AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS BENÉFICOS DEL

SUELO DE LA GRANJA FAZ - UNP

Elera Ojeda Rosario Nelly1 Guerra Delgado Marco Sergio1 , 1Docentes de la Escuela Profesional de Medicina Veterinaria. Facultad de Zootecnia. UNP

relera14@hotmail.com; msguerra90@hotmail.com

MODALIDAD POSTER

RESUMEN

El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estudios de aislamiento de

microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con capacidad amilolítica,

lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir de una muestra de suelo

de la granja FAZ-UNP. El método microbiológico empleado constó de cinco etapas: (i)

dilución de la muestra; (ii) cultivo en medios de cultivo generales; (iii) cultivo en medios

específicos, para la selección de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación

taxonómica, mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de

diferentes substratos. Para el aislamiento de las cepas amilolíticas se utilizaron medios

modificados con almidón y la positividad frente al test de lugol, utilizando medios CZAPEK,

PCA (plate count agar) y MRS (Man Rogosa Sharpe). Las cepas amilolíticas fueron

identificadas, purificadas y crío conservadas, obteniendo un total de 100 cepas nativas, de

estas, 9 cepas pertenecieron a los géneros Bacillus sp ,Clostridium sp y Kurthia sp. Se

recuperaron tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y

Brevibacterium sp. con actividad celulolítica. Los microorganismos mostraron 88,6% de

actividad para degradar materia orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser

detectada en los microorganismos aislados. La capacidad de síntesis de melanina se encontró

en: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,

Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita, Aspergillus niger, Candida albicans, Exophiala

(Wangiella) dermatitidis y Penicillium marneffei. Los hongos que sintetizan melanina son

resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B,

Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y

Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos; mientras que las bacterias y helminto,

productores de melanina, encontrados mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y

antiparasitarios, respectivamente.

Palabras claves: suelo, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolíticas, lipolítica, melanina.

ABSTRACT

This research work was to begin these studies of isolation of enzymatic activities of industrial

interest with capability amilolític, lipolytic, antimicrobial and capacity for synthesis of

melanin of a sample of the FAZ-UNP farm soil micro-organisms.The microbiological method

consisted of five stages: (i) the sample dilution; (ii) culture media general culture, providing

the conditions for growth for all micro-organisms of the sample; (iii) cultivation in specific

medias for selecting groups of organisms; (iv) count; and (v) taxonomic identification through

a review of biochemical parameters, as the fermentation of different substrates. For the

isolation of amilolítics strains were growth on starch modified media and positivity to lugol

test using CZAPEK, PCA (plate count agar) and modified MRS (Man, Rogosa, Sharpe)

medias. Strains obtained amilolítics were duly purified, kid preserved and identified

biochemically, obtaining a total of 100 native strains, 9 strains belonging to the genus Bacillus

sp, Clostridium sp. and Kurthia sp. Also recovered three strains for Bacillus megatherium,

Bacillus licheniformis and Brevibacterium sp. with celulolític activity. Fixed

microorganisms were 88,6% of activity to degrade organic matter to 36 hours. Lipolytic

capacity could not be detected in the isolated microorganisms. Melanin synthesis capacity was

found in: Aeromonas, Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida,:

Streptomyces antibioticus, Fasciola gigantita and fungis, Aspergillus niger, Candida

albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. The fungi synthesized

melanin are resistant to some antifungals such as Aspergillus niger resistant to Amphotericin

B, Candida albicans and Exophiala dermatitidis, resistant to Amphotericin B and fluconazole

and Penicillum marneffei resistant six antifungal; while bacteria and helminth, producing

melanin, found were shown to be sensitive to different antimicrobials and anti-parasitary,

respectively.

key words: soil, Bacillus, Clostridium, Kurthia sp. amilolítics, lipolytic, melanin.

INTRODUCCIÓN

Algunas de las enzimas extracelulares producidas por los microorganismos son usadas en la

industria farmacéutica, alimenticia y textil. Estas actividades enzimáticas son: La amilolítica;

que la produce la enzima amilasa y tiene diversas funciones industriales tanto en el área

alimenticia como en la producción de combustibles. Los usos más importantes son: La

obtención de jarabes de maltosa y glucosa, obtención de fructosa a través de la hidrólisis del

almidón. La actividad lipolítica degrada lípidos, la cual sirve para la creación de detergentes y

mejor absorción de grasas. La síntesis de melanina, es útil en proyectos genéticos para

solucionar casos en los que éste pigmento no es producido por el individuo o su síntesis es

alterada, se usa sobre todo en la cosmetología, en cremas bloqueadoras y bronceadoras. La

actividad antimicrobiana es usada en la producción de medicamentos en el área farmacéutica.

De las enzimas microbianas también se obtienen los antibióticos que matan o inhiben el

crecimiento de otros organismos y se emplean como tratamiento de enfermedades infecciosas.

Los antibióticos comerciales útiles están producidos primordialmente por hongos

filamentosos y bacterias del grupo de los actinomicetos (Gonzalez y col. 2005).

En países latinoamericanos cuya biodiversidad microbiana del suelo se desconoce, así como

las alteraciones provocadas por el impacto ambiental, en un escenario de trabajo con recursos

e infraestructura limitada; los estudios de la calidad del suelo, a través de la evaluación de las

alteraciones en la estructura de los ecosistemas microbianos, deberían iniciarse, con el objeto

de registrar dicha biodiversidad, en términos taxonómicos. Porque en un futuro no muy lejano

esta será una nueva forma de valoración económica de los suelos, dada su potencialidad en

recursos biotecnológicos. Los cuales sólo podrán ser capitalizados por cada país si son

estudiados en un contexto nacional y no por empresas transnacionales. El suelo representa la

fuente más importante de microorganismos benéficos y se estima que sólo el 1% de los

microorganismos presentes en este ambiente han sido aislados y caracterizados. A partir de

éstos se han identificado especies capaces de producir compuestos de interés industrial.

Es por ello que este trabajo de investigación tuvo como objetivo iniciar estos estudios de

aislamiento de microorganismos con actividades enzimáticas de interés industrial con

capacidad amilolítica, lipolítica, antimicrobiana y capacidad de síntesis de melanina a partir

de una muestra de suelo del Centro Productivo de la Granja de la Facultad de Zootecnia de la

Universidad Nacional de Piura.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se eligieron 7 muestras al azar del exterior de los corrales. El aislamiento e identificación de

los microorganismos de las muestras de suelo tomadas del Centro Productivo de la granja de

la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional de Piura.se realizó en el laboratorio de

Nutrición Fisiológica de la misma Facultad y Universidad.

El método microbiológico desarrollado en el estudio del suelo constó de siete etapas: En la

primera se tomaron aproximadamente 100 g.de muestras de suelo con guante estéril,

previamente identificadas; en la segunda, se realizaron diluciones seriadas y plaqueo en agar

nutritivo, se incubaron a 30ºC por 24 horas hasta observar crecimiento. A partir del

crecimiento en placas se procedió a realizar el conteo de las colonias que aparecieron en las

cuadrículas del Counter coult de Queboc. En la tercera, se aislaron 100 colonias a partir de las

muestras por dilución y se sembraron en agar nutritivo por el método de estrías sobre agar. En

la cuarta, se subcultivó las muestras de suelo sembradas e incubadas inicialmente en Caldo

triptosa (medio de cultivo de enriquecimiento) en agar común. En la quinta, se sembró en

medios selectivos, para la selección de grupos de organismos se obtuvieron un banco de 100

colonias que se evaluaron en estos medios de cultivo selectivos, para la detección de las

actividades de interés industrial. En la sexta etapa, se realizó la identificación taxonómica

mediante la evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes

substratos evaluándose: la actividad amilolítica en el medio agar nutritivo con almidón

soluble al 1%, la actividad lipolítica en medio agar con aceite de oliva al 1% emulsificado, la

actividad antimicrobiana contra una bacteria Gram-positiva, la síntesis de melanina: agar con

tirosina y sulfato de cobre, la capacidad enzimática, usando un sustrato y la enzima, con el fin

de identificar los microorganismos con la mayor capacidad enzimática. Finalmente se

conservaron las cepas obtenidas, previa confirmación de su pureza.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

100 cepas tuvieron actividad amilolítica interesante con almidón y la positividad frente al test

de lugol. La actividad lipolítica salió negativa, pero con actividad de síntesis de melanina

positiva. Se seleccionaron 9 para su respectiva identificación, las cuales se presentan en la

Tabla 1.

Tabla 1. Selección de algunas cepas amilolíticas aisladas de la granja FAZ-UNP

Nº de

colonias

Descripción Lugol Tipo de M.O

1 Colonias irregulares, amarillas en forma

de abanico

+ Bacilos grampositivos

20 Colonias regulares, medianas, blancas y

brillantes

+ Bacilos grampositivos

41 Colonias medianas, planas, regulares y

blancas

+ Bacilos grampositivos

73 Colonias pequeñas, blancas y cremosas + Bacilos gramnegativos

113 Colonias irregulares, pequeñas y blancas + Bacilos grampositivos

119 Colonias regulares, brillantes y cremosas + Bacilos grampositivos

121 Colonias irregulares, grandes y blancas + Bacilos gramnegativos

130 Colonias irregulares, medianas y blancas + Bacilos gramnegativos

166 Colonias regulares, medianas y cremosas + Bacilos gramnegativos

Las cepas amilolíticas pertenecían a los géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia sp.,

siendo el primero el más predominante dentro de las cepas seleccionadas.

Tabla 2: Clasificación de las cepas amilolíticas seleccionadas según género.

Nº de coloniaPruebas bioquímicas

Género

Oxidasa Catalasa Citrato SIM TSI

1 - + + - + Bacillus sp.

20 - + + + + Bacillus sp.

41 - + - + + Bacillus sp.

73 - + + - + Bacillus sp.

113 - + - + - Kurthia sp.

119 - + + + + Bacillus sp.

121 - - + + - Clostridium sp.

130 - + + + - Bacillus sp.

166 + + + + + Bacillus sp.

Las bacterias mas abundantes en el suelo son pequeños bacilos cocoides de morfología

variable, que dan lugar a pequeñas colonias en medios con agar. En los cultivos jóvenes

predominan los bacilos Gramnegativos, mientras que en cultivos viejos sobre sustrato

favorable, el predominio es de cocos Grampositivos (Sánchez y col, 2005).

Winogradsky clasificó los microorganismos del suelo en autóctonos o indígenas y zimógenos

o fermentadores. Los zimógenos suelen ser escasos y florecen abundantemente cuando se

añade una determinada cantidad de materia orgánica y luego desaparecen al terminarse ésta

(García, 2005).

Las bacterias del suelo son extremadamente resistentes a la sequía, desaparecen las formas

vegetativas pero se mantienen las formas esporuladas. Azotobacter sobrevive tras 30 años de

almacenamiento en seco. Los suelos húmedos son desfavorables para muchas bacterias. El

factor restrictivo es el oxígeno y no el exceso de agua (Sullivan, 2007).

Las temperaturas óptimas para el desarrollo bacteriano se encuentran situadas entre los 25-35º

C. La escala de pH que normalmente toleran las bacterias es la comprendida entre los valores

de 4 y 10. En suelos ácidos los hongos se desenvuelven mejor y la competencia por el

alimento hace descender el número de bacterias. Durante el verano seco y cálido baja la

población microbiana, mientras que en otoño aumenta otra vez; en invierno queda inactiva y

se reanima en la primavera (Sullivan, 2007).

Las modificaciones de la fuente de carbono del medio estándar seleccionado utilizando

almidón, glucosa y dextrina en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el

comportamiento de las cepas seleccionadas cuando utilizamos un medio de cultivo con

almidón o dextrina como fuente de carbono es similar a la obtenidas por Sánchez y col.

(2005); quiénes realizaron la electroforesis de las muestras de fermentaciones realizadas,

observando que las proteínas presentes en el medio de cultivo modificado con almidón son

exactamente las mismas que se expresan en el medio de cultivo modificado con dextrina.

Existen muchos factores como la temperatura, la deshidratación, la purificación, la

congelación etc., que pueden desnaturalizar las proteínas y enzimas. La actividad de las

enzimas depende de la concentración de éstas en el medio fermentado. Sin embargo, los

protocolos utilizados para la determinación de las actividades, tanto, de amiloglucosidasa

como alfaamilasa requieren de una concentración mínima de enzimas para llevar a cabo con

éxito la cuantificación del microorganismo, y que estimulen la expresión de la enzima

amilolítica AMG (Sánchez y col., 2005).

Otras bacterias abundantes del suelo son los bacilos esporulados, que constituyen usualmente

un 25% del total. Los correspondientes al género Bacillus alcanzan valores medios en suelos

del 15 %. Las bacterias nitrificantes como Nitrosomonas y Nitrobacter también se encontraron

y representan menos del 1 % de la población. Se recuperaron también tres cepas

correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus licheniformis y Brevibacterium sp. con

actividad celulolítica. Los microorganismos inmovilizados mostraron 88,6% de actividad para

degradar materia orgánica a las 36 horas. La actividad de las enzimas depende de la

concentración de éstas en el medio fermentado.

La melanina es responsable de la coloración de plantas y animales; se encuentra en los ojos, el

cabello, la piel, el plumaje, la cáscara de los huevos, la cutícula de los insectos, la tinta de los

cefalópodos, en la pared y citoplasma de microorganismos. En los humanos tambíén se ha

encontrado en neuronas y hepatocitos. En la tabla 3, se listan los MO encontrados.

Tabla 3. Síntesis de melanina de microorganismos aislados del suelo de la granja FAZ-

UNP

Tipo de MO Nº encontrado

Aeromonas 63

Mycobacterium leprae 68

Bacillus 70

Pseudomonas aeruginosa, P. putida 72

Streptomyces antibioticus, 96

Fasciola gigantita 5

Aspergillus niger 202

Candida albicans 151

Exophiala (Wangiella) dermatitidis 11

Penicillium marneffei 15

Tabla 4. Resistencia a los antimicóticos, inducida por diferentes tipos de hongos productores

de melanina.

Microorganismo Antifúngico

Aspergillus niger Anfotericina B

Candida albicans Anfotericina B, Fluconazol

Exophiala (Wangiella) dermatitidis Anfotericina B, Fluconazol

Penicillium marneffei Anfotericina B, Fluconazol, Ketoconazol,

Itraconazol, Miconazol, Flucitosina

La presencia de melanina en muchos microorganismos genera mayor resistencia a los

compuestos antimicrobianos y principalmente a los antimicóticos. En el presente estudio se ha

encontrado que los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos

como es el caso de Aspergillus niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y

Exophiala dermatitidis, resistentes a la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei

resistente a seis antimicóticos (Tabla 4); mientras que las bacterias, protozoos y helmintos

mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente

Uran (2008) encontró que, en general, las células melánicas presentaban menor

susceptibilidad que las células nativas (no melánicas) a antimicóticos como ketoconazol,

fluconazol, itraconazol, sulfametazol y anfotericina B; esta última es el antimicótico menos

efectivo sobre las células melánicas, dando dos explicaciones para estos resultados: una, que

la melanina disminuye la permeabilidad de la pared celular, o dos, que la melanina disminuye

el daño de la membrana celular causado por los medicamentos. Sin embargo, no todos ellos

parecen ser resistentes, como es el caso de E. dermatitidis en el que la presencia o ausencia de

melanina no interfiere con la actividad antimicótica.

Finalmente, Gonzáles y col. (2005) han propuesto un modelo de cómo la melanina presente

en la pared de C. neoformans, uno de los hongos más estudiados en este aspecto, forma una

especie de malla que puede presentar dos tipos de poros, unos pequeños que permitirían el

paso de moléculas hasta del tamaño de los anticuerpos y otros que serían inaccesibles para

moléculas de tamaños mayores como los antimicóticos.

El método microbiológico clásico que se empleó en este estudio del suelo, originalmente

desarrollado para muestras acuosas, constó de cinco etapas: (i) dilución de la muestra; (ii)

cultivo en medios de cultivo generales, que proporcionan las condiciones de crecimiento para

todos los microorganismos de la muestra; (iii) cultivo en medios específicos, para la selección

de grupos de organismos; (iv) conteo; e (v) identificación taxonómica, mediante la

evaluación de parámetros bioquímicos, como la fermentación de diferentes substratos

(Parkinson et al., 1971; Schinner et al., 1996). Su empleo en el estudio de suelos se realizó

con ciertos reparos, ya que se asumía que sus premisas no se cumplían totalmente. Primero,

porque el supuesto de una dilución homogénea de la muestra en el caso de los suelos es irreal,

ya que nunca se logra alcanzar dicha condición; segundo, debido a que los organismos están

estrechamente unidos a las partículas del suelo, no se puede lograr una dilución representativa

de todas las especies; y tercero, las condiciones del medio de cultivo general, no aseguran el

crecimiento de todos los microorganismos presentes en la muestra de suelo, ya que las

condiciones aeróbicas, así como las concentraciones de los substratos, no son las óptimas

para todas las comunidades microbianas.

CONCLUSIONES

Se logró obtener un cepario de 100 cepas amilolíticas, de las cuales 9 presentaron mayor

actividad amilolítica y pertenecen a los géneros Bacillus sp , Clostridium sp y Kurthia sp. Se

recuperaron también tres cepas correspondientes a Bacillus megatherium, Bacillus

licheniformis y Brevibacterium sp. con actividad celulolítica, lo cuales degradaron la materia

orgánica a las 36 horas. La capacidad lipolítica no pudo ser detectada en los microorganismos

aislados.

La capacidad de síntesis de melanina se encontró en las bacterias: Aeromonas,

Mycobacterium leprae, Bacillus, Pseudomonas aeruginosa, P. putida, Streptomyces

antibioticus, en el helminto: Fasciola gigantita y en los hongos: Aspergillus niger, Candida

albicans, Exophiala (Wangiella) dermatitidis, Penicillium marneffei. Se ha encontrado que

los hongos que sintetizan melanina son resistentes a algunos antimicóticos como Aspergillus

niger resistente a la Anfotericina B, Candida albicans y Exophiala dermatitidis, resistentes a

la Anfotericina B y Fluconazol y Penicillum marneffei resistente a seis antimicóticos;

mientras que las bacterias, protozoos y helmintos, productores de melanina, encontrados

mostraron ser sensibles a diferentes antimicrobianos y antiparasitarios, respectivamente

Los microorganismos que se lograron aislar del suelo de la granja FAZ-UNP no causan

ningún peligro al medio ambiente, ni a los seres humanos y animales. Estos microbios

benéficos consumen las sustancias que causan la putrefacción, malos olores y enfermedades,

eliminando la mayoría de microbios patógenos por medio de la exclusión competitiva.

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Inglés: © NCAT 2004.Español: © NCAT 2007.