AJUSTE Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA ...
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN ANÁLISIS QUÍMICO, INDUSTRIAL Y AGROPECUARIO (LIAQIA) AJUSTE Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD - GLUCOSIDASA EN SUELOS Trabajo Especial de Grado presentado ante la ilustre Universidad de Los Andes, como requisito para optar al Titulo de Licenciada en Química PRESENTADO POR: Br. YESENIA CALDERÓN TUTOR: Dr. FROILAN CONTRERAS COTUTOR: Dr. GUILLERMO BIANCHI MÉRIDA – VENEZUELA
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
LABORATORIO DE INVESTIGACIONES EN ANÁLISIS QUÍMICO, INDUSTRIAL
Y AGROPECUARIO (LIAQIA)
AJUSTE Y VALIDACIÓN DE UN MÉTODO FOTOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD �- GLUCOSIDASA EN SUELOS
Trabajo Especial de Grado presentado ante la ilustre Universidad de Los Andes, como requisito para optar al Titulo de Licenciada en Química
PRESENTADO POR: Br. YESENIA CALDERÓN
TUTOR: Dr. FROILAN CONTRERAS
COTUTOR: Dr. GUILLERMO BIANCHI
MÉRIDA – VENEZUELA
1
1. INTRODUCCIÓN Los suelos constituyen sin lugar a dudas el recurso natural más importante para la
humanidad, por ser éste su principal fuente de alimentación, paradójicamente, el
mayor depredador de la capa terrestre es el propio ser humano, quien no ha
sabido aprender de las experiencias del pasado y continúa explotándolo en forma
irracional.
Para propiciar su productividad y el equilibrio ambiental (sustentabilidad), es
necesario comprender a fondo sus propiedades, características y distribución, así
como hacer uso de un conjunto de herramientas que permitan conocer su
condición. Las actividades enzimáticas surgen como indicadores potenciales
dentro de este conjunto, debido a que son de fácil determinación y responden
rápidamente al manejo del recurso, [1] además que están relacionadas con
funciones ecológicas como, la producción de biomasa, la remediación de
contaminantes y la conservación de los ecosistemas.
De las enzimas determinadas en suelos, son las hidrolasas las más estudiadas, si
bien también lo han sido otros grupos entre los que podemos citar a las
oxidoreductasas, liasas y transferasas.
La �-glucosidasa actúa en la hidrólisis de los enlaces �-glucósidos de las grandes
cadenas de carbohidratos. La hidrólisis de estos sustratos se utiliza en la
obtención de energía para los microorganismos del suelo [2].
La actividad de la �-glucosidasa, esta relacionada con el estado de
descomposición de la materia orgánica del suelo la cual es de vital importancia en
el funcionamiento de los ecosistemas, por ser ésta la única vía de reposición de
los nutrientes que han sido tomados por las plantas durante su proceso de
crecimiento y sirve como mecanismo regulador de los procesos químicos,
biológicos y físicos que en ellos ocurren.
El contenido de la materia orgánica del suelo se obtiene determinando el carbono
orgánico. La cantidad de carbono orgánico (COT) se encuentra correlacionada con
el clima y la textura (a más arcilla, más COT). El contenido de COT es mayor
2
bajo climas húmedos, fríos y con texturas finas. La proporción de COT en los
primeros 20 cm, se relaciona directamente con las cantidades de precipitación e
inversamente con la temperatura. La estructura de la vegetación (pasto, arbustos y
bosques) afecta no tanto a las cantidades sino a como se distribuye
porcentualmente en profundidad, siendo más uniforme, en general, en los
arbustos que en los pastizales y bosques. Del mismo modo, en los climas áridos,
semiáridos y tropicales también se distribuye más homogéneamente en
profundidad.
2. El Suelo:
Es un recurso vivo, dinámico y no renovable, cuya condición y funcionamiento es
vital para la producción de los alimentos y la calidad ambiental, es el sustrato en el
cual se fijan las plantas y los animales. De igual forma se puede definir un medio
poroso, biológicamente activo y estructurado.
El suelo se forma por un largo proceso en el que interviene el clima, los seres
vivos y la roca más superficial de la litosfera. Este proceso es una sucesión
ecológica en la que va madurando el ecosistema suelo. La roca es meteorizada
por los agentes meteorológicos (frio/calor, lluvia, etc.) y se va fragmentando. Los
fragmentos de roca se entremezclan con restos orgánicos (heces, organismos
muertos o en descomposición, fragmentos de vegetales, pequeños organismos
que viven en el suelo, etc.), y con el paso del tiempo todos estos materiales se van
estratificando y terminan por formar lo que conocemos como suelo.
2.1. Importancia de los suelos: En los últimos años se ha incrementado el interés por el desarrollo de un concepto
de calidad de suelo, sin embargo ha sido difícil de definir y cuantificar. La calidad
del suelo está determinada por funciones simultáneas como sostener la
productividad de los cultivos, el mantener la calidad del agua y del aire, y el
proporcionar condiciones saludables para plantas, animales y el hombre dentro de
los límites de un ecosistema. Por consiguiente, la calidad de este recurso
3
determina la sostenibilidad de la agricultura, la calidad ambiental y como
consecuencia la salud de plantas, animales y del hombre [3].
1. Materia Orgánica:
Es la fracción orgánica del suelo que incluye restos de materiales vegetales y
animales en diferentes grados de descomposición, tejidos y células de organismos
que viven en el suelo [4].
3.1 Factores que afectan a la materia orgánica: Existen cinco factores
principales que afectan directamente a la cantidad de materia orgánica del suelo [5].
3.1.1. Vegetación:
� Hay aproximadamente el doble de materia orgánica en un suelo de pradera
que en otro suelo similar de bosque.
� La materia orgánica se extiende más profundamente en el suelo de
pradera, ya que las raíces de césped pueden descomponerse en el suelo,
mientras que la materia orgánica de los suelos de bosque vienen
principalmente de la descomposición de residuos de la superficie. La
mayoría de la materia orgánica de la pradera está en el suelo. En los
bosques, la mayoría de la materia orgánica reside en árboles que están en
pié.
3.1.2. Clima: Debido a que los suelos en climas áridos soportan muy poca
vegetación, son más bajos en contenido de materia orgánica que los suelos de
pradera o de bosque.
4
Cuanta mas lluvia, mayor es la cantidad total de vegetación, es decir mas materia
orgánica. La materia orgánica se descompone más rápidamente a altas
temperaturas.
3.1.3. Textura del Suelo: Los suelos de textura arcillosa suelen tener más
materia orgánica que los suelos más gruesos, ya que en ellos crecen una gran
cantidad de plantas porque retienen bien el agua y los nutrientes, y también
porque la arcilla de los suelos de textura arcillosa protege al humus de su
descomposición posterior [5].
3.1.4. Drenaje del suelo: Éste tiene un impacto sobre los niveles de materia
orgánica del suelo. Cuanto más mojado está el suelo, hay menor cantidad de
oxigeno disponible para alimentar la descomposición y hay una mayor
acumulación de materia orgánica [6].
3.1.5. Laboreo: Los suelos vírgenes pierden materia orgánica cuando empiezan
a ser cultivados. Los niveles de materia orgánica descienden rápidamente al
principio pero luego, con el tiempo la perdida de humus se retarda y alcanza de
nuevo un equilibrio [6].
La fracción más estable de la materia orgánica, se llama humus es de color
marrón o negro. Esta compuesto por cadenas largas de polímeros heterogéneos,
formados por la interacción de polifenoles, aminoácidos, polisacáridos y otras
sustancias. Las dos primeras son los productos principales de descomposición
vegetal, mientras que los polisacáridos son producto de la síntesis microbiana. El
humus es capaz de absorber grandes cantidades de agua, con lo que aumenta la
capacidad de retención de líquido del suelo y, por lo tanto, incrementa las
posibilidades de buenas cosechas. En muchos suelos es difícil conservarlo en
niveles suficientemente altos [7].
5
3.2 Ciclo del Carbono:
La fotosíntesis toma la energía del sol y la acumula en las cadenas carbonadas de
los carbohidratos; la respiración libera esta energía rompiendo dichas cadenas.
Las plantas y animales respiran, pero sólo las plantas (y otros productores como
las cianobacterias) pueden realizar fotosíntesis. El reservorio principal de CO2 está
en los océanos y en las rocas. El CO2 se disuelve rápidamente en el agua. Una
vez en el agua, precipita como roca sólida conocida como carbonato de calcio
(calcita). El CO2 convertido en carbohidratos en las plantas tiene tres rutas
posibles: puede liberarse a la atmósfera con la respiración, puede ser consumido
por animales o es parte de la planta hasta que ésta muere.
Los animales obtienen todo el carbono de su alimento, así que todo el carbono en
el sistema biológico proviene al final de los organismos autótrofos. En los
animales, el carbono tiene las mismas tres rutas. Cuando las plantas y animales
mueren pueden ocurrir dos hechos: la energía contenida en las moléculas es
utilizada por las bacterias y hongos del suelo y el carbono es liberado a la
atmósfera en forma de CO2 o puede permanecer intacto y finalmente
transformarse en combustibles minerales. Los combustibles fósiles al ser
utilizados liberan a la atmósfera CO2 [8].
6
2. Indicadores de calidad de un suelo: Se han propuesto un conjunto de indicadores para determinar la calidad del suelo,
entre los cuales se encuentran: los de tipo físico, físico – químico (estabilidad de
agregados, pH, conductividad eléctrica), y químico (indicadores nutricionales y
fracciones de carbono), como los de tipo microbiológico y bioquímico (carbono de
biomasa microbiana, respiración microbiana, o diversas actividades enzimáticas).
Los cuales deben satisfacer ciertos requisitos como lo son:
1. Ser sensibles ante la presencia del mayor número posible de agentes
degradantes del suelo.
2. Deben permitir conocer la dirección del cambio a producirse ante la
presencia de un contaminante dado.
3. Deben tener la capacidad de reflejar diferentes niveles de degradación [9].
Algunas actividades enzimáticas se han propuesto como indicadores potenciales
ya que están relacionadas con funciones ecológicas, como la producción de
biomasa, la remediación de contaminantes y la conservación de ecosistemas.
Éstas pueden formar parte del conjunto de herramientas necesarias para asignar
sostenibilidad. Son de fácil determinación y responden rápidamente al manejo del
recurso [10].
5. Actividad Enzimática del suelo: 5.1. Aspectos generales: Las enzimas constituyen un amplio grupo de proteínas cuyo papel es catalizar las
reacciones químicas en los sistemas vivos, actúan sobre sustratos específicos
transformándolos en productos necesarios para los ciclos biológicos [11].
7
enzima+ sustrato complejo producto + enzima enzima – sustrato
Las enzimas del suelo pueden proceder tanto de microorganismos como de
plantas y animales. Una parte de las enzimas del suelo son extracelulares siendo
liberadas durante el metabolismo y muerte celular; otra son intracelulares,
formando parte de la biomasa microbiana. Por ultimo, existen las enzimas
inmovilizadas que son las que pueden mantener un nivel constante y estable de
actividad enzimática en el suelo, independiente de la proliferación microbiana y de
las formas usuales de regulación de la síntesis y secreción de enzimas. Este tipo
de enzimas inmovilizadas pueden permanecer unidas a coloides minerales (como
la arcilla) u orgánicos (como las sustancias húmicas), siendo muy resistentes a
procesos de desnaturalización [12].
La importancia fundamental del estudio de la actividad de las enzimas del suelo
radica en que el funcionamiento de los ecosistemas no se puede entender
correctamente sin la participación de los procesos enzimáticos [13], ya que las
enzimas determinan la pauta de gran parte de las transformaciones químicas que
se producen en el suelo [8].
Con las enzimas del suelo se puede establecer categorías de acuerdo a su
función: hidrolasas, oxidorreductasas, liasas, transferasas, ligasas e isomerasas
(ver la Tabla A).
8
Tabla A: Enzimas en el suelo de acuerdo a su función:
Categoría Reacción Química Catalizada
Nombre de la Enzima
Oxido – Reductasas
Reacción de óxido –reducción
Glucosa oxidasa
Transferasas Transferencia de grupos funcionales (glucósilos,
fosfatos)
Glucoquinasa
Hidrolasas Reacciones de hidrólisis. Transforman polímeros
en monómeros. Actúan sobre: Enlaces C=O
�- glucosidasa
Liasas Adición a dobles enlaces(C�O; C�C; C�N)
Descarboxilasa
Fosfoglucosa isomerasa
Isomerasas Reacción de
isomerización Ligasas Formación de enlaces ,
con aporte de ATP ( C�O; C�S; C�N; C�C)
Piruvato Carboxilasa
Tomada de [19].
Las enzimas del suelo pueden considerarse útiles para monitorizar cambios en las
actividades microbianas. Ofrecen información sobre la capacidad potencial del
suelo para llevar a cabo reacciones específicas, los cuales son importantes en el
ciclo de nutrientes [14].
6. Actividad de la �- glucosidasa en el suelo:
Pertenece al grupo de las hidrolasas, las cuales catalizan reacciones de hidrólisis
con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Actúan sobre
enlaces C = O.
La enzima �- glucosidasa esta involucrada en el desarrollo del ciclo del carbono en
los suelos, puesto que se encarga de catalizar reacciones de hidrólisis de finales
de cadenas no reducibles de �-D-glucósidos para formar �-glucosa que es una
fuente importante de energía para los microorganismos [15].
9
Esta enzima, por tanto, podrá reflejar el estado de la materia orgánica en el suelo
y todos los procesos que tengan lugar en ella, desde la mineralización hasta la
humificación [11].
La reacción general de hidrólisis de esta enzima es:
Glucósido + H2O � azúcar + aglicon
Su distribución en la naturaleza es bastante amplia estando presente tanto en
plantas como en microorganismos, e interviniendo en la descomposición de
residuos vegetales en los suelos [16]. La actividad �- glucosidasa encontrada en el
suelo por Hayano [17], en cuanto a especificidad de sustrato y pH óptimo, era
similar a la determinada en algunos hongos, lo que parece confirmar que dicha
enzima puede tener un origen predominantemente fúngico [12]. Esta enzima es
bastante sensible a la presencia de metales pesados y otros contaminantes que
pueden acompañar a los residuos orgánicos [18].
Por lo tanto, la determinación de la actividad �- glucosidasa no es sólo importante
por hacer referencia cualitativa del estado de descomposición en que se encuentra
la materia orgánica, sino que es capaz de ser un bioindicador del estado de
contaminación de un suelo.
6.1. Métodos de Determinación de la Actividad de la �-glucosidasa en el suelo: Autores como Hayano (1973) y Tabatabai (1988) han desarrollado métodos para
la determinación de dicha actividad, ambos coinciden en la utilización del mismo
substrato, p-nitrofenil-�-D-glucopiranósido, con la diferencia que cada uno fija las
condiciones de extracción y determinación colorimétrica del p-nitrofenol y
establecen los reactivos que permiten una recuperación cuantitativa del p-
nitrofenol producido, sin causar hidrólisis química del sustrato.
10
Otra línea metodológica, es la propuesta por Hoffman y Dedeken (1965) que utiliza
como sustrato salicina (2-hidroximetil-fenil- �- D-glucopiranósido) y se cuantifica el
saligenol (2-hidroxibenzilalcohol) formado.
Tabla B: Condiciones experimentales de cada método:
Método A Hoffman y Dedeken,1966
Método B Hayano, 1973
Método C Eivazi, Tabatabai, 1988
Método D Modificación del método de Eivazi, Tabatabai por Trasar – Cepeda,1999
Sustrato
2-hidroximetil-fenil-
�-D-glucopiranosido
p-nitrofenil-�-D-Glucopiranósido
p-nitrofenil-�-D-Glucopiranósido
25mM
p-nitrofenil-�-D-Glucopiranósido
25mM
Longitud de onda ( nm) …… 400 400 - 420 400 – 420
Temperatura de incubación ( ºC )
37 30 37 37
Tiempo de incubación (horas) 3 1 1 1
Agente Bacteriostático Tolueno Tolueno Tolueno …….
Patrón (Curva de Calibración) Fenol p-nitrofenol. p- nitrofenol. p- nitrofenol.
Buffer
Acetato (pH=6,2)
McILvaine (pH=4,8)
MUB - HCl (pH=6)
MUB – HCl (pH=6)
Prevenir la dispersión de las
arcillas y disminuir la extracción de materia orgánica del suelo cuando se añada la
solución extractante.
---------
Etanol.
CaCl2.
CaCl2.
Extractante
2,6- dibrochin- 4-
cloroamida
Solución Tris
2M.
Solución THAM –
NaOH pH 12
Solución THAM – NaOH, pH 12.
Curva de calibración
Sin suelo
Sin suelo
Sin suelo
Con suelo
11
El método que reunió las mejores condiciones para ser aplicado fue el Método D,
modificación del método de Eivazi, Tabatabai por Trasar – Cepeda,1999 [19], ya
que en primer lugar es un método sencillo y de fácil estandarización, su incubación
es por una hora, es decir que no existe el peligro que se produzca un crecimiento
microbiano no deseado en ese tiempo, utiliza un buffer el cual permite obtener
niveles altos de actividad �- glucosidasa, y lo mas importante es que su curva de
calibración se realiza en presencia de suelo ya que cada suelo tiene una
capacidad de absorber el p – nitrofenol de forma diferente, además que pueden
estar presentes en el suelo otros compuestos que pueden dar coloración como por
ejemplo los taninos.
6.2. Factores que afectan la actividad de la �- glucosidasa en el suelo [2]:
6.2.1. Distribución de la actividad en los suelo en perfiles:La actividad enzimática usualmente disminuye en muestras de perfiles más
profundos y está acompañada por una disminución del contenido de materia
orgánica.
Eivazi y Tabatabai (1988), establecieron que las actividades de �- glucosidasa en
cinco muestras de perfiles examinados disminuían marcadamente con la
profundidad y lo asociaron con una disminución en el contenido de carbono
orgánico, ya que un análisis estadístico les mostró que en los perfiles de suelo
estudiados la actividad de esta enzima esta significativamente correlacionada con
el contenido de carbono orgánico.
6.2.2. Efecto de sales inorgánicas: Estudios realizados por Eivazi y Tabatabai (1988), demostraron que, con unas
pocas excepciones, todas las sales inorgánicas utilizadas inhiben la actividad de
esta enzima en el suelo. De estos resultados esta claro que la adición de sales
inorgánicas como materiales fertilizantes o la acumulación de agua de irrigación
podría tener un gran efecto en la actividad de glicosidasas en suelo y por lo tanto
en el ciclo del carbono.
12
6.2.3. Efecto de trazas de elementos en glucosidasas en el suelo: Algunos iones metálicos como el mercurio (Hg), el plomo (Pb) y el cadmio (Cd)
pueden inhibir las reacciones enzimáticas a través de la formación de complejos
con el sustrato, por combinación con el grupo activo proteico de la enzima o por
reacción con el complejo enzima – sustrato, la manera de inhibición depende del
tipo de sustrato usado.
La magnitud de inhibición de la enzima �-glucosidasa por trazas de estos
elementos fue relacionada con el nivel de actividad presente en el suelo. A más
alta actividad menor será el porcentaje de inhibición. 6.2.4. Efecto de Pretratamiento: El secado del suelo húmedo resulta en un marcado incremento en la actividad de
esta enzima. Los efectos de pretratamiento dependen de la enzima en estudio, no
puede ser establecido como regla general [20].
7. Atributos del método a ser determinados para su validación [21]:
Sensibilidad: Se define como el cambio que experimenta una determinada señal
analítica por unidad de concentración. Para regresiones lineales representa la
pendiente de la recta de calibración.
Exactitud: La exactitud de un método analítico es la proximidad entre el resultado
obtenido y el valor real. La exactitud debe establecerse en todo el intervalo
especificado para el método analítico.
Precisión: Se define como la dispersión de los valores obtenidos alrededor del
valor medio, o bien como la proximidad entre los resultados obtenidos por la
aplicación del mismo procedimiento experimental varias veces bajo condiciones
predescritas.
Rango: Se refiere al intervalo de concentraciones de analito en el cual se
determinaron los atributos del método.
13
Como consecuencia de la revisión bibliográfica realizada hasta este momento, nos
permitimos proponer la siguiente hipótesis.
8. HIPÓTESIS La precisión en la medida de la actividad de �-glucosidasa en suelo, la cual esta
relacionada con el estado de descomposición de la materia orgánica y es capaz
de ser un indicador de calidad y contaminación de los mismos, puede mejorarse
ajustando el tamaño de las partículas que conforman la muestra.
Para la comprobación de esta hipótesis se proponen los siguientes objetivos:
9. OBJETIVOS 9.1. Objetivo General:
Plantear, ajustar y validar un método para la determinación de la actividad
enzimática de la �-glucosidasa a ser usada como parámetro para evaluar la
calidad de un suelo.
9.2. Objetivos Específicos:
• Determinar en forma experimental los principales atributos del método
seleccionado para la determinación de la actividad enzimática de la
�-glucosidasa en suelo tales como: precisión, exactitud, sensibilidad, y
rango de trabajo.
• Montaje, ajuste y validación del método seleccionado para la determinación
de la actividad enzimática de la �-glucosidasa en suelo.
• Estudiar los efectos de pH y temperatura sobre las medidas.
• Documentar el método analítico ya ajustado para la determinación de la
actividad enzimática de la �-glucosidasa.
• Determinar el carbono orgánico, mediante el método de Walkley – Black
para correlacionarlos con las medidas obtenidas.
14
10. Principios de los métodos empleados:
Método fotométrico para la determinación de la actividad de la �-glucosidasa en el suelo: El método modificado por Trasar - Cepeda se basa en la determinación
colorimétrica del p-nitrofenol obtenido por la acción de la �-glucosidasa después
de incubar el suelo con el sustrato �-D-glucopiranósido en medio tamponado a pH
6. La incubación se lleva a cabo a 37°C durante una hora y el p-nitrofenol liberado
se extrae por filtración después de la adición de CaCl2 y tampón THAM pH 12. La
reacción aceptada para la formación del p-nitrofenol se muestra en el siguiente
diagrama.
Reacción 1: Formación del p–nitrofenol
Método fotométrico para la determinación de carbono orgánico en suelos:
El método de Walkley – Black es un método indirecto que determina el carbono
orgánico del suelo que se oxida con dicromato de potasio en presencia de ácido
sulfúrico. Se basa en que la cantidad de carbono que se oxida es equivalente a la
cantidad de iones dicromato reducidos. Los iones de cromo trivalente pueden
determinarse colorimétricamente.
Reacción 2: Formación de Cr3+
C6H12O6 + 4 Cr2O7= + 32 H+ 8 Cr3+ + 22 H2O +6CO2
OO NO2
CH2OH
OH
OH
HO
O
CH2OH
OH
OH
HO
OH +HO NO2H2O
15
11. PROCEDIMIENTOS
11.1 Procedimiento para la curva de calibración para la medida de actividad enzimática de la �-glucosidasa: (esquema 1).
11.2. Procedimiento para la medida de Actividad enzimática de la �-glucosidasa: (esquema 2).
16
11.3. Procedimiento para la curva de calibración utilizada en la determinación espectrofotométrica de carbono orgánico en suelos: (Walkley y Black) (esquema 3).
11.4. Procedimiento para la determinación espectrofotométrica de carbono orgánico en suelos: (Walkley y Black) (esquema 4).
17
12. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
12.1. Montaje, ajuste y Validación del método para la determinación de la actividad de la �–glucosidasa:
Para la determinación de p–nitrofenol se empleó el método fotométrico propuesto
(ver esquema 1) en un intervalo de concentración de 0 a 100 ppm de p - nitrofenol.
Las soluciones se prepararon a partir de un patrón de p-nitrofenol de 2000 ppm.
Se establecieron los atributos del método mediante el uso de herramientas
estadísticas de análisis del programa Excel de Office 2003 para Windows.
En la tabla 1 se presentan los valores obtenidos de absorbancia para las
diferentes concentraciones de p-nitrofenol conocidas las cuales se midieron por
quintuplicado y en forma aleatoria para minimizar los errores determinados. Al
representar gráficamente la absorbancia versus la concentración de p-nitrofenol,
se observa un comportamiento lineal con un coeficiente de correlación de 0,998.
Se obtuvo la siguiente relación:
Y = 0,0123 X + 0,266 Dicha relación presenta una precisión aceptable con un valor de desviación
estándar pequeño de 0,0175. El gráfico 1, representa la curva de calibración del método y permitió demostrar
que los resultados obtenidos son reproducibles y que este método puede ser
utilizado para la aplicación pretendida, es decir la determinación de la actividad
enzimática de la �-glucosidasa a ser usada como parámetro para evaluar la
calidad de un suelo.
18
Tabla 1: Absorbancia en función de la concentración de p–nitrofenol.
Concentración(ppm) Absorbancia 0 0,265 0,258 0,273 0,279 0,282 20 0,528 0,530 0,529 0,532 0,526 40 0,735 0,765 0,732 0,740 0,755 60 0,972 0,981 0,975 0,985 0,989 80 1,260 1,260 1,270 1,240 1,260
100 1,510 1,520 1,510 1,500 1,520 Medida a 390 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
Tabla 2: Modelo de ajuste aplicado al método en estudio.
Parámetros Modelo linealY = a + b X
R2 0,998
s 0,0175
n 30
Tabla 3: Características analíticas del modelo lineal. Regresión lineal Y= a +bX
Parámetro Valor Error
b 0,0123 9,35.10-5
a 0,266 0,0056
Rango de trabajo (0 - 100) ppm
19
12.1.2. Efecto de la matriz: (Ver esquema 2)
El propósito de este ensayo es verificar si podrían existir compuestos
interferentes que afectaran la medida del p–nitrofenol. Evalúa el error sistemático
del método.
� Se homogenizó una muestra de suelo, se dividió en dos porciones y
una de ellas se humedeció, se calentó en la estufa a 100 °C por 2
horas para inactivar la enzima.
� Se realizaron mezclas de las dos porciones para preparar la curva de
calibración en función de la cantidad de suelo con enzima activa.
Para ello se colocó un gramo de suelo inactivado en la estufa y
cantidades crecientes del suelo molido conteniendo la enzima activa.
� Se analizaron las muestras por el método fotométrico propuesto (ver
esquema 2).
En la tabla 4 se muestran los datos obtenidos para la medida de absorbancia en
función de la cantidad de suelo con enzima activa.
20
En el gráfico 2 se observa que existe una dispersión en las medidas obtenidas
para el p-nitrofenol liberado en el suelo debido a la complejidad de la matriz en
estudio (suelo), esto se puede atribuir a que otros compuestos distintos del
p–nitrofenol absorben cerca de la región visible donde este lo hace y pudieron
dar señal en el espectrofotómetro o bien que se produjo una catálisis no
enzimática.
En la tabla 5 se señalan las características del modelo lineal para la determinación
de p-nitrofenol por medida fotométrica de la absorbancia como función de la
cantidad de suelo.
Tabla 4: Valores de absorbancia en función de la cantidad de suelo (g).
Cantidad de suelo (g) Absorbancia
0,00 0,068 0,054 0,062 0,049 0,20 0,158 0,172 0,166 0,181 0,40 0,282 0,275 0,279 0,290 0,60 0,392 0,403 0,388 0,410 0,80 0,523 0,516 0,531 0,512 1,00 0,654 0,645 0,649 0,639
Absorbancia medida a 390 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
Tabla 5: Características del modelo lineal al que se ajusta el método.
Parámetro Valor Error
b 0,587 0,0056
a 0,0520 0,0034
n 24
S 0,0093
21
12.2. Efecto del fraccionamiento granulométrico de la muestra en la actividad enzimática de la �-glucosidasa en el suelo. Este ensayo se realizó con el objetivo de conocer la distribución de las partículas
que conformaban el suelo utilizado, para ello:
Se pesó una muestra de suelo seco de 400,00 g, se pasó por una batería de
tamices de malla 2,0; 1,4; 1,0; 0,85; 0,71; 0,5; 0,3 y 0,212 mm. Se separaron las
fracciones y se pesaron. La tabla 6, señala el porcentaje, en masa, de cada
fracción en la muestra de suelo como función del rango del tamaño de partícula
que varia desde 2,0 mm hasta menores que 0,212 mm. Con dichos datos se
obtuvo el gráfico 3, porcentaje en masa de fracción de muestra de suelo como
función del tamaño de partícula (mm). Con esto se determinó que la mayor
cantidad de partículas (29,76 %) tienen un tamaño que oscila entre (0,212 � 0,3)
mm.
22
Tabla 6: Análisis granulométrico de una muestra de suelo.
Tamaño Partícula (mm)
% peso muestra
suelo
(1,40 � 2) 4,08 (1 � 1,40) 6,53 (0,85 � 1) 2,48
(0,71 � 0,85) 3,26 (0,5 � 0,71) 6,96 (0,3� 0,5) 20,3
(0,212� 0,3) 29,8 (� 0,212) 26,6
Gráfico 3: Distribución granulométrica de la muestra de suelo analizada.
0
5
10
15
20
25
30
35
(2,0���1,4) (1,4���1,0) (1,0���0,85) (0,85��0,71)
(0,71��0,50)
(0,5���0,3) (0,3��0,212)
(<�0,212)
Tamaño de particulas (mm)
%m
asa
de fr
acci
ón
de m
uest
ra
23
12.3. Determinación del efecto del tamaño de la partícula en la medida de la actividad enzimática de la �-glucosidasa en la muestra de suelo. Este ensayo se realizó para conocer el comportamiento de la actividad enzimática
al utilizar diferente tamaño de partícula.
Las fracciones de suelo obtenidas en el análisis granulométrico se sometieron a la
determinación de la actividad enzimática por el procedimiento propuesto (ver
esquemas 1 y 2). En las tablas 7 y 8 se aprecian los resultados de absorbancia y
de actividad enzimática respectivamente presentes en cada fracción estudiada.
En el gráfico 4 se muestran las curvas de calibración obtenidas para cada fracción
de suelo, con los datos de dichas curvas se procedió a calcular la actividad
enzimática en cada fracción de suelo.
En los gráficos 4.1 y 4.2 se puede apreciar que a medida que va disminuyendo el
tamaño de la partícula se obtienen valores más altos de actividad enzimática y el
método se hace más preciso ya que su coeficiente de variación se hace cada vez
menor. Esto se debe a que las partículas de menor tamaño corresponden a la
fracción de suelo más pequeña (por ejemplo la arcilla) y esta se une en el estado
coloidal con el humus lo que les da mayor estabilidad. A diferencia de las
fracciones con tamaño de partículas grandes en las cuales no hay casi
interacción con el humus por lo se obtienen bajos niveles de actividad enzimática.
Tabla 7: Valores de absorbancias obtenidos con las curvas de calibración con las diferentes fracciones de suelo.
Absorbancia ppm de p - nitrofenol (2 -1,4) (1,4 -1,0) (1,0 – 0,85) (0,85- 0,71) (0,71 - 0,5) (0,5 – 0,3) (0,3 -0,212) (� 0,212)
0 0,262 0,276 0,277 0,281 0,298 0,355 0,720 0,730 20 0,542 0,555 0,594 0,603 0,625 0,652 0,970 0,980 60 1,090 1,090 1,110 1,210 1,220 1,250 1,410 1,480
100 1,600 1,660 1,690 1,710 1,750 1,810 1,90 1,950 Absorbancia medida a 390 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
24
Tabla 8: Efecto del tamaño de partícula sobre la actividad enzimática de la �-glucosidasa en el suelo.
Tamaño de partícula
(mm)
Actividad (�g p - nitrofenol / g suelo * hora)
promedio S CV S2
(2 - 1,4) 14,8 15,0 14,6 15,3 14,5 14,8 0,3 2,0 0,09
(1,4 – 1,0) 16,4 16,7 17,2 16,8 16,2 16,7 0,4 2,4 0,2
(1,0 – 0,85) 22,2 22,1 22,5 22,3 22,1 22,2 0,2 1,0 0,04
(0,85 - 0,71) 24,2 24,5 24,6 23,3 23,6 24,0 0,6 2,5 0,4
(0,71 - 0,5) 25,2 24,9 25,9 25,4 24,6 25,2 0,5 2,0 0,3
(0,5 – 0,3) 30,4 30,6 30,8 29,4 29,2 30,1 0,7 2,3 0,4
(0,3 – 0,212) 35,0 34,2 35,4 33,0 34,5 34,4 0,9 2,6 0,8
(� 0,212) 37,9 38,6 37,5 37,3 38,3 37,9 0,5 1,3 0,3
y = 0,0139 x + 0,270 R² = 0,999 y = 0,0139 x + 0,275 R² = 0,999 y = 0,0140 x + 0,290 R² = 0,999 y = 0,0140 x + 0,306 R² = 0,997 y = 0,0140 x + 0,320 R² = 0,998 y = 0,0140 x + 0,360 R² = 0,999 y = 0,011 x + 0,723 R² = 0,999 y = 0,012 x + 0,735 R² = 0,999
25
Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
26
12.4. Efecto de la reducción del tamaño de la partícula de toda la muestra sobre la
actividad enzimática de la �- glucosidasa:
Este ensayo se realizó para comprobar el efecto de la molienda del suelo sobre la
medida de la actividad enzimática de la �-glucosidasa.
Se utilizó una muestra de suelo de partícula � 2 mm, se homogenizó y se dividió
en dos porciones iguales.
Una de las porciones se trituró en un molino mecánico hasta que pasó por un
tamiz que permite obtener partículas de tamaño menores a 0,212 mm. De cada
porción se tomaron cinco muestras para su análisis por el método fotométrico
propuesto (ver esquema 2).
En las tablas 9 y 10 se recopilan los valores de absorbancia y actividad enzimática
para el suelo molido como el sin moler. En el gráfico 5 se observa las curvas de
calibración para cada porción de suelo analizada, a partir de estas se calcularon
las actividades enzimáticas tanto de suelo molido como sin moler.
En los gráficos 6 y 6.1 se muestra la actividad enzimática para cada porción de
suelo con sus respectivos errores (desviación estándar y coeficiente de variación).
En los mismos se observa que al comparar los valores de actividad enzimática
presentes en ambas porciones de suelo, el mayor valor corresponde al suelo
molido (19,3 (�g p - nitrofenol / g suelo * hora) con una desviación estándar de 0,60), mientras que el suelo sin moler presenta un valor inferior (13,6 (�g p -
nitrofenol / g suelo * hora) con una desviación estándar de 0,58). En lo que
respecta a los coeficientes de variación obtenidos el del suelo molido es menor
(3,1) con respecto al del suelo sin moler (4,3), lo que indica que existe una mayor
precisión cuando se utiliza suelo molido.
Estas diferencias se deben a que al moler el suelo se aumenta la superficie de
contacto y por lo tanto la reacción es más rápida, es decir las partículas de menor
tamaño tienen mejor interacción con la materia orgánica del suelo.
27
Tabla 9: Valores de absorbancias obtenidos de las curvas de calibración con suelo molido y suelo sin moler.
Concentración (ppm p – nitrofenol)
Absorbancia obtenida (Suelo sin moler)
Absorbancia obtenida (Suelo molido)
0
0,275 0,384
20 0,579 0,674
40 0,852 0,952
60 1,180 1,230 Absorbancia medida a 390 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
28
Tabla 10: Efecto de la molienda en el aumento de la actividad enzimática de la � – glucosidasa del suelo.
Replicas Actividad (�g p - nitrofenol / g suelo *
hora) Suelo sin moler Suelo molido
1era
13,3
19,4 2da 13,9 18,9 3era 14,1 20,1 4ta 13,9 19,6 5ta 12,7 18,6
Promedio 13,6 19,3 S 0,58 0,60
CV 4,3 3,1 NOTA: Replicas significa las veces que se realizo la medida de cada muestra por separado.
Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
29
A : Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
12.5. Estudio del pH del buffer sobre la actividad enzimática de la �-glucosidasa
en el suelo:
Este ensayo se realizó para evidenciar el efecto del pH en la medida de actividad
enzimática y para constatar que el pH propuesto en el método empleado era el
adecuado.
Una muestra de suelo de partícula � 2 mm, se homogenizó y se trituró en un
molino mecánico hasta que pasó por un tamiz que permite obtener partículas de
tamaño menores a 0,212 mm, dicha muestra se analizó por el método fotométrico
propuesto (ver esquemas 1 y 2), con la diferencia que se vario el pH del buffer en
un rango de valores de 5 a 8. En las tablas 10.1 y 10.2 se presentan los valores de
absorbancias y actividad respectivamente obtenidos para los diferentes pH.
El gráfico 6.2, corresponde a las curvas de calibración obtenidas con cada pH
estudiado, a partir de estas se calcularon las actividades correspondientes
representadas en el gráfico 6.3.
Se comprobó que la variación de la actividad �-glucosidasa con el pH es muy
marcada, obteniéndose una reducción de la actividad con los otros pH
comparados con la alcanzada utilizando el pH óptimo propuesto en el método
empleado (ver esquema 2), tal como lo indica Tabatabai (1988) [6].
30
Este autor realizó un estudio con varios tipos de suelos, y encontró un máximo en
la medida de la actividad enzimática de la �-glucosidasa cuando utilizó el buffer
MUB - HCl a pH 6 en un rango de pH de 3 a 9. Este estudio es similar al reportado
por Galstyan (1965) para actividad �-glucosidasa en suelo en presencia de buffer
fosfato [6].
Tabla 10.1: Valores de absorbancias obtenidos para las curvas de calibración con los diferentes pH de buffer utilizados.
Absorbancia ppm de p - nitrofenol (pH 5) (pH 6) (pH 7) (pH 8)
0 0,302
0,381 0,247 0,208
20 0,545 0,672 0,452 0,396 40 0,787 0,915 0,669 0,625 60 1,058 1,195 0,913 0,847
Tabla 10.2: Actividad de la �-glucosidasa en función del pH en un rango de (5 a 8) empleando buffer THAM – HCl.
pH Actividad
(�g p - nitrofenol / g suelo * hora)
promedio S CV S2
5 18,5
18,3 18,0 17,8 18,3 18,2 0,3 0,02 0,09 6 21,2
21,4 21,7 22,3 21,2 21,6 0,5 0,02 0,25 7 16,7
17,1 17,5 17,2 17,7 17,3 0,4 0,02 0,16 8 16,5
16,8 17,0 16,2 16,3 16,6 0,3 0,01 0,09
31
Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
32
12.6. Efecto de la temperatura de incubación del suelo sobre la actividad
enzimática de la �-glucosidasa:
Este ensayo se efectuó para examinar como variaba la actividad de esta enzima
al emplear temperaturas por debajo y por encima de la propuesta en el método
utilizado (ver esquemas 1y 2).
Una muestra de suelo de partícula � 2 mm, se homogenizó y se trituró en un
molino mecánico hasta que pasó por un tamiz que permite obtener partículas de
tamaño menores a 0,212 mm. Con esta muestra de suelo se procedió a realizar el
método fotométrico propuesto (ver esquemas 1 y 2) para un rango de temperatura
de incubación de 20 a 60 ºC.
En las tablas 10.3 y 10.4 se presentan los valores de absorbancias y actividad
respectivamente obtenidos para las diferentes temperaturas de incubación
empleadas.
Las curvas de calibración obtenidas con cada temperatura estudiada, se muestran
en el gráfico 6.4 a partir de estas se calcularon las actividades correspondientes a
cada una de ellas.
La velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas del suelo se
incrementa con la temperatura, hasta llegar a una determinada temperatura a la
que la actividad enzimática comienza a disminuir debido a que la enzima
comienza a desnaturalizarse, esto se puede apreciar en el gráfico 6.5. Algunos
autores como Eivazi y Tabatabai (1988) encontraron resultados similares para los
suelos que analizaron encontrando q a partir de la temperatura de 20 ºC la
actividad se incrementa hasta llegar a una temperatura de 60 ºC en donde se
aprecia una disminución de la actividad ya que la enzima comienza a
desnaturalizarse [6].
33
Tabla 10.3: Valores de absorbancias obtenidos para las curvas de calibración con las diferentes temperaturas utilizadas.
Absorbancia ppm de p - nitrofenol (T 20ºC) (T 40 ºC) (T 60ºC)
0 0,287
0,385 0,162 20 0,518 0,680 0,367 40 0,727 0,961 0,616 60 0,969 1,222 0,854
Tabla 10.4: Actividad de la �-glucosidasa en función de la temperatura de incubación de 20 a 60 ºC.
Temperatura (ºC)
Actividad (�g p - nitrofenol / g suelo * hora)
promedio S CV S2
20 16,1
16,8 17,1 16,7 15,4 16,4 0,7 0,04 0,49
40 19,1
18,9
20,1
19,6
18,6
19,3
0,6
0,03
0,36
60 12,1
11,8
11,5
11,7
11,3
11,7
0,3
0,03
0,09
34
Actividad (μg p – nitrofenol/ g suelo *hora)
12.7. Determinación del carbono orgánico, mediante el método de Walkley –
Black:
Se determinó el contenido de carbono orgánico presente en las diferentes
fracciones de suelo que se habían empleado para la determinación de la actividad
de la �-glucosidasa, para correlacionarlo con los resultados obtenidos y poder
probar que el tamaño de partícula influye en el contenido de carbono presente en
cada fracción de suelo analizada, mediante la oxidación ácida con dicromato y
determinación fotométrica (Walkley – Black). (Ver esquemas 3 y 4).
Una vez preparadas las soluciones necesarias se procedió a realizar la
determinación fotométrica a una longitud de onda de 600 nm. Se graficó la
absorbancia versus las concentraciones conocidas de carbono ver tablas 11,11.1,
12 y 12.1 y gráficos 7 y 8.
En lo que respecta al porcentaje de carbono orgánico (tabla 14 y gráficos 9 y 9.1),
se observa diferencias entre las fracciones de suelo estudiadas como era de
esperarse, ya que se encontró mayor contenido de carbono orgánico en las
fracciones de tamaño de partícula menor, lo cual confirma lo dicho anteriormente
que la actividad enzimática de la �-glucosidasa esta directamente correlacionada
con el contenido de carbono orgánico del suelo y que éste se encuentra en mayor
35
proporción en las partículas de tamaño reducido. Además se demostró que el
método propuesto (ver esquemas 3 y 4) se hace mas preciso a medida que el
tamaño de la partícula disminuye.
Tabla 11: Datos de la curva de calibración para los tamaños de partículas de 2 a 0,71mm. C mg 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 A 0,010 0,049 0,087 0,115 0,158 0,194 Absorbancia medida a 600 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
Tabla 11.1: Características analíticas del modelo lineal para los tamaños de partículas de 2 a 0,71 mm. Regresión lineal. Y= a +bX
Parámetro Valor Error
A 0,0111 0,0024
B 0,0729 0,0158
N 6
S 0,0033
Rango de trabajo (0 – 2,5) mg C
36
Tabla 12: Datos de la curva de calibración para los tamaños de partículas de 0,71 a <0,212mm.
C mg 0,00 2,50 5,00 7,50 10,0 A 0,010 0,194 0,396 0,600 0,793
Absorbancia medida a 600 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
Tabla12.1: Características analíticas del modelo lineal para los tamaños de partículas de 0,71 a <0,212mm. Regresión lineal. Y= a +bX
Parámetro Valor Error
b 0,0789 0,0008
a 0,00420 0,00475
n 5
S 0,0061
Rango de trabajo (0 -10,0) mg C
37
Tabla 13: Concentraciones obtenidas para las diferentes absorbancias con los diferentes tamaños de partículas utilizadas.
Tamaño de partícula (mm)
(>2)
(2 -1,4)
(1,4 – 1,0)
(1,0- 0,85)
(0,85 – 0,71)
(0,71 – 0,50)
(0,50 – 0,30)
(0,30 –0,212)
(<0,212)
Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A Conc. A
0,506 0,048 0,660 0,059 0,950 0,080 1,36 0,110 2,36 0,183 3,34 0,268 4,59 0,366 6,69 0,532 9,10 0,722
0,479 0,046 0,700 0,062 1,00 0,084 1,40 0,113 2,40 0,186 3,22 0,258 4,43 0,354 6,77 0,538 9,17 0,728
0,410 0,041 0,730 0,064 1,04 0,087 1,22 0,100 2,37 0,184 3,31 0,265 4,61 0,368 6,79 0,540 9,01 0,715
0,520 0,049 0,680 0,061 1,11 0,092 1,43 0,115 2,43 0,188 3,39 0,272 4,41 0,352 6,71 0,534 9,05 0,718
0,465 0,045 0,600 0,055 1,07 0,089 1,29 0,105 2,40 0,186 3,36 0,269 4,51 0,360 6,64 0,528 9,15 0,726
Promedio 0,480 0,050 0,670 0,060 1,03 0,090 1,34 0,109 2,39 0,185 3,32 0,270 4,51 0,360 6,72 0,534 9,10 0,720
S 0,04 0,00 0,05 0,00 0,06 0,00 0,08 0,006 0,03 0,002 0,07 0,01 0,09 0,007 0,06 0,005 0,07 0,01
CV 8,98 6,80 6,97 5,68 6,13 5,34 6,26 5,62 1,12 1,05 2,03 2,00 1,99 1,96 0,900 0,894 0,750 0,750
Tabla14: Porcentajes de carbono orgánico obtenidos para las fracciones de suelo.
Tamaño de Partículas % C S CV
(>2) 0,480 0,04 8,98 (2 – 1,4) 0,670 0,05 6,97
(1,4 – 1,0) 1,03 0,06 6,13 (1,0 – 0,85) 1,34 0,08 6,26
(0,85 – 0,71) 2,39 0,03 1,12 (0,71 – 0,50) 3,32 0,07 2,03 (0,50 – 0,3) 4,51 0,09 1,99
(0,3 – 0,212) 6,72 0,06 0,900(� 0,212) 9,10 0,07 0,750
38
Gráfico 9:Porcentajes de carbono en las diferentes fracciones de suelo.
012345678910
(>2) (2,0���1,4) (1,4���1,0) (1,0���0,85) (0,85���0,71) (0,71���0,50) (0,5���0,3) (0,3���0,212) (<�0,212)
Tamaño de particulas (mm)
% C
39
12.8. Efecto de la reducción del tamaño de la partícula de toda la muestra sobre el
porcentaje de carbono:
Este ensayo se llevo a cabo para comprobar el efecto de la molienda del suelo
sobre el contenido de carbono orgánico.
Se utilizó una porción de suelo de partícula � 2 mm, y otra de suelo que fue
triturada en un molino mecánico. Se tomaron cinco muestras de cada porción y se
analizaron por el método de Walkley – Black, (ver esquema 4). En la tabla 15 se
aprecian los datos de la curva de calibración.
Los resultados del ensayo se expresan en la tabla 16 y en los gráficos10 y 10.1.
Al triturar la muestra de suelo se observa que las partículas de menor tamaño
aumentan su porcentaje de carbono en relación al suelo sin triturar. Esto se debe
a que la arcilla logro una mejor interacción con el carbono orgánico del suelo, es
decir, cuando el suelo esta molido aumenta la superficie de contacto y por
consiguiente la reacción es más rápida.
Tabla: 15: Datos de la curva de calibración para carbono orgánico. C mg 0,00 2,50 5,00 7,50 10,0 A 0,010 0,194 0,396 0,600 0,793 Absorbancia medida a 600 nm en celdas de 1 cm de camino óptico.
40
Tabla 16: Concentración obtenidas para las diferentes absorbancias con suelo molido y sin moler.
Suelo sin Moler Suelo Molido
mg de C/g
suelo A mg de C/g
suelo A 2,42 0,193 5,21 0,410 2,47 0,197 5,23 0,412 2,45 0,195 5,26 0,414 2,53 0,201 5,19 0,409 2,40 0,191 5,14 0,405
Promedio 2,45 0,195 5,21 0,410 S 0,049 0,004 0,043 0,003
CV 2,01 1,97 0,840 0,830
41
13. CONCLUSIONES � Se confirmó la hipótesis propuesta que la precisión en la medida de la
actividad de �-glucosidasa en suelo puede mejorarse ajustando el tamaño
de las partículas que conforman la muestra.
� Se comprobó que el método fotométrico para la determinación de actividad
de �-glucosidasa en suelo empleado es sencillo, de fácil ejecución.
� Se verificó que tanto la actividad de la enzima como el contenido de
carbono orgánico del suelo aumenta a medida que el tamaño de la partícula
disminuye.
� Se confirmó que la actividad de esta enzima esta directamente
correlacionada con el contenido de carbono orgánico en el suelo.
14. RECOMENDACIONES
� Evaluar la precisión del método en función de muestras de suelo diferentes.
� Para otros métodos de análisis de suelo verificar si el tamaño de la partícula
influye en la sensibilidad y precisión.
42
15. BIBLIOGRAFÍA
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activities. Soil Biology and Biochemistry 31, 1471 – 1479.
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activities in soils. Soil Biology and Biochemistry 22,891 - 897.
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de interpretación. Trillas. México.D.F. p 6- 85.
[5] FitzPatrick E. A.1996. Introducción a la Ciencia de los suelos. Trillas. México.
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[8] Leningher, A. L. 1972. Bioquímica las bases moleculares de la estructura y
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[9] García C, Hernández T. 2003. Técnicas de Análisis de Parámetros
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43
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Special Publication Nº 35, Madison, Wisconsin. p 107-124.
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