland streams than low gradient wetland

streams where nutrient loading from sediments may be greater. We would also expect relative abundances of low nutrient taxa to decrease in both types of streams

with increasing human disturbance that causes nutrient loading. Thus different natural biological

conditions would be expected in these two types of streams. Measuring the same level of an indicator in

the two stream types would have different interpretations.


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10 100Total P (µg/L)

0.10

1.00

10.00

100.00

Ben

thic

Chl

a (µ

g /cm

2 )

2.5 3.5 4.5 5.5MAIA TSI

assessed and therefore characterized in expected condition. Alternatively, we could use regression models of VEAs as a function of human disturbance and naturally varying determinants of VEAs (Wiley et al., 2002). For example, relative abundance of individuals requiring high organic nutrients could be predicted based on channel slope and percent wetlands in the riparian zone.

With corrections for expected condition based on site-specific attributes, algal indicators could be used in multiple regions and more accurately and precisely transferred. Issues about autecological variability among populations still remain. However, we know indices based on worldwide generalizations of species autecologies (e.g. Van Dam et al., 1994) are satisfactory in some situations in North America (Fore & Grafe, 2002), even though they were not refined for environmental preferences and tolerance of North American populations. We should expect that autecological indices are transferable among regions, because human disturbance causes similar contamination among regions, such as nutrient enrichment, sediments, salinization, and organic pollution. However we should also expect a decrease in precision due to differences in populations of the same species among regions. Variation in expected conditions is another issue that should be accounted for, because the same index value may characterize very different degrees of impairment in different regions and habitat types (Fig. 3). Thus a reasonable approach is to start assessments using autecological information and indices from other regions with locally refined expectations for reference condition;

but that should be followed by refining species autecological information and indices based on regional variability among populations. The latter stages of the assessment/management framework involve diagnosing stressors and human activities causing the contamination and habitat alteration. Diatom indicators are highly valuable in diagnosing stressors. Of course, diatom inference models are particularly valuable in paleoecological reconstructions of environmental characteristics. In addition, gathering evidence indicates that diatom indicators can be used to predict stressors such as nutrient concentrations more precisely than one time sampling and chemical measurement of nutrient concentrations. The precision of inferred stressor conditions based on diatom indicator values may be valuable for assessing whether water quality criteria are being satisfied and for increasing precision in stressor-response relationships. Thus, diatom indicators of total phosphorus concentrations could complement TP measurements in lakes, streams, and wetlands where nutrient criteria have been established. But also, using diatom inferred TP to indicate P availability may increase precision in the stressor-response relationships that are so valuable for establishing stressor criteria for use in protecting existing condition or restoring impaired conditions (Fig. 4). Caution should be used to prevent circularity when using algal species indicators of VEAs and stressors in the same analysis – but both will be valuable.

Fig. 4. The relationship between chlorophyll a of benthic algae and nutrients availability, indicated by measured total phosphorus (TP) concentration of stream water and by inferred trophic status (MAIA TSI) based on diatom species composition and autecological information (unpublished data). Precision of relations between chl and

nutrient availability is much greater when using a diatom indicator of trophic status than measured total phosphorus concentration.


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In conclusion, diatom indicators from other regions can probably be used more extensively and perhaps even worldwide, if expectations for conditions are corrected for locally and regionally varying natural factors. Regional corrections in autecological characteristics and indices should be made when sufficient data have been accumulated. The capability of using algae and particularly diatoms in assessments will benefit greatly by using and comparing indices across regions and timely communication of those results in the peer-reviewed scientific literature. Literature Cited Bryce, S. A.; D.P. Larsen; R.M. Hughes & P.R. Kaufmann. 1999. Assessing relative risks to aquatic ecosystems: a mid-Appalachian case study. Journal of the American Water Resoures Association 35: 23-36. Charles, D.F. 1985. Relationships between surface sediment diatom assemblages and lake-water characteristics in Adirondack lakes. Ecology 66: 994-1011. Costanza, R.; R.. dArge; R. deGroot; S. Farber; M. Grasso; B. Hannon; K. Limburg; S. Naeem; R.V. ONeill; J. Paruelo; R.G. Raskin; P. Sutton & M. VandenBelt. 1991. The value of the world's ecosystem services and natural capital. Nature 387: 253-260. Denicola, D.M.; E.D. Eyto; A. Wemaere & K. Irvine. 2004. Using epilithic algal communities to assess trophic status in Irish lakes. Journal of Phycology 40: 481-495. European Commission. 2000. Directive 2000/ EC of the European Parliament and of the Council - Establishing a framework for Community action in the field of water policy. Brussels, Belgium. Fore, L.S. & C. Grafe. 2002. Using diatoms to assess the biological condition of large rivers in Idaho (USA). Freshwater Biology 47: 2015-2037. Frey, D.G. 1977. Biological integrity of water - an historic approach. Pages 127-140, in R.K. Ballentine & L.J. Guarraia, editors: The integrity of water. U. S. Environmental Protection Agency, Office of Water and Hazardous Substances, Washington, DC. Hughes, R.M. 1995. Defining acceptable biological status by comparing with reference conditions. Pages 31-47, in W.S. Davis & T.P. Simon, editors: Biological Assessment and Criteria: Tools for Water Resource Planning and Decision Making. Lewis Publishers, Boca Raton, Florida, USA. Karr, J.R. & D.R. Dudley. 1981. Ecological perspective on water quality goals. Environmental Management 5: 55-68. Leland, H.V. & S.D. Porter. 2000. Distribution of benthic algae in the upper Illinois River basin in relation to geology and land use. Freshwater Biology 44: 279-301. Slàdecek, V. 1973. System of water quality from the biological point of view. Archiv für Hydrobiologie und Ergebnisse Limnologie 7: 1-218.

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Il existe relativement peu d'information sur le phytoplancton comparé au phytobenthos et aux diatomées en particulier. Le phytoplancton est un élément essentiel des cours d'eau d'ordre supérieur ou égal à 3 (Reynolds & Descy, 1996) et cependant les réseaux de suivi qualitatif et quantitatif sont rares et souvent limités aux grands fleuves internationaux comme le Rhin, le Danube (http://www.midcc.at/) ou la Meuse (Friedrich et al., 1998; Ibelings et al., 1998). Ceci peut être attribué d'une part à la très forte variabilité spatiale et temporelle du phytoplancton (Autréaux-Noppe, 2000) et donc à la nécessité de disposer d'un grand nombre d'échantillons qui rend les opérations de suivi onéreuses. D'autre part, la rareté des données historiques utilisables rend difficile la proposition de conditions de référence (Kohler & Descy, 2003). Enfin, le déterminisme des peuplements phytoplanctoniques est complexe et fait intervenir de nombreux paramètres chimiques, physiques et biologiques (Bauer et al., 2002, Gosselain et al., 1998; Wehr & Descy, 1998). Cette complexité a conduit à l'élaboration de plusieurs modèles pour la gestion des grands cours d'eau (Garnier et al., 1995; Everbecq et al., 2001; Kowe et al., 1998). Les réseaux sont donc pour l'essentiel limités au seul suivi de la chlorophylle a comme en France (Noppe & Prygiel, 1999; Prygiel , 2003) bien qu'elle ne permette pas de distinguer les différents groupes d'algues présents dans la masse d'eau. La Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC) permet de caractériser la structure des communautés phytoplanctoniques en séparant et en quantifiant différents pigments spécifiques (Wright et al., 1991). Cette technique a été initialement développée pour le milieu marin et a été depuis appliquée avec succès en milieu côtier et estuarien (Tester et al., 1995; Wong & Wong, 2003; Li et al., 2002) ainsi qu'en cours d'eau (Descy & Metens, 1996). Certains auteurs recommandent toutefois un couplage de l'HPLC avec des observations microscopiques pour valider la technique (Antosegui et al., 2001; Breton et al., 2000). Des procédures statistiques telles que CHEMTAX peuvent également être utilisées (Mackey et al., 1996). Elles permettent à partir des différents pigments identifiés en HPLC de partitionner la chlorophylle a totale (biomasse algale totale) en chlorophylle a générée par chaque groupe algal (Pinckey et al., 2001; Schülter &

Mohlenberg, 2003; Schülter et al., 2000). Descy et al. (2000) ont appliqué cette procédure également développée en milieu marin au phytoplancton des lacs et ont constaté qu'une validation des données pigments restait encore à effectuer. D'autres méthodes basées sur l'analyse de traits biologiques et écologiques (taille, forme, capacité à fixer l'azote…) peuvent aussi être utilisées pour caractériser les aspects fonctionnels du phytoplancton (Weithoff, 2003). L'utilisation d'indices de diversité, de similarité, de dominance… est largement répandue, mais se révèle la plupart du temps décevante. En fait, ce sont souvent les indices les plus simples qui sont souvent les plus efficaces (Tsirtis & Karydis, 1998).

Dans les conclusions d'un colloque sur le phytoplancton des grands cours d'eau qui s'est tenu à Berlin début 2003, Kohler et Descy (2003) constatent qu'aucune méthode ne satisfait à ce jour aux exigences de la directive cadre mais que le suivi de la biomasse phytoplanctonique est nécessaire dès lors que le temps de rétention des masses d'eau est supérieur à 6 jours. Ces auteurs recommandent donc un suivi de la chlorophylle à l'aide de normes ISO avec dénombrements et identifications des espèces phytoplanctoniques quand la teneur en chlorophylle a est supérieure à 20 µg/l. En conclusion, le recours aux mesures pigmentaires revêt plusieurs avantages: - les analyses de pigments peuvent donner des indications sur la nature et l'abondance des principaux groupes du phytoplancton, ce qui rend cette procédure compatible avec la DCE. - cette technique est utilisable en milieu continental (cours d'eau et plans d'eau), en eaux de transition (estuaires) et dans les eaux côtières. - le recours à des comptages et identifications n'est plus systématique mais reste toutefois nécessaire pour calibrer les relations pigments/algues avant application en routine et pour vérifier qu'il n'y a pas de dérive dans le temps de cette relation une fois qu'elle est établie. - ce type d'analyse est plus rapide et moins onéreux que les analyses phytoplanctoniques traditionnelles et autorise donc une fréquence d'échantillonnage plus grande, un bon compromis pouvant être un prélèvement tous les 15 jours. - ce type d'analyse se prête plus facilement aux exercices d'intercalibration que les comptages

Le phytoplancton et la Directive cadre. Intérêt d'une approche fonctionnelle basée sur les pigments

Jean Prygiel Agence de l'Eau Artois-Picardie - Mission Ecologie du Milieu

France [email protected]


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El horizonte marcado por la progresiva implementación de la Directiva Marco del Agua (DMA) ha estimulado un panorama impensable hace unos pocos años. Las Confederaciones Hidrográficas y los organismos con competencias en calidad del agua de algunas Comunidades Autónomas están elaborando, o están en curso de finalizar, estudios de definición de las masas de agua, en las que la información biológica es parte esencial. De hecho, los biólogos estamos de enhorabuena, ya que la DMA establece que los organismos son elementos definitorios de la “calidad ecológica” del sistema. Hasta hace muy poco, tan sólo la química del agua era considerada como un elemento en la definición de la calidad de las masas de agua. Los organismos vivos han alcanzado, pues, el nivel que les correspondía en la evaluación y seguimiento de las masas de agua. Los trabajos que se están efectuando en las distintas cuencas aportan datos hasta ahora inéditos en muchos ríos, lagos y zonas húmedas.

Más en particular, el uso de los organismos en las tareas de monitoraje se había centrado en gran medida en aquellos organismos de fácil identificación, que no requieren de una muy elevada especialización para su uso de diagnóstico ambiental. Estos habían sido principalmente las comunidades de macroinvertebrados, que pueden proporcionar un correcto diagnóstico sin la dificultad que encierran otros grupos, como las algas. El trabajo con estos organismos ha abierto el camino, justo es reconocerlo, para que otros grupos de organismos, entre ellos las propias algas, reciban la atención necesaria. Como fruto de un proceso largo, la DMA establece que es necesaria la información proporcionada conjuntamente por las comunidades de peces, macroinvertebrados y algas. La Directiva reconoce, pues, la capacidad diferenciada y complementaria que tiene cada uno de estos grupos de organismos para indicar uno u otro tipo de perturbaciones. El uso extendido de las comunidades de algas, fitoplanctónicas o fitobentónicas, además de ser una buena noticia, ha sucedido sin que en nuestro país se hubiesen desarrollado especificamente las herramientas adecuadas. En esencia, las herramientas deben traducir desde lo que sucede en la naturaleza a algo tangible que pueda ser integrado en la gestión concreta del

sistema.

A diferencia, por ejemplo, de lo que sucedía en Francia, Alemania o Inglaterra, en las que las Agencias del Agua hacía mucho tiempo que habían hecho un esfuerzo de desarrollo de herramientas, no solamente para las comunidades de algas, sino para los grupos de organismos que son mayoritarios en las aguas continentales. En nuestro país, mientras tanto, estábamos enzarzados en disputas estériles sobre cuales eran los mejores indicadores a implementar, discusión que discurría no tanto por razones científicas sino más bien por razones económicas y de una pereza ancestral enraizada en aquel “que inventen ellos”. Sea como fuere, el adecuado uso de las comunidades de algas como herramienta ambiental requiere como mínimo de dos condiciones: - profesionales adecuadamente formados que puedan aplicar las herramientas con sentido crítico, y - el desarrollo o la adecuación de herramientas de diagnóstico. Por lo que se refiere a la formación de profesionales, es obvio que en estos momentos existe una escasez de ellos. Sabido es que durante años formar a alguien en la taxonomía de algún grupo concreto era arriesgar a convertirlo en un parado con un altísimo nivel de especialización. Esta ha sido una realidad no solamente en España, pero aquí ha sido especialmente dolorosa por la escasez previa de buenos taxónomos. La formación de profesionales es principalmente función de las Universidades, que deben formar, pero también de las empresas y de las administraciones que deben contratar. En muchos casos, ni las empresas ni las administraciones tienen muy claro que se deba contratar a alguien para efectuar un análisis tan especializado como es el de, pongamos, las comunidades de diatomeas. Si no existe, o no ha existido, demanda de profesionales, es absurdo que se plantee la formación. Y creo que si durante años no se ha formado a suficientes profesionales ha sido en gran parte, por la ausencia de perspectivas que justificase su formación. Las Universidades debemos formar profesionales con una adecuada formación en taxonomía, y también con criterio ecológico suficiente que permita una adecuada interpretación de los resultados que

Uso de las comunidades de algas en la categorización y seguimiento de masas de agua continentales. Algunas potencialidades y limitaciones

Sergi Sabater Facultat de Ciències - Universitat de Girona, Campus de Montilivi

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proporcionan las comunidades. Sostengo que no debemos formar técnicos sino profesionales, puesto que los primeros no tienen necesidad de entender el funcionamiento de los sistemas en los que trabajan, mientras que los segundos sí deben entenderlos con profundidad. Por lo que se refiere a las herramientas, la llegada de la DMA requiere del desarrollo o de la adaptación de herramientas adecuadas para los sistemas continentales españoles. Las herramientas para el correcto uso de las comunidades de algas incluyen la adecuada taxonomía de las especies en los distintos sistemas, la información autoecológica asociada a las especies, el desarrollo de metodologías de muestreo específicas, y la aplicación de índices biológicos que se puedan aplicar con éxito al diagnóstico de las distintas masas de agua. Algunos retos en la correcta aplicación de las comunidades de algas como indicadoras de la calidad ecológica en los sistemas acuáticos * Mejorar el conocimiento de las especies.

Es necesario definir correctamente la adscripción taxonómica de las especies que participan en los índices. Es frecuente encontrar taxones que se caracterizan por su variabilidad morfológica, lo que comporta dudas acerca de su identidad. En organismos plásticos como las algas estas dudas no son extrañas, y nacen de la única consideración de la morfología de los organismos como base para decidir sobre la identidad de las especies. En definitiva, puede suceder que exista una situación de cierta subjetividad en la asignación de las especies, que conlleva una cierta confusión taxonómica. Esta discusión, que es legítima en un debate académico entre taxónomos, se convierte en un complejo problema en cuanto se trata de asignar características autoecológicas a las especies que integran la comunidad. ¿Qué representa una especie que no podemos discriminar a ciencia cierta, o que tiene una variabilidad intramuestral tan grande que implica su asignación a varias entidades taxonómicas? La correcta asignación especies-autoecología constituye la base de su aplicación como herramientas de diagnóstico ambiental. No debemos descartar añadir a las herramientas descriptivas usuales otros estudios detallados de la variabilidad de las especies. En algunos casos, pueden existir entidades taxonómicas que probablemente no resisten un análisis morfométrico en poblaciones naturales o en cultivos. Se ha visto en experimentos en cultivos que algunas especies varían en función de gradientes ambientales. ¿Qué pasaría si sometiésemos a algunos taxones o grupos de

taxones muy cercanos al análisis mediante herramientas genéticas? Este debate es insoslayable si queremos progresar en la aplicación de las comunidades de algas como herramientas potentes en el diagnóstico ambiental.

* Relacionar las características de las especies y de las comunidades con los datos ecológicos de los sistemas.

De la misma manera que las herramientas taxonómicas deben ser perfeccionadas, también debe progresar el conocimiento ecológico de nuestros sistemas naturales. Este progreso en paralelo es esencial a fin de efectuar una adecuada conexión entre la correcta descripción de las comunidades biológicas con los caracteres geomorfológicos, físicos, y químicos que caracterizan los ambientes en los cuales se encuentran. El conocimiento ecológico de nuestros sistemas naturales es incompleto, especialmente por lo que se refiere a las condiciones de referencia (sistemas no perturbados), que permitirán evaluar las posteriores desviaciones. Por tanto, el trabajo ecológico debiera ser lo más completo posible, para así poder determinar con certeza los óptimos de distribución de las especies, y así poder comprender sus respuestas ante las variaciones ambientales. El poder predictivo de las comunidades de indicadores es posible, principalmente a escala ecorregional. Y es precisamente en esta escala en la que la información debe ser más exhaustiva. * Aplicación adecuada de índices.

Se está haciendo una labor importante de estandarización de las metodologías de muestreo y de observación y cuenteo, que están siendo plasmadas en normas CEN. Sin embargo, aún no existe un acuerdo internacional en los mecanismos de resumen de la información suministrada por las comunidades de algas. Por su facilidad de aplicación, se ha trabajado más en las comunidades de diatomeas, pero cualquier intento de aplicación se encuentra con una gran diversidad de índices. Es obvio que se debe tener cautela al aplicar herramientas desarrolladas en otras ecorregiones, a pesar de que su elaboración haya sido rigurosa. A modo de ejemplo, el índice IPS de diatomeas desarrollado por las Agences de l’Eau francesas ha sido elaborado y posteriormente contrastado con miles de muestras en diversidad de situaciones. Sin embargo, una cierta falta de representatividad puede ser especialmente importante en sistemas meridionales, como los mediterráneos, que tienen poco peso en el país vecino.


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Por tanto, la aplicación de los índices no puede hacerse de manera automática, sino que requiere de una tarea previa de validación, que puede estar basada en aquellos índices que han funcionado de manera adecuada en sistemas distintos a los propios. Esta validación de una herramienta disponible parece más razonable, en principio, que la formulación de otros nuevos índices, cuya formulación quedaría justificada en el caso de que ninguno de los índices existentes reflejase las especificidades de las áreas de estudio (grandes ecorregiones) de la Península Ibérica. La validación pasa por dos grandes principios: - Asignación de valores de sensibilidad y de valor indicador adecuados para las especies características de los sistemas, valores que pueden divergir de otros formulados para las mismas especies en otros países o ecorregiones. Sabemos, por ejemplo, que la abundancia de la diatomea Asterionella formosa no indica lo mismo en sistemas planctónicos templados que en otros más fríos. La asignación de nuevos valores autoecológicos debe hacerse de manera rigurosa y, a ser posible, contrastada estadísticamente con datos ecológicos de los lugares en los que se distribuye la comunidad objeto de estudio. - Reescalamiento de los valores asignados por los índices seleccionados a las distintas realidades de cada ecorregión. Los valores de los índices se resumen, comúnmente, por rangos y a veces por colores. Toda la información proporcionada por las comunidades se cifra, pues, Los estudios sobre la calidad biológica de los sistemas acuáticos, sobre todo de los ríos, han estado en nuestro país durante muchos años centrados en los macroinvertebrados. Los múltiples trabajos realizados en las distintas cuencas hidrográficas no sólo han permitido hacer un seguimiento de diferentes tipos de perturbaciones sobre los sistemas, sino que además han servido para incrementar el conocimiento faunístico y de los requerimientos ecológicos de los diferentes organismos implicados. La aprobación de la Directiva Marco abrió la puerta a la utilización de otros grupos de bioindicadores, por ejemplo las algas. Pero ¿se puede poner en marcha la DMA con facilidad y con rapidez en España?

en una clase de valores o de color. Es por ello necesario que evaluemos críticamente los valores proporcionados por los índices. En este sentido, es substancial el criterio de experto. El potencial re-escalamiento de los valores otorgados por los índices sólo será posible en el caso que se disponga de datos de estaciones de referencia. Ello puede ser especialmente complejo en las partes medias y bajas de sistemas fluviales (habitualmente sometidos a la perturbación humana) o en sistemas estuarinos. En definitiva, no se debe olvidar que la información proporcionada por las comunidades de organismos es opaca para los profesionales no especializados, y por tanto también lo es para las necesidades de los gestores de las aguas continentales. Es nuestra responsabilidad resumirla e interpretarla. Además, los diagnósticos que se emiten califican a las masas de agua para su posterior mejora. Por tanto, los diagnósticos deben ser correctos y, por lo que nos afecta, que sean adecuadamente interpretados. Este objetivo requiere, pues, del concurso de los dos elementos antes descritos: profesionales bien formados, y herramientas adecuadas. Sólo así podremos asegurar la credibilidad de las comunidades de algas como indicadores del estado ecológico de las masas de agua. Mientras en nuestro país ha habido un notable desinterés por este tema, muchos de los países europeos se afanaban en terminar o poner al día sus floras (John et al., 2000; Kelly, 2000; Rott et al., 1997; Rott et al., 1999), en el diseño de diferentes métodos de trabajo (Buwal, 2001; Chovanec et al., 2004; Coring et al., 1999; Dares, 2004a, b, c; Gevrey et al., 2004; Jarlman et al., 1995; Star, 2002; Van Dam et al., 1994), en la elaboración de diversos tipos de índices (Kelly, 1999; Lange-Bertalot, 1979; Lecointe et al., 1999; Pipp, 2001) o en comprobar la viabilidad de los métodos propuestos en cada país (Almeida et al., 1997; Clausen & Biggs, 1997; Coring, 1997; Dell’Uomo, 1997; De Nicola, 2004; Descy & Ector, 1997; Elorante, 1997; Harding & Kelly, 1997; Hürliman et

Las algas y la implantación de la Directiva Marco del Agua en España Marina Aboal

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al., 1997; Kelly, 2003; Lindstroem, 1999; Muñoz et al., 1998; Poulickova et al., 2004; Prygiel & Coste, 1993; Prygiel et al., 1999; Root & Pipp, 1997; Rott et al., 2003). Todo ello queda perfectamente reflejado en los diferentes volúmenes que recogen las aportaciones a los congresos convocados precisamente para debatir sobre el uso de las algas como indicadores en el monitoreo biológico, y que vienen celebrándose periódicamente en distintos países europeos (Prygiel et al., 1999; Whitton et al., 1991; Whitton & Rott, 1996; Journal of Applied Phycology 14, 2002). La falta de este trabajo inicial en nuestro país y la premura impuesta por las diferentes administraciones parece haber obligado a la adquisición casi automática de los métodos ya existentes, en la mayor parte de los casos sin ningún estudio o intento previo de adaptación. Sin embargo, la Península Ibérica tiene una serie de peculiaridades que hacen difícil esta transferencia automática. Existen, por ejemplo, un número importante de cursos de agua temporales o muy someros, tanto de forma natural como por imposición de la regulación de caudales, mucho más acuciante en la parte meridional del país. Pero además el gradiente de aridez suele ir unido a un gradiente en la concentración de sales: se produce un aumento de la alcalinidad, de la conductividad y, en muchos casos, también un aumento en la concentración natural de nitrato o sulfato. Muchas veces los valores detectados son bastante superiores a los señalados en otros lugares más alejados (centroeuropeos). Por otra parte, raras veces se incluyen en los estudios de biomonitores variables biológicas que muchas veces explican gran parte de la variabilidad observada en la naturaleza, por ejemplo el papel de los herbívoros (Prygiel, este mismo volúmen). Es probable que incluso la competencia entre los diferentes grupos de organismos puedan alterar notablemente el desarrollo de las comunidades bentónicas e influir en la diagnosis de la calidad ambiental, como parecen señalar algunos datos (Aboal et al., 2002). Nuestro conocimiento de la flora algal es muy parcial, muchas regiones carecen de estudios recientes o históricos y, es muy frecuente que cuando se emprende un estudio florístico se aporten un número importante de novedades no sólo para la región, sino para el país o la ciencia (Aboal et al., 2003; Cambra et al., 1998; Clavero, 2004; Gomá et al., 2004; Linares, 2003; Marín et al., 2004; Trobajo, 2003). Hay, por tanto, mucho trabajo pendiente a realizar sobre la flora de las ecorregiones, y es necesario reforzar los esfuerzos para definir mejor la autoecología de las especies para optimizar su utilización como bioindicadores. Los índices de calidad biológica están basados en datos recolectados en zonas geográficas

concretas, fundamentalmente centroeuropeos, que resultan difícilmente aplicables en los países del sur de Europa, sobre todo del ámbito mediterráneo. Estas dificultades podrían explicar, al menos en parte, el retraso en la implantación de estos métodos en los países de la Europa meridional. Diversos estudios han permitido comprobar la existencia de gradientes geográficos que, al menos, deberían tomarse en consideración (Leira & Sabater, 2004; Potapova & Charles, 2002; Stevenson, este número). La problemática mencionada parece minimizarse cuando las diagnosis se elaboran a partir de los datos relativos a un único grupo de algas (diatomeas), pero se muestran en toda su magnitud en el caso de utilizar las comunidades fitoplanctónicas o fitobentónicas, generalmente diversas y constituidas por diferentes grupos taxonómicos (Noppe & Prygiel, 1997; Pipp & Rott, 1993; 1994). Es indudable que la información aportada por la comunidad en su conjunto es mucho más valiosa desde todos los puntos de vista, que la ofrecida por un único grupo taxonómico (Biggs & Kilroy, 2000; Lindstroem et al., 2004), pero también es evidente que su estudio representa una mayor complejidad, aunque puede ser perfectamente abordable simplemente contando con los materiales adecuados (Barbour et al., 1999; Biggs & Kilroy, 2000; Stevenson & Bahls, 2003; Stevenson et al., 2002). La elaboración y edición de floras, claves y otros medios adicionales, deberían constituir una de las prioridades de las administraciones y entidades responsables del control de la calidad ambiental, siguiendo el ejemplo de otros países, europeos y extraeuropeos. ¿Existe suficiente personal técnico con la formación suficiente para llevar a cabo estas tareas? En la actualidad es perentoria la necesidad de establecer mecanismos de formación y actualización del personal técnico encargado de la realización de estos trabajos, habida cuenta del nivel de precisión necesario para reconocer y diferenciar los diferentes taxones. Quizá sería adecuado implicar a las sociedades científicas (Asociación Española de Limnología, AEL, Sociedad Española de Ficología, SEF) como aglutinantes de los expertos en todo este proceso, aunque hasta la fecha hayan permanecido bastante al margen, porque nunca han sido consideradas como interlocutores, en ninguno de los niveles administrativos de decisión. Quizá no sería excesivamente complicado favorecer la celebración de cursos periódicos de formación, que además permitirían realizar una labor de homogeneización de los métodos y de los criterios taxonómicos, por ejemplo.


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Por otra parte, sería una buen iniciativa tratar de consolidar una colección en cada una de las confederaciones (o mejor centralizarlas todas en algún lugar) con las muestras testigo de los trabajos de las redes de calidad. Esto facilitaría el necesario control de calidad de todo el proceso (Kelly et al., 2002), la realización de trabajos comparativos (Prygiel et al., 2002) y, por último, aunque no menos importante, establecer una colección básica de la biodiversidad de las aguas continentales de todo el país, que podrían ser de bastante utilidad para otros paises de la cuenca mediterránea, tanto europeos como del norte de África. La información acumulada, convenientemente introducida en una base de datos, permitiría la puesta a disposición de todos, de los datos florísticos y ecológicos, que servirían de base para la realización de los ajustes o modificaciones de los métodos utilizados, en cualquier momento. En este contexto, la SEF ha dado un primer paso para facilitar la búsqueda de información sobre la distribución de las algas, sean marinas o continentales, recopilando en su web (www.sefalgas.org) las listas florísticas que se han ido publicando a lo largo de los años. El paso siguiente, que supondría la elaboración de un banco de datos sobre biodiversidad de las comunidades de algas en los sistemas acuáticos del país, requiere, además de interés y entusiasmo, algún tipo de ayuda institucional. Los niveles de calidad ecológica potenciales varían con diferentes tipologías de ríos o en diferentes ecorregiones (Agencia Catalana del Agua, este número; Arnwine & Sparks, 2003; Prygiel, este número; Solheim et al., 2003; 2004; Solheim & Schartau, 2004). Esta información junto con el reconocimiento de las condiciones de referencia constituyen la piedra angular de todo el proceso, pero paradójicamente hay mucho por hacer todavía en este tema. El recalentamiento global del clima puede tener como consecuencia un incremento en la frecuencia de las proliferaciones de grupos como las cianoprocariotas (cianobacterias, cianofíceas), muchas de las cuales tienen la capacidad de producir distintos tipos de toxinas, de incierta función ecológica, pero seguro carácter tóxico para la población y para el ganado o especies amenazadas, en peligro o de especial interés en las políticas de conservación (Gunn et al., 1992; Matsunaga et al., 1999; Metz et al., 1997; Onodera et al., 1997).

Aunque con frecuencia se asocian estas proliferaciones con el aumento de la eutrofia (Chorus & Bartram, 1999; Mur et al., 1999) no siempre esta relación es evidente (Metz et al.,

1997). A medida que se intensifican los estudios aumenta el número de especies potencialmente tóxicas, sobre todo en las comunidades bentónicas, aunque la capacidad de producir toxinas no es una característica de especie sino de clon (Chorus & Bartram, 1999). Si en algún momento se pretende desarrollar algún sistema de alerta precoz de toxicidad será necesario no sólo conocer las especies capaces de producir toxinas sino también en qué condiciones son capaces de activar la síntesis. La única forma de conseguirlo es conociendo los ciclos anuales de desarrollo de las especies: la sucesión temporal de las comunidades fitoplanctónicas o fitobentónicas. Las técnicas genómicas, tan en uso en la actualidad, sólo permiten comprobar la existencia de cepas potencialmente tóxicas (que contienen el gen que codifica la toxina) pero se sabe muy poco de los factores que promueven o inhiben su expresión. Estas consideraciones son aplicables tanto a los medios continentales como los marinos. Las comunidades bentónicas, aunque mucho menos estudiadas también producen de forma constante toxinas que son liberadas al agua tanto de los ríos como de los embalses de regiones calcáreas (Aboal & Puig, 2005; Aboal et al., 2005). Aunque por ahora, son muy escasos los incidentes provocados por la proliferación de algas tóxicas en sistemas continentales (Quesada et al., 2000), quizá no estaría de más incrementar los esfuerzos en tareas divulgativas y preventivas. En este aspecto algunos países vecinos también nos han tomado la delantera (Calado et al. este número). Es curioso que en un momento en el que es tan grande nuestro desconocimiento de la biología de muchas especies y de sus requerimientos se esté vislumbrando la posibilidad de diseñar sensores multiespecie que permitan determinar con técnicas genómicas la calidad del agua. Quizá no esté lejos el día en que esto sea posible. El problema es que estos métodos no serán verdaderamente útiles si no se basan en estudios taxonómicos y ecológicos profundos. Referencias

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Use of diatoms to monitor eutrophication in UK rivers Martyn Kelly

Bowburn Consultancy, 11 Monteigne Drive, Bowburn Durham DH6 5QB

UNITED KINGDOM [email protected]


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producers and there were no nationally-accepted methods for the direct assessment of these components of the river biota. Research on appropriate methods for assessment of eutrophication in rivers arose out of this need, and followed two paths – the use of macrophytes, which led to the development of the Mean Trophic Rank (MTR: Holmes et al., 1999), and the use of diatoms, leading to the development of the Trophic Diatom Index (TDI: Kelly & Whitton, 1995). Development of the TDI The assumption underlying the TDI is that the response of benthic diatom assemblages to phosphorus can be detected over and above variation due to other factors. In theory at least, assemblages characteristic of low, moderate and high phosphorus concentrations can be defined; however, in practice, there are many other factors that can also influence the composition of diatom assemblages. As the purpose of the TDI was to aid decisions relating to sewage discharges, it is especially important to note that many of the other variables associated with such discharges typically covary with phosphorus (Lenoir & Coste, 1996). Whilst taxa that are described as “pollution tolerant” (e.g. Nitzschia palea) are typically associated with nutrient-rich water, there is also evidence to show that they are adapted to cope with high concentrations of ammonia (Hürlimann & Schanz, 1993), they can survive at low oxygen concentrations (van Dam et al., 1994) and, in some cases, can take advantage of the abundance of organic matter via heterotrophic nutrition (e.g. Li & Vulcani, 1987). In addition, many such taxa are motile, allowing them to cope with the deposition of fine material on surfaces. For these reasons, a correlation between a diatom index such as the TDI and phosphorus must not be interpreted as indicating a causal relationship without some additional qualification. This is important within the context of monitoring related to the UWWTD as a decision to install nutrient stripping at a large sewage works will necessitate capital investment exceeding €1 million, as well as increasing the running costs for the works. The TDI was based on the weighted average equation of Zelinka and Marvan (1961), which had been used successfully in a number of other indices, notably the Indice de Polluosensibilité of Coste (in CEMAGREF, 1981). Another version of the same equation is used widely by palaeoecologists (Birks et al., 1990). 70 sites were sampled to provide the data on which the TDI was based. All had chemical characteristics and benthic invertebrate faunas that indicated that they were free from significant organic pollution.

Although there are computer programs which permit the automatic calculation of weighted average equations (e.g. Line & Birks, 1990), the first version of the TDI was constructed simply by assigning a value from 1 to 5 to each taxon, depending upon its sensitivity to nutrients, and then through an iterative process, adjusting these to maximise the relationship between the prototype index and aqueous P (see Fig. 1). For the first version, 100 taxa were included – a mixture of genera and species (Kelly & Whitton, 1995), and this figure has been expanded to 113 taxa in the latest version (Kelly et al., 2001). Whilst some phytoplankton taxa (e.g. Stephanodiscus hantzschii) are characteristic of lowland, eutrophic rivers, none of the ten taxa that are predominately planktonic are included in the calculation because they are not a natural part of the benthic assemblage, and because they can confound interpretation in some situations, such as immediately downstream of impoundments. A novel feature of the TDI is the use of a second value, alongside the index itself, to indicate the reliability of the TDI as an estimate of eutrophication at a site. The original rationale was to highlight sites where non-nutrient factors associated with sewage discharges were exerting an effect on the flora. In the latest version, however (Kelly et al., 2001), this was modified to simply “percent motile valves”, firstly because many of the taxa that were characteristic of organically-enriched waters were motile, but secondly because spatial or temporal shifts between sessile and motile taxa seemed to provide some general indication of the importance of non-nutrient factors in influencing the composition of the flora. The TDI in practice In order to facilitate national implementation of the TDI, the NRA funded

Fig. 1. Relationship between TDI and Filtrable Reactive Phosphorus (FRP), measured at 70 sites in

the UK. From Kelly & Whitton (1995).


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STWTown

Upstream and downstream of STW

Upstream of townRecovery zone

STWTown

Upstream and downstream of STW

Upstream of townRecovery zone

development of a user’s guide, first published in 1996 and subsequently revised in 2001 (Kelly et al., 2001). This provides procedures for sample collection, preparation and analysis, along with guidance for data interpretation and quality assurance. The first version included, in addition, a simple key to benthic diatoms (one constraint on adoption of diatom-based methods before this was the absence of user-friendly identification guides). However, this was subsequently developed as a separate publication (Kelly, 2000) and was omitted from the revised manual. A new computer-based multi-access key is presently under development. Methods in the user’s guide are compatible with two European standards (EN 13946 and EN 14407) both of which are close to publication. The wording of the UWWTD requires assessments of eutrophication in relatively limited geographical areas and, for this reason, the User’s Manual presents a variety of options for data collection, permitting the methods to be tailored to local circumstances. For example, use of cobbles and small boulders is the most widely used method of sample collection, but there are several stream types within lowland UK where such substrates are rare or absent and, for this reason, options are also provided to allow for sampling from artificial substrates or from macrophytes. Lengths of frayed polypropylene rope have proved to be a cheap and effective substrate. The preparation of permanent slides is an important advantage of benthic diatom analyses, allowing samples to be stored indefinitely and to be posted between laboratories. The former permits archives of material to be reanalysed in the future if required, whilst the latter facilitates quality assurance procedures such as intercalibration exercises and independent audits. The development of robust QA protocols is another novel feature of the TDI. This was particularly important as many laboratories had only one individual trained in diatom identification, which meant that it was necessary to provide a means by which these analysts could be reassured about the quality of the data that they were producing. An audit procedure, based on Bray-Curtis similarity was developed (Kelly, 2001) and is described in full in the User’s Manual.

The difference in TDI between two trained workers is usually < 5, and the average difference between skilled analysts is typically less. Training is facilitated by a distance learning course, developed by Bowburn Consultancy, in which students perform a number of exercises based on both prepared slides supplied with the course, and on material collected from the student’s own local environment. Students send photographs or drawings for confirmation, along with the results of analyses performed on both the supplied material and their own samples. This allows students to learn at their own place and in a manner that can be tailored to their own practical needs. Evaluation of point-source eutrophication using the TDI The basic experimental design adopted for the assessment of the impact of sewage discharges on eutrophication was to select sites upstream (“control”) and downstream (“treatment”) of the discharge and to sample over a period of about three years in order to ensure that any trends demonstrated were robust. The null hypothesis of such an analysis is that there is no difference in flora (and, therefore, in index values) between the two sites, as the distance will be too short for natural hydromorphological and chemical changes to exert a significant effect. It would appear most logical to sample just far enough downstream of a discharge to ensure full mixing. However, this is often the zone which exhibits the most serious effects of organic pollution, with elevated ammonia, biochemical oxygen demand and suspended solids, and reduced oxygen concentrations (Hynes, 1960). The effects of these on the aquatic flora have already been discussed (see above). For this reason, it is often useful to add a further sampling site in the “recovery zone”, further downstream. Finally, as sewage works are typically located downstream from the communities that they serve, and as a consequence sites upstream of the sewage works may themselves show the impact of runoff and industrial effluents from the urban area itself. So, finally, there is often value in placing a further sampling site upstream of the urban area (Fig. 2). In practice, however, the situation is rarely as clean cut as this, and the following two case studies (both based on data collected as part of UWWTD designations in the UK) illustrate the TDI in action.

Fig. 2. Schematic representation of sampling strategy for the TDI. Circles indicate sampling stations. See text for

more details.


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)Case study 1: the River Wear The River Wear rises in the Pennines and flows 107 km to join the North Sea at Sunderland (Fig. 3). The Pennines are an area with a low population density and rough sheep grazing, but at approximately 20 km from the source the river flows onto the Durham coalfield, an area of higher population density.

Between km 40 and the tidal limit, effluent from nine large sewage works enters the river either directly or via tributary streams. Annual mean concentrations of dissolved phosphorus, which are < 30 µg l-1 at km 24, rise to more than 400 µg l-1 by the tidal limit, and exceed the Environment Agency’s target concentration of 200 µg l-1 by km 60, just upstream of Durham City (Fig. 4).

Fig. 3. Map showing River Wear and major tributaries. Distances on the main river are measured downstream from Wearhead (marked “W” on the map). Locations of sewage works with a population equivalent > 10,000 (“Qualifying

discharges”) are marked with arrows. From Kelly (2001).

Fig. 4. Annual mean concentrations of P (as orthophosphate) in the River Wear as a function of distance from Wearhead. Crosses: values less than detection limit of analytical methods (20-61 µg L-1). Dashed line:

Environment Agency’s proposed target value for lowland rivers. Modified from Kelly (2001).


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Distance from source (km)

TDI

Along with many other rivers in England and Wales, the River Wear was examined by the Environment Agency to see whether there was a case for designation as a “eutrophic sensitive area” under the terms of the UWWTD. Diatoms formed one part of the evidence that was accumulated, along with chemical data (nutrients and dissolved oxygen concentrations), results of macrophyte surveys and the output from mass balance models predicting likely concentrations if P stripping was installed. Knowledge of the loads contributed by point sources underpinned the application of mass balance models to these data and predicted that significantly lower concentrations of P would be found in the lower part of the river after the onset of nutrient stripping. However, there is no indication from these results whether or not there are likely to be ecological benefits from reducing nutrient concentrations in the river. For this reason, the Environment Agency also used the TDI and the MTR. Diatom samples were collected from approximately 20 km the source down to the tidal limit. The large number of sewage works entering the river meant that the experimental design described in the previous section had to be adapted, as the density of sewage discharges in the river was such that it was not possible to separate the impacts of each individual sewage works. Sampling continued for five years. TDI values at all sites along the river were variable, as the dominant taxa varied between samples. The uppermost samples, for example, were dominated by Achnanthidium minutissimum, Cocconeis placentula var. euglypta and Nitzschia fonticola. However, despite this within-site variability, there was a pattern of gradually increasing TDI values until km 60, after which values remained high until the tidal limit (Fig. 5). Moreover, the pattern of longitudinal variability was consistent within individual surveys, and use of a paired sample t-test permitted significant differences to be detected between sites even when the mean difference was < 5 (Kelly, 2001).

Both the TDI and the MTR show the flora of the River Wear to change from one dominated by taxa indicative of low or moderate nutrient enrichment in the upper part of the river to one dominated by taxa indicative of high nutrients in the lower part of the river. This, along with evidence of increasing nutrients in the water derived largely from sewage works formed the basis for the case made for designating the River Wear as a “eutrophic sensitive area”. The designation started at the point at which the first large sewage works enters the river, which occurred at km 40, and extends to the tidal limit. However, it is important to point out that the ecological evidence on which this designation is based is derived from spatial, not temporal, studies, with the implicit assumption that a reduction in nutrient concentrations will itself drive a change to a flora more typical of low nutrient waters. The case study will illustrate a situation under which these assumptions were not valid. Case study 2: the River Stour There are at least five English rivers with the name “Stour” (thought to mean “the strong one” in Old English). The river on which this study is based rises in the south Downs in Kent and flows in an approximately north-easterly direction before joining the English Channel near Ramsgate. The catchment is largely rural but includes two large towns in the freshwater section – at Ashford, approximately 22 km from the source, and Canterbury, 30 km downstream from Ashford. The river downstream of Ashford sewage works was one of 33 sensitive areas designated in 1994, before the MTR and TDI were developed. The local Environment Agency ecology team monitored the river above and below the discharge before and after the onset of nutrient stripping in October 1998.

Fig. 5. TDI values in R. Wear

between 1993 and 1997. From Kelly

(2001).


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BybrookLongport

Although chemical monitoring showed an almost immediate benefit, with dissolved P concentrations downstream of the discharge falling to a level that was more or less thesame as concentrations measured upstream (Fig. 6), the diatom assemblage showed almost no change (Fig. 7).

Fig. 7. TDI values in the River Stour, above and below Ashford STW. From Kelly & Wilson (in pres).

Fig. 6. Phosphorus (as FRP) concentrations in River Stour above (Bybrook Bridge) and below (Longport Bridge) Ashford STW. From Kelly & Wilson (in press).


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This lack of response occurred not just with the TDI, but also with a German variant of the index (Coring et al., 1999) and the Austrian Trophic Index (Rott et al., 1999) and the reasons provide some useful lessons for the future exercises in eutrophication control. First, the lack of a significant difference between upstream and downstream sites before the onset of nutrient stripping, despite an obvious increase in nutrient concentrations, suggest that there was probably not a strong case on ecological grounds for the installation of nutrient stripping in the first place. A close examination of chemical data shows that summer P concentrations even after the onset of nutrient stripping can reach 0.5 mg l-1. Furthermore, these summer P concentrations are sufficiently high that P is unlikely to be the limiting nutrient so there is little scope for the ecological benefits of nutrient stripping to be manifested (Kelly & Wilson, submitted). However, further downstream the situation was appeared more optimistic. Monitoring in this stretch only started after the start of nutrient stripping but Spring samples in the area approximately 15 to 20 km downstream from Ashford had TDI values between 60 and 70 (Fig. 8) and were dominated by Achnanthidium minutissimum, a species characteristic of low or moderate nutrient levels. P concentrations along this stretch of the river are lower than those measured immediately downstream of Ashford largely a consequence of dilution by water from tributary streams.

Examination of P concentrations in this stretch before and after the onset of nutrient stripping, and a comparison with the known autecology of A. minutissimum, suggests that this is likely to be a consequence of nutrient stripping, although this conclusion – based on post hoc reasoning - should be treated with caution. It does, however, illustrate some of the problems of bringing about demonstrable ecological changes in lowland rivers. Lessons in eutrophication management in lowland rivers One of the lessons of the past few years is that repeated sampling is necessary in order to ensure that any trends observed by ecological monitoring are robust. This is true both of establishing longitudinal trends to provide the evidence for the designation, and for subsequent temporal monitoring to establish whether or not any nutrient stripping was successful. This, along with the inevitable time lags caused by the designation process and by the time required to plan the necessary investment in tertiary treatment at affected works, means that there are few strong demonstrations of the ecological benefits of the UWWTD yet available in the UK. However, there are a few general lessons that have been learnt over the past decade. One of these is to understand that all measures of a biological response to nutrients have a theoretical foundation in the principle of limiting factors first proposed by Lieberg in the nineteenth century.

Fig. 8. Longitudinal distribution of TDI values in the River Great Stour during study period. Arrows indicate the locations of large (>10,000 p.e.) sewage works. Unpublished data.


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One assumption implicit in the use of any mathematical function that attempts to infer an environmental variable from biological data is that the variable in question is able to exert a detectable influence on the biota. Where a nutrient is in short supply then this is clearly the case; however, there will be a point at which there are sufficient nutrients to satisfy all the needs of the biota. Fig. 9 expresses this diagrammatically. When phosphorus is in short supply, then an increase in the supply will influence both the composition of the flora and the total biomass, with taxa able to thrive at low nutrient concentrations being replaced by more competitive species as the phosphorus concentration increases. However, there will be a point at which the composition of the flora ceases to change and the only response will be an increase in the biomass of those taxa that were best equipped to compete under high nutrient concentrations. Finally, a point will be reached when the phosphorus supply is such that there is no scope for the biomass to increase, perhaps due to self-shading or other density-dependent factors unless or until a density-independent factor (e.g. grazing or scouring spates) is able to remove some of the accumulated biomass. It follows from this that the TDI, and other indices of eutrophication that are based on community structure, will have an upper limit of effectiveness at the point where community

structure ceases to respond to increases in phosphorus and that it is important for users to be able to identify this point (Kelly, 1998). An insight into this can be obtained by looking at the N:P ratio, assuming a ‘Redfield Ratio’ of 106:16:1 for C:N:P (Redfield, 1958), which would suggest that N:P > 16 indicates a P-limited system whilst N:P < 16 indicates an N-limited system. Experimental studies (Chiaudani & Vighi, 1974; Fosberg & Ryding, 1980; Chessman et al., 1992) have shown that the situation is not quite this simple (presumably because of differences in the metabolism of particular species), and that N:P < 10 usually indicates N limitation, with N:P between 10 and 16 representing a ‘grey area’ where either nutrient might be limiting. It is also important to point out that other factors (e.g. light availability) might override nutrients and limit growth, so an analysis based on N:P ratios alone is rather crude. However, applying this logic to data from the River Stour we see that many of the samples collected from the river have N:P ratios that suggest that P is not limiting (Fig. 10) and, furthermore, that these tend to occur in the summer, when the biological effects of eutrophication are most obvious. Low N:P ratios occurred both before and after the onset of nutrient stripping (Kelly & Wilson, submitted), with N:P >10 corresponding to P concentrations of < 0.3 mg l-1. A sensible target for nutrient-stripping in this river would therefore be for summer orthophosphate-P concentrations to meet this criterion, and it would not be difficult for such scenarios to be built into modelling exercises in advance of future designations. It is also

Fig. 9. Schematic representation of stages in response of photosysnthetic community to increase

in nutrient loading. From Kelly et al. (2001), modified from Sas (1989). The response to P loading

depends upon the zone in which the initial P concentration is found: I, Increase in biomass and floristic change in response to increased P loading;

II, Increase in biomass but no floristic change; III, No biomass response to increase in P loading.

Fig. 10. N:P ratios in River Stour (calculated as ‘total oxidised nitrogen’ (nitrate-N + nitrite-N) :

orthophosphate-P. Horizontal line indicates N:P = 10.


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0

5

10

15

20

0 2 4 6 8 10 12

number of samples

min

imum

sig

nific

ant

diffe

renc

e

B (5.64)A (7.32)C (2.28)

important to point out that any such limit is, to some extent, catchment-specific, depending upon the sources of nutrients and, perhaps, upon the importance of non-nutrient factors in limiting growth. Also it is worth reiterating that this limit applies only to changes in community structure and the effect of nutrient stripping on plant biomass in the River Stour has not been evaluated. A second lesson is the need for repeat sampling, and for robust experimental designs. Whilst surveys along the length of a river are useful for indicating broad trends (see Figs. 5 & 8), it is useful to focus attention on particular sewage works. In the case of the River Wear, individual sewage works could be studied in isolation, by selection of an appropriate pair of sites, one upstream and one downstream of the discharge. This was aided by the relatively good water quality in much of the Wear, which meant that variables associated with organic pollution were unlikely to exert a strong influence on the biota. Simultaneous collection of upstream and downstream samples eliminated temporal factors as a major source of variation and permitted the use of a paired sample t-test, which was able to detect differences in TDI as small as two units (Kelly, 2001). In addition, use of statistical power analysis (Peterman & M’Gonigle, 1992) enabled the sensitivity of the analysis to be maximised (Fig. 11). It is also pertinent to note from Fig. 11 that the difference that was detectable varied between pairs of sites and at present the scale of such variation cannot be predicted in advance. However, as a general rule at least six samples are required per sample in order to ensure that results have a statistical power > 0.8 (Kelly, 2001).

The future: diatoms and the Water Framework Directive The focus of environmental monitoring has shifted with the adoption of the Water Framework Directive (WFD: European Union, 2000). Whilst the UWWTD gave ecologists an important role in the decision-making process, it is possible for a water body to be eutrophic yet still be technically in compliance with the UWWTD. This is because the targets outlined in Article 5 and Annex I are still drafted in terms of chemical concentrations in the final effluent. The WFD will change this by making “good ecological status” into the target for all improvements to the aquatic environment. However, this poses a number of challenges to ecologists including, most importantly, the need to develop the predictive capabilities of monitoring tools, particularly bearing in mind the scale of within-site variation noted above. The notion of “good ecological status” is one that is still evolving as Member States attempt to flesh out the brief definitions given in Annex V of the WFD. A key feature, however, will be an objective definition of “good ecological status” that can apply to any water body within a Member State and that can be calibrated against definitions used elsewhere in the European Union. Good ecological status will need to combine information from the entire aquatic biota, including algae, macrophytes, invertebrates and fish. The WFD calls for ecological status to be measured in terms of deviation from values that would be obtained from a similar site free from any human-induced stress, which requires the establishment of a network of ‘reference sites’ to serve as a baseline against which such deviations can be measured.

Fig. 11. Number of samples necessary to detect a significant difference between sites upstream and downstream of major discharges on River Wear. The calculation is based on Schoenfeld (1998)’s power analysis software and

assumes a one-sided paired sample test with a P< 0.05 confidence limit and a statistical power of 0.8. Comparisons: A = Wolsingham (km 24.5 km) vs Bradley (km 28.5); B = Bradley vs Gaunless (km 43.5); C = Gaunless vs Sunderland

Bridge (km 58.5); all distances downstream of Wearhead.


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Tools such as the TDI which were developed for the UWWTD provide a useful first step towards fulfilling the requirements of the WFD, but their use has tended to be limited to limited geographical ranges, such that a sample site upstream of a sewage works acts as a reference site (of sorts) for a sample site downstream of the works. The discussion above has highlighted some of the problems encountered even when using this in practice and there will be some major intellectual challenges ahead if tools are to be developed that are capable of providing statistically-sound judgements of ecological status that are applicable to all river sites within a Member State. Acknowledgements Thanks to Gestión Ambiental Viveros y Repoblaciones de Navarra S. A. for funding my participation at the workshop "Jornadas sobre empleo de la flora acuática como indicador biológico para determinación del estado ecológico de los ríos según la Directiva Marco del Agua" (9 abril 2003). References

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Desde 1999 existe en Francia una red nacional de monitoreo basada en la utilización del índice biológico de diatomeas. En realidad este índice no cumple los requisitos de la Directiva Marco del Agua ya que, en algunos casos, utiliza grupos de especies en lugar de especies individuales, y se basa en abundancias relativas (referidas a 400 individuos). Sin embargo, se ha tratado de tomar en consideración las desviaciones de los requerimientos de referencia identificando regiones naturales para las comunidades de diatomeas. Ya se han presentado las primeras propuestas para los valores de referencia y los límites entre “muy bueno-bueno”, y “bueno-moderado” para cada una de las cinco grandes regiones reconocidas para las diatomeas. Las propuestas se revisarán y actualizarán con los resultados de las redes de calidad. Además se pretende que en el futuro sea posible comparar las listas de diatomeas con las de las estaciones de referencia mediante algún índice de similitud como el de Bary-Curtis.

En la actualidad no se realiza ningún tipo de monitoreo del fitoplancton en todo el territorio francés, a excepción de la cuantificación de clorofila a. Algunas cuencas poseen redes, muy limitadas tanto en el espacio como en el tiempo, para el control tanto cualitativo como cuantitativo (Loire, Loing, Meuse), que además aportan datos muy difíciles de interpretar. Durante los años 1994 y 1996 en Artois-Picardie se estudiaron tanto los recuentos como los análisis de pigmentos en grandes ríos y canales, y se comprobó que la variabilidad era demasiado grande y que era necesaria la elaboración y estandarización de protocolos precisos. Además existen otros problemas como la falta de un número suficiente de expertos o la ausencia de condiciones de referencia para el fitoplancton. Por ahora, se considera que el monitoreo tradicional del fitoplancton es demasiado caro y que los resultados son difíciles de interpretar, por lo que parece más adecuado proponer el uso de la cromatografía de alta resolución para realizar análisis de pigmentos específicos, ya que pueden ser más rápidos, más baratos y cumplen los requerimientos de la Directiva Marco, al ser tanto cuantitativos como cualitativos. Este tipo de aproximación también podría ser adecuado para aguas costeras y de transición. En todos los casos la calibración y puesta al día del método debe hacerse mediante estudios florísticos tradicionales.

Las algas filamentosas se incluyen dentro

de los macrófitos que se utilizan en el cálculo del índice de macrófitos (IBMR, AFNOR, 2003). Este índice es un buen indicador del nivel trófico.

No existen métodos estandarizados para el monitoreo de lagos aunque en los más grandes se estudia el fitoplancton. El CEMAGREF propuso la realización de lo que llamaron “diagnóstico rápido” y que incluye la química del agua, análisis fitoplanctónicos (proporción de grupos algales), además de los invertebrados del sedimento (oligoquetos y moluscos). En la actualidad se está elaborando una propuesta para lagos someros y se han hecho algunos ensayos para comprobar si el índice IBD puede utilizarse en lagos, aunque con protocolos de muestreo modificados.

El índice biológico de diatomeas (AFNOR, T 90-354, 2000)

La red nacional consta de 836 muestras recolectadas entre mayo y agosto. Las determinaciones las realizan dos equipos de experiencia reconocida.

El índice biológico de diatomeas (IBD) tiene como ámbito de aplicación los cursos de agua, excepto los de aguas salinas o las zonas de estuario. Su objetivo es la estimación de la calidad del agua.

Metodología: muestreo de piedras, de substratos duros, de macrófitos o de substratos artificiales (por orden de preferencia) en zonas aclaradas de corriente máxima. 1.1. El área de muestreo será de 100 cm2. 1.2. El nivel de identificación: especies o grupos de especies. 1.3. Valores del índice de 0 a 20 (en cinco clases de calidad). 1.4. Cálculo del índice: el índice tiene en cuenta la abundancia relativa de cada taxón, su perfil ecológico a lo largo de las clases de calidad y su valor indicador. 1.5. Repertorio taxonómico: 209 taxones (631 considerando los sinónimos y las especies asociadas). Se distinguieron 11 grupos de estaciones, cada una de las cuales representa una comunidad particular característica de condiciones ambientales específicas: 6 grupos en zonas con alteraciones antrópicas y 5 grupos de comunidades de referencia ligados a un contexto geoclimático

Redes de control biológico en Francia. Algo de historia y situación actual Jean Prygiel

Agence de l'Eau Artois-Picardie - Mission Ecologie du Milieu France

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particular y ligadas a características hidro-ecorregionales. Las cinco regiones de diatomeas diferenciadas (Fig.1) son: 1. Ríos ácidos de mineralización muy débil. 2. Ríos débilmente mineralizados sobre substrato silíceo. 3. Ríos de montaña de pH neutro y mineralización débil. 4. Ríos alcalinos de llanura. 5. Ríos alcalinos de montaña.

Los valores de IBD de referencia del límite entre estaciones de calidad muy buena y calidad buena quedan recogidas en la tabla siguiente:

Diversos proyectos han permitido evaluar las fuentes potenciales de error en las distintas etapas de cálculo del índice de diatomeas.

En primer lugar se realizó un proyecto en el que participaron 24 representantes de la comunidad científica, consultoras ambientales y de administración. Cada participante realizó 28 cálculos de IBD a partir de preparaciones microscópicas elaboradas a partir de la misma muestra. Tanto la recolección como la preparación

del material la llevó a cabo en todos los casos la misma persona. La variación de los valores fue sólo de una unidad en el valor del índice IBD. La principal fuente de error fue la incertidumbre en las identificaciones de las especies de los géneros Cocconeis y Achnanthes s.l. Posteriormente se realizaron ejercicios de intercalibración, para los que se seleccionaron 9 estaciones de agua dulce entre las 13 estaciones de la Red Homogénea de Medida de Escaut: - un inventario por estación realizada en noviembre de 2000. - envío a siete operadores de Francia y Bélgica de un juego de 9 preparaciones (1 por estación). - identificación al mínimo nivel taxonómico requerido para el índice IBD. - recolección de datos y tratamiento de datos.

Los resultados (Fig. 2) indican que en todos los casos todos los operadores dieron el mismo perfil para las estaciones, pero las diferencias en los valores asignados fueron en algunos casos importantes. La principal fuente de error fue la confusión en la identificación taxonómica de los pequeños Achnanthes. El fitoplancton en el monitoreo de algas

El Ministerio de Medioambiente y Desarrollo Sostenible reconoció seis grandes cuencas hidrológicas (MEDD).

Por el momento no existe una red nacional de monitoreo del fitoplancton y sólo se han llevado a cabo unos cuantos estudios cualitativos o cuantitativos en algunas cuencas: estudio de la influencia de una central nuclear (R. Loire), estudios científicos (Seine, Lot, Charentes) o estudios de impacto (R. Scarpe). En el río Loira se ha estado realizando un control desde 1989 en un número variable de puntos según los años. Los muestreos han sido mensuales y bimensuales para analizar tanto variables químicas, como hidrológicas o biológicas, con identificación de organismos (a nivel genérico excepto en el caso de desarrollos masivos que fue especifica) y cálculos de densidad según el método Ütermohl. Este estudio permitió comprobar que existe una gran e impredecible variabilidad cuantitativa intra e interanual, además de que los desarrollos masivos (“blooms”) varían tanto en composición florística como en el momento del año para cada estación. Normalmente en primavera proliferan las diatomeas mientras que los clorófitos lo hacen en verano. Existe un gradiente tanto en abundancia como en diversidad desde la cabecera hasta la desembocadura, con un máximo en el curso medio. No se han apreciado relaciones entre los máximos de pigmentos y las máximas densidades celulares.

Fig. 1. Regiones de diatomeas diferenciadas en Francia.

Región de diatomeas

IBD de referencia

Límite de estado muy

bueno

EQR

Límite del

buen estado

EQR

1 19 18 0,93 15 0,71 2 16 14 0,93 11 0,67 3 18 16 0,85 14 0,69 4 16 13 0,80 11 0,67 5 19 17 0,86 14 0,64


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En el río Loing (afluente del Sena) se realizan controles desde 1992 hasta la actualidad. De los seis puntos seleccionados, sólo 3 han sido regularmente muestreados desde marzo a noviembre para analizar variables químicas, hidrológicas y biológicas (tanto cualitativas al nivel más bajo posible, como cuantitativas). Se apreciaron importantes variaciones cuantitativas en los máximos de dominancia entre los años. En primavera, con niveles muy bajos de nitrato e indetectables de fosfato, se desarrollan las diatomeas. Los tramos de mayor diversidad pertenecen al curso bajo, mientras que en las partes altas puede desarrollarse Planktolyngbya agardhii en densidades importantes. En los ríos Saar y Mosel (cuenca del Meuse), se estudiaron seis estaciones, tres por río, desde 1997 hasta la actualidad, con muestreos bimensuales desde marzo hasta octubre, para análisis químicos, hidrológicos y biológicos (cualitativo hasta un nivel genérico excepto diatomeas y cuantitativo, mediante clases de abundancia y biovolúmenes). También se muestreó el zooplancton. Se pudieron apreciar grandes diferencias en las densidades celulares. Mientras en el río Saar dominan las diatomeas centrales al final de mayo y una comunidad de diatomeas centrales, clorófitos y cianobacterias al final de agosto, en el río Mosel sólo se detecta un pico de biomasa en mayo-junio debido a diatomeas centrales. No parece existir correlación entre los biovolúmenes y la densidad celular.

Además se comprobó una gran variabilidad espacial y temporal en los datos y que el zooplancton muy raramente limita el desarrollo del fitoplancton. En el río Lot (Adour-Garonne), se seleccionaron 15 estaciones muestreadas en periodos de estiaje en 1991-1992, con el fin de determinar el valor del fitoplancton que permitiera elaborar un modelo de la eutrofización a lo largo del río. Los organismos se determinaron hasta un nivel genérico, excepto los taxones dominantes, y se cuantificaron tantos las densidades celulares, como los pigmentos y los biovolúmenes. El grupo dominante es el de los clorófitos y se pueden diferenciar tres zonas: una superior en la que el fitoplancton procede de grandes embalses, un tramo medio con varias presas que permiten el desarrollo del fitoplancton y un tramo bajo en el que con la turbidez y la profundidad disminuye la biomasa algal, aunque pueden producirse florescencias de cianofíceas. Además se encontraron correlaciones significativas entre la concentración de clorofila a y los biovolúmenes y la densidad celular. Como principales conclusiones se pudo indicar que el tiempo de residencia, la transparencia, la profundidad y los nutrientes son los principales factores que determinan las comunidades de algas fitoplanctónicas. En la cuenca de Artois-Picardie, existen un buen número de arroyos lentos y canalizados ricos en fitoplancton, en los que se hicieron diversos estudios:

A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W XOperator

12

14

16

18

20IB

D

ReferenceSample 1Sample 2Sample 3

Fig. 2. Resultados de intercalibración: diferencias en el análisis de las muestras.


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- estudio del impacto de las florescencias de cianofíceas en el embalse de Val Joly y su desarrollo en los ríos de aguas abajo. Se comprobó que 20 km aguas abajo desaparece el dominio de las cianobacterias en el río pero permanecen en el canal del Sambre.

- estudio del efecto de la construcción de una depuradora en el río Scarpe.

- estudio de las comunidades fitoplanctónicas en algunas de las estaciones de la red de control nacional (incluidos ríos canalizados), con un muestreo mensual desde marzo a octubre para recoger datos químicos, biológicos, con identificaciones al menos a un nivel genérico. A pesar de la elevada artificialización y elevada carga de nutrientes las comunidades fitoplanctónicas son similares a las descritas en otros países europeos y se pueden reconocer hasta tres tipos diferentes de arroyos basándose en ellas y con correlaciones altas con nutrientes (nitrógeno, fósforo y silicio) además de la temperatura. Entre las conclusiones metodológicas se pueden mencionar: que es suficiente con recolectar una única muestra en el centro del cauce, justo bajo el nivel del agua, pero que es necesario muestrear siempre a las mismas horas en los mismos puntos para minimizar las variaciones diarias y que la periodicidad del muestreo debe ser al menos quincenal.

Se comprobaron también las dificultades en la repetibilidad y la reproducibilidad, ya que se obtienen variaciones muy grandes en las densidades celulares (de hasta un 24%) tanto dentro del mismo laboratorio como entre laboratorios, aunque las diferencias son menores para el mismo laboratorio. También se aprecian diferencias a un nivel cualitativo incluso a nivel genérico. Otras fuentes detectadas de error son: los protocolos de muestreo, errores de identificación, la ausencia de floras de referencia, la presentación de los resultados, el nivel de especialización de los técnicos o el tiempo dedicado a los análisis

Todos estos estudios permiten extraer como conclusiones que existe una gran variabilidad en los datos tanto de campo como de laboratorio en una escala espacial y temporal y que aparentemente otros factores como caudal, temperatura o herbívoros, por ejemplo, pueden tener tanta o más influencia que los nutrientes en el desarrollo de las comunidades fitoplanctónicas. Además se ha comprobado que existe, en general, una escasa correlación entre las densidades celulares y a biomasa.

((Traducción del original en francés de Marina Aboal.)) Figura 4. Estaciones para el estudio de fitoplancton en Artois-Picardie.


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Norway has a unique variety and diversity in nature types connected to watercourses. More than 250,000 km of river stretches, with average annual discharge above 1 m3 s-1, is registered (Homstvedt et al., 1989). 42 watercourses have an annual average discharge above 50 m3 s-1, and the largest watercourse, Gloma, has a discharge of 625 m3 s-1. As a consequence, methods and standards for river monitoring have been developed during the past 30 years (Holtan & Rosland, 1992). Periphyton investigations are a component in many monitoring programs. One reason for this is the exceptionally good growth conditions for periphyton in Norway. Most rivers: + are fast flowing, this means:

- that the river bed mainly consists of rocks, a suitable substrate for periphyton. - continuous flow and exchange of nutrients. - no accumulation of metabolic products around the algae.

+ carry small loads of particulate material: - particle scouring is moderate. - light conditions are good.

+ are located far north and/or in the mountains: - long days, in summer 24 h daylight. - no closed canopy.

+ carry water all year, this: - allows enough time for algal growth. - prevents drying out of algae.

A brief presentation of the methods and

the major categories of river algal studies used for monitoring in Norway are given below. A more detailed presentation is given in the proceedings from the second symposium on the use of algae for monitoring rivers (Lindstrøm, 1996). In addition to the presentation of the regular monitoring programs, some matters that have invoked special attention in Norway are discussed.

REGULAR MONITORING Methods

Methods for river algal studies can be divided in three main categories. 1. Standard monitoring methods - based on the naturally occurring periphyton community - give a description of: species composition, species number and diversity, species frequency,

estimation of quantitative occurrence and in some cases index calculations. At present two versions of standard monitoring methods are carried out. + "Method A" is detailed and fairly time consuming (Lindstrøm, 1991). Due to its simplicity and replicability, diatom analyses are increasingly emphasised in "Method A". + "Method B" is a simplified screening version. A draft of this method is given in Jarlman et al. (1996). 2. Transect analyses - are carried out to achieve reliable estimates of algal biomass from percent cover of periphyton. + Underwater photography is done within a frame to allow exact mapping of the river bed along well defined transects across the river. The slides are analysed under a stereoscopic microscope. + Estimation of percent cover of periphyton on the river bed is done along marked belt transects. As for the underwater photography it is done within a frame to delimit the observed area. 3. Nutrient diffusing artificial substrates - are used to study the potential for growth of algae and the factors that control primary production. To get comparable and reproducible estimates of periphyton biomass is another objective. + Heavy, bottom seated metal cages have been used. For detailed description see Lindstrøm (1996). + Since the method was first published by Fairchild & Lowe (1984), nutrient diffusing clay flower pots have been used in several experiments to study the conditions for growth of attached algae in lakes. After two interesting experimental studies in lakes (Lindstrøm, 1996, and unpublished data) clay flower pots were used in running water for the first time in Norway in 1997 (Hylland et. al., 1997). + Both methods/substrates seem to work according expectations, but they need some adjustments to withstand the substantial and unpredictable fluctuations in discharge that occur in running water. Categories of river algal studies

A brief outline of the main categories of algal studies is given below. The methods used is given in brackets.

Use of algae for monitoring of rivers and some matters of special importance in Norway Eli-Anne Lindstrøm

Norwegian Institute for Water Research Jean Norway

[email protected]


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+ Basic surveys (Detailed method "A" and Transect analyses).

Basic surveys are carried out from time to time. Such surveys are not always part of regular monitoring programs. + General pollution - eutrophication and saprobication (Detailed method "A" and Screening method "B").

Eutrophication from domestic sewage, runoff from farming and other local pollution sources has decreased, but can still cause problems in small watercourses. For periphyton studies both detailed and screening standard methods are used. The screening method B was applied, when more than 100 small rivers (approximately 200 localities) in the county of Moere and Romsdal were investigated in 1992-94 (Lindstrøm & Relling, 1994). Most of the rivers receive local pollution from farming, and they were classified from moderately to very strongly polluted according to the periphyton investigations. The investigations were repeated in 1996-97, after actions were taken to reduce the pollution. According to the preliminary results (not published), the screening method "B" provided sufficiently detailed information to distinguish minor changes in water quality. + Heavy metal pollution (Standard monitoring: A - detailed method).

The previous presentation of river algal studies (Lindstrøm, 1996) described a program that monitors the impacts of heavy metal pollution in the watercourse Gaula in Norway. This program is still running. New studies were be carried out in 1998. The objective was to assess the degree of restoration of the aquatic ecosystems more than five years after actions were taken to reduce the metal pollution in 1990-91. Other programs that assess the impacts of heavy metal pollution on periphyton are also running (Grande et al., 1996). + Hydroelectric power plants (Detailed method "A" and Transect analyses).

Quite a few of the numerous watercourses that were subject to hydroelectric development in the past, do call for regular monitoring. One reason for this is the build up of high biomass of aquatic macrophytes, mosses and algae after the development of the powerplant. The vegetation cover changes the food supply for invertebrates and affects their habitat. Spawning grounds that are practically inaccessible to fish, because they are completely covered by vegetation is another impact that causes substantial concern. Transect analyses and underwater photography has proven to be a reliable method to measure the long term development of this biomass (Johansen, 1997).

+ Long-term studies in Reference- and Research-catchments (All types of methods).

The first Reference- and Research-catchment was established in 1985, the second in 1994. Long term studies were carried out there, with the main objective to obtain better knowledge on the short and long term variability in natural biological communities. Scientist from different fields were participating. The periphyton investigations emphasise routine studies of species composition, species number and diversity, combined with transect analysis to document long term changes in biomass (Lindstrøm, 1989). Case studies were also carried out. One example of a case study is the field experiments to test and develop the use of nutrient diffusing substrates in routine monitoring (Lindstrøm and Johansen, 1995). + Airborne pollution - acidification (All types of methods).

Due to the hard inert bedrock and thin soil covering a large part of Norway, a large part of the watercourses have very little buffering capacity. As a consequence, long range transboundary pollution is a major problem in Norway. Although the deposition of sulphuric acid has decreased since 1990, the N load has increased (Semb, 1994). In the most affected areas, the annual deposition is more than 3 g N m-2 yr-1. This has caused substantial concern in respect to the possible effects on plant growth. From all over Norway reports of increased growth of algae in lakes and rivers have caused additional concern (Lindstrøm, 1993). The potential impacts and problems of increased growth of mosses and algae are several:

- Rivers "filled up" with algae are unpleasant. The reputation that Norway is a country with exceptionally clean watercourses can be severely affected and the recreational value will be reduced.

- Increased periphyton growth causes problems for fishing. Fishnets catch algae and mosses instead of fish, and so do the anglers.

- Spawning grounds get completely overgrown and are no longer available for the fish.

- The original biota will change and the biodiversity seems to be threatened. A rich flora of nitrogen-fixing cyanobacteria seems to be decreasing and substituted by a few types of filamentous green algae. + Liming – biodiversity.

Large-scale liming of acidified catchments has started in Norway. The aim is to counterbalance some of the most obvious negative effects of acidification; total loss of all fish populations from thousands of lakes and rivers. Preliminary studies indicate that liming have


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several effects on the entire biology in freshwater. Therefore, a program that will evaluate the impacts of liming was initiated this year, with biodiversity as a particular focus of interest. The program will last for at least five years, and both short- and long-term effects of liming will be studied. All types of methods will probably be applied in the periphyton studies. Pollution problems of particular importance and actuality in Norway

If one looks ahead for future challenges in the use of algae for monitoring rivers, it seems as if Norway has some special responsibilities and some special problems. One important challenge is the protection of the great variety of pristine river habitats fairly unaffected by pollution. This includes the protection of the habitat itself, the conservation of the water quality and the biota. The objectives are obvious. Alteration and destruction of habitats is reported to be the most frequent cause to loss of biodiversity (Redeka Fulda, 1997). Some type of monitoring must be applied to secure the protection of these habitats and the conservation of biodiversity. Due to the complexity of the ecosystems and the problems to identify some of the algae, it seems as if new methods and strategies must be developed to obtain effective monitoring of the biodiversity of algal communities.

The establishment of reference catchments is one attempt to monitor biodiversity and to counteract the human impairment of the freshwater ecosystems. The first Reference- and Research-catchment was established in 1985, the second in 1994 (Øvstedal & Bradland, 1996). Long term studies were carried out, with the main objective to obtain better knowledge about the short and long term variability in natural biological communities. Periphyton studies have been carried out in the fist reference catchment, the river Atna, since 1986 (Lindstrøm & Johansen, 1997; Lindstrøm et al., 2004). Standard monitoring methods were combined with underwater photography and transect analyses to document amongst others, natural variability and long term changes in biomass.

Due to extensive and effective efforts during the last thirty years, to counteract pollution from domestic sewage, industrial wastewater and runoff from farming, eutrophication and saprobication are no longer the major pollution problem in Norway. At present long range airborne pollution seems to have the most widespread and serious impact on the ecosystems in Norwegian watercourses.

It is at least two reasons for this. Due to the hard inert bedrock that covers large parts of

Norway, the majority of the watercourses have unusually soft water, with low conductivity and low nutrient content. They do also carry small loads of particulate matter. As a consequence they have low buffering capacity and are particularly vulnerable to acidification. They are also vulnerable to other pollutants, such as heavy metals and micropollutants. Deposition of airborne nitrogen oxides, ammonia and other nutrients are causing additional concern.

The global transport of micropollutants to the arctic and polar regions by air is another reason for concern. Transport by air is a very effective way of transport, and micropollutants from Europe can be transported to the pristine watercourses in the arctic regions within a few days. The accumulation of these pollutants in the upper levels of the nutrient web is surprisingly high. As the first level in this web, the algae are of particular interest. Methods that are able to map the mechanisms of uptake and accumulation of micropollutants in algae in arctic regions are needed.

Climate change should be mentioned as well. The primary producers should be the first organism group to react to environmental changes caused by climate change. Environmental conditions that are likely to change and to affect periphyton are: temperature, length of growth season, precipitation (quality, amount and runoff patterns), nutrient availability (generally higher runoff during winter), light (less snow cover, increased insulation, increased UV-radiation), changed competition conditions and… PERIPHYTON USED FOR BIOMONITORING –

ADVANCES AND PROBLEMS Some comments seen from a Norwegian viewpoint Advances

Periphyton is an extremely good indicator of water quality. The organisms live attached to the substratum. They are exposed to all types of events and cannot escape during unpleasant events. They have no roots, and cannot like the macrophytes, extract nutrients from the sediments. They are directly dependant on the water to extract nutrients, etc. Therefore, the periphyton community at a given site is a direct and integrated response to the water quality and to the other environmental conditions at that site.

Periphyton communities do generally display high diversity and a large number of the organisms have different lifespan strategy (R- contra K-strategy). Several periphytic algae react to short events and appear /disappear within a few days (e.g. several diatoms). On the other hand; some red algae were re-found at the exact same location after more than


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60 years. Differences in lifespan-strategy enables monitoring of short events as well as slowly occurring changes. The high diversity allows for monitoring of all types of pollutants. Problems

1. Periphyton taxonomy is difficult (more difficult for some groups than for others).

2. Some periphyton groups have incomplete/unrevised taxonomic literature.

3. The expertise is limited, regarding taxonomy as well as general experience.

4. Some watercourses are only periodically suitable for periphyton monitoring because they dry out during the dry (summer) season.

5. Some rivers have a closed canopy of trees that prevents the light from penetrating to the river bed (few primary producers without light).

The monitorization of inland water bodies

using freshwater algae, involving the regular identification of algal communities and the evaluation of their change over time, is an important tool for assessing the quality of aquatic formations and, to some extent, estimate the direction of future changes. Although the recent enforcement of more strict environmental regulations at the European level has led to an increasing involvement of official water agencies in biological monitoring, much of the generally available information about algal communities in Portuguese waters comes from time-limited scientific researches and is therefore very fragmentary. The following is an attempt to summarize community level phycological work that may be used for comparison with the present day situation in the studied areas. We excluded from this account all phycological studies not specifically centred around particular aquatic formations, such as reports of species new for Portugal and revisionary work focused on taxonomic groups. Undoubtedly, the list of included works will be found faulty for two main reasons: disagreement with our decisions about what to include; and the absence of works we overlooked.

6. Some rivers are unsuitable because they carry large loads of particulate matter, that may prevent the primary producers from establishing due to limited light and particle scouring. 7. Slow flowing rivers with fine particulate matter in the river bed, may not have a sufficiently stable substratum to allow for the establishment and development of a diversified periphyton community. Point 1-3 implies for all areas and types of

rivers. Point 4-7 implies for several rivers in Central

Europe, an area that have very few rivers compared to some of the “outskirt countries” in Europe (e.g. Norway, Greece, and Rumania). Norway has a tremendous number of watercourses, but we seldom encounter the conditions outlined in point 4-7.

Studies on reservoirs and lakes are often concerned with the plankton community, whereas in rivers the main phycological component is the periphyton, either collected from different substrates or from the water column as (false) plankton. As the methods involved in the two types of studies are different, works on predominantly lenthic habitats are grouped separately from works on running waters. Reservoirs and small lakes

The earliest plankton studies that include the identification of algae from Portuguese reservoirs are those of Frade (1952, 1954, 1957) on the plankton of Castelo do Bode (River Zêzere), which contain notes on the changes that this artificial lake imposed on the river communities. Most important in this early period was the work of Nauwerck (1962), a detailed taxonomic study of algae from 18 locations, including 13 reservoirs, widely distributed from northern Minho to southern Alentejo; although based on a single sample per site, the work included chemical data and the description and illustration of many species of algae, most of which reported for the first time in Portugal. Oliveira, under the name Moita (1976), published the first Portuguese

Phycological surveys and monitoring in Portugal – a summary Calado, A.J.; S.F.P. Almeida & S.C. Craveiro

Department of Biology - University of Aveiro P-3810-193 Aveiro

PORTUGAL [email protected]


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yearlong phytoplankton survey, based on monthly sampling in Roxo Reservoir (Roxo stream, a tributary of River Sado). This was followed by a number of phytoplankton surveys in reservoirs located in several water basins, involving qualitative and quantitative analyses of the algal species, sometimes including biomass estimation through the calculation of biovolumes; the community data was combined with physical and chemical parameters to assess the trophic status of the studied waterbodies (partly summarized in Oliveira, 1987). The reservoirs were, in the basin of River Cávado (Northern Portugal): Venda Nova, Alto Rabagão and Salamonde (Oliveira, 1982a; 1985; Oliveira et al., 1985); in the northern part of River Tagus basin: Santa Luzia, Cabril, Bouçã, Pracana, Idanha, Castelo do Bode (Oliveira, 1982b, c; Cabeçadas et al., 1980; Andrade et al., 1988); and south of River Tagus: Montargil, Monte da Rocha, Odivelas, Arade, Bravura, Santa Clara, Caia, Campilhas, Magos, Maranhão, Póvoa e Meadas, Vale do Gaio, Roxo, Pêgo do Altar, Divor and Mula (Oliveira, 1984a, b, c; Ferreira, 1987; Oliveira, 1987). Based on monthly surveys conducted between 1979 and 1981, Coutinho (1990) and Oliveira (1992) reported on phytoplankton dynamics and ecology in Montargil reservoir (River Sôr) and in Santa Clara reservoir (River Mira), respectively.

Brito & Andrade (1991) reported on water quality in Castelo do Bode and Ómnias based on phytoplankton observations ranging from 1980 to 1990, a work integrated in an international cooperative project on water monitoring systems.

While in most of the studied situations the trophic state of the system was recognized as the main driving force for phytoplankton composition and dynamics, in some cases pollution with heavy metals was shown to have an effect. The contamination with Cu was examined in Venda Nova reservoir (Oliveira 1982a, 1985). The effect on phyto- and zooplankton composition of Cu, Cd and Zn introduced from abandoned mines in River Sado was studied by Monteiro et al. (1995), who documented shift toward resistant species in the most polluted areas.

More recent information on the phytoplankton of reservoirs in River Douro and adjacent basins is found in Vasconcelos (1991; Azibo), Branco & Guimarães (1991; Torrão), Branco et al. (1991; Ermal and Andorinhas) and Galhano et al. (1991; Bemposta). An assessment of phytoplankton variations in the small reservoir at Coimbra (River Mondego), strongly conditioned by short retention times, was reported by Craveiro & Santos (1988, 1999).

Published studies on algal communities in Portuguese small lakes are scarce. Calado et al.

(1991) reported on the algal community in the species-rich Pateira de Fermentelos (River Cértima) in the winter of 1986. The spring-summer transition was followed in Lagoa das Braças, a shallow, eutrophic lake located in coastal sand dunes (Calado 1993). Santos et al. (1996) concentrated on silica-scaled chrysophyte variation in three organic-rich marshes in the lower Mondego area. Phytoplankton and eutrophication in the city lakes of Oporto were examined by Moreira et al. (2000). Cyanobacteria and cyanobacterial toxins

In most studies conducted in reservoirs, estimates of phytoplankton biomass, either involving species identification or derived from chlorophyll measurements, was used to evaluate the trophic status of the system. Eutrophic and hypertrophic water masses are prone to develop nuisance blooms, which will often be dominated by cyanobacteria. Increased awareness of cyanobacterial toxins and their potential effects on water users led to numerous studies in rivers and reservoirs throughout the country, increasing our knowledge of the distribution and importance of toxic species.

Most of the work combining cyanobacterial species distribution in Portugal with toxicity evaluation was started by Vasconcelos (1993, 1994, 1995). More recent works include diversity and toxicity studies in water treatment plants (Pereira et al. 2001; Vasconcelos & Pereira 2001) and the detection of cyanobacteria-derived paralytic toxins (PSP) in reservoirs (Ferreira et al. 2001). See Vasconcelos (2001) for an overview of previous work. The distribution and toxicity of the invasive species Cylindrospermopsis raciborskii was studied by Saker et al. (2003a, b). Running waters, periphyton and the application of biological indices

Several Portuguese researchers have concentrated on algal communities in running waters, most often with the objective of estimating water quality through the application of biological indices. Although lists of river algae collected in the water as (pseudo-) plankton have often included different taxonomic groups, works centred on the periphyton were in most cases restricted to the diatoms. For many of these works the emphasis was on the calculation of biological indices based on diatom epilithic communities, which usually require the adoption of specific sampling procedures. Commonly used were the saprobic indices (not restricted to diatoms, but often calculated from the diatom community only; Zelinka & Marvan 1961; Sladecek 1973, 1986) and their adaptation by Leclercq & Maquet (1987;


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diatoms only), the diatomological index of Coste (1986) and its derived “Economic Community Index” CEC (Descy & Coste 1991), and the diatomological index of Descy (1979), which developed into the Specific Polluosensitivity Index — SPI (see Descy & Coste 1991).

The first published survey of the algal community of a Portuguese river is that of Oliveira & Caldas (1970). This work, which included both algal and non-algal waterborne organisms of River Almonda, was later expanded to include also the species living on the bottom (Oliveira & Caldas 1971).

In a pioneering study, Rino & Gil (1987) analysed epiphytic, epilithic and waterborne communities of diatoms from the whole length of River Cértima, collected in autumn 1985 and in spring 1986; using quantitative data (cells/ml) for diatoms in the water column, they compared the efficiency of a number of indices in displaying the widely different pollution levels encountered, and obtained more accurate results with saprobic indices complemented with diversity measures, than with the diatom indices available (see above).

In an imposing volume, Gil (1988) presented the results of an extensive ecological study of diatom communities in three rivers of the Vouga basin (central Portugal). The work included the detailed comparison of communities attached to four different types of artificial substrata, which involved the absolute quantification of species in a huge number of samples; the degree of taxonomic discrimination was unprecedented in Portugal, and the mass of biological and chemical data was integrated in numerous multivariate analysis diagrams. Fragments of this work were published in Gil et al. (1990, 1991).

Caldas (1988) used epipelic (mud-dwelling) diatoms for monitoring two localities in River Tagus. Works by Cerqueira da Silva (1989, 1990, 1991) and Fidalgo (1990) report on waterborne algae of localities in rivers Tagus, Lima, Ave and Vizela. Microscope glass slides were used in studies of periphytic algae and other protists in rivers Cávado, Paiva and Âncora (Cerqueira da Silva 1992, 1994, 1996).

The analysis of epilithic and waterborne communities of diatoms from 18 localities in the lower reaches of rivers in the Vouga basin (central-north Portugal), conducted over a year, extended our knowledge of diatom autoecology and allowed the comparison of attached and detached river communities (Almeida & Gil 1998, 1999, 2000). Calculation of diatom indices from these extensive data showed that CEC and SPI produced more adequate results than saprobity-based indices, which failed to reveal the differences in pollution levels observed. Although the relative adequacy of

CEC and SPI for discriminating between pollution levels in the studied area reflected the general agreement between the ecological characteristics of local diatoms and those of the index databases, discrepancies were noted for some taxa, leading to the suggestion of corrections in sensivity and indicator values (Almeida & Gil 2001; Almeida 2002). Biological indices tailor-made for monitoring — the IBD

Based on the experience with routine biological monitoring, including diatom sampling and identification, a group of researchers in France developed a diatom index that aims to combine reliability with simplicity, thereby reducing the length of the training period required for its application by water agencies. It is called “Indice Biologique Diatomées” (IBD) and, although its basic philosophy is similar to other indices based on quantified autoecological characteristics, its simplification lies in the reduction of the number of relevant taxa (limited to 209), avoiding the need to discriminate between very similar forms (Prygiel & Coste 2000). For best results, the IBD should be based on uncontaminated epilithic diatom communities, and detailed instructions were given for the sampling procedures.

The proposal of the IBD, now in routine use in France, prompted a number of studies to check its applicability in Portuguese waters under different conditions. One common problem in Portuguese lowland rivers is the scarcity of adequate rocky substrates, leading to the replacement of epilithic by other benthic communities, which may, or may not, produce adequate results with the IBD.

Ferreira et al. (2002) studied the effects of the effluent from a paper mill on periphytic diatoms developing on plastic artificial substrates placed upstream and downstream of the discharge point. The results were surprising, with the most polluted site showing the highest Shannon-Wiener diversity of diatoms. The results of the IBD were no better, with the highest (best) value obtained for the most affected section of the river (Craveiro et al. 2003). Absolute quantitative analysis revealed a much smaller number of frustules attached to the substrate in the most polluted area than in sections not affected by the effluent. However, only relative abundances of taxa are used in the calculation of current diatom indices, including the IBD, which are therefore vulnerable to similar situations.

In a study of diatom communities differently affected by organic pollution in River Pavia, the IBD showed optimistic results, underestimating pollution levels in the most affected localities, whereas the SPI realistically


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revealed bad water quality (Castro et al. 2003; Castro 2004).

Nunes et al. (2003a) applied the IBD and SPI to diatom communities from streams affected by abandoned mines in the basins of rivers Mau and Caima; despite the contamination of stream sediments with Pb, Cd, Zn and Ni, both indices indicated medium to good water. However, heavy metal stress was indicated by valve deformations in some diatom species and by geochemical indices, suggesting the need to combine different approaches to discriminate between pollution levels (Nunes et al. 2003b). Ongoing work

In response to European legislation, the Portuguese Water Institute (INAG), which holds the responsibility for the management of water resources, is now taking biological monitoring into its own hands, through collaborative projects with researchers in several universities. The first large scale test of the IBD in Portugal, involving samples from 58 places in northern rivers, gave promising results (Almeida et al. 2003), although the limits of applicability of the index still need clarification (see above).

A larger project led by INAG is currently underway, involving partners from six Portuguese universities. Biological communities, including fishes, macroinvertebrates, diatoms and macrophytes, are being studied in rivers throughout the country to establish reference conditions and to determine the boundaries of classes of quality.

Although the analysis of algal communities is still not legally required, some of the regional agencies under INAG have started regular phytoplankton sampling, especially in reservoirs, and performing quantification of cyanobacterial toxins when the plankton composition justifies it.

Data on diatom ecology with regard to organic pollution are currently being added to an open database originally built by Calado (1990). The potential of this information as a tool for water quality estimation, entirely based of data from Portugal and therefore uninfluenced by other databases, is being evaluated. References

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Muestreo del fitobentos en ríos, lagos y humedales: requisitos y recomendaciones para la Directiva Marco del Agua, con especial enfoque a los trabajos desarrollados sobre diatomeas en la

Cuenca del Duero Saúl Blanco1,2, Luc Ector2 y Eloy Bécares1 1: Área de Ecología - Universidad de León

24071-LEÓN [email protected]

2: Centre de Recherche Public-Gabriel Lippmann, CREBS, 41 rue du Brill; L-4422 Belvaux LUXEMBOURG

[email protected]


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Decenas de estudios en Europa avalan la eficacia de los índices biológicos basados en diatomeas y en otras algas para el control del estado ecológico del agua, fundamentalmente en medios lóticos (Descy, 1976; Lange-Bertalot, 1979; Round, 1991; Whitton et al., 1991; Eloranta, 1995; 1999; Whitton & Rott, 1996; Dell’Uomo et al., 1999; Prygiel et al., 1999b; Rott et al., 2003). Dentro de los índices diatomológicos, los más empleados hasta ahora en Europa (Ector & Rimet, 2005) son el Índice de Poluosensibilidad Específica (IPS, Coste en CEMAGREF, 1982) en Austria, Bélgica, Eslovaquia, España, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Inglaterra, Italia, Luxemburgo, Portugal, Polonia, Suecia, Suiza, etc.; el índice CEE en Andorra, Bélgica, España, Finlandia, Francia, Grecia, Hungría, Luxemburgo, Portugal; el Índice Biológico de Diatomeas (IBD, Lenoir & Coste, 1996; AFNOR, 2000) en Francia, Luxemburgo, Hungría, España y Portugal; los índices sapróbicos y tróficos de Rott (Rott et al., 1997; 1999) en Austria; y el índice de eutrofización/polución de Dell’Uomo (Dell’Uomo, 2004) en Italia.

En el ámbito de la Unión Europea, la Directiva Marco del Agua –DMA- (Parlamento Europeo, Consejo de la Unión Europea, 2000) contempla el uso de bioindicadores basados en fitobentos para la determinación de la calidad ecológica de las masas de agua epicontinentales con respecto a determinadas condiciones de referencia. La aplicación de esta Directiva en España ha llevado a diversos grupos de investigación al muestreo sistemático de varias cuencas hidrográficas y al establecimiento en ellas de redes de biomonitorización basados en el empleo de índices diatomológicos. Las diatomeas epilíticas en los ríos de varias cuencas y regiones hidrográficas ya han sido muestreadas en la Península Ibérica (p. ej. Aragón en 2002-2003, Cataluña en 2002-2003, Duero en 2004, Ebro en 2002-2003, Galicia-costa en 2003, Guadalquivir en 2004, Júcar en 2000, Norte en 2003-2004, País Vasco en 2003-2004, Portugal en 2004) Así, durante los últimos años han surgido varios trabajos publicados sobre las comunidades de diatomeas bentónicas y su empleo como bioindicadores, principalmente en ríos del norte de España (Tomás & Sabater, 1985; Sabater et al., 1987; 1996; 2003; Merino et al., 1994; 1995; Leira & Sabater, 2002; 2005; Cambra et al., 2003; Gomà et al., 2004; 2005) y también en Portugal (Almeida et al., 1999; Almeida & Gil, 1998; 2000; 2001; Nunes et al., 2003).

El empleo de indicadores específicos para sistemas leníticos, sin embargo, no está tan desarrollado en España, aunque la relación entre las comunidades de diatomeas perifíticas y los parámetros ambientales en estos ecosistemas está

demostrada (Hawes & Smith, 1993; Hoffman, 1994; Mayer & Galatowitsch, 1999; Blanco et al., 2003; Kitner & Poulícková, 2003). Dentro de este tipo de sistemas, destacan las lagunas someras y los humedales por su abundancia y diversidad en toda la meseta ibérica. Se trata de zonas de gran riqueza biológica que, sin embargo, han sido escasamente estudiadas y no gozan de estados de conservación adecuados. La necesidad de desarrollar bioindicadores específicos para estos ecosistemas es evidente. Muestreo de diatomeas béntónicas en los ríos de la cuenca del Duero

La Confederación Hidrográfica del Duero, en colaboración con el Área de Ecología de la Universidad de León y el Centro Público de Investigación Gabriel Lippmann de Luxemburgo, comenzó en 2004 el establecimiento de una red de biomonitorización de la calidad del agua en los cursos fluviales de la cuenca del río Duero mediante el uso de índices diatomológicos. En verano de este año se efectuó un primer muestreo preliminar sobre 140 puntos seleccionados a partir de las estaciones de la Red Integral de la Calidad de las Aguas (ICA), a fin de conocer mejor las comunidades de diatomeas de los ríos de la cuenca del Duero y de poder comparar los resultados obtenidos mediante los índices biológicos con el registro de parámetros fisicoquímicos de estas estaciones. La metodología empleada para el muestreo de comunidades de diatomeas epilíticas de ríos fue la estandarizada en diversas normativas de Francia y de la Unión Europea (AFNOR, 2000; 2003; European Committee for Standarization, 2003; 2004). La recogida, procesado y análisis sistemático de diatomeas bentónicas para la determinación de la calidad del agua se discute ampliamente en Kelly et al. (1998). El resultado final conduce al cálculo de varios índices diatomológicos, habitualmente mediante el programa OMNIDIA (Lecointe et al., 1993; 1999), originando un valor numérico que expresa la calidad general del agua en ese punto con respecto a los valores extremos que puede adoptar teóricamente cada índice. Los índices se someten periódicamente a ensayos de intercalibración (Prygel et al., 1999a; 2002) a fin de ajustar su valor indicador.

La aplicación de esta metodología general requiere en la práctica de una adaptación a las peculiaridades de cada sistema hidrográfico. Los cursos fluviales de la cuenca del Duero, la más extensa de la Península Ibérica, son muy diversos desde el punto de vista hidrogeológico, asentándose sobre sustratos de muy variada naturaleza. Adicionalmente, la mayoría de los ríos en esta región están regulados artificialmente, lo


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cual supone una alteración muy significativa en su hidrodinamismo natural que es necesario tener en cuenta al planificar las campañas de muestreo. El protocolo de muestreo exige considerar preferentemente tramos con corriente, ya que las muestras recogidas en zonas leníticas y semileníticas, o situadas río abajo de los embalses, contienen frecuentemente especies planctónicas o células muertas procedentes de cursos superiores que no se corresponden con la comunidad de diatomeas característica de ese punto. Algunas estaciones de la red ICA, no obstante, se asientan sobre tramos de escasa o nula corriente, en las proximidades de presas y azudes, lo que obliga frecuentemente a buscar zonas anejas más propicias para poder realizar el muestreo según las normas europeas, pero lo suficientemente próximas como para mantener la representatividad de los datos fisicoquímicos recogidos por la estación. No obstante, siempre se efectúa además una medición in situ de los principales parámetros (pH, O2 disuelto, temperatura y conductividad especifica) para caracterizar específicamente cada punto de muestreo.

La mayor parte de la cuenca del Duero se sitúa dentro de la región climática mediterránea, lo cual condiciona el régimen hidrológico de sus cauces fluviales en función de la distribución estacional de las precipitaciones característica de este clima. Las normativas proponen realizar los muestreos en el momento en el que los potenciales contaminantes se encuentren más concentrados, siendo la época estival aquella en la que usualmente los caudales de los ríos no regulados son mínimos. Sin embargo, es frecuente encontrar en esta época cauces secos o con un canal de estiaje cuyas dimensiones no son representativas de todo el lecho fluvial. Aún en el caso de hallar un caudal suficiente, es necesario tener en cuenta que el sustrato a muestrear ha de haber permanecido sumergido durante las últimas cuatro semanas, condición que no resulta fácil hallar en años especialmente áridos.

La heterogeneidad de sustratos inertes disponibles para la toma de muestras puede suponer un inconveniente adicional. La disponibilidad de piedras y rocas en determinados tramos puede ser nula o en todo caso insuficiente como para considerarse representativa del ambiente muestreado. Esta situación es particularmente frecuente en ciertos cauces de la margen izquierda del río Duero, que discurren por terrenos arenosos y limosos. Para estos casos, se recomienda muestrear sobre superficies duras verticales, tales como diques o pilares de puentes, o bien sobre macrófitos sumergidos. En cualquier caso, conviene evitar muestrear sobre

comunidades epipélicas o epipsámmicas. Por último, es necesario resaltar la considerable diversidad litológica de los lechos fluviales muestreados (calcáreos, silíceos, margosos); sin embargo esta heterogeneidad no parece afectar el resultado de los índices diatomológicos más usuales (Kelly et al., 1998). Muestreo de algas epifíticas en sistemas leníticos de la Submeseta Norte

El Área de Ecología de la Universidad de León está llevando a cabo actualmente diversos proyectos de investigación sobre lagos y lagunas someras de la depresión del Duero, ecosistemas caracterizados por una notable diversidad florística y faunística, actualmente bajo diversas figuras de protección. Uno de los objetivos de estos estudios es el desarrollo de bioindicadores específicos para evaluar su estado ecológico. Durante los veranos de 2003 y 2004 se llevaron a cabo sendas campañas de muestreo en una treintena de lagunas someras de Castilla y León. Se realizó un análisis detallado de los parámetros fisicoquímicos del agua y se recogieron muestras de toda la comunidad biológica presente, incluyendo algas fitoplanctónicas y epifíticas, tanto sobre vegetación emergente como sumergida. Para ello se utilizaron muestreadores Kornijow (Kornijow & Kairesalo, 1994; Kornijow, 1998), que han demostrado su eficacia en el muestreo de fauna asociada a plantas. Los resultados preliminares (Blanco et al., en prep.) ponen de manifiesto la importancia de la comunidad perifítica en el conjunto de la biocenosis lacustre y su influencia en el desarrollo de la vegetación acuática.

En España, diversos estudios recientes han mostrado la potencialidad de las diatomeas como indicadoras del estado ecológico en ambientes lacustres, tanto en humedales costeros (Trobajo, 2003) como en lagos de montaña (Linares, 2003) y lagunas someras (Blanco et al., 2004). El muestreo de diatomeas perifíticas en sistemas leníticos someros necesita sin embargo una previa estandardización de los métodos de recogida de muestras al nivel europeo y de la Península Ibérica, ya que el epiliton está generalmente ausente. Las comunidades epifíticas, por su parte, pueden verse condicionadas por la naturaleza de las distintas especies de plantas hospedadoras -superficies colonizables, efectos alelopáticos diferenciales (Cattaneo & Kalff, 1980; Blindow, 1987) - especialmente en lagos oligotróficos (Eminson & Moss, 1980). No obstante, Blanco et al. (2004) concluyen que los tallos de los macrófitos emergentes (helófitos como Typha sp., Scirpus sp., Phragmites sp., etc.) son el sustrato más adecuado para estudios de biomonitorización, en base a una


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serie de ventajas que presentan con respecto a otros posibles sustratos: - Son plantas comúnmente distribuidas y presentes bajo un amplio espectro de condiciones ambientales, lo cual permite la obtención de resultados comparables y reproducibles en todo Europa. - Presentan superficies verticales que minimizan la acumulación de células muertas. Además, su arquitectura es sencilla, posibilitando la medida directa de la superficie muestreada y por lo tanto estudios cuantitativos (p. ej. de productividad). - La comunidad epifítica no se altera significativamente en función del estado fenológico de estas plantas (Caput & Plenkovic-Moraj, 2000), y su composición se relaciona estrechamente con las características ambientales del medio (Lakatos, 1989; Ács et al., 1994) más que con las de la planta sustrato (Cattaneo et al., 1998). - Estudios comparativos (Hoffman, 1994; Lenoir & Coste, 1994) no han encontrado diferencias significativas utilizando índices diatomológicos a partir de comunidades epilíticas y epifíticas.

En comparación con los resultados obtenidos en ríos, los trabajos realizados hasta el momento en la meseta Norte demuestran que las diatomeas epifíticas son mejores indicadores de la calidad del agua en lagos someros y humedales (Blanco et al., 2004) que los macroinvertebrados bentónicos (García-Criado et al., 2005). Conclusión y recomendaciones

La implementación de las redes de biomonitorización de la calidad del agua mediante diatomeas en los sistemas fluviales españoles está aún en su fase inicial. Los estudios realizados hasta ahora han demostrado, en términos generales, la aplicabilidad en nuestras aguas de los índices diatomológicos diseñados inicialmente para ríos centroeuropeos. Sin embargo, como hemos señalado, es necesario tener en cuenta las peculiaridades de cada cuenca a la hora de diseñar una metodología de muestreo específica. En cualquier caso, es esencial seguir en la medida de lo posible los protocolos normalizados de muestreo si se desean obtener resultados comparables a nivel de la Unión Europea. A este respecto, se debe hacer un énfasis especial en la importancia que tiene la fase de recogida de muestras. Es necesario estudiar en cada estación el comportamiento del curso de agua y la morfología del cauce para seleccionar el punto de muestreo óptimo, recogiendo en él una cantidad de muestra que sea representativa de la comunidad presente.

Como consecuencia de estos estudios, se están completando los inventarios taxonómicos de diatomeas para las distintas cuencas, en las que se

están describiendo decenas de nuevas especies para la ficoflora ibérica (Gomà et al., 2004; Monnier et al., 2004) con respecto al catálogo existente (Aboal et al., 2003), lo cual tiene de por sí gran interés a nivel florístico y también biogeográfico. Paralelamente a los trabajos ecológicos, no hay que olvidar los análisis puramente taxonómicos necesarios para contribuir a la estabilidad nomenclatorial y a estudios de biodiversidad. En este sentido, es recomendable la creación de ficotecas de referencia, iconografías y bases de datos estandarizadas que permitan avanzar sistemáticamente en el estudio de cada cuenca. Igualmente, la elaboración por expertos de guías metodológicas con la descripción de las principales especies características de las distintas grandes cuencas hidrográficas sería de gran ayuda para la formación de personal técnico en el análisis de muestras, así como la organización de cursos anuales de formación a la taxonomía y ecología de las diatomeas y de ejercicios de intercalibración al nivel regional, estatal y europeo.

La DMA establece igualmente la necesidad de definir diferentes ecorregiones y tipologías de ríos dentro de cada una de las cuencas fluviales mediante una relación de parámetros físicos (geología, altitud, etc.). En la actualidad, los trabajos prioritarios deben orientarse a la definición, dentro de cada ecorregión y tipo fluvial, de las condiciones de referencia respecto de las cuales evaluar la calidad del agua (Nijboer et al., 2004; Moog et al., 2004), como desviación respecto al estado de alta calidad. Esta desviación se mide a través de un Cociente de Calidad Ecológica (EQR) entre el estado actual de la masa de agua y su estado óptimo o de referencia. Las condiciones de referencia se corresponden con las de una masa de agua donde los impactos antropogénicos son mínimos o nulos (Ector & Rimet, 2005), y representan el estado ecológico óptimo de cada ecorregión.

Con respecto a los sistemas leníticos, parece claro que las diatomeas deben ser incluidas como una de las comunidades prioritarias en el establecimiento de su calidad, pudiendo ayudar a dirimir los importantes problemas encontrados con otras comunidades citadas en la Directiva Marco del Agua. Sin embargo aún son necesarios más estudios sobre la ecología de las diatomeas en estos sistemas. Especial atención requiere el análisis de las interacciones perifiton-sustrato y perifiton-fitoplancton, así como la determinación precisa de los rangos autoecológicos de las principales especies, fundamento de todos los índices diatomológicos. Los estudios pueden hacerse extensivos hacia otros ambientes acuáticos poco conocidos, como el fitoplancton fluvial, las charcas efímeras o las turberas.


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En conclusión, es evidente que los estudios de bioindicación serán uno de los objetivos prioritarios de la presente generación de algólogos en toda Europa. Los resultados científicos futuros y, en definitiva, la conservación y protección de los diversos ambientes acuáticos, dependerá en gran medida de nuestra capacidad actual de elaborar un trabajo sistemático y estandarizado en el ámbito de cada cuenca hidrográfica, de toda la Península Ibérica y también en cada una de las grandes ecorregiones definidas en Europa. Referencias

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La Directiva Marco del Agua (Directiva

Europea 2000/60/EC) aprobada por la Unión Europea en el 2000 establece el marco comunitario de actuación en el ámbito de política de aguas y tiene como objetivo prioritario el que se alcance el buen estado ecológico de los sistemas acuáticos (aguas superficiales, estuarios, aguas costeras y aguas subterráneas) en el año 2015. Específicamente la DMA pide un uso racional de los recursos hídricos y la conservación, protección y mejora de la calidad de los sistemas acuáticos. Desde el punto de vista de procedimientos, la DMA requiere la tipificación de las masas de agua continentales, así como el establecimiento de las condiciones de referencia para cada tipología de masa de agua, basadas en indicadores hidromorfológicos, físicos, químicos y biológicos y la evaluación del estado actual de conservación de las masas de agua utilizando dichos indicadores.

Es importante destacar que la DMA es la primera normativa en gestión del agua que incluye los conceptos de estado ecológico y estado de referencia de los sistemas acuáticos. Puntos de partida interesantes pero que a su vez requieren de un buen conocimiento del funcionamiento de los ecosistemas acuáticos.

Los sistemas acuáticos fluctuantes y de transición (donde se incluyen los humedales costeros, estuarios, ramblas y marjales) se caracterizan por un gran dinamismo, elevada interacción entre parámetros e intercambio de

Sabater, S.; E. Tornés; M. Leira & R. Trobajo. 2003. Anàlisi de viabilitat i proposta d’indicadors fitobentònics de la qualitat de l’aigua per als cursos fluvials de Cataluña (Muga, Fluvià, Ter i Daró). Documents tècnics de l’Agència Catalana de l’Aigua, Barcelona, 113 pp.

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materia y energía con los sistemas adyacentes (terrestre y acuáticos), siendo precisamente esta complejidad en el funcionamiento lo que dificulta su estudio y tipificación pero que a su vez también supone un reto.

Algunas de las características de estos sistemas, como la baja profundidad y confinamiento, los hace especialmente vulnerables a la eutrofización y a la contaminación química siendo difícil encontrar humedales costeros prístinos en Europa. Concretamente y durante siglos los humedales mediterráneos han estado sometidos a intensas explotaciones y manipulaciones por parte del hombre, y en la mayoría de los casos describir las condiciones de estos ambientes para posteriormente definir su estado ecológico es muy difícil sino imposible (Barnes, 1999). Quizás tendremos que aceptar que en estos sistemas no hay ambientes de referencia a priori y que como proponen Boix et al. (2004), solamente se podrán identificar a posteriori, una vez hecho el estudio exhaustivo de la calidad de los humedales mediterráneos.

La utilización de indicadores biológicos para evaluar la calidad de las aguas ha sido especialmente estudiada en los ecosistemas lacustres y fluviales. La utilización de índices biológicos basados en algas es particularmente adecuada en sistemas acuáticos con gran varibilidad de carga o flujo de nutrientes (Whitton,

La Directiva Marco del Agua y las diatomeas como indicadoras de los humedales mediterráneos Rosa Trobajo Pujades

Natural History Museum Cromwell Road. London SW7 5BD

UNITED KINGDOM manolito


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1999) siendo éste el caso de muchos de los humedales mediterráneos (Quintana et al., 1998).

Entre los diferentes grupos taxonómicos que forman las comunidades algales presentes en los sistemas acuáticos, las diatomeas juegan generalmente siempre un papel importante, ya sea a nivel cuantitativo (en términos de abundacia de especies) y/o a nivel cualitativo (en términos de produccióm) (Round, 1981; Sullivan, 1999). Las diatomeas son excelentes indicadoras ambientales (Margalef, 1955; Patrick, 1973; Coste, 1976; Lange-Bertalot, 1979; Kobayasi & Mayama, 1982; Fabri & Leclerq, 1986; Sabater et al., 1988; Rott, 1991; Kelly et al., 1995; Stevenson & Pan, 1999; Sullivan & Currin, 2000) ya que debido a su pequeño tamaño (micras) y a su elevada taxa de reproducción (algunas especies pueden presentar hasta 2 o 3 divisiones al día) las comunidades de diatomeas responden rápida y sensiblemente a cambios físicos, químicos y biológicos que se producen en su entorno. Además, el hecho de que vivan en casi la totalidad de los sistemas acuáticos, que sean de fácil recolección y que los elementos estructurales de su esqueleto de silicio permitan su determinación a nivel de especie con gran exactitud, son otras de las características de las diatomeas que facilitan su uso indicador.

En Europa existen actualmente más de 20 métodos diferentes que evalúan la calidad de las aguas de los ríos basándose en la comunidad de diatomeas bentónicas, si bien estos métodos han tenido que ser adaptados de acuerdo con el país (según áreas geográficas y climáticas), en algunos países como Reino Unido, Francia y Alemania se utilizan ya de forma rutinaria en el seguimiento de la calidad de las aguas fluviales (Prygiel et al., 1997). En cambio, no existe ningún índice de diatomeas para evaluar la calidad de los humedales mediterráneos a pesar de que la importancia ecológica y económica de estos ambientes haya sido puesta de manifiesto (Ramade, 1990; Britton & Crivelli, 1993; Pearce & Crivelli, 1994) y que su conservación haya sido reconocida como una prioridad a través de convenciones (eg. Ramsar convention) e iniciativas (eg. Mediterranean Wetland Initiative –MedWed-).

En el caso concreto de España, son muy escasos los estudios (ya sea utilizando las algas u otro tipo de organismo) encaminados a la evaluación de la calidad de las aguas de los humedales en general y mediterráneos en particular. Sin embargo, ya existen estudios del funcionamiento de estos sistemas y a pesar de que actualmente no existe ninguna flora de diatomeas de los humedales mediterráneos, sí existen trabajos puntuales acerca de las diatomeas de diferentes áreas del mediterráneo español (Aboal, 1986; 1988; Aboal et al., 1996; Cambra, 1986; Cambra et al.,

1988; Cantoral & Aboal, en prensa; Clavero-Oms, 2004; Clavero-Oms et al., 2000; Margalef, 1951; 1952; 1953; 1954; Margalef & Mir, 1973; Miracle et al., 1984; Romo & Miracle, 1994; Sabater et al., 1990; Salvat, 1997; Sánchez-Castillo, 1987; 1993; Tomàs, 1988; Trobajo, 2003; 2004a y b) aunque estos trabajos todavía son pocos sobre todo comparados con los estudios existentes de agua dulce (Sullivan, 1999; Underwood & Provot, 2000; Trobajo et al., 2004a). Sería pues quizás el momento de entender los humedales mediterráneos en su totalidad y de recopilar y ampliar la información de la que se dispone para poder obtener una base de datos sólida a partir de la cual se pudiera elaborar un índice que evalúe la calidad de la diversidad de ambientes acuáticos presentes en ellos, índice que sería nuevo en España pero también en Europa. El camino por recorrer no es poco, todavía hay bastantes zonas del mediterráneo español donde no se conoce la flora de diatomeas ni las especies representativas de estos ambientes y faltan todavía estudios (de campo pero también experimentales) sobre los requerimientos de estas especies. Porque es el conocimiento de las especies de diatomeas representantes de los humedales mediterráneos así como de su ecología (requerimientos de las especies y factores que afectan a las asociaciones) los requisitos previos e indispensables para su utilización como indicadoras del estado ecológico de estos ambientes. Bibliografía

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Este protocolo está basado en las normas y

prenormas europeas publicadas por la Comisión Europea de Normalización: Norma CEN/TC 230 prEN 13946 y prenorma prEN 14407 (2002) 1. PROTOCOLO DE MUESTREO Y

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE DIATOMEAS EPILÍTICAS DE LOS RÍOS.

1.1. Material. 1.1.1. Material de muestreo. - Equipo apropiado resistente al agua. - Botas de pescador. - Cepillo de dientes duros (o instrumento similar) o navaja (otra hoja adecuada). - Botes de muestreo con tapa hermética. - Bolígrafo o rotulador permanente (o cualquier otro método de rotulación). Si se utilizan etiquetas, éstas deben ser resistentes a las condiciones de humedad. - Raspador de mango largo con una red fina adherida para muestrear superficies duras verticales. - Caja con fondo de cristal (Aquascope) para la búsqueda de substratos idóneos.

1.1.2. Material de laboratorio. - Campana extractora o sistema equivalente. - Placa calefactora, baño de arena o baño de agua. - Vasos de precipitados y tubos de ebullición (uno por muestra). - Medios para medir volúmenes de 20 ml de agentes oxidantes. - Pipetas Pasteur limpias. - Centrífuga (opcional). - Tubos de centrífuga resistentes a los agentes oxidantes utilizados para la limpieza de las diatomeas (opcional).

Trobajo, R.; E.J. Cox & X.D. Quintana. 2004b. The effects of some environmental variables on the morphology of Nitzschia frustulum (Bacillariophyta), in relation its use as a bioindicator. Nova Hedwigia 79 (3-4): 433-445.

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Whitton, B.A. 1999. Perspective on the use of phototrophs to monitor nutrients in running waters. Aquatic conservation: Marine and Freshwater Ecosystems 9: 545-549.

Nota: si no se dispone de centrífuga se puede dejar sedimentar la muestra durante una noche, eliminando el sobrenadante con cuidado posteriormente. 1.2. Reactivos. 1.2.1. Fijadores. No es necesario el empleo de fijadores si las muestras se van a procesar de forma inmediata, siempre que se conserven a baja temperatura (4ºC) y en la oscuridad. - El lugol es adecuado para conservar durante periodos de tiempo cortos. Se recomienda formaldehido tamponado o etanol para periodos largos. Un método alternativo es la ultracongelación. - Solución tamponada de glutaraldehido (HCHO) al 4% v/v. Diluir una solución stock al 4% de formaldehido en una solución tamponada a pH 7. Entre los tampones más adecuados están el HEPES (N-2- Hidroximetilpiperazina-n-2-ácido sulfónico), borato y hexametil-tetramina. Se recomienda una solución entre el 1,1 y el 4% v/v (la cantidad necesaria dependerá de la cantidad de materia orgánica presente en la muestra). Nota: el tampón es necesario para evitar la disolución de los frústulos. -Etanol al 70% (C2H5OH).

1.2.2. Reactivos para la limpieza de diatomeas. - Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30% (100 volúmenes). - Ácido clorhídrico diluido 1M (HCl). - Ácido sulfúrico concentrado (H2 SO4). - Permanganato potásico (KMnO4) en cristales. - Ácido oxálico saturado (H2C2O4).

Protocolo para la evaluación de la calidad biológica de los ríos mediante las diatomeas. Aplicación de la Directiva Marco en política de aguas de la Unión Europea (2000/60/EU)

Departamento de Medioambiente Generalitat de Cataluña


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1.2.3. Reactivos para la elaboración de preparaciones permanentes.

Se requiere un medio de montaje con un índice de refracción superior a 1,6. Las marcas registradas son NAPHRAX e HYDRAX. 1.3. Procedimiento.

1.3.1. Selección de substrato. El substrato ideal son las piedras de las zonas sumergidas del lecho el río, ya que son un substrato duro que puede ser extraído del río para realizar el muestreo. En ausencia de este tipo de substrato se pueden utilizar estructuras realizadas por el hombre tales como pilares de puentes (siempre que no sean de madera) u otras, siempre que permanezcan sumergidas el tiempo suficiente (un mínimo de 4 semanas, aunque puede variar según las condiciones). En ríos profundos o con ausencia de substratos líticos se pueden introducir substratos artificiales. También es posible muestrear macrófitos sumergidos aunque es necesario muestrear siempre la misma especie o el mismo tipo morfológico si se quieren hacer estudios comparativos entre ríos.

1.4. Selección del punto de muestreo. Por regla general debe tener unos 10 m de largo, aunque longitudes mayores pueden ser más adecuadas dependiendo de la uniformidad física del medio y de la disponibilidad de substratos. Debe hacerse una descripción detallada del punto de muestreo: localización, anchura, profundidad, tipo de substratos, presencia y abundancia de macrófitos sombra y otras características ecológicas. También se recomienda realizar alguna foto. En cada visita conviene apuntar todas las variaciones observadas así como todas las incidencia en el muestreo. 1.4. Metodología de la recogida de muestras. 1.4.1. Superficies duras y naturales móviles. Como mínimo se debe muestrear cinco piedras, cinco rocas pequeñas o cantos. Como mínimo debe muestrearse 10 cm2. En caso que no sea posible debe anotarse la razón. Entre las condiciones de microhábitat se señalan: -deben evitarse zonas muy sombredas o demasiado próximas a la orilla. -el substrato debe estar sumergido el tiempo suficiente, como ya se ha comentado anteriormente (al menos 4 semanas). La profundidad no es importante siempre que permanezca en la zona iluminada y que la superficie no haya estado expuesta al aire. Será posible muestrear en todas las profundidades con unas buenas botas de pescador.

-en general las muestras deben ser recolectadas en la corriente principal de la zona de muestreo. Se deben evitar las zonas de corriente lenta, ya que permiten la concentración de limos y detritus y la pérdida de diatomeas epilíticas. Es preciso eliminar cualquier tipo de contaminación presente limpiando las piedras a muestrear en la zona de corriente máxima, lavar el bote en el que se ha de introducir la muestra con el agua del río (repitiendo el proceso tres veces). Llenar el bote con 50 ml de agua del río. Limpiar el cepillo de muestreo con agua limpia contra una superficie dura para minimizar las contaminaciones. Raspar las piedras para recoger la película de diatomeas con ayuda del cepillo, que se lavará periódicamente en el bote de muestreo. El contenido final debería ser turbio y de color pardo. Si en el substrato hay algas filamentosas deberán retirarse tantos filamentos como sea posible antes de proceder al raspado. En la medida de lo posible es conveniente evitar este tipo de substrato. En cada bote de muestra deben rotularse los detalles precisos para su identificación: código de la muestra, fecha de recolección, nombre del río y nombre del municipio. El transporte de las muestras al laboratorio debe hacerse en un lugar fresco y oscuro. Si las muestras no van a ser transportadas al laboratorio antes de 24 horas es necesario fijarlas en el campo, siempre que no exista alguna razón que impida la utilización de fijadores en el campo. En todas las muestras debe indicarse el fijador utilizado.

1.4.2. Superficies verticales de infraestructuras. Este tipo de muestreo es a menudo necesario en las tierras bajas y en los ríos navegables. Se recomienda muestrear a una profundidad de 30 cm. La manga de muestreo debe agitarse en el agua del río para liberar cualquier material enganchado antes de proceder al raspado. Debe rasparse una superficie equivalente a 10 cm2. La manga debe lavarse en un contenedor con agua del río. Debe repetirse la operación tres veces y juntar las tres réplicas.

1.4.3. Utilización de substratos artificiales. Es recomendable utilizar substratos con superficies heterogéneas y no superficies lisas (portaobjetos de vidrio). Deben mantenerse en el río el tiempo suficiente para que se establezca una comunidad madura (al menos 4 semanas), aunque el periodo dependerá de las condiciones ambientales. El tiempo de exposición deberá ser más largo por ejemplo en condiciones muy oligotróficas, bajas temperaturas o sombreado excesivo. Deben tomarse las precauciones precisas para evitar interferir con los usos normales del río y para evitar, en lo posible, el vandalismo. Es


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conveniente también colocar algunos substratos extra para compensar las posibles pérdidas por vandalismo, crecidas, etc. Cuando se empleen substratos artificiales deben colocarse siempre en las mismas condiciones, en la misma fecha y durante el mismo periodo de tiempo.

1.4.4. Macrófitos y macroalgas sumergidas. Recolectar cinco réplicas de la planta en bolsas de plástico y transportarlas al laboratorio, agitarlas violentamente en un vaso de precipitados con agua destilada para soltar las diatomeas adheridas. Retirar las plantas, dejar que sedimenten las diatomeas. Eliminar el sobrenadante. Alternativamente se pueden cortar de forma aleatoria algunos tallos de las plantas sumergidas, colocándolos en botes de muestreo. Los fragmentos se pueden seccionar más en el laboratorio, colocándolos directamente en los tubos de limpieza para proceder a la eliminación de la materia orgánica. Las algas filamentosas se pueden escurrir, recogiendo la suspensión resultante, que contendrá las diatomeas epífitas, en un bote.

1.4.5. Macrófitos emergidos. Este tipo de substrato sólo debe ser muestreado si hay porciones que están permanentemente sumergidas y no están contaminadas con el sedimento del fondo. Los tallos deben cortarse al nivel del agua. Colocar un bote de muestreo boca abajo en los tallos cortados y cortar hasta la boca del bote. Después girar el bote con el tallo dentro y cerrar. En el laboratorio liberar las diatomeas agitando o raspando con cuidado.

1.5. Pretratamiento previo a la observación

microscópica. 1.5.1.1. Fijación y tratamiento preliminar en el

laboratorio. Las muestras se deben transportar en oscuridad y a baja temperatura al laboratorio, dejándolas reposar 24 horas como mínimo para permitir que las diatomeas sedimenten y poder eliminar el sobrenadante. Como alternativa se puede centrifugar la muestra. Para eliminar los restos grandes de substrato o de plantas se puede utilizar primero un colador de cocina. La velocidad y el tiempo de sedimentación de todas las diatomeas (incluidas las formas más pequeñas) dependerá de las características de la centrífuga utilizada. Es conveniente hacer alguna prueba previamente para estar seguros de no eliminar las diatomeas de menor tamaño. Si no se añadió fijador en el campo debe hacerse ahora. Es recomendable realizar una observación preliminar de la muestra y anotar cualquier

característica observada, por ejemplo, la abundancia de frústulos vacíos. Siempre debe guardarse una parte de la muestra para el caso de que pueda ocurrir cualquier incidencia durante el proceso.

1.5.1.2. Métodos de limpieza de diatomeas. El peróxido de hidrógeno es el oxidante más utilizado y el más recomendado, pero otros métodos pueden dar buenos resultados (Anexo A). En aguas ricas en carbonatos o en hierro es recomendable utilizar clorhídrico diluido (HCl). 1.5.1.3. Montaje de las preparaciones permanentes. Diluir la suspensión de frústulos limpios para conseguir una concentración adecuada. Deben verse partículas finas en suspensión. Si la suspensión está más concentrada se puede diluir con agua destilada. La densidad puede comprobarse haciendo una preparación microscópica y observándola a x400. Si la suspensión está muy diluida puede concentrarse centrifugando. Nota: la dilución de la suspensión también se puede realizar con etanol, lo que facilita la dispersión homogénea sobre el cubreobjetos. Agitar el vial que contiene las diatomeas limpias. Utilizando una pipeta Pasteur limpia tomar una parte del líquido de la parte central del tubo. Depositar una gota o dos en un cubreobjetos redondo. Dejar que se evapore el líquido, dejándolo en un sitio caliente protegiéndolo del polvo, o calentándola suavemente en una placa calefactora. El resultado final debe ser una fina capa de color gris sobre el cubreobjetos. Seguir las instrucciones del fabricante en la utilización del medio de montaje. Una de las resinas más utilizadas es NAPHRAX. Asegurarse de que el medio alcanza los bordes del cubreobjetos. Dejar enfriar y observar al microscopio. La concentración ideal es aquella con la que se observan 10-15 valvas por campo x1000. Si la preparación es muy densa se debe repetir con una suspensión más diluida. Finalmente debe etiquetarse la preparación. Debe consignarse la localización, la fecha y cualquier código necesario que permita acceder al resto de la información necesaria.

2. PROTOCOLOS DE IDENTIFICACIÓN, RECUENTO E INTERPRETACIÓN DE MUESTRAS DE DIATOMEAS EPILÍTICAS DE RÍOS. 2.1. Requerimientos. - Equipo para registrar los recuentos de diatomeas: puede ser un formulario con una lista de taxones o


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un programa de ordenador preparado para la introducción directa de datos. - Guías de identificación e iconografía: adecuadas al ámbito de la zona de estudio. - Microscopio óptico: equipado con una platina mecánica y objetivos de gran aumento y de inmersión. Se recomienda el contraste de fases o el contraste interdiferencial. El microscopio debe estar preparado para hacer medidas (ocular micrométrico), con una resolución de 1 micrómetro como mínimo. Los equipos de captura de imagen pueden ayudar a registrar las especies difíciles y en la medida de la densidad de estrías. - Medios para verificar las especies difíciles. Se puede hacer de varias maneras: con dibujos, microfotografías de alta resolución, imágenes capturadas mediante video. Es también muy útil localizar el taxón en la preparación utilizando la escala Vernier del microscopio. - Pañuelo para limpiar las lentes. - Aceite de inmersión y aplicador. - Portaobjetos con escala micrométrica para calibrar el ocular micrométrico. 2.2. Criterios taxonómicos. Recientes debates sobre los fundamentos taxonómicos de las diatomeas han provocado la coexistencia de dos sistemas paralelos de nomenclatura. Es importante, cuando se utilizan las diatomeas para valorar la calidad del agua, realizar una identificación correcta eliminando la posibilidad de cualquier error. La mayoría de los índices de calidad requieren una identificación a nivel específico, aunque algunos pueden utilizar el nivel genérico o una mezcla de ambos niveles. Es recomendable utilizar la nomenclatura de la flora del área de estudio, aunque también se pueden utilizar las “checklist” nacionales o regionales. Cuando los convenios taxonómicos del índice difieren de los de la “checklist”, los del índice deben adaptarse. La nomenclatura definitiva a utilizar deberá ser establecida al comienzo del trabajo. Deben citarse siempre los autores para evitar problemas de confusión nomenclatural. 2.3. Determinación de los individuos para el recuento. Existen diferentes criterios para el recuento de las diatomeas, como utilizar la valva o el frústulo como individuo, o bien no distinguir entre valva y frústulo. El efecto que estos criterios puedan tener en el resultado final no ha sido evaluado pero los expertos creen que debe ser pequeño. No obstante, es importante que los criterios se clarifiquen por adelantado. En el caso de géneros como Navicula o Achnanthes no es posible distinguir con certeza

entre frústulos y valvas aisladas en todas las ocasiones. 2.4. Determinación del tamaño de la muestra. Una medida típica es contar entre 300 y 500 individuos, aunque dependiendo de los objetivos se pueden contar más o menos. Valores menores podrían carecer del rigor estadístico necesario para algunas aplicaciones. Debe indicarse por adelantado el número mínimo y máximo de individuos a contar de acuerdo con los objetivos de nuestro estudio. Pueden darse situaciones en las que la muestra esté dominada por un taxón cosmopolita o por uno que no esté incluido en el índice utilizado. En estos casos sólo los taxones que son relevantes para el índices contarán en el total establecido de individuos a contar. Sin embargo, los taxones no incluidos también deben contarse ya que pueden contribuir a aportar información útil para interpretar los resultados de los índices. 2.5. Preparación del microscopio. El ocular micrométrico, o cualquier otro aparato de medida debe calibrarse regularmente con ayuda de un porta con escala micrométrica. Una resolución de un micrómetro es adecuada para los análisis rutinarios. El segundo ocular puede estar equipado con una cuadrícula para ayudar en el recuento, que puede tener diferentes formas pero lo importante es que permita impedir contar dos veces el mismo individuo. Hay diferentes opciones para contar: - hacer transectos con desplazamientos horizontales o verticales en los que cada diatomea que pasa por una línea de la cuadrícula del ocular es identificada y contada. - identificar y contar todas las diatomeas visibles en un campo de visión y después desplazarse con un movimiento horizontal o vertical, o al azar, a un nuevo campo de visión. - se pueden utilizar los métodos al mismo tiempo para obtener el número preciso. En todos los casos se debe repetir el proceso hasta que se obtenga el número necesario para completar el recuento. El operador debe establecer criterios propios para definir situaciones en las que una diatomea no esté completa en el campo de visión. Es importante seguir el mismo criterio, sea el que sea, en todo el recuento. Es importante que los campos de visión de los diferentes transectos no se solapen en ningún caso. Si un recuento no se acaba en una misma sesión, es útil anotar la posición de cada eje utilizando la escala de Vernier, para asegurarse de


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no repetir el recuento en campos ya observados. Nota: se deben tomar precauciones cuando se utilizan diferentes microscopios, ya que las escalas de Vernier pueden ser diferentes. 2.6. Tratamientos de los frústulos rotos y las diatomeas no identificadas. Para evitar el riesgo de incluir fragmentos separados de valvas, debe decidirse el criterio a utilizar antes de iniciar el trabajo. Posible criterios: - incluir un individuo roto sólo si incluye aproximadamente 1/4 de la valva. - incluir un individuo si contiene al menos un extremo y la parte central de la valva. - excluir todos los individuos rotos. Nota 1: el segundo criterio es difícil de aplicar en los casos en que la especie no tiene un área central diferenciada. En este caso no se puede asumir que el número total de individuos es igual al número de extremos dividido por dos. Nota 2: la presencia de un número elevado de fragmentos puede indicar el arrastre de diatomeas de aguas arriba. Una diatomea puede ser no identificable por varias razones: que la diatomea esté en posición pleural, la imposibilidad de una visión clara o que se trate de un taxón desconocido para el identificador. Si hay un exceso de suciedad que oculta las valvas, es conveniente repetir la preparación utilizando suspensiones más diluidas para separar las diatomeas de la suciedad. Algunos taxones son identificables incluso en posición pleural porque incluso en esta posición tienen una visión característica (Rhoicosphenia abbreviata). No obstante, esto no siempre es posible y en caso de duda se deben contar las visiones pleurales al nivel más bajo posible (p.ej. Gomphonema o diatomea pennada en visión pleural). Este mismo criterio debe emplearse para cualquier otro individuo de la preparación que no pueda ser identificado. La existencia de un número elevado de individuos no identificados puede ser debida a un problema con la preparación o a los conocimientos del operador. La resolución a adoptar dependerá del método de evaluación propuesto. Algunos índices no precisan la identificación de todos los taxones. Se recomienda que el número de taxones no identificados no supere el 12% del total contado. 2.6. Procedimientos analíticos. a) Colocar la preparación en la platina del microscopio y anotar la información más importante en la hoja de recuento o el programa de ordenador. La información mínima recomendada es: número de muestra, nombre del río, localidad y fecha de muestreo, fecha del recuento y analista.

b) Seleccionar una buena posición de la preparación para comenzar. Se recomienda el margen, pero hay que asegurarse de que no existe “efecto margen” significativo (no hay una concentración de individuos mayor en el margen que en cualquier otro punto de la preparación). Nota 1: Si el recuento se hace por campos aleatorios, éstos se deben localizar utilizando las escala de Vernier y una lista de números generados aleatoriamente. c) Identificar todos los individuos presentes en el primer campo de visión utilizando un objetivo de gran aumento. Utilizar el mecanismo de enfoque para diferenciar entre una valva y un frústulo intacto. Si la unidad básica es la valva, un frústulo son dos unidades. Nota 2: Un frústulo intacto tiene dos planos de enfoque donde las estrías, el rafe y otras estructuras son claramente visibles. Debe utilizarse con cuidado el mecanismo de enfoque para observar la diferencia. Además un frústulo intacto tiene propiedades ópticas diferentes de una valva sola. Nota 3: si se encuentran diatomeas formando filamentos cada individuo debe ser contado por separado. Si el número de filamentos observados es elevado sería conveniente repetir la preparación con agentes oxidantes más agresivos. d) Si un individuo no se puede identificar deben tomarse fotografías, imágenes digitales o dibujos detallados. Debe describirse el taxón: forma y dimensiones de la diatomea, densidad de las estrías, forma y medida del área central, número y posición de los estigmas y detalles de la terminación de la rafe. e) Una vez que han sido identificados y contados todos los individuos de un campo, el recuento debe continuar hasta obtener el número de individuos preciso. f) En algunos casos puede interesar continuar el recuento y la identificación de individuos después de obtener el número requerido y considerar los restantes taxones como presentes. Hacer un recorrido con un objetivo mediano (x 400) puede permitir observar los taxones grandes (Gyrosigma) que pueden obviarse con aumentos mayores. g) Al final del recuento debe quitarse la preparación de la platina y limpiar el aceite de inmersión del objetivo y de la preparación. h) En los casos en que hay una especie muy abundante, una vez finalizado el recuento, calcular la proporción de la especie dominante y continuar contando teniendo en cuenta todos los taxones menos el dominante. Continuar contando hasta volver a llegar al cómputo máximo sumando todos los taxones a excepción del dominante. Después se recalcula el valor del taxón dominante en función de la proporción calculada inicialmente.


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Nota 4: Por ejemplo si Cocconeis placentula representa 200 unidades de un total de 300, habría que utilizar el procedimiento comentado anteriormente, continuando el recuento de los otros taxones hasta llegar a un total de 300 y después incrementar el valor de Cocconeis placentula con un factor de 3 con el objetivo de reflejar su abundancia real en la muestra. 2.7. Registro de datos, preparaciones y muestras. Las preparaciones de diatomeas se pueden guardar permanentemente, lo que permite revisar los resultados en el futuro. Por eso, es importante conservar las preparaciones de forma correcta, por ejemplo en algún herbario. Las preparaciones deben estar etiquetadas con un código que permita identificarlas inequívocamente en una base de datos que contenga otros datos de la localidad: coordenadas geográficas, datos químicos, hidrológicos... La suspensión de frústulos limpios también se debe etiquetar y guardar para permitir hacer nuevas preparaciones en caso necesario. Para prevenir el crecimiento microbiano o la disolución química de los frústulos debe utilizarse un fijador como etanol o formol. Se recomienda también conservar las muestras fijadas por si fuese necesaria alguna comprobación. 2.8. Interpretación de los datos. 2.8.1. Utilización de índices. La mayor parte de los índices se basan en la abundancia relativa de los taxones presentes en la muestra. Muchos de ellos se han desarrollado para su uso en un área concreta, pero comprobaciones posteriores han mostrado que algunos tienen una validez más amplia. Antes de utilizar cualquier índice es recomendable hacer una evaluación previa del mismo.

Los índices no sirven para evaluar cualquier algunos tipos concretos de contaminación (metales pesados). 2.8.2. Comparación con las condiciones de referencia. Para evaluar el grado de la alteración ambiental de un lugar es preciso compararlo con los datos de referencia.

Los datos de referencia representan la comunidad natural esperada en el lugar en ausencia de alteraciones antrópicas significativas. De momento no se ha desarrollado ningún método para efectuar la evaluación con diatomeas bentónicas. 3. Obtención de resultados y adaptación a los ríos catalanes. Introducir los datos en el programa OMNIDIA para obtener los valores de los índices que calcula el programa, siguiendo las instrucciones del programa para su utilización. De todos los índices que proporciona el programa se toma el índice IPS como indicador de la calidad biológica del agua en los ríos catalanes. Este índice varía del 1 al 20, siendo 1 el valor que indica la peor calidad y 20 la mejor. El rango de valores se divide en cinco categorías no equivalentes:

Es preciso ajustar el valor del índice en algunas ecorregiones: - en las cabeceras calcáreas el valor más alto que se puede alcanzar es de 18. El rango entonces iría de 17 a 18 (calidad excelente). El resto de categorías quedaría igual. - el valor máximo que alcanza el índice en tramos medios de ríos grandes es 18. El rango en estos casos también oscilaría de 17 a 18, como en el caso anterior. El resto de las categorías quedaría igual. - en los tramos bajos el valor máximo alcanzado es de 13. Se dispone de pocos puntos situados en estos tramos por lo que es más difícil reescalar el índice. 4. Frecuencia del seguimiento. Se recomienda una frecuencia de un mínimo de dos muestreos anuales: uno en la época de mínimo caudal y otro en primavera. Para las estaciones de referencia se propone un único muestreo anual. ((Original catalán facilitado por Jaume Cambra. Traducción del original catalán de M. Aboal))

Color Calidad Muy buena Buena Mediocre Mala Muy mala Valor índice 20= 17? 17>13? 13>9? 9>5? 5<?


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Los resultados obtenidos en cualquier estudio dependen, en buena medida, de una correcta aplicación metodológica. En esta nota tratamos de repasar todos los procesos de manipulación que realizamos sobre las muestras de fitoplancton, desde su recolección en el sistema acuático, hasta la obtención del listado de organismos con sus datos poblacionales, destacando aquellas secuencias del proceso que, a nuestro juicio, pueden ser fuente de algunos errores. Obtención de las muestras

El grado de exactitud que obtengamos en el conocimiento del sistema dependerá de la planificación de la campaña de recogida de muestras. Si bien tradicionalmente se ha asumido la homogeneidad del fitoplancton de los ambientes continentales, no toda la masa de agua presenta las mismas características físicas ni químicas, por lo tanto sus poblaciones de algas pueden variar. Un primer paso importante es planificar el muestreo. Se tratará de localizar, en nuestro sistema, las principales fuentes de variación que produzcan algún tipo de heterogeneidad que puedan afectar a la distribución de las poblaciones: - La heterogeneidad horizontal es especialmente patente en aquellos sistemas que presenten flujo de agua (embalses y lagos abiertos), donde se deberán tomar, al menos dos muestras, una próxima a la zona de aguas estancadas y otra próxima a la zona de entrada. Amplias zonas litorales con y sin vegetación, tipo de sustrato, influencia de actividades antrópicas, etc, también pueden contribuir a la heterogeneidad de la masa de agua. - La heterogeneidad vertical es especialmente patente en aquellos sistemas profundos y estratificados, en los cuales se deberán tomar muestras de superficie, y a distintos niveles de extinción de la luz.

En cada punto de muestreo se pueden obtener dos tipos de muestras: - Muestras directas.- Se obtendrán sin alterar la concentración y proporciones celulares presentes en el medio. Los recuentos celulares se llevarán a cabo sobre muestras directas o de sedimentación,

las cuales se recogerán bien con botellas específicas para este fin (van Dorn, Niskin, etc.) o bien mediante bomba peristáltica. Las muestras obtenidas se guardarán en frascos de cristal (nunca de plástico) de color topacio y de una capacidad próxima a los 100 ml. Siempre que sea posible se conservaran en frío hasta su fijación. - Muestras de arrastre.- Se tomarán mediante redes de fitoplancton, las cuales deberán ser de un tamaño de poro comprendido entre 10 y 25 µm. En aguas oligotróficas, generalmente pobladas por especies pequeñas, se utilizarán redes de 10 µm, mientras en aquellas eutróficas (aguas verdes, pardas o marrones) se deberán utilizar redes de mayor diámetro de poro para evitar su rápida obturación. Dependiendo de los objetivos de nuestro trabajo, los arrastres podrán ser horizontales y/o verticales. Fijación de las muestras

Se llevará a cabo de forma inmediata, tras la recolección del material. La fijación de las muestras debe perseguir dos objetivos, por una parte una correcta conservación y por otra parte resaltar (o no ocultar) aquellos caracteres taxonómicos que nos permitan el reconocimiento de los organismos. Las muestras de arrastre se fijarán con formaldehido (hasta una concentración final próxima al 4%.). Es recomendable calcular la cantidad de fijador a añadir para evitar un exceso del mismo, ya que es tóxico y de penetrante olor (muy molesto cuando se manipula la muestra en laboratorio).

Las muestras de sedimentación se deben fijar con una solución de yodo iodurado (lugol), al igual que en caso anterior es recomendable cuantificar la cantidad a añadir para evitar un exceso de coloración de las células. Una mezcla de lugol (∼ 2 ml) y formaldehido (∼ 0.5 ml) suele realizar una adecuada fijación para el reconocimiento estructural, estas muestras se deben guardar en frío y revisar su fijación periódicamente. Determinación taxonómica

La determinación taxonómica debe ser previa al proceso de censo de las algas fitoplanctónicas. Para llevar a cabo la

Metodología para el estudio taxonómico y ecológico del fitoplancton de las aguas continentales Pedro Sánchez Castillo

Departamento de Botánica – Facultad de Ciencias Universidad de Granada

18071 – GRANADA [email protected]


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determinación se usarán las floras generales de mayor difusión, bien a nivel genérico (Bourrelly, 1966-1970; Margalef, 1957; Wehr & Sheath, 2003) o específico (Ettl, 1985-2005; Huber-Pestalozzi, 1932-1983) así como aquellas monografías que faciliten la más adecuada determinación específica o genérica (dependiendo de nuestros objetivos). Para determinar las especies presentes se utilizarán tanto las muestras de sedimentación como los arrastres horizontales y/o verticales. Además de la observación de los caracteres taxonómicos es preciso realizar una adecuada cuantificación biométrica, la cual se deberá llevar a cabo sobre 20-30 individuos. Cuando la distancia al laboratorio lo permita, se mantendrá una muestra viva para su observación “in vivo”. La observación de los organismos vivos (especialmente su coloración) puede resolver muchas dudas taxonómicas (y ofrecernos momentos de gran fascinación).

Determinados grupos de algas precisan de un tratamiento específico para la observación de los caracteres taxonómicos, como son las diatomeas. Se trata de realizar una combustión de la muestra con un agente oxidante, tras la cual se llevará a cabo una centrifugación y posterior montaje en resina de alto índice de refracción. Es conveniente realizar tratamientos individualizados de las diferentes muestras donde observemos diatomeas, lo que nos permitirá comprobar la existencia de una o varias especies, casi imposibles de diferenciar en muestras de sedimentación. Sedimentación y recuento de las muestras

Se llevará a cabo en microscopio invertido mediante el uso de cámaras compuestas de Utermöhl (base con cubreobjetos enroscable y columna desmontable), cuyo volumen dependerá del grado de concentración celular de la muestra, desde 2,5 ml hasta 100 ml. En ambientes fuertemente hipertróficos se procederá a una dilución de la muestra o a la utilización de hematocitómetros. El tiempo de sedimentación estará en relación con la altura de la columna, estableciéndose como regla general un tiempo (en horas) equivalente a tres veces la altura de la cámara (en centímetros). Nos debemos asegurar que la superficie sobre la que se sitúa la muestra no esté inclinada, ya que la inclinación produciría una sedimentación sesgada. Cuando existan especies formadoras de flores de agua, las muestras se someterán a una pequeña presión (en el interior de una jeringa del volumen adecuado) para facilitar el colapso de las vacuolas de gas, posibilitando de este modo su sedimentación y observación.

Una vez transcurrido el tiempo adecuado se realizará el recuento celular que nos permitirá calcular el censo de las diferentes poblaciones. La

enumeración de las células se puede llevar a cabo mediante el recuento total de la cámara o mediante métodos más rápidos (seleccionando parte de ella: campos al azar o transectos). En cualquier caso, este proceso se llevará a cabo teniendo en cuenta una serie de precauciones, las cuales evitarán algunos errores en la estimación de las poblaciones: - Efecto de los bordes.- La distribución celular en la mayor parte del fondo de la placa se realiza al azar, a excepción de los márgenes donde se manifiesta el denominado efecto de los bordes, que consiste en un incremento del proceso de sedimentación debido a la proximidad de las paredes. - Recuentos diferenciales.- Sobre la superficie de la placa se deben hacer al menos dos recuentos diferentes. Uno se realizará para contar los organismos de mayor tamaño (claramente diferenciables con los objetivos de menor tamaño: 4x ó 10x). El otro se realizará para cuantificar aquellos otros de menor tamaño, no claramente discernibles a pocos aumentos, cuya enumeración se realizará con el objetivo 40x ó 100x, dependiendo de sus tamaños. - Contabilización de especies multicelulares (tricomas, cenobios, colonias).- Además de conocer el número de agrupaciones, es de interés saber que número de células las forman, por lo que junto a cada individuo contabilizado anotaremos el número de células que lo componen. - Recuento de la especie más abundante.- Para que el error estadístico sea asumible se ha de contar entre 100 y 400 individuos de la especie más abundante. Cálculo de los resultados

Para llevar a cabo el censo de cada una de las especies detectadas (campos al azar), podemos utilizar la siguiente expresión: Nº de células/ml = Nº de células x Superficie de la cámara Nº de campos x Superficie del campo x Vol. muestra Si deseamos expresar nuestros resultados teniendo en cuenta el tamaño de los individuos censados, el método de cálculo más utilizado es aproximar la forma de la célula a un cuerpo geométrico. Cuando la forma celular es relativamente compleja podemos utilizar la combinación de varios cuerpos geométricos. Por el mismo método podemos calcular otros parámetros de interés ecológico y que también pueden tener una aproximación geométrica como son la superficie celular y la relación superficie/volumen. A partir de los biovolúmenes individuales se puede obtener un dato de gran interés ecológico, el biovolumen densidad (BD):


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BD = Volumen medio celular x densidad celular Su expresión como biomasa responde a la consideración de que la densidad física de las células de las microalgas es próxima a 1, por lo que ambos términos serían equivalentes. Conservación de las muestras en ficoteca

El sedimento contado, junto al resto de la muestra no utilizada, se podrá volver a fijar con formol y guardar en un tubo de ensayo (de vidrio) de pequeño tamaño (~ 10 ml). Se taponará y sellará con cinta aislante y una vez etiquetado y/o numerado pasará a formar parte de nuestra colección de muestras. Esta ficoteca, además de constituir una base científica de gran interés, es un instrumento de consulta para la resolución de problemas que se presenten en futuras determinaciones.

Del mismo modo, todas aquellas preparaciones permanentes, sobre todo las de diatomeas, se deberán conservar con la misma finalidad que la antes comentadas para las muestras líquidas. Cada centro de investigación en ficología o limnología debería conservar sus muestras en ficoteca, ya que esta constituye el registro científico de sus datos publicados, además de ser fuente de consulta en trabajos taxonómicos de ámbito más general. APÉNDICE TAXONÓMICO

Las diferentes especies que forman parte del fitoplancton se pueden englobar en tres tipos biológicos claramente diferenciados: cocales, flagelados y filamentosos. Diferentes grupos taxonómicos han desarrollado especies que responden al mismo tipo biológico. A continuación se ofrece una clave básica para la diferenciación de los distintos grupos taxonómicos de mayor representación en el fitoplancton. Cuando se alude a coloración, siempre se refiere a la coloración en muestras fijadas con lugol. I. Algas filamentosas. - Filamentos formados por células de pequeño tamaño, donde es imposible diferenciar el cromatoplasma, o bien células de mayor tamaño con clara estructura procariota…….Oscilatoriales y Nostocales (Cyanoprokaryota) - Filamentos eucariotas, con clara diferenciación de orgánulos:

¤ Filamentos formados por células que no presentan una patente tinción con el lugol. Células unidas por sus ápices o por sus lados o por sus vértices................Diatomeas

¤ Filamentos con células claramente teñidas por el lugol, dando una coloración claramente marrón.......................Ulotricales

II. Algas flageladas, generalmente con envoltura celular delgada o estrangulación transversal patente. En ocasiones los flagelos desaparecen con la fijación, entonces envoltura celular, heteropolaridad y vacuolas son importantes caracteres diagnósticos: - Células con estrangulación transversal (cíngulo), sulcus menos patente, pared celular rígida (teca) o no. Coloración rojiza o marrón.................Dinofíceas - Células de morfología piriforme, globosa, elipsoidal o irregular, presentando 1, 2 ó 4 flagelos:

¤ Células irregulares, lenticulares con estriación manifiesta, o rodeadas por una lórica no transparente. Un flagelo y citoplasma de color rojizo, con gránulos (paramilon) diferenciados.....Euglenofíceas ¤ Células de morfología más o menos regular, redondeadas o elipsoidales:

♦ Células poco teñidas (amarillentas), tinción nunca de color marrón intenso:

◘ Flagelos en número de (1 ó) 2 de diferente tamaño. A veces cubiertas por lóricas transparentes y en ocasiones formando agrupaciones..................Crisofíceas ◘ Flagelos en número de 2, del mismo tamaño, con una estructura filiforme (haptonema), recta o enrollada, situada entre los dos flagelos...........................Haptofíceas

♦ Células fuertemente teñidas, de color marrón intenso:

◘ Células elipsoidales, con 2 flagelos casi iguales y de inserción subapical. Citoplasma o pirenoide fuertemente teñido.......Criptofíceas ◘ Células de morfología variable (globosa, discoidal, elipsoidal, piriforme o fusiforme), 2 ó 4 flagelos de inserción apical. Aisladas o en agrupaciones:

╩ Células con 2 flagelos dispuestos a partir del ápice o de una papila. Células aisladas o en agrupaciones.......Volvocales ╩ Células con 1 (ó 2) flagelos, si son 4 se desarrollan a partir de una depresión apical.................Prasinofíceas


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III. Algas cocales, bien aisladas o bien formando agrupaciones de morfología relativamente sencilla, a veces con vainas o paredes maternales dilatadas: - Cromatoplasma homogéneo o únicamente interrumpido por inclusiones o vacuolas de gas, tinción variable. Células aisladas o formando agrupaciones de diferente morfología.............Croococcales (Cyanoprokaryota) - Cloroplastos claramente diferenciados, uno o varios por célula. Pirenoides ausentes o presentes:

¤ Células poco teñidas, pirenoides ausentes o poco teñidos:

♦ Pared bivalva, valvas persistentes tras la muerte de la célula. Visiones valvar y comisural diferenciadas...................Diatomeas ♦ Pared celular normal, inclusiones lipídicas, formas pedunculadas frecuentes.......................Xantofíceas

¤ Células fuertemente teñidas, pared celular bien estructurada:

♦ Células sin división interna, reproducción mediante autosporas o bipartición....................Clorofíceas ♦ Células divididas en semicélulas simétricas (hemisomas), prolongaciones celulares frecuentes, reproducción por bipartición........................Zigofíceas

Bacterias y picoplancton autótrofo (PPA) (Hobbie et al., 1977; Weisse, 1988)

Obtención de la muestra

La misma muestra sirve para el recuento de bacterias y de PPA. Utilizamos botellas (botes) de 50-60 ml de plástico a las que añadimos 2 ml de formol al 40% en el laboratorio y rellenamos en el campo con la muestra de agua hasta 50 ml. Importante: debe llenarse únicamente hasta 50 ml. de muestra (utilizar la graduación del bote o botellita si la tiene, o hacer una marca en la altura que se corresponda con los 50 ml.) para que se mantenga la concentración final de formol al 1-2%.

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Wehr, J. & R. Sheath. 2003. Freshwater Algae of North America. Academic Press. Amsterdam. Debe anotarse la cantidad de formol añadido para posteriormente hacer la corrección del volumen de fijador añadido sobre la concentración celular final. Igualmente, debe enroscarse fuertemente la tapa del bote-botellita para que no se salga el formol durante el muestreo y tomar las precauciones necesarias en la manipulación del bote a la hora de llenar la muestra.

Deben mantenerse las muestras en la nevera, a ser posible, hasta el momento de su análisis. Si no se dispone de refrigeración, al menos deben situarse en la oscuridad porque la luz

Metodología para el estudio taxonómico y ecológico de picoplancton y plantas de las aguas continentales, la elaboración de catenas vegetales y la estimación de la biomasa

Miguel Álvarez Cobelas Centro de Ciencias Medioambientales – C.S.I.C.

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disminuye la fluorescencia del picoplancton autótrofo. Recuentos del bacterioplancton - Filtración y tinción con naranja de acridina: todo el material utilizado en esta técnica será de uso exclusivo debido a la toxicidad del colorante utilizado. Hay que utilizar guantes, pero, sobre todo, evitad que el colorante entre en contacto con objetos no deseados. 1º) Montar la torreta de filtración con un filtro Nucleopore (GTBP 02500, Millipore; están teñidos de negro) de 0,2 µm de diámetro de poro y acoplarla al sistema de vacío (la torreta debe estar perfectamente horizontal para que la distribución de las células sea lo más homogénea posible). 2º) Añadir un chorrito de agua destilada prefiltrada por 0,2 µm a la que se le ha añadido formol (1% concentración final). 3º) Agitar convenientemente la botella de la muestra antes de tomar una alícuota. 4º) Añadir el volumen de la muestra apropiado (variable dependiendo del origen de la muestra; entre 250 y 500 µl en la mayoría de los casos) con una pipeta automática. La punta de la pipeta es siempre la misma para las distintas muestras y se ha de lavar varias veces con agua destilada y dos ó tres veces con la muestra siguiente cada vez que cambiamos de muestra. 5º) Añadir el colorante: nosotros ponemos 80 µl de Naranja de Acridina al 0,1% (solución “stock” guardada en nevera en frasco oscuro) con una pipeta automática (de hasta 250 µl). 6º) Añadir otro chorrito de agua destilada prefiltrada para que haga turbulencias y se mezcle todo bien (aunque con cuidado para que no salpique fuera, porque el naranja de acridina tiñe y es tóxico). 7º) Esperar dos minutos. 8º) Aplicar el vacío suavemente. Cuando haya filtrado todo el agua, se retira el filtro Nucleopore con unas pinzas Millipore de bordes esmerilados, dejando que se seque sobre un papel de filtro. Hay que evitar que le incida directamente la luz (los dejamos secando dentro de una caja de cartón). 9º) Cuando el filtro esté seco (unos 10 min aprox.), hay que montarlo sobre un portaobjetos. Colóquese en la parte central del porta una gota de aceite de inmersión y, sobre ella, depositar el filtro. Añádase una nueva gota de aceite sobre el filtro (sin que el gotero toque el filtro), colocando suavemente el cubreobjetos. En el borde esmerilado del portaobjetos se debe rotular el nombre de la muestra y el volumen filtrado. 10º) Deben guardarse los filtros en refrigeración hasta el momento de su observación al microscopio. Nosotros utilizamos una caja de preparaciones que guardamos en vertical; así, las

preparaciones se mantienen verticales, para evitar que el aceite se salga de la preparación por gravedad. 11º) Por último, hay que recoger los residuos (puntas, agua, etc,) del naranja de acridina en contenedores apropiados para su posterior eliminación como residuo tóxico. - Observación de las bacterias teñidas al microscopio de fluorescencia: 1º) Debe utilizarse un microscopio de epifluorescencia. Dependiendo de la marca y del modelo del microscopio, los filtros tienen distintas nomenclaturas. El “set” de excitación debe ser blue waveband de 470-500 nm. 2º) Aseguraos de que la lámpara UV no haya sido apagada recientemente antes de volver a encenderla porque podría dañarse el aparato. Anotar la hora de comienzo de la utilización de la lámpara. 3º) Enfocad la preparación con luz visible y, una vez enfocada, cambiad a la luz visible por la ultravioleta. 4º) Recontad tantos campos (el campo para nosotros es el área total de la cuadrícula ocular) como haga falta para llegar a 400 células, lo cual nos dará un error de recuento del 10%. Anotad el número de campos recontados. 5º) En principio, la mayoría de las células se ven de color anaranjado, pero, además, pueden aparecer algunas de color verdoso, las cuales se incluirán también en el recuento total. La variación de color se debe al tipo de ácido nucleico, de doble o de simple cadena, en el que se intercala el naranja de acridina. Si hay morfologías muy diferentes, debe intentarse recontar por separado. 6º) Fijad previamente un criterio con aquellas células que quedan en el límite de la cuadrícula (por ejemplo: contad las que estén sobre dos de los bordes y no contéis las que estén sobre los otros dos bordes). Precaución: Evitad que el aceite de inmersión de la preparación (que está en contacto con el naranja de acridina) manche el microscopio. 7º) Apagad la lámpara ultravioleta, anotando la hora de apagado para información del siguiente usuario. - Cálculo de la densidad celular: el número de microorganismos por ml se estima utilizando la siguiente fórmula:

Cel/ml = (c * Af / (Ac * V * n * F) ) - celPPA/ml c: nº total de células recontadas (400 o más). Af :Área de filtración en mm2 (calculado a partir del diámetro de la mancha que deja la torreta de filtración sobre el filtro; determinadla utilizando un filtro blanco y tinta azul, por ejemplo).


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Ac : Área de la cuadrícula ocular en mm2, que es el campo observado. V : volumen de muestra filtrada en ml. n : nº de campos recontados. F: Factor de corrección del volumen de fijador utilizado (por ejemplo, si añadimos 2 ml de formol a 50 ml de muestra, el factor de conversión es 0,96). celPPA/ml: descontar el nº de células del picoplancton autotrófico, porque en la tinción también habremos teñido las células del PPA. - Estimación de la biomasa: la estimación de los biovolúmenes y el cálculo de la biomasa se pueden hacer de modo análogo a las del fitoplancton. Los biovolúmenes celulares de bacteriras pueden calcularse mediante análisis de imagen, si se dispone de él, o –en su defecto- pueden medirse la longitud y la anchura de las células mediante un pie de rey en fotografías ampliadas de las preparaciones microscópicas. Es necesario fotografiar un micrómetro objetivo para tener una referencia del tamaño real. Las formas geométricas a las que más habitualmente se asemejan las bacterias son la esfera para los cocos y un cilindro acabado en dos hemiesferas para los bacilos. Si se desea calcular la biomasa en carbono, una aproximación útil es la de Bratbak (1985):

1 µm3 = 0,22 pg C Recuentos del picoplancton autótrofo - Filtración: el método de filtración es básicamente el mismo que para las bacterias con la salvedad de que en este caso no se usa ningún colorante sino que las células se observan a partir de su autofluorescencia. 1º) Montad la torreta de filtración con un filtro Nucleopore (GTBP 02500, Millipore; están teñido de negro) de 0,2 µm de diámetro de poro y acopladla al sistema de vacío. La torreta debe estar perfectamente horizontal para que la distribución de las células sea lo más homogénea posible. 2º) Añadid un chorrito de agua destilada prefiltrada por 0,2 µm y fijada con formol (1% concentración final). No es absolutamente necesario porque es extraño que crezca PPA en el agua destilada. 3º) Agitad convenientemente la botella de la muestra. 4º) Añadid el volumen de la muestra apropiado (muy variable dependiendo del origen; aprox. 5-10 ml con una pipeta automática.). Es raro que pase un volumen mayor a través del filtro porque las bacterias obstruyen en filtro. La punta de la pipeta es siempre la misma para las distintas muestras y se ha de lavar varias veces con agua destilada y dos ó tres veces con la muestra siguiente cada vez que cambiemos de muestra. En algunos casos, si hay mucho fitoplancton grande se puede prefiltrar

la muestra por malla de Nytal de 15µm, eliminando así los organismos más grandes y facilitando la filtración. 5º) Añadid otro chorrito de agua destilada prefiltrada para que haga turbulencias y se mezcle todo bien. 6º) Aplicad el vacío suavemente. Cuando haya pasado todo el agua, retirad el filtro Nucleopore con unas pinzas Millipore y dejad que se seque sobre un papel de filtro. Debeis evitar que le incida directamente la luz. 7º) Cuando el filtro esté seco (unos 10 min aprox.), montadlo sobre un portaobjetos. Colocad en la parte central del porta una gota de aceite de inmersión y, sobre ella, depositad el filtro. Añadid una nueva gota de aceite sobre el filtro (sin que el gotero toque el filtro) y colocad suavemente el cubreobjetos. En el borde esmerilado del portaobjetos rotulad el nombre de la muestra y el volumen filtrado. 8º) Guardad en refrigeración hasta el momento de su observación al microscopio de la manera indicada en el apartado dedicado al bacterioplancton. - Observación al microscopio: es preciso utilizar un microscopio de epifluorescencia. Dependiendo de la marca y del modelo los filtros tienen distintas nomenclaturas. Aseguraos de que la lámpara ultravioleta no haya sido apagada recientemente antes de volver a encenderla porque podría dañarse el aparato. Anotad la hora de comienzo de la utilización de la lámpara. 1º) Enfocad la preparación con luz visible y, una vez enfocada, cambiad a la luz ultravioleta, utilizando un filtro violeta-azul (400-500 nm). Las células eucariotas y las proclorofitas fluorescen de color rojo intenso. Las cianobacterias que poseen ficoeritrina I emiten una coloración amarillo-anaranjada brillante. Contad las células que se iluminen sin cambiar el campo. Una vez realizado ese recuento, cambiad al filtro verde-amarillento (520-560 nm) y se iluminarán en rojo las cianobacterias con ficocianina y en anaranjado las que poseen ficoeritrina II. 2º) Recontad tantos campos (cuadrícula ocular) como haga falta para llegar a 400 células en total para cada filtro de fluorescencia y coloración celular. Anotad el número de campos recontados. 3º) Fijad previamente un criterio con aquellas células que quedan en el límite de la cuadrícula. 4º) Apagad la lámpara UV, anotando la hora de apagado para información del siguiente usuario. - Cálculo de la densidad celular: el número de microorganismos por ml se estima de la forma indicada en el apartado de las bacterias (usando,


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claro está, únicamente el primer término de la fórmula). - Estimación de la biomasa: si el picoplancton autótrofo tiene igual o menos de una micra de diámetro, entonces puede usarse el mismo método que para las bacterias. Si su tamaño fuera superior, seguiríamos los criterios usados para el fitoplancton.

Recolección de plantas (Moore, 1986; Bridson & Forman, 1998)

Todos los organismos son indicadores de

las condiciones en que viven. La denominación de una planta con un nombre latino no supone sólo el mero nombre científico. Tras él, hay toda una biología del organismo en cuestión que refleja las condiciones en las que le es posible la vida a ese ser vivo. Por lo tanto, es fundamental una buena recolección de las plantas para poder identificarlas y, a partir de esa identificación, deducir las principales características ambientales del hábitat donde residen. Fundamento

Una recolección correcta es la base de la botánica, es la base de la biología vegetal. Por otro lado, todas las normativas de conservación ambiental se basan en la correcta identificación de distintos especímenes vegetales y animales, para lo cual su recolección debe ser la mejor posible. Material y método

La recolección se debe hacer por hábitats. Para ello: 1º) Deben delimitarse a grandes rasgos los hábitats principales presentes en un ecosistema acuático y en su entorno. A menudo, es difícil señalar dónde empieza y dónde termina un ambiente acuático porque los niveles del agua son muy cambiantes, sobre todo en ambientes mediterráneos. 2º) Dentro de cada hábitat hídrico (zonas de borde o ecotono, aguas permanentes profundas, aguas permanentes someras, zonas de oscilación hídrica estacional, etc.) se toman varias muestras de cada especie existente dentro de las distintas formaciones vegetales presentes. De cada individuo se incluirán raíz, tallo, hojas, flores y frutos. 3º) En las zonas más profundas, en las que no puede accederse fácilmente, pueden utilizarse pequeños ganchos atados a un lastre y una cuerda suficientemente larga. Se arroja este artilugio al agua y una vez hundido se arrastra varias veces desde la orilla o desde la barca.

4º) Se seleccionan las plantas que estén en mejor estado, pero siempre tomando ejemplares de todas las supuestas especies presentes. 5º) Cada ejemplar, eliminando lo más posible la tierra y otras adherencias y el agua, se dispone dentro de un pliego de papel absorbente, de tamaño A-3 o similar. Se coloca convenientemente para que luego puedan observarse fácilmente los caracteres morfológicos. No es conveniente que los pliegos estén muy llenos porque luego es más difícil la observación. En el caso de plantas grandes se cortan las partes más representativas, ya que no es necesario preparar toda la planta. Si fuera necesario se emplearían dos pliegos para la misma planta. En el caso de las plantas acuáticas más delicadas es conveniente colocarlas encima de una cartulina, operación que puede realizarse en la superficie del agua, extendiendo la planta con cuidado sobre la cartulina mojada. Las plantas acuáticas es conveniente prepararlas en el momento de su recolección, y una vez preparadas se meten en una prensa de campo. En el caso de los carófitos es preferible mantenerlos en medio líquido para poder identificarlos fácilmente. Para ello se guardan en bolsas de plástico o botes con algo de agua a la que se añade un chorrito de conservante compuesto por 8 partes de alcohol etílico y una parte de glicerina. 6º) Se redacta una etiqueta con la siguiente información: nombre del recolector, fecha (día-mes-año), lugar de recolección, nombre tentativo (si se supone alguno). 7º) Como las plantas suelen tener un gran contenido en agua, es conveniente cambiar los pliegos de papel en varias ocasiones durante los días subsiguientes. 8º) Una vez secas por completo las plantas, se dispone cada una con su etiqueta en el pliego definitivo y, cuando se identifican se le asigna un nombre latino con su autor correspondiente y el nombre del botánico identificador. 9º) Algunas claves básicas para la determinación de plantas acuáticas son las de Moore (1986) y Comelles (1985) para los carófitos y la de Haslam et al. (1975) para las plantas superiores. 10º) Paralelamente a la recogida, se anotan en un cuaderno las características ambientales de la formación vegetal de la que se han tomado especímenes para su clasificación. Por ejemplo: altura del agua, distancia a la orilla, contaminación “de visu”, animales presentes, tipo de agua, tipo de sedimento, etc.


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Elaboración de catenas vegetales (Braun-Blanquet, 1979; van den Berghen, 1982)

Las especies vegetales se disponen a

menudo en el paisaje a lo largo de gradientes, el más conocido de los cuales es el altitudinal. El agua no es una excepción, pues puede determinar un gradiente de hábitats desde las aguas permanentemente estancadas y profundas hasta zonas donde la influencia del agua sea prácticamente nula y las plantas accedan a ella gracias a un gran sistema radicular. A lo largo de ese gradiente, se sitúan las distintas especies de plantas superiores en un lago, río o humedal. Esa disposición de las plantas en gradiente se denomina “catena de vegetación”. Fundamento

El fundamento es muy simple: el gradiente abiótico hídrico implica una cadena de distintas especies vegetales. Material y método

Es recomendable efectuar el dibujo de catenas en dos épocas del año distintas: con agua al máximo y con agua al mínimo de inundación. Se procederá como sigue: 1º) Se trazará una línea recta imaginaria desde la zona nunca inundable del humedal, lago o río hasta el centro del mismo. 2º) Se cartografiarán las principales formaciones vegetales existentes a lo largo de dicha línea imaginaria, indicando la anchura aproximada que ocupa cada una. La multiplicación de dicha anchura por la longitud aproximada de la formación nos dará la cobertura de la misma. 3º) Se anotará la altura que alcanza el agua en el centro de cada formación vegetal. 4º) Se elaborará un dibujo a escala de cada catena. Esta elaboración a escala permitirá luego una cuantificación de la catena, si se desea. Y si esa cuantificación se hace porcentual referida al total del gradiente, podrán compararse cuantitativamente las catenas de distintas localidades y ecosistemas.

Estimación de la biomasa vegetal (Westlake, 1969)

La cobertura de una especie en un

ambiente determinado es un indicador útil del espacio que ocupa, pero es fácil entender que una misma especie alcanzará diferentes biomasas para la misma cobertura según sea la magnitud de las variables ambientales que condicionen su crecimiento. La biomasa de una especie es, por lo tanto, el aspecto de su biología que mejor se

relaciona con las condiciones ambientales. Ese es el interés de su determinación. Fundamento

La inmensa mayoría de las plantas superiores crecen enraizadas en el suelo o en el sedimento. La determinación de la biomasa de cada especie vegetal debe realizarse, por lo tanto, por unidad de superficie. Material y método 1º) Dependiendo del tamaño de los individuos y de las manchas que formen esos individuos, se fabricará un cuadrado de madera o de metal. En la mayor parte de los casos son suficientes cuadrados de 0,5 x 0,5 metros e incluso inferiores, pero luego es conveniente dar los resultados en biomasa por metro cuadrado. 2º) Dentro de cada formación vegetal, se sitúa el cuadrado cinco veces distintas al azar. Después de cada una, se corta la vegetación a la altura del suelo o del sedimento. 3º) Se elimina el agua lo más posible. En el caso de los macrófitos sumergidos, esto puede hacerse en el campo con una centrifugadora de mano para lechuga. 4º) La biomasa de cada cuadrado de muestreo se introduce en una bolsa de plástico que se etiqueta convenientemente. 5º) Una vez en el laboratorio, se pesa el contenido de cada bolsa con la mayor precisión posible y luego en una cápsula de porcelana grande (si son plantas sumergidas) o en una bolsa de papel (si son plantas emergentes) se meten en una estufa a 110 ºC durante una semana hasta que la pesada resultante sea constante. La diferencia porcentual entre el peso inicial y el final nos da el contenido en agua de cada planta. 6º) El peso seco final será el de la biomasa seca de cada muestra por unidad de superficie, una vez transformada la extensión del cuadrado de muestreo al metro cuadrado (por ejemplo, si usamos un cuadrado de 0,5 x 0,5 metros, habrá que multiplicar por 4 para dar la biomasa seca por metro cuadrado). 7º) La biomasa no es una componente constante de ninguna formación vegetal. Por eso, es conveniente calcular un promedio y una desviación típica de todas las muestras tomadas en una misma formación vegetal en cada momento de muestreo. Bibliografía

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ALGAS

Boletín de la Sociedad Española de Ficología

ISBN: 1695-8160

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Editor: Dr. J. Eduardo Linares Cuesta Dpto. Botánica - Facultad de Ciencias c/Severo Ochoa s/n Universidad de Granada 18071-GRANADA Tel.: 958-243268 Fax: 958-243254 [email protected] La Sociedad Española de Ficología (S.E.F.) y el editor no se hacen responsables de las opiniones vertidas en los artículos incluidos en la presente publicación, siendo todas ellas responsabilidad de los propios autores.

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http://www.sefalgas.org

Junta Directiva

Presidenta: Dra. Marina Aboal Sanjurjo Laboratorio de Algología. Departamento de Biología Vegetal. Facultad de Biología. Campus de Espinardo. 30100-MURCIA Tel.: 968-364990 [email protected] http://www.um.es/ecoalgas Vicepresidenta: Dra. Ángela Noguerol Seoane Dpto. Bioloxía Animal, Bioloxía Vexetal e Ecoloxía. Universidade da Coruña. Campus da Zapateira s/n 15071-A CORUÑA Tel.: 981-16 70 00 ext. 2151 y 2237 Fax: 981-167065 [email protected] Secretaria: Dra. Conxi Rodríguez Prieto Facultat de Ciències - Universitat de Girona Campus de Montilivi 17071-GIRONA Tel.: 972-418157 Fax: 972-418150 [email protected] Tesorera: Dra. Mª. Carme Barceló i Martí Laboratori de Botànica - Facultat de Farmàcia Universitat de Barcelona Av. Joan XXIII s/n 08028-BARCELONA Tel.: 93-4024490 [email protected]


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ALGAS es el boletín informativo semestral editado por la Sociedad Española de Ficología (S.E.F.) que se distribuye gratuitamente a todos sus socios. Esta publicación está dirigida no solamente a los socios, sino a todos los que trabajan en algología o temas afines, en nuestro país o en el extranjero. Contiene información sobre actividades desarrolladas por la Sociedad, tales como reuniones, congresos, cursillos, etc., así como propaganda sobre actividades de otras sociedades extranjeras e información de congresos y reuniones de temas relacionados con la algología. La revista está abierta a la colaboración de socios, y no socios, interesados en aportar información sobre su asistencia a dichas actividades o sobre cualquier tema relacionado con su línea de trabajo que pueda ser de interés general. Es nuestra intención que esta revista permita, además, un fecundo intercambio de informaciones, opiniones y material entre todos aquellos que viven de, por y para las algas. Desde el volumen cero, que vió la luz en octubre de 1987, un tiempo antes incluso de la constitución legal de la S.E.F., ha ido creciendo y consolidando sus contenidos, hasta adquirir el aspecto que muestra actualmente. Si desea pertenecer a la Sociedad Española de Ficología (S.E.F.) y tener acceso a esta útil información, rellene el formulario de inscripción que se encuentra más abajo y envíelo a la Secretaria de la Sociedad. El pago de la cuota se realiza por transferencia bancaria, y su cuantía es la siguiente: Clase de miembro: Ordinario.....24 euros Becario.....12 euros Estudiante.....6 euros ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- SOLICITUD DE INSCRIPCIÓN EN LA SOCIEDAD ESPAÑOLA DE FICOLOGÍA (S.E.F.) Nombre: Tipo de socio (marcar con una X): Ordinario__ Estudiante__ Becario__ Dirección:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Ciudad:______________ Código Postal:______ Teléfono:________ Fax:________ e-mail:________________ Campos de interés (incluir en un círculo): 1.Ecología marina. 2.Ecología de agua dulce. 3.Plancton. 4.Bentos. 5.Sistemática. 6.Morfología y desarrollo. 7.Fisiología y bioquímica. 8.Biología celular. 9.Genética. 10.Biología molecular. 11.Fisiología aplicada. 12.Docencia. 13.Algas fósiles. 14.Toxicidad. 15.Acuicultura. 16.Ecofisiología. 17.Otros (especificar):____________________________________________________________________ DATOS PARA EL COBRO BANCARIO Nombre completo del titular de la cuenta:_____________________________________________________ Banco/Caja/Entidad:_____________________________________________________________________ Dirección:_____________________________________________________________________________ Código Cuenta Corriente: Entidad: _ _ _ _ Oficina: _ _ _ _ D.C.: _ _ Nº de cuenta: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Cortar por las líneas punteadas, enviando la parte superior a la Secretaria de la SEF y la inferior al propio banco. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Sr. Director/a del Banco/Caja/Entidad:_______________________________________________________ Le ruego dé las órdenes oportunas para que, a partir de la fecha, hagan efectivos los recibos que a mi nombre y a cargo de mi cuenta corriente/libreta de ahorro número________________________________ pase a cobrar la Sociedad Española de Ficología. Nombre y apellidos:______________________________________________________________________ En _____________, a ___ de __________ de _____.

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