Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre

superficies

RODRIGO HERNAacuteNDEZ SANTIAGO

TESIS DOCTORAL

Doctorado en Ciencias de los Alimentos

Departament de Ciegravencia Animal i dels Aliments

Facultat de Veterinagraveria

Bellaterra Abril 2019

Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre

superficies

TESIS DOCTORAL

MC RODRIGO HERNANDEZ SANTIAGO

DIRECTORES

DIRECTOR Dr ZACARIacuteAS JIMEacuteNEZ SALAS Profesor titular del Departamento de laboratorio de geneacutetica y biologiacutea molecular UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN DIRECTORA Dra REYES PLA SOLER Catedraacutetica del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA

TUTORA Dra MANUELA HERNAacuteNDEZ HERRERO Profesora titular del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS

Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de

Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra

a 21 abril de 2019

Dra Reyes Pla Soler

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y

Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey

NL a 21 de abril de 2019

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas

Si no puedes volar corre

Si no puedes correr camina

Si no puedes caminar gatea

Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante

Martin Luther King jr (1929-1968)

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Aislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre

superficies

TESIS DOCTORAL

MC RODRIGO HERNANDEZ SANTIAGO

DIRECTORES

DIRECTOR Dr ZACARIacuteAS JIMEacuteNEZ SALAS Profesor titular del Departamento de laboratorio de geneacutetica y biologiacutea molecular UNIVERSIDAD AUTOacuteNOMA DE NUEVO LEOacuteN DIRECTORA Dra REYES PLA SOLER Catedraacutetica del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA

TUTORA Dra MANUELA HERNAacuteNDEZ HERRERO Profesora titular del Departament de ciegravencia animal i dels aliments UNIVERSITAT AUTOgraveNOMA DE BARCELONA

PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS

Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de

Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra

a 21 abril de 2019

Dra Reyes Pla Soler

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y

Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey

NL a 21 de abril de 2019

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas

Si no puedes volar corre

Si no puedes correr camina

Si no puedes caminar gatea

Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante

Martin Luther King jr (1929-1968)

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Dra Reyes Pla Soler Catedraacutetica de Tecnologia dels Aliments del Departament de

Ciegravencia Animal i dels Aliments de la Universitat Autogravenoma de Barcelona

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de Doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Bellaterra

a 21 abril de 2019

Dra Reyes Pla Soler

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y

Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey

NL a 21 de abril de 2019

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas

Si no puedes volar corre

Si no puedes correr camina

Si no puedes caminar gatea

Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante

Martin Luther King jr (1929-1968)

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas Profesor titular de la Facultad de Salud Puacuteblica y

Nutricioacuten de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

HACE CONSTAR

Que la memoria titulada ldquoAislamiento y caracterizacioacuten parcial de bacterioacutefagos de

Salmonella spp con potencial aplicacioacuten en el biocontrol sobre superficiesrdquo presentada

por Rodrigo Hernaacutendez Santiago para optar al grado de doctor por la Universitat

Autogravenoma de Barcelona la cual ha sido realizada bajo su direccioacuten y cumple con los

requisitos para su defensa autoriza su presentacioacuten para que sea juzgada por la

comisioacuten correspondiente

Y para que conste a los efectos oportunos firma el presente certificado en Monterrey

NL a 21 de abril de 2019

Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas

Si no puedes volar corre

Si no puedes correr camina

Si no puedes caminar gatea

Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante

Martin Luther King jr (1929-1968)

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Si no puedes volar corre

Si no puedes correr camina

Si no puedes caminar gatea

Pero hagas lo que hagas siempre sigue hacia adelante

Martin Luther King jr (1929-1968)

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Agradecimientos

Este trabajo se ha realizado gracias a la financiacioacuten aportada por el Programa de

mejoramiento del profesorado (PROMEP) PROMEP1035062037 UANL-326 de la

Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) dentro del programa de becas para la

formacioacuten de investigadores y a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para

el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y de

Cooperacioacuten) Programa Extranjeros II-A convocatoria 2010-2011 0000521211

A la Dra Teresa de los Reyes Pla Soler por la confianza depositada en miacute y darme la

oportunidad de ser su estudiante sin sus consejos no hubiera sido posible concluir esta

tesis

Al Dr Zacariacuteas Jimeacutenez Salas por ser un guiacutea durante mi formacioacuten como

investigadora por sus ensentildeanzas con palabras y el ejemplo y por su apoyo en el

aspecto profesional y personal

Al Dr Joseacute Juan Rodriacuteguez Jerez por su gran apoyo acadeacutemico y por permitirme

trabajar desinteresadamente en las instalaciones y con el equipo de laboratorio

A la Dra Manuela Hernaacutendez Herrero que es una gran persona que me ha apoyado

desde el peincipio de estos estudios

A la Dra Marta Capellas Puig que me ha alentado todo el tiempo para terminar de

buena manera

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

Dedicatorias

Con mucho carintildeo a mi Sentildeor padre Bartolomeacute Hernaacutendez Balbuena (dagger) y a mi Sentildeora

madre Lucia Santiago Santos son un ejemplo en mi vida ya que ellos son fundamentales

en mi formacioacuten como persona

A mis hermanos Flavio Viacutector Manuel Guadalupe Hilda (dagger) porque siempre

estuvieron alliacute alentaacutendome en este trabajo con palabras experiencias etc

A mi prometida y futura esposa Dontildea Rosa Salas Martiacutenez desde que inicmos a estar

juntos siempre estaacute apoyaacutendome en todos los aspectos y en todas las cosas que he

emprendido y que con algunas locuras que se nos pueda ocurrir mas adelante nos

llevaraacute a mejores cosas cada diacutea

A mi hija Gabriela Sarahi Hernaacutendez Flores ella es lo que maacutes aprecio y espero vea

en mi un ejemplo que sirva para alentarla a ser cada diacutea mejor y sacar todas las cosas

que se proponga adelante

A mis compantildeeros y amigos Vannesa Fabio Fontecha Abel Rita Jacira Kathy

Genaro Fabio Poliseli Dora Cecilia Diana Angela Sonia Dolors Marco y Cristina por

las convivencias durante mi estancia en Espantildea que de alliacute solo me llevo grandes

recuerdos

A mis compantildeeros Mirna Patty Letty Tere Adelita Luluacute Betty Marco Arnoldo Joseacute

Luis y Gustavo que compartimos buena cantidad de tiempo gracias por las convivencias

y por los muchos trabajos que hicimos en equipo

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

CONTENIDO RESUMEN 1

SUMMARY 3

RESUM 5

I INTRODUCCIOacuteN 7

Presentacioacuten del proyecto 9

Justificacioacuten 10

II ANTECEDENTES 13

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos 15

A1 Problemaacutetica 16

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea 17

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria 19

B1 Escherichia 19

B2 Campylobacter 20

B3 Enterobacter 21

B4 Listeria 22

B5 Salmonella 23

B51 Origen 23

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp 25

B53 Manifestaciones cliacutenicas 27

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis 28

C Crecimiento microbiano 30

C1 Crecimiento de los microorganismos 30

C11 Disponibilidad del agua 31

C12 Acidez y pH 31

C13 Oxiacutegeno 31

C14 Temperatura 32

D Control del crecimiento microbiano 34

D1 Agentes fiacutesicos 34

D2 Agentes quiacutemicos 35

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

E Fagos 35

E1 Antecedentes 35

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos 37

E3 Clasificacioacuten de los fagos 37

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico 39

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten 39

F Biofilm 40

G Microscopiacutea electroacutenica 41

H Fagoterapia 42

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 47

A Objetivo general 49

B Objetivos especiacuteficos 49

C Plan de trabajo 49

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS 51

A Toma de muestras 53

B Obtencioacuten de fagos 54

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos 55

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas 56

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos 56

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC) 58

B6 Modelo de infeccioacuten 59

B7 Controles utilizados durante los ensayos 60

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium 60

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos 61

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica 63

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 64

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM 65

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 67

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras 69

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis 70

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S Typhimurium 70

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium 72

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis 72

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis 73

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten 73

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli 75

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM 80

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa (DEM) 81

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable 83

VI CONCLUSIONES 89

VII BIBLIOGRAFIacuteA 93

Iacutendice de figuras

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa 16

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por Salmonella spp 24

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella 24

Figura 4 Adsorcioacuten del bacterioacutefago T4 e inyeccioacuten del ADN 39

Figura 5 Diagrama general de trabajo 50

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten bacterioacutefago-hueacutesped 59

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten 62

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por bacterioacutefagos 74

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria 79

Figura 10 Imagen por TEM del bacterioacutefago MRH6 80

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 81

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable 82

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes del DEM 84

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 por el fago MRH6helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip86

Iacutendice de tablas

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias 19

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos 25

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales 33

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos 38

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos 44

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria 45

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos 54

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten 57

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos 70

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC 71

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium 72

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis 73

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten 75

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades 77

Lista de abreviaturas y acroacutenimos

ADN Aacutecido desoxirribonucleico

ARN Aacutecido ribonucleico

ADC Agar doble capa

AS Agar suave

AECID Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el

Desarrollo

ATCC American Type Culture Collection

APPCC Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control

aw Actividad del agua

BGA Agar verde brillante

BHI Infusioacuten cerebro corazoacuten

CCUG Culture Collection University of Goumltenborg

CENAVECE Centro Nacional de Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de

Enfermedades

CETC Coleccioacuten Espantildeola de Cultivos Tipo

CINSP Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica

EDTA Etilendiaminotetraceacutetico

DEM Microscoacutepica de epifluorescencia directa

EE UU Estados Unidos de Norteameacuterica

ETA Enfermedades transmitidas por alimentos

FAO Food and Agriculture Organization (Organizacioacuten de las

Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura)

FaSPyN Facultad de Salud Puacuteblica y Nutricioacuten UANL

FAUANL Facultad de Agronomiacutea UANL Unidad Mariacuten NL

FCB Facultad de Ciencias Bioloacutegicas UANL

HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points (Anaacutelisis de

Peligros y Puntos Criacuteticos de Control)

INEGI Instituto Nacional de Estadiacutestica y Geografiacutea de los Estados

Unidos Mexicanos

nd Aparente baja efectividad o halo difuso

OMS Organizacioacuten Mundial de la Salud

PANALIMENTOS Instituto Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y

Zoonosis

PEG Polietilenglicol

SDS Dodecilsulfato soacutedico

SIRVETA Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos

SSF Solucioacuten salina fisioloacutegica

SUH o SHU Siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico

TEM Microscopio electroacutenico de transmisioacuten

TSA Agar soya de tripicasa

TSAYE TSA con 06 de extracto de levadura

TSB Caldo de soja trypticasa

UAB Universitat Autogravenoma de Barcelona

UANL Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten

ZMM Zona Metropolitana de Monterrey

RESUMEN

La inocuidad alimentaria es un tema amplio y relevante que impacta directamente en todos

los segmentos de la sociedad involucra productores desarrolladores innovadores

consumidores y gobierno ademaacutes de diversos sectores como la industria la ingenieriacutea y hasta

la educacioacuten Sin embargo las nuevas tecnologiacuteas en la cadena de produccioacuten provocan que

eacutesta sea maacutes larga y compleja

Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) causan alta morbilidad y varios casos

de mortalidad Entre los agentes infecciosos maacutes comunes se encuentran Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Los bacterioacutefagos o fagos son virus bacterianos especiacuteficos de una ceacutelula hueacutesped en la

cual se multiplican invadiendo su maquinaria de material geneacutetico Son los sistemas bioloacutegicos

maacutes abundantes del planeta se encuentran en el medio ambiente y se introducen y conviven

en la flora intestinal de otros seres cuando eacutestos ingieren diversos alimentos ya sean de tipo

animal o vegetal

El objetivo del presente trabajo fue aislar y probar la especificidad de una serie de fagos de

Salmonella spp a partir de aguas residuales para lo cual se utilizaron muestras de agua

recolectadas de diferentes localidades del aacuterea metropolitana de Monterrey N L Meacutexico La

purificacioacuten de fagos se llevoacute a cabo mediante la teacutecnica de agar doble capa (ADC) hasta

obtener placas liacuteticas uniformes y se usaron diferentes cepas de referencia de Salmonella

como cultivos indicadores

Se aislaron un total de 15 fagos putativamente distintos de los cuales al pasar las pruebas

de replicacioacuten soacutelo uno logroacute mantener la capacidad liacutetica Se seleccionoacute y purificoacute para

realizar pruebas in vitro especiacuteficas para Salmonella Se utilizoacute una concentracioacuten de fagos

de 1x1012 UFPmL para analizar al fago mediante su morfologiacutea por microscopiacutea electroacutenica

la cual se identificoacute como miembro de la familia Siphoviridae Asiacute mismo se probaron los fagos

contra Salmonella in situ en discos de acero que simulan las superficies de trabajo y para

analizar el efecto de la infeccioacuten del fago sobre Salmonella en los discos de acero inoxidable

se utilizoacute el microscopio de epifluorescencia

Para el conteo de fagos se utilizoacute los meacutetodos LIVEDEAD Para finalizar para evaluar la

efectividad del fago MRH6 que resulto liacutetico en nuestro ensayo se procedioacute a dar las

condiciones necesarias para la formacioacuten del biofilm de Salmonella sobre superficies de acero

inoxidable El fago MRH6 fue capaz de disgregar los biofilms a temperatura ambiente Las

mayores reducciones de Salmonella en un menor tiempo se obtuvieron con concentraciones

de fago mayores a 1x108 UFPmL El meacutetodo de cultivo mostroacute reducciones del patoacutegeno a

niveles indetectables sin embargo la tincioacuten vital reveloacute la presencia de ceacutelulas viables

(coloracioacuten verde) que podriacutea representar un riesgo de contaminacioacuten cruzada estas

pudieran tambieacuten presentarse por la presencia de material orgaacutenico Este trabajo con un fago

puede proporcionar una medida adyuvante para controlar la contaminacioacuten de superficies de

acero inoxidable con biofilms de Salmonella La DEM resultoacute ser una buena herramienta para

evaluar raacutepida y adecuadamente por observacioacuten y posterior anaacutelisis el efecto de los fagos

SUMMARY

Food safety is a broad and relevant issue that directly affects all aspects of society involving

producers developers innovators consumers and government as well as various sectors

such as industry engineering and even education However new technologies in the

production chain cause it to be longer and more complex

Foodborne diseases (ETA) cause high morbidity and several cases of mortality Among the

most common infectious agents are Salmonella spp Campylobacter spp Escherichia coli

Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus Clostridium botulinum Listeria

monocytogenes and Staphylococcus aureus

Bacteriophages or phages are bacterial viruses specific to a host cell in which they multiply

by invading their machinery of genetic material They are the most abundant biological systems

on the planet they can be found in the environment In organisms they enter and coexist in

the intestinal flora of other beings when they ingest various foods whether animal or vegetable

The objective of this study was to isolate and test the specificity of a series of phages of

Salmonella spp from wastewater for which water samples were collected from different

locations in the metropolitan area of Monterrey N L Meacutexico The purification of phages was

carried out by means of the double layer agar technique (ADC) until uniform lithic plates were

obtained and different Salmonella reference strains were used as indicator cultures

A total of 15 putatively different phages were isolated of which upon passing the replication

tests only one managed to maintain the lytic capacity It was selected and purified to perform

specific in vitro tests for Salmonella A phage concentration of 1x1012 PFUmL was used to

analyze the phage by means of its electron microscopy morphology which was identified as a

member of the Siphoviridae family Likewise the phages against Salmonella were tested in

situ on steel discs simulating the work surfaces and the epifluorescence microscope was used

to analyze the effect of phage infection on Salmonella on the stainless steel discs

For the phage count the LIVE DEAD Finally in order to evaluate the effectiveness of the

phage MRH6 that was lytic in our trial the necessary conditions for the formation of the

Salmonella biofilm on stainless steel surfaces were established The phage MRH6 was able

to disintegrate the biofilms at room temperature The greatest reductions of Salmonella in a

shorter time were obtained with phage concentrations greater than 1x107 PFUmL The culture

method showed reductions of the pathogen to undetectable levels however vital staining

revealed the presence of viable cells (green coloration) which could represent a risk of cross

contamination these could also be presented by the presence of organic material This work

with a phage can provide an adjuvant measure to control contamination of stainless steel

surfaces with Salmonella biofilms The DEM proved to be a dependable tool to quickly and

adequately evaluate the effect of phages by observation and subsequent analysis

RESUM

La innocuiumltat alimentagraveria eacutes un tema ampli i rellevant que impacta directament en tots els

segments de la societat involucra productors desenvolupadors innovadors consumidors i

govern a meacutes de diversos sectors com la induacutestria lenginyeria i fins a leducacioacute No obstant

aixograve les noves tecnologies en la cadena de produccioacute provoquen que aquesta sigui meacutes llarga

i complexa

Les malalties transmeses per aliments (ETA) causen alta morbiditat i diversos casos de

mortalitat Entre els agents infecciosos meacutes comuns es troben Salmonella spp

Campylobacter spp Escherichia coli Clostridium perfringens Vibrio parahaemolyticus

Clostridium botulinum Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus

Els bacteriogravefags o fags soacuten virus bacterians especiacutefics duna cegravelmiddotlula hoste en la qual es

multipliquen envaint la seva maquinagraveria de material genegravetic Soacuten els sistemes biologravegics meacutes

abundants del planeta es troben en el medi ambient i sintrodueixen i conviuen en la flora

intestinal daltres eacutessers quan aquests ingereixen diversos aliments ja siguin de tipus animal

o vegetal

Lobjectiu del present treball va ser aiumlllar i provar lespecificitat duna segraverie de fags de

Salmonella spp a partir daiguumles residuals per a aixograve es van utilitzar mostres daigua recollides

de diferents localitats de lagraverea metropolitana de Monterrey N L Megravexic La purificacioacute de fags

es va dur a terme mitjanccedilant la tegravecnica dagar doble capa (ADC) fins a obtenir plaques liacutetiques

uniformes i es van usar diferents soques de referegravencia de Salmonella com a cultius indicadors

Es van aiumlllar un total de 15 fags possiblement diferents dels quals en passar les proves

de replicacioacute nomeacutes un va aconseguir mantenir la capacitat liacutetica Es va seleccionar i va

purificar per realitzar proves in vitro especiacutefiques per Salmonella Es va utilitzar una

concentracioacute de fags de 1x1012 UFPmL per analitzar fag mitjanccedilant la seva morfologia per

microscogravepia electrogravenica la qual es va identificar com a membre de la famiacutelia Siphoviridae Aixiacute

mateix es van provar els fags contra Salmonella in situ en discos dacer que simulen les

superfiacutecies de treball i per analitzar lefecte de la infeccioacute del fag sobre Salmonella en els

discos dacer inoxidable es va utilitzar el microscopi depifluorescegravencia

Per al recompte de fags es va utilitzar els megravetodes LIVE DEAD Per finalitzar per avaluar

lefectivitat del fag MRH6 que va resultar liacutetic en el nostre assaig es va procedir a donar les

condicions necessagraveria per a la formacioacute del biofilm de Salmonella sobre superfiacutecies dacer

inoxidable El fag MRH6 va ser capaccedil de disgregar els biofilms a temperatura ambient Les

majors reduccions de Salmonella en un menor temps es van obtenir amb concentracions de

fag majors a 1x107 UFP mL El megravetode de cultiu va mostrar reduccions del patogen a nivells

indetectables perograve la tincioacute vital revelar la presegravencia de cegravelmiddotlules viables (coloracioacute verda)

que podria representar un risc de contaminacioacute creuada aquestes poguessin tambeacute

presentar-se per la presegravencia de material orgagravenic Aquest treball amb un fag pot proporcionar

una mesura adjuvant per controlar la contaminacioacute de superfiacutecies dacer inoxidable amb

biofilms de Salmonella La DEM va resultar ser una bona eina per avaluar ragravepida i

adequadament per observacioacute i posterior anagravelisi lefecte dels fags

7

I INTRODUCCIOacuteN

Introduccioacuten

8

Introduccioacuten

9

Presentacioacuten del proyecto

Se realizoacute una revisioacuten bibliograacutefica sobre las innovaciones en seguridad alimentaria en

Meacutexico la cual puso en evidencia la necesidad de analizar alternativas enmarcadas en el

aacutembito del uso de las tecnologiacuteas verdes lo que presentoacute la posibilidad de desarrollar un

trabajo innovador y que no se estuviera aplicando ya en el sector alimentario local o nacional

De esa manera se inician las actividades experimentales que para este trabajo doctoral se

dividieron en dos partes la primera realizada en Meacutexico y la segunda en Espantildea

En primera instancia se desarrolloacute un anaacutelisis en el Laboratorio de geneacutetica y biologiacutea

molecular del Centro de Investigacioacuten en Nutricioacuten y Salud Puacuteblica (CINSP) en el Campus

Ciencias de la Salud de la Universidad Autoacutenoma de Nuevo Leoacuten (UANL) y gracias al apoyo

de Programa de mejoramiento del profesorado (PROMEP nuacutemero UANL-326) por medio de

una beca se iniciaron los estudios y asiacute se cumplioacute el primer propoacutesito que fue obtener virus

nativos contra cepas de Salmonella y purificarlos

Posteriormente para lograr los demaacutes objetivos que eran realizar la caracterizacioacuten parcial

de los fagos contra Salmonella se solicitoacute una beca a la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten

Internacional para el Desarrollo (Becas MAEC-AECID del Ministerio de Asuntos Exteriores y

de Cooperacioacuten curso 2010-2011) con el fin de realizar una estancia de investigacioacuten y crear

oportunidades de desarrollo aprovechando las tecnologiacuteas innovadoras disponibles en la

Universitat Autoacutenoma de Barcelona (UAB) considerando ademaacutes que la alta reputacioacuten de la

institucioacuten y la supervisioacuten por parte de sus investigadores impactariacutean positivamente en el

desarrollo del trabajo y en el Curriculum Vitae del investigador y por consiguiente en su futuro

profesional como docente e investigador

Otra finalidad de este proyecto fue dejar un buen referente al concluir la estancia ya que

ello ofreceriacutea nuevas oportunidades para seguir forjando el perfil del investigador cimentaraacute

cualquier trayectoria profesional y facilitariacutea optar por un plan postdoctoral en esta misma

Universidad De esta manera se accedioacute a la beca del Programa Extranjeros II-A

Convocatoria 2010-2011 Nuacutemero 0000521211 del cual se cumplieron los objetivos

establecidos y otros maacutes por ejemplo conocer nuevas tecnologiacuteas

Siendo eacutesta una liacutenea de investigacioacuten relativamente reciente en Meacutexico se espera que

impacte en las posibilidades laborales en diversos contextos y seacutea de utilidad para sentar

precedentes para futuras liacuteneas de trabajo en dicha aacuterea

Introduccioacuten

10

Justificacioacuten

En las uacuteltimas deacutecadas los cambios ocurridos en la produccioacuten y consumo de alimentos

han tenido un impacto sobre la inocuidad alimentaria La industria en la produccioacuten masiva de

alimentos ha evolucionado de ser local a constituirse en otra donde la produccioacuten yo el

procesamiento estaacuten localizados en diferentes partes del paiacutes o del mundo Por otra parte la

poblacioacuten estaacute envejeciendo por lo que se vuelve maacutes vulnerable a problemas de salud

ademaacutes los agentes patoacutegenos son cada vez maacutes virulentos (DeWaal y Barlow 2014)

Los reportes sobre problemas gastrointestinales que recopila el Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades (CENAVECE) indican que Nuevo

Leoacuten ha permanecido dentro de los primeros 12 lugares de casos de fiebre tifoidea y en los

primeros 14 de fiebre paratifoidea y otras salmonelosis A nivel nacional las enfermedades

infecciosas intestinales se ubican entre las primeras 10 causas de mortalidad de nintildeos en

edad escolar entre los 5 y 14 antildeos de edad (CENAVECE 2007)

Los microorganismos del geacutenero Salmonella pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

Son bacilos o cilindros con puntas redondeadas y se diferencian de las demaacutes enterobacterias

mediante reacciones bioquiacutemicas y de aglutinacioacuten existen maacutes de 2500 serotipos todos

ellos patoacutegenos Actualmente se considera una sola especie denominada Salmonella

enterica de la cual seguacuten el esquema de Kauffmann-White se clasifican nueve serogrupos

Esta especie tiene importancia cliacutenica debido a que es la uacutenica capaz de infectar animales

homeotermos esta investigacioacuten se centra en cuatro serovariedades Salmonella enterica

serovar Typhimurium (S Typhimurium) S enterica serovar Paratyphi (S Paratyphi) S

enterica serovar Enteritidis (S Enteritidis) y S enterica serovar Typhi (S Typhi) estos

microorganismos se pueden aislar tanto de fuentes alimentarias (carne de res pollo crudo

huevo fresco carne de puerco almejas chorizos vegetales entre otros) como del medio

ambiente (suelo agua materia fecal y superficies) (Chlebicz y Śliżewska 2018 Nguendo

2018)

En Meacutexico S Enteritidis y S Typhimurium son los microorganismos aislados con mayor

frecuencia en las salmonelosis Normalmente S Enteritidis habita en el intestino de los

animales sin causar enfermedad pero puede infectar a humanos y promover diarrea voacutemito

dolor abdominal calambres y ocasionalmente insuficiencia renal y en los peores casos la

muerte (DeWaal y Barlow 2014) La contaminacioacuten de alimentos por Salmonella spp se debe

Introduccioacuten

11

a una combinacioacuten de factores relacionados con la produccioacuten a gran escala o cambios en el

manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los mismos (Uribe y Suarez 2006)

Por otra parte estaacuten los virus que pueden replicarse independientemente de los

cromosomas de una ceacutelula pero no sin su participacioacuten (Madigan y Martinko 2006) El hecho

de descubrir virus que pueden infectar y destruir bacterias fue recibido con optimismo por su

posible aplicacioacuten en usos terapeacuteuticos (McLaughlin et al 2006)

En un estudio realizado en diversos estados de Meacutexico (Coahuila Durango Estado de

Meacutexico Jalisco Morelos Oaxaca Puebla y Quereacutetaro) se ha fagotipado Salmonella spp

proveniente de huevo carne de pollo de engorde y gallinas progenitoras reproductoras de

postura comercial y productoras (Mancera et al 2004) Ademaacutes diversas investigaciones han

utilizado fagos liacuteticos para reducir la contaminacioacuten por Salmonella en pollos (canal y piel)

semillas germinadas y dulces de frutas cortadas (Goode et al 2003)

El uso de aditivos en los alimentos se ha reducido considerablemente debido al rechazo

generalizado por parte de los consumidores lo que podriacutea repercutir en un incremento en los

casos de intoxicaciones alimentarias En este contexto los fagos aportan ventajas sobre los

desinfectantes conocidos y los meacutetodos tradicionales de aplicacioacuten de friacuteo o calor ya que

pueden actuar como agentes de deteccioacuten y control bioloacutegico de bacterias patoacutegenas en

alimentos y su produccioacuten es relativamente raacutepida y econoacutemica (Atterbury et al 2003)

La utilidad de los fagos en el aacuterea de investigacioacuten es amplia una posible utilidad es ser

un instrumento para identificar cepas bacterianas especiacuteficas Tambieacuten se han utilizado para

el estudio de diversos fenoacutemenos moleculares el trabajo con estos virus permitioacute desarrollar

ensayos de placas de lisis conocer la naturaleza del ciclo de vida viral los tipos de mutaciones

geneacuteticas y los genes como segmentos de aacutecido desoxirribonucleico (ADN) (Muniesa et al

2005)

Las empresas dedicadas a la biotecnologiacutea (Intralytix Omnilytics) se centran en desarrollar

productos utilizando fagos especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan las ETA y estos

productos comerciales de terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

(Segundo 2010) Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos antildeos debido a sus

caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutefico sin dantildear la microbiota

en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros distribucioacuten de

Introduccioacuten

12

esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla (Oh y Park

2017)

En este sentido el objetivo general de este estudio es el aislamiento y caracterizarizacion

de fagos contra Salmonella a partir de diversas fuentes para su uso potencial en el control

bioloacutegico

13

II ANTECEDENTES

Antecedentes

14

Antecedentes

15

A Las enfermedades trasmitidas por los alimentos

A nivel internacional la produccioacuten de alimentos y todos los mecanismos tecnoloacutegicos

involucrados en su procesamiento implican ademaacutes de la optimizacioacuten de los tiempos y de

la calidad un riesgo para la adquisicioacuten de enfermedades inherentes a la misma adopcioacuten

de nuevas tecnologiacuteas (Weaver et al 2017)

La OMS (2017) estima que las enfermedades diarreicas son la segunda mayor causa de

muerte de nintildeos menores de cinco antildeos matan a 525000 nintildeos menores de cinco antildeos

cada antildeo una proporcioacuten significativa de las enfermedades diarreicas se puede prevenir

mediante el acceso al agua potable y a servicios adecuados de saneamiento e higiene

ademaacutes de que en todo el mundo se producen unos 1700 millones de casos de

enfermedades diarreicas infantiles cada antildeo

Seguacuten la OMS (2017) existen diferentes condiciones que propician el desarrollo de las

ETA Como son las de tipo bioloacutegico producidos por hongos o bacterias causantes de

enfermedades ya sea por sus metabolitos o toxinas virus o huevecillos de paraacutesitos asiacute

como los venenos de algunos peces y plantas Las de tipo quiacutemico como productos de

limpieza o desinfeccioacuten pesticidas toxinas marinas insecticidas o venenos y fiacutesicos cuando

en la materia prima de los alimentos se encuentran objetos como vidrios metal piedras

grapas barniz de untildeas joyeriacutea cabellos o cualquier elemento extrantildeo

De acuerdo con el Sistema Regional de Informacioacuten para la Vigilancia de las

Enfermedades Transmitidas por Alimentos (SIRVETA) ndashdesarrollado por el Instituto

Panamericano de Proteccioacuten de Alimentos y Zoonosis (PANALIMENTOS)ndash ocurrieron 1683

brotes de ETA en Meacutexico que ocasionaron 53860 casos de enfermedades y provocaron

207 muertes mientras que en los demaacutes paiacuteses de Ameacuterica Latina se produjeron durante el

mismo periacuteodo 6324 brotes que provocaron 228579 casos y 314 muertes (Forsythe y

Hayes 2002) Cabe aclarar que eacutestos son soacutelo los brotes notificados por la autoridad

competente El sistema utilizado internacionalmente para obtener alimentos inocuos es el

APPCC (Anaacutelisis de Peligros y Puntos Criacuteticos de Control) o HACCP (por sus siglas en ingleacutes

Hazard Analysis and Critical Control Points) que se puede implementar en cualquier tipo de

industria y permite prevenir controlar y eliminar cualquier peligro antes de consumir los

alimentos (Rodriacuteguez Torrens et al 2015)

En Meacutexico el Distintivo H es un programa implementado por los servicios alimentarios

Antecedentes

16

oficiales mediante el cual se ofrece a los clientes alimentos seguros El Centro Nacional de

Vigilancia Epidemioloacutegica y de Control de Enfermedades de Meacutexico (CENAVECE) advierte

que uno de los problemas de salud maacutes importantes lo constituyen los trastornos

gastrointestinales cuya mortalidad predomina entre los 5 y los 14 antildeos Entre 2006 y 2012

el Estado de Nuevo Leoacuten ha permanecido entre los primeros 7 lugares de casos de diarrea

(CENAVECE 2018)

La figura 1 muestra la distribucioacuten de la incidencia en Meacutexico la cual estaacute asociada a la

densidad demograacutefica y la accesibilidad a servicios de salud que facilitan el registro es asiacute

que son precisamente las entidades federativas con mayor poblacioacuten quienes registran

nuacutemeros maacutes altos

Figura 1 Tasa de incidencia de enfermedad diarreica aguda por entidad federativa en

Meacutexico 2010-2012 (CENAVECE 2018)

A1 Problemaacutetica

La inocuidad alimentaria es una preocupacioacuten mundial que se refleja en el incremento

de reportes y noticias relacionadas con la contaminacioacuten de los alimentos difundidos en

diversos paiacuteses a su vez estos productos son retirados del mercado lo que provoca

peacuterdidas por varios cientos de millones de doacutelares El Codex Alimentarius indica que las ETA

y los dantildeos provocados por los alimentos son en el mejor de los casos desagradables y

Antecedentes

17

en el peor fatales y pueden influir negativamente en el comercio y la confianza de los

consumidores Por consiguiente es imprescindible un control eficaz de la higiene Todos los

eslabones de la cadena alimentaria ndashfabricantes elaboradores manipuladores y

consumidores de alimentosndash son responsables del control de los riesgos microbioloacutegicos

desde la explotacioacuten agriacutecola o ganadera hasta el consumidor final Desde esta oacuteptica el

anaacutelisis de riesgos deberiacutea aplicarse dentro de un contexto estrateacutegico organizativo y

operacional reconocido si bien en el proceso puede haber elementos comunes establecer

un nivel apropiado de proteccioacuten en esos sectores puede representar las maacuteximas

diferencias (Atterbury et al 2003)

La OMS ha identificado siete microorganismos patoacutegenos ndashC jejuni C perfringens E

coli 0157H7 L monocytogenes Salmonella spp S aureus y T gondiindash que causan entre

123 y 33 millones de casos de infeccioacuten solamente en los EE UU lo que representa

peacuterdidas econoacutemicas de entre 5500 y 34900 millones de doacutelares Ademaacutes resalta que su

incidencia podriacutea ser de 300 a 350 veces mayor de lo que indican las estadiacutesticas dado que

soacutelo se notifica un nuacutemero relativamente pequentildeo de casos de ETA Se estima que 70 de

los 1500 millones de episodios de diarrea son causados por alimentos en mal estado Es

posible que en los paiacuteses en desarrollo se notifique a las autoridades sanitarias una

proporcioacuten de casos auacuten inferior principalmente por pobreza y escasez de recursos a

disposicioacuten de los servicios de gestioacuten de la inocuidad alimentaria e inspeccioacuten de alimentos

(Van de Venter 2000)

A2 Infeccioacuten del tracto digestivo diarrea

La OMS estima que el 88 de los casos de diarrea a nivel mundial son atribuibles al

agua el saneamiento y la higiene todos los aspectos de inocuidad de los alimentos estaacuten

relacionados con estos factores En menor medida la enfermedad se transmite a traveacutes de

otras viacuteas por ejemplo el aire y alrededor del 94 de los casos son atribuibles al

saneamiento ambiental el total de fallecimientos se calcula en maacutes de 15 millones

principalmente en nintildeos en los paiacuteses desarrollados el promedio es ligeramente menor a

90 La diarrea atribuible al agua y saneamiento inapropiado representa 53 de las

muertes totales y 35 en nintildeos europeos de 0-14 antildeos y es ademaacutes una de las causas

principales de malnutricioacuten (Pruumlss-Uumlstuumln y Corvalaacuten 2006)

Antecedentes

18

Las enfermedades diarreicas constituyen un problema de salud puacuteblica en el mundo

especialmente en paiacuteses en desarrollo Su alta incidencia se debe en gran parte a la

ingestioacuten de alimentos contaminados con microorganismos patoacutegenos como Salmonella

que causa episodios de diarrea aguda Salmonella spp es uno de los patoacutegenos enteacutericos

maacutes frecuentes tanto en paiacuteses desarrollados como subdesarrollados Dependiendo de la

especie tamantildeo del inoacuteculo factores de virulencia expresados por la cepa hueacutesped

involucrado estado inmunoloacutegico del paciente e intervencioacuten meacutedica puede ocasionar una

infeccioacuten gastrointestinal de media a severa hasta una infeccioacuten sistemaacutetica que

comprometa la vida del paciente (Fernaacutendez 2008)

Otros microorganismos que tambieacuten pueden contaminar el agua y los alimentos como

bacterias (Bacillus cereus Clostridium botulinum Campylobacter jejuni Vibrio cholera) virus

(Norwalk Rotavirus Hepatitis A) y paraacutesitos (Entamoeba histolytica Cryptosporidium

parvum Toxoplasma gondii) pueden transmitirse tambieacuten de una persona a otra como

resultado de una higiene deficiente (Freedman et al 2015)

Estudios de empresas dedicadas exclusivamente a la crianza de cerdos reportan

epidemias como el virus de la diarrea porcina la cual posteriormente se transmite a los

consumidores de estas carnes contaminadas ya sea por contacto con las heces o por

consumo de carnes contaminadas lo cual implica tambieacuten una peacuterdida econoacutemica para la

industria alimentaria resaltando la necesidad de establecer medidas preventivas y

correctivas seguacuten sea el caso (Huss et al 2017)

Seguacuten la Organizacioacuten de las Naciones Unidas para la Alimentacioacuten y la Agricultura (FAO

por sus siglas en ingleacutes Food and Agriculture Organization) las toxiinfecciones alimentarias

son la segunda causa de morbilidad pero muchas permanecen sin declarar quizaacutes por su

mediana severidad y recuperacioacuten raacutepida salvo el coacutelera Los alimentos son susceptibles a

contaminacioacuten de todo tipo la fuente de agentes causales suele ser el tracto gastrointestinal

de individuos reservorios o las heces de animales y humanos infectados o bien agua

corrompida que por deficiencias sanitarias contamina carne fresca pescados moluscos

pasteles de crema y leche no pasteurizada entre otros productos (Riacuteos et al 2012) como

se puede observar en la tabla 1

Antecedentes

19

Tabla 1 Caracteriacutesticas de algunas toxiinfecciones alimentarias (Riacuteos et al 2012)

Agente Periacuteodo de

incubacioacuten Fuente Agente patoacutegeno

Salmonella spp 8-24 h Aves huevos mascotas

(tortugas lagartos pollos) Bacteria y endotoxina

E coli

enterotoxigeacutenica 24-72 h

Agua y alimentos

contaminados

Enterotoxina

termoestable

V cholerae 24-72 h Alimentos contaminados Enterotoxina termolaacutebil

Shigella spp 24-72 h Agua y alimentos

contaminados Bacteria y endotoxina

C jejuni 1-7 d Leche aves de corral y

agua no potable

Bacteria y Enterotoxina

termolaacutebil

Yersinia spp 1-7 d Carne de cerdo leche Bacteria y Enterotoxina

B Patoacutegenos importantes en la industria alimentaria

La historia referente a las toxiinfecciones alimentarias se comienza a documentar y

legislar en el siglo X con el botulismo en Bizanzio y documentos sobre el ergotismo en el

siglo XVI En el siglo XIX aparecen los alimentos enlatados y Louis Pasteur asocia el

deterioro de los alimentos con las bacterias En el siglo XX se produce un desarrollo

espectacular de la microbiologiacutea de los alimentos con el establecimiento de la etiologiacutea de

las toxiinfecciones alimentarias el comienzo de una nueva era de la quiacutemica e ingenieriacutea

alimentaria Aunado a los movimientos migratorios de las personas la diversificacioacuten de

alimentos la produccioacuten masiva de alimentos y la facilidad de transporte desde puntos

lejanos entre la produccioacuten y preferencia en el consumo de alimentos aunadas a la

capacidad que tienen los microorganismos para evolucionar y adaptarse a su medio

ambiente hacen pensar en estos microorganismos como patoacutegenos emergentes (DeWaal y

Barlow 2014)

B1 Escherichia

Las cepas de E coli se pueden diferenciar seroloacutegicamente por los antiacutegenos somaacuteticos

(O) flagelares (H) y capsulares (K) Ademaacutes pueden hallarse fimbrias y estructuras

Antecedentes

20

emparentadas que desempentildean un papel en la patogenia Actualmente se reconocen cinco

grupos de E coli causantes de diarrea en funcioacuten del siacutendrome que provocan cuyas

diferencias estaacuten codificadas por plaacutesmidos (Wright et al 2017) Los diferentes tipos son

E coli enteropatoacutegeno (EPEC) es responsable de la diarrea acuosa en lactantes

Produce voacutemitos fiebre y diarrea acuosa con mocos pero sin sangre Coloniza las

microvellosidades de todo el intestino produciendo la lesioacuten de ldquoadhesioacuten y erosioacutenrdquo en

el ribete en cepillo de la membrana de la vellosidad Afecta a adultos y nintildeos menores de

dos antildeos siendo este rango de edad el principal factor de riesgo

E coli enterotoxigeacutenico (ETEC) es el causante de la llamada vulgarmente ldquodiarrea

del viajerordquo se manifiesta con diarrea acuosa como agua de arroz y poca fiebre

Coloniza la porcioacuten proximal del intestino delgado Afecta a adultos y nintildeos son una causa

frecuente de diarrea en lactantes de paiacuteses en desarrollo asiacute como la causa maacutes comuacuten

de diarrea en individuos de paiacuteses industrializados que viajan a zonas menos

desarrolladas del mundo

E coli enteroinvasor (EIEC) coloniza el colon origina fiebre y diarrea profusa con

heces que contienen mocos y estriacuteas sanguinolentas Presenta un plaacutesmido de 120-140

mD conocido como plaacutesmido invasivo que lleva todos los genes necesarios para la

virulencia Al igual que ETEC pero afecta principalmente a adultos

E coli enterohemorraacutegico (EHEC) origina diarrea sanguinolenta colitis hemorraacutegica

siacutendrome ureacutemico hemoliacutetico (SUH o SHU) y puacuterpura trombocitopeacutenica En este grupo se

incluye E coli verotoxigeacutenico (VTEC) serotipos O157 O26 O111 Afecta principalmente

a nintildeos el principal factor de riesgo es el consumo de carne sin la coccioacuten adecuada

E coli enteroagregativo (EAggEC) posee caraacutecter clonal diferenciaacutendose dos clones

relacionados (1 y 2) Dentro de cada grupo estaacute presente una variedad concreta de

antiacutegenos O mientras que los antiacutegenos H se conservan

En los reportes cientiacuteficos sobre E coli se refieren a las plantas como otra fuente de

infeccioacuten especiacuteficamente en la espinaca (Spinacia oleracea) y lechuga (Lactuca sativa) Se

recomienda igualmente estudiar profundamente los cultivos y los tejidos vegetables y

animales ya que se deben considerar como paraacutemetros de riesgo para la inocuidad de los

alimentos (Fernaacutendez Ferran et al 2003 Wright et al 2017)

B2 Campylobacter

Campylobacter spp es un bacilo delgado gram negativo (05-08 microm x 02-05 microm) y

Antecedentes

21

microaeroacutefilo (necesita 3-5 de O2 y 2-10 de CO2) Su morfologiacutea puede variar entre

vibrioacutenica (bacilos curvados) espirilar en forma de rosquilla de S y cocoide de tal forma

que en fase logariacutetmica de crecimiento las ceacutelulas tienen forma espiral o curvada pero a

medida que los cultivos envejecen adquieren formas esfeacutericas Moacutevil con un uacutenico flagelo

polar que presenta de dos a tres veces el largo de la ceacutelula Aunque hay diversas especies

de Campylobacter causantes de enfermedades C jejuni C coli y C lari son las especies

que se aiacuteslan con mayor frecuencia en casos de gastroenteritis humana siendo C jejuni la

responsable de la mayoriacutea de las toxiinfecciones alimentarias 89-93 de las

toxiintoxicaciones (OMS 2017)

Las especies C coli y C lari son semejantes a C jejuni su diferencia se basa en pruebas

bioquiacutemicas C coli no es capaz de hidrolizar el piruvato y C lari es capaz de crecer en

presencia de 30 microgramos de aacutecido nalidiacutexico (Haddad et al 2013) La movilidad la

quimiotaxis y los flagelos son factores importantes en la virulencia pues de ellos depende la

colonizacioacuten del epitelio intestinal Campylobacter produce una enterotoxina parecida a la

toxina coleacuterica que tambieacuten juega un papel importante en la patogenia (Nichols 2005) C

jejuni puede sobrevivir de 2 a 4 semanas en condiciones de baja humedad oxigenacioacuten y

temperaturas de 4ordmC superando muchas veces el tiempo de vida uacutetil del producto Asimismo

puede perdurar de 2 a 5 meses a -20ordmC pero a temperatura ambiente apenas dura algunos

diacuteas (Khan et al 2013)

C jejuni y C coli son sensibles a diversos agentes antimicrobianos como los macroacutelidos

los aminoglucoacutesidos el cloranfenicol y la tetraciclina La eritromicina ha sido el antibioacutetico de

eleccioacuten para tratar las infecciones del tracto intestinal Al igual que en Salmonella el control

de Campylobacter se debe realizar tanto en el sector agropecuario como en los

establecimientos alimentarios por lo que los controles especificados para Salmonella

podriacutean extrapolarse a este microorganismo Un aspecto importante de su control reside en

la refrigeracioacuten de las aves ya que la baja temperatura junto con la desecacioacuten superficial

que se produce reduce significativamente la incidencia y los recuentos de Campylobacter

viables incluso en canales altamente contaminadas (Fernaacutendez 2008)

B3 Enterobacter

Conocido antiguamente como Cronobacter spp incluye varias especies de patoacutegenos

emergentes relacionados con brotes de meningitis septicemia y enterocolitis necrotizante

especialmente en neonatos y nintildeos La tasa de mortalidad de estos brotes es alta entre 20

Antecedentes

22

y 80 y los supervivientes suelen sufrir severos desoacuterdenes neuroloacutegicos (Grimont y

Grimont 2006)

E sakazakii es un bacilo moacutevil no esporulado gram negativo que ha sido encontrado en

alimento para bebeacutes es maacutes resistente a los cambios osmoacuteticos y a la sequiacutea que otros

miembros de la familia Enterobacteriaceae y se asocia con casos esporaacutedicos de sepsis

meningitis cerebritis y enterocolitis necrotizante La mayoriacutea de las infecciones se observan

en bebeacutes con bajo peso al nacer y que son alimentados de forma insalubre La mortalidad

ha disminuido a menos de 20 en los uacuteltimos antildeos Este microorganismo no se ha

encontrado presente en la foacutermula laacutectea tampoco existe evidencia de la transmisioacuten de

persona a persona o un medio general de difusioacuten ambiental (Vanegas et al 2009)

B4 Listeria

L monocytogenes estaacute muy difundida en la naturaleza en la que suele adoptar un ciclo

saprofiacutetico en estrecha relacioacuten con el suelo Ademaacutes se ha encontrado en aguas

continentales sedimentos marinos material vegetal en descomposicioacuten forrajes heces

humanas y animales y aguas residuales de explotaciones animales entre otros ambientes

lo que explica su presencia en alimentos crudos Epidemioloacutegicamente se caracteriza por su

ubicuidad sobreviviendo en tierra huacutemeda hasta 500 diacuteas en funcioacuten de la temperatura En

heces o aguas residuales mantenidas a temperatura de refrigeracioacuten sobrevive maacutes de seis

antildeos este periodo se reduce si se mantiene a temperatura ambiente (Guenther et al 2009)

Listeria spp son bacilos gram positivos de forma regular y con forma de vara corta

Algunas veces pueden tener forma cocoide apareciendo como ceacutelulas individuales o en

cadenas cortas Son moacuteviles entre 20-25ordmC pero no a 37ordmC Existen seis especies de Listeria

descritas L monocytogenes L innocua L welshimeri L seeligeri L grayi y L ivanovii

subespecie ivanovii y subespecie londoniensis Las cepas patoacutegenas de L monocytogenes

producen la listeriolisina O responsable de la hemoacutelisis-β y de la destruccioacuten de las ceacutelulas

fagocitarias es una hemolisina que segrega la bacteria a causa de la disminucioacuten de pH

(Liu 2006)

L monocytogenes tolera y se multiplica en concentraciones altas de NaCl contando con

la posibilidad de sobrevivir durante un antildeo en ambientes con una concentracioacuten de 16 su

tolerancia aumenta al disminuir el pH o la temperatura del medio Los tratamientos para su

inactivacioacuten son de 617ordmC35min 70ordmC20min 78ordmC15min u 80ordmC5min favoreciendo su

Antecedentes

23

resistencia al calor con la presencia de grasas Se multiplica entre 0 y 4ordmC las temperaturas

bajas ejercen un efecto protector de tal manera que en condiciones de acidez su inactivacioacuten

es maacutes lenta en refrigeracioacuten que a temperatura ambiente (Leverentz et al 2003) La acidez

influye en la capacidad de Listeria para sobrevivir a la congelacioacuten (temperaturas inferiores

a -47ordmC) y almacenamiento a menos de -18ordmC en carne mostrando una disminucioacuten en la

recuperacioacuten de ceacutelulas viables que han sido dantildeadas por el friacuteo (Wu et al 2015)

B5 Salmonella

B51 Origen

Salmonella tiene su origen principal en el tracto intestinal de animales fundamentalmente

las aves y los porcinos y pueden acabar contaminando las carnes crudas el pollo crudo los

productos marinos crudos o el huevo Los brotes de Salmonella estaacuten asociados al consumo

de alimentos elaborados con huevo crudo y siguen siendo frecuentes a pesar de conocerse

el riesgo que representa su consumo de las medidas legales adoptadas y de los programas

de educacioacuten sanitaria dirigidos a disminuir su incidencia Este geacutenero pertenece a la familia

Enterobacteriaceae fue descrito a principios del siglo XX por el bacterioacutelogo estadounidense

Theobald Smith (Zaidi et al 2006) En la figura 2 se muestran los factores de virulencia y

en la figura 3 se presenta la clasificacioacuten de Salmonella enterica con las diferentes

subespecies y serovares que se aiacuteslan maacutes frecuentemente

Antecedentes

24

Figura 2 Factores de virulencia importantes en la patogenia por

Salmonella spp (Brenner et al 2000)

Figura 3 Clasificacioacuten de Salmonella (Brenner et al 2000)

Antecedentes

25

B52 Caracteriacutesticas de Salmonella spp

La mayoriacutea de los miembros de este geacutenero se encuentra en el tracto intestinal del

hombre y los animales como bacterias patoacutegenas o comensales Estaacute integrado por bacilos

gram negativos anaerobios facultativos y no esporulados La mayor parte de los serotipos

conocidos son moacuteviles mediante flagelos peritricos Se conocen maacutes de 2460 serotipos

muchos de ellos patoacutegenos para el ser humano (Chlebicz y Śliżewska 2018)

Son bacterias invasoras enterotoxigeacutenicas y estaacuten ampliamente diseminadas en todo el

mundo su temperatura ideal de sobrevivencia entre los 15 y los 35degC (mesoacutefilas) y en una

amplitud de pH de 45 a 9 Los microorganismos de este geacutenero se distribuyen en seis

grupos se han definido mediante biotipado hibridacioacuten DNA-DNA anaacutelisis de la secuencia

del RNA ribosomal 16S y por ldquomultilocus enzyme electrophoresisrdquo (MLEE) (Brenner et al

2000) La serotipificacioacuten se utiliza para diferenciar maacutes allaacute del nivel de subespecie como

puede observarse en la tabla 2

Tabla 2 Clasificacioacuten de Salmonella spp en serotipos (Brenner et al 2000)

Grupo Microorganismo

A S Paratyphi Al

B S Typhimurium S Bredeney

C1 S Choleraesuis S Montevideo S Oranienburg

C2 S Newport

D S Typhi S Enteritidis S Dublin S Gallinarum

E S Butantan S Anatum S Give

Salmonella serotipo Typhi es la causante de la fiebre tifoidea presentando siacutentomas como

son fiebre de intensidad variable cefalea diarrea estrentildeimiento tos naacuteuseas y voacutemitos

anorexia dolor abdominal y escalofriacuteos Mientras que los demaacutes serotipos considerados no

tifoidicos presentan un estado asintomaacutetico En el antildeo 2000 los serotipos aislados con

mayor frecuencia en EE UU fueron S Typhimurium S Enteritidis y S Newport (Dunkley et

Antecedentes

26

al 2009) En Meacutexico los serotipos de Salmonella spp identificados con mayor frecuencia

en los servicios de salud fueron S Typhimurium (204) y S Enteritidis (183) (Guenther

et al 2009)

La salmonelosis se produce por la ingestioacuten de alimentos o bebidas contaminados por

Salmonella se manifiesta como una enterocolitis aguda y se caracteriza por presentar

siacutendromes febriles asociados a manifestaciones gastrointestinales o sisteacutemicas con

frecuencia severas (Figueroa y Verdugo 2005 Fernaacutendez 2008) El cuadro cliacutenico se

localiza baacutesicamente en el iacuteleo terminal y el intestino grueso La enfermedad se manifiesta

a traveacutes de diferentes fases En la primera fase la infeccioacuten se limita a la mucosa intestinal

en la siguiente la bacteria invade el tejido linfaacutetico local y le sigue una fase de bacteriemia

durante la cual la mayoriacutea de las bacterias son fagocitadas por macroacutefagos del hiacutegado y el

bazo (Calva et al 2006 Bettini et al 2012)

Con frecuencia el meacutedico hace un diagnoacutestico basaacutendose en el cuadro cliacutenico del

paciente pero sin contar con los estudios microbioloacutegicos necesarios para establecer un

diagnoacutestico certero cuando se presenta infeccioacuten por Salmonella inicia una fase de

crecimiento bacteriano intracelular el cual despueacutes de varios diacuteas provoca la liberacioacuten de

gran cantidad de patoacutegenos al torrente sanguiacuteneo (Zaidi et al 2006)

La salmonelosis es una enfermedad aguda de distribucioacuten mundial Afecta a todos los

grupos de edad con mayor incidencia en los extremos de la vida provocando infecciones

en forma endeacutemica o en brotes epideacutemicos de intoxicacioacuten alimentaria que en ocasiones

abarcan amplias zonas geograacuteficas debido a las extensas cadenas de distribucioacuten de

alimentos existentes hoy en diacutea (Fernaacutendez 2008)

Para la salud puacuteblica la salmonelosis tiene un impacto socioeconoacutemico tanto en los paiacuteses

en desarrollo como en los paiacuteses desarrollados Ademaacutes al no recibir tratamiento puede

ser causante del siacutendrome de Reiter el cual se manifiesta por dolor en articulaciones

irritacioacuten en los ojos dolor al orinar y puede durar meses o antildeos desencadenaacutendose una

artritis croacutenica (CFSPH 2005) Desde la deacutecada de los ochenta la incidencia de

salmonelosis de origen alimentario ha aumentado considerablemente en Meacutexico Este

incremento es resultado de una combinacioacuten de factores como la calidad del agua utilizada

para riego y el manejo almacenamiento distribucioacuten y preparacioacuten de los alimentos (Zaidi

et al 2006)

Antecedentes

27

Un meta-anaacutelisis (revisioacuten sistemaacutetica en la cual se combinan matemaacuteticamente los

resultados de varios estudios para contestar una misma pregunta) realizado recientemente

confirma que Salmonella resiste a antibioacuteticos empleados en los alimentos de origen animal

ya que pueden estar contaminados con este microorganismo es resistente a 3 antibioacuteticos

como la amoxicilina las sulfonamidas y las tetraciclinas ya que son ampliamente usados en

produccioacuten animal (Ejo et al 2016)

B53 Manifestaciones cliacutenicas

El cuadro cliacutenico normalmente es de 2 a 5 diacuteas aunque en ocasiones persiste varias

semanas La gravedad de los siacutentomas variacutea considerablemente siendo mayor en nintildeos y

ancianos Si el microorganismo pasa desde el intestino a la corriente sanguiacutenea y llega a

otras partes del cuerpo puede ocasionar la muerte si la persona afectada no es tratada

raacutepidamente La mayoriacutea de las muertes causadas por esta bacteria han ocurrido entre

ancianos que viven en residencias La tasa de mortalidad es baja inferior a 1 en paiacuteses

desarrollados pero suelen producirse de 40-50 muertes al antildeo especialmente entre nintildeos

ancianos o personas inmunodeprimidas Las excretas de los enfermos contienen gran

cantidad de la especie de Salmonella implicada al comienzo de la enfermedad la cifra inicial

decrece seguacuten transcurre el tiempo (DeWaal y Barlow 2014)

El estado de portador se refiere a la condicioacuten en que las personas curadas pueden

eliminar Salmonella en sus heces durante meses La mitad de los individuos afectados

excretan este patoacutegeno de 2-4 semanas posteriores a su curacioacuten cliacutenica entre 10 y 20

continuacutean durante 4-8 semanas unos pocos durante 3 meses y en raras ocasiones se

prolonga hasta 6 meses El microorganismo puede eliminarse tambieacuten por la orina La dosis

infectante capaz de desencadenar la salmonelosis humana es alrededor de 1times105 UFCmL

dependiendo de factores como tipo de alimento virulencia de la cepa involucrada y

susceptibilidad del individuo Entre las especies altamente virales se encuentran la S Dublin

y sobre todo S Enteritidis (Callaway et al 2008)

El incremento del serotipo de S Enteritidis en los casos de salmonelosis humana al

contrario de otras del geacutenero Salmonella representa un importante problema de salud

puacuteblica en muchos paiacuteses ya que este serotipo infecta a gallinas aparentemente sanas que

posteriormente transmiten las enfermedades al hombre Si se consumen huevos crudos o

Antecedentes

28

poco cocidos el microorganismo podriacutea causar la enfermedad El nuacutemero de casos de

salmonelosis se incrementa durante el verano (Parra et al 2002 Callaway et al 2008

Fernaacutendez 2008)

B54 Alimentos involucrados en la salmonelosis

Gran parte de las salmonelosis se deben al consumo de alimentos de origen animal

(carnes de abasto pollo mariscos pescado leche y huevos asiacute como ovoproductos y

productos laacutecteos no pasteurizados) o de origen vegetal que se contaminan con productos

en malas condiciones de salubridad o mal manipulados Muchos alimentos sobre todo los

de origen animal o contaminados con aguas residuales han servido como vehiacuteculos en

brotes de salmonelosis La carne de matadero estaacute contaminada habitualmente con

Salmonella su incidencia es mayor en las canales de ganado y otros animales debido por

ejemplo a la contaminacioacuten por el contenido intestinal de la res viva cuyas heces manchan

su piel pelo y patas al llegar al matadero Las canales de cerdo se contaminan durante las

operaciones de escaldado y pelado La contaminacioacuten entre las mismas canales y de eacutestas

a utensilios superficies de trabajo y manos de los que las manipulan es faacutecil Otro de los

principales reservorios de Salmonella es la carne de aves de corral La contaminacioacuten de las

canales de pollo y otras aves procede igualmente del tracto intestinal o del material fecal

de los animales que manchan sus patas y plumas Las etapas criacuteticas de la contaminacioacuten

de las canales aviares estaacuten en el desplumado y la evisceracioacuten tambieacuten es comuacuten la

contaminacioacuten cruzada a traveacutes de las manos de los operarios equipo y utensilios utilizados

en la preparacioacuten y troceado de las canales (Marcus et al 2004)

Son raras las salmonelosis adquiridas directamente de carnes bien cocinadas la mayoriacutea

de los brotes se deben a una coccioacuten insuficiente o por contaminacioacuten posterior a su

preparacioacuten Las carnes elaboradas mediante fermentacioacuten (salami chorizo y salchichoacuten)

pueden ser causa de brotes de salmonelosis teniendo en cuenta que las especies que

integran este geacutenero pueden sobrevivir al proceso de fermentacioacuten (Forsythe y Hayes

2002)

Como se mencionoacute anteriormente otro alimento que se asocia con frecuencia a

Salmonella es el huevo La contaminacioacuten se produce por dos viacuteas a traveacutes de la caacutescara

contaminada y por viacutea transovaacuterica en aves infectadas (gallina pata pava) En el primer

caso la superficie de la caacutescara se contamina siempre a su paso por la cloaca o cuando el

Antecedentes

29

huevo estaacute en un ambiente fecal los huevos rotos o manchados constituyen un peligro en

la propagacioacuten de especies de Salmonella (EFSA 2014)

La contaminacioacuten partiendo de la caacutescara se produce si eacutesta mantiene un grado de

humedad apropiado y existe una temperatura diferencial significativa entre el contenido del

huevo y el ambiente La diferencia de temperaturas entre el huevo maacutes elevada y el

ambiente favorece la absorcioacuten de los microorganismos como Salmonella Tambieacuten se

transmite sobre la caacutescara por contaminacioacuten cruzada a traveacutes de los manipuladores que

han tenido contacto con superficies infectadas durante el transporte y almacenamiento de

los mismos en lugares con precarias condiciones de higiene (Ejo et al 2016) Salmonella

es causal de graves enfermedades que son trasmitidas por productos derivados de huevo

contaminado y la asociacioacuten entre la infeccioacuten del tracto reproductivo de los pollos fue un

fuerte incentivo para desarrollar programas de prevencioacuten (Jawale y Lee 2014)

La leche cruda puede albergar Salmonella y ser causa de brotes de salmonelosis se

contamina a traveacutes del pezoacuten y por las manos del ordentildeador la pasteurizacioacuten elimina la

presencia de la bacteria Entre los productos laacutecteos se han identificado como causa de

brotes de salmonelosis la leche en polvo el queso los helados y maacutes raramente la

mantequilla todos ellos por fallos en su elaboracioacuten Salmonella se destruye o inactiva

durante la fermentacioacuten de alta acidez como el yogur y el queso de pH inferior a 45 En el

caso del queso poco aacutecido (pH superior a 49) la Salmonella puede desarrollarse en

cualquier etapa de su elaboracioacuten (Mastroeni y Maskell 2006)

Entre las verduras cualquiera puede contener Salmonella cuando se cultivan con aguas

residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen animal Algunos vegetales

como los berros han sido causa de brotes de salmonelosis Por otro lado los mariscos se

contaminan con Salmonella cuando se criacutean en aguas residuales contaminadas por lo que

han sido la causa de numerosos brotes en todo el mundo la depuracioacuten es la medida

preventiva adecuada Diferentes alimentos se han identificado como portadores de

Salmonella entre ellos coco cebada harina de cereales pimienta blanca y negra pasta

cacao en polvo y chocolate (Fernaacutendez 2008) La FDA (2017) reportoacute el aumento de las

pruebas de las cuales ha identificado papayas de dos granjas que resultaron positivas para

las cepas de Salmonella que coinciden con enfermedades no relacionadas con este brote

Antecedentes

30

C Crecimiento microbiano

El crecimiento microbiano puede definirse como un incremento en los constituyentes

celulares que ocasiona un aumento del nuacutemero de ceacutelulas de los microorganismos que se

multiplican por gemacioacuten y fisioacuten binaria En el uacuteltimo caso las ceacutelulas individuales se

agrandan y dividen para originar dos ceacutelulas hijas de un tamantildeo aproximadamente igual

(Atlas y Bartha 2002)

C1 Crecimiento de los microorganismos

Todos los mamiacuteferos incluyendo los seres humanos se adaptan a la vida del mundo

microbiano Louis Pasteur Robert Koch Eacutelie Metchnikoff y Theodor Escherich entre otros

investigadores sentaron las bases conceptuales sobre las interacciones microbio-hueacutesped

Pasteur postuloacute que los microbios eran necesarios para la vida humana y Metchnikoff afirmoacute

que la composicioacuten de la flora microbiana era esencial para el bienestar del hueacutesped

Igualmente Escherich estaba convencido de que el conocimiento preciso de la flora

endoacutegena era esencial no soacutelo para la comprensioacuten de la fisiologiacutea de la digestioacuten sino para

la comprensioacuten de la patologiacutea y terapia de enfermedades microbianas intestinales A pesar

de estas primeras ideas soacutelo recientemente los cientiacuteficos han desarrollado meacutetodos que

permiten caracterizar directamente los mecanismos moleculares que subyacen a la creacioacuten

y mantenimiento de diversos ecosistemas microbianos (Falk et al1998)

El crecimiento de una poblacioacuten bacteriana resulta de la suma de ciclos celulares de todos

sus individuos y suele ser asincroacutenico puesto que cada microorganismo se encuentra en un

punto diferente del ciclo celular Por consiguiente en un momento determinado en una

poblacioacuten se encuentran ceacutelulas que acaban de dividirse otras estaacuten replicando su ADN y

elongaacutendose y otras estaacuten iniciando la divisioacuten celular (Melbinger et al 2015)

El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza en la mayoriacutea de los

casos mediante la produccioacuten de colonias aisladas en cultivos soacutelidos El crecimiento

explosivo de las bacterias produce un gran nuacutemero a partir de una uacutenica ceacutelula inicial de

forma que tras un periacuteodo de tiempo de incubacioacuten en las condiciones ambientales

adecuadas se produce una colonia de individuos iguales Para que un microorganismo

crezca necesita nutrientes que le aporten energiacutea y elementos quiacutemicos para la siacutentesis de

sus constituyentes celulares De acuerdo a la fuente de carbono que utilizan los

Antecedentes

31

microorganismos se clasifican en autoacutetrofos si es el CO2 atmosfeacuterico (microorganismos que

fotosintetizan) y heteroacutetrofos si utilizan carbono orgaacutenico (Ouyang y Li 2013)

C11 Disponibilidad del agua

El agua es un factor importante para el crecimiento microbiano se requiere para crecer y

llevar a cabo las funciones metaboacutelicas de lo contrario los microorganismos se deshidratan

o mueren La aw depende de la concentracioacuten de solutos y de la cantidad de agua disponible

en el medio ambiente La mayoriacutea de las bacterias y hongos necesitan valores entre 098 y

0995 de aw para su pleno desarrollo (Madigan y Martinko 2006)

Una membrana plasmaacutetica permanentemente selectiva separa el contenido

citoplasmaacutetico del microorganismo de su ambiente por ello las alteraciones en la

concentracioacuten osmoacutetica del medio extracelular pueden afectar incluso la viabilidad de los

mismos Si se coloca un microorganismo en una solucioacuten isotoacutenica el agua entraraacute en la

ceacutelula y causaraacute su estallido salvo que la propia ceacutelula desarrolle alguna estrategia para

evitarlo por ejemplo reducir la concentracioacuten osmoacutetica del citoplasma gracias a los cuerpos

de inclusioacuten Los procariotas tambieacuten pueden contener canales sensibles a la presioacuten

osmoacutetica que se abren para permitir la salida de solutos cuando la osmolaridad del entorno

se vuelve maacutes baja que la del citoplasma (Madigan y Martinko 2006)

C12 Acidez y pH

El pH intracelular debe permanecer cercano a la neutralidad entre 5 y 8 para impedir la

destruccioacuten de las macromoleacuteculas haacutebiles en condiciones aacutecidas o alcalinas Los aacutecidos

fuertes (inorgaacutenicos) y los aacutecidos deacutebiles (orgaacutenicos) disminuyen el pH externo

posteriormente se disocian en el interior de la ceacutelula inhibiendo la actividad enzimaacutetica y el

transporte de nutrientes por lo tanto los microorganismos no pueden generar energiacutea de

almacenamiento y ocurre la muerte celular (Brooks et al1992)

C13 Oxiacutegeno

El oxiacutegeno molecular (O2) influye en el metabolismo de los microorganismos Durante el

Antecedentes

32

proceso de reduccioacuten del O2 se crean formas reactivas como peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2)

superoacutexidos (O2-) y radicales hidroxilos (OH-) que producen dantildeo celular por la oxidacioacuten

de compuestos orgaacutenicos e incluso macromoleacuteculas (Prescott et al1999)

C14 Temperatura

La temperatura afecta el desarrollo y la supervivencia de los microorganismos En bajas

temperaturas la velocidad de crecimiento de algunos microorganismos disminuye y los

periacuteodos de latencia se alargan Por otro lado las temperaturas elevadas aceleran las

reacciones enzimaacuteticas (antes de los 40degC) pero si se intensifica el calor en algunos casos

provocan la desnaturalizacioacuten de las proteiacutenas y por consiguiente la lisis celular (Brooks et

al1992)

Es importante considerar que cada microorganismo tiene una temperatura de desarrollo

adecuada a mayor temperatura se produce un incremento lineal de la velocidad de

crecimiento hasta alcanzar el clima perfecto a velocidad maacutexima Por encima de esta

temperatura oacuteptima la velocidad de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte

celular (Atlas y Bartha 2002) En la tabla 3 se presentan algunas condiciones ambientales

para el desarrollo de los microorganismos

Antecedentes

33

Tabla 3 Respuesta microbiana a factores ambientales (Lu et al 2006 Madigan et al 2006 Falk et al 2009)

Factor Tipo de

microorganismo Caracteriacutesticas Microorganismo representativo

NaCI

Osmotolerante Capaz de crecer en un amplio rango de aw o

presioacuten osmoacutetica St aureus Saccharomyces rouxii

Haloacutefilo Requiere altas concentraciones de NaCl para

crecer normalmente por encima de 02 M Halobacterium Dunaliella Ectohiorhodospira

pH

Acidoacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 0 y 55 Sulfolobus Picrophilus Ferroplasma Acontium

Cyanidium caldarium

Neutroacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 55 y 80 Euglena Paramecium

Alcaloacutefilo Oacuteptimo de crecimiento entre pH 85 y 1 15 Badilas alcalophilus NaIronobaciacuteerium

Temperatu

ra

Psicroacutefilo Crece bien a 0degC temperatura oacuteptima de 15degC

o inferior Badilas psychrophilus Chlamydomonas nivalis

Psicroacutetrofo Puede crecer a 0-7degC oacuteptima de 20 a 30degC Listeria monocytogenes

Mesoacutefilo Temperatura maacutexima de 35degC

Temperatura oacuteptima alrededor de 20-45degC

P fluorescens E coli Neisseria gonorrhoeae

Trichomonas vaginalis

Termoacutefilo Puede crecer a 55degC o superior temperatura

oacuteptima a menudo entre 55 y 65degC

Geobacillus stearothermophilus Thermus

aquaticus Cyanidium caldarium

Hipertermoacutefilo Temperatura oacuteptima entre 80 y 113degC Chaetomium thermophile Sulfolobus

Atmoacutesfera

Aerobio obligado Completamente dependiente del O2 para

crecer Pseudomonas Mycobacterium tuberculosis

Anaerobio

facultativo

No requiere O2 pero crece mejor en su

presencia

M luteus St aureus

Streptococcus pneumoniae L monocytogenes

Anaerobio

aerotolerante Crece bien en presencia o en ausencia de O2 Lactobacillus

Anaerobio

obligado No tolera el O2 y muere en su presencia Clostridium botulinum C perfringens

Microaeroacutefilo

Requiere nivel de O2 inferior a 2-10 para

crecer y es dantildeado por el O2 (20) C fetus

Antecedentes

34

D Control del crecimiento microbiano

Los microorganismos toleran determinados factores ambientales Asiacute unas bacterias

pueden tener condiciones para su desarrollo y estas condiciones pueden ser nocivas para una

especie bacteriana El crecimiento de una poblacioacuten microbiana se estudia analizando la curva

de crecimiento de un cultivo La curva del crecimiento microbiano representa la evolucioacuten del

nuacutemero de nuacutemero de ceacutelulas viables presente en un cultivo microbiano liacutequido a lo largo del

tiempo de estudio Se estudia el nuacutemero de ceacutelulas viables por mililitro de un cultivo de

volumen limitado y con una cantidad de nutrientes limitada como por ejemplo un medio de

cultivo liacutequido en un matraz que ha sido inoculado con una cantidad inicial de microorganismos

o inoacuteculo (Hunter-Cevera y Belt 1996) Para llevar a cabo estos estudios se distingue tres

niveles entre los modelos de microbiologiacutea predictiva los que describen los cambios en el

nuacutemero de microorganismos con respecto al tiempo con respecto al efecto de las condiciones

ambientales y los que combinan los dos aspectos anteriores (Larcher y Cattaneo 2006)

Se considera el crecimiento de las bacterias en funcioacuten de su fondo geneacutetico en relacioacuten

con los nutrientes y en unas hipoteacuteticas condiciones ideales (oacuteptimas) Sin embargo el trabajo

experimental con microorganismos ha de tener en cuenta los factores ambientales es decir

una serie de agentes fiacutesicos y quiacutemicos El anaacutelisis de la curva de crecimiento bacteriano es

muy importante para determinar el potencial de una teacutecnica de control especiacutefica Al igual que

las bacterias los fagos al forman una interaccioacuten con su bacteria hueacutesped se necesita

determinar una cuantificacioacuten del nuacutemero de copias que se generan por la infeccioacuten a esta

condicioacuten se le conoce como fase de eclipse siendo el momento idoacuteneo para realizar la

infeccioacuten fago-bacteria (Lee et al 2016)

D1 Agentes fiacutesicos

La temperatura es uno de los paraacutemetros ambientales maacutes importantes que condicionan el

crecimiento y la supervivencia de los microorganismos La temperatura afecta a la velocidad

de crecimiento y por lo tanto al tiempo de generacioacuten Cada bacteria es diferente y esto se

puede observar en una curva de tasa de crecimiento en funcioacuten de la temperatura Si se suele

utilizar calor en combinacioacuten con otros agentes fiacutesicos (filtracioacuten presioacuten y radiacioacuten) Al

aplicar temperaturas altas se refleja desnaturalizacioacuten e inactivacioacuten de proteiacutenas enzimaacuteticas

esenciales colapsamiento de la membrana citoplaacutesmica y a veces lisis teacutermica de la bacteria

Antecedentes

35

esta condicioacuten se presenta raacutepidamente cuando se aplica presioacuten la cual se utiliza para

esterilizar objetos como lo demuestra el uso universal de la autoclave en todos los

laboratorios de microbiologiacutea (Madigan y Martinko 2006) El calor es auacuten uno de los meacutetodos

maacutes comunes para destruir microorganismos se puede aplicar huacutemedo o seco (Salgado-Nava

y Jimeacutenez-Munguiacutea 2012) Por otro lado ademaacutes de aplicar calor si a las bacterias se le

extrae el calor del medio de manera intensa recurrir a la congelacioacuten con fines de conservacioacuten

de microorganismos por largos periacuteodos si se realiza apropiadamente numerosos

laboratorios disponen de congeladores a -30 o -70degC para la conservacioacuten de colecciones de

cultivos microbianos (Shafiei et al 2014)

D2 Agentes quiacutemicos

Aunque los objetos se desinfectan a veces con agentes fiacutesicos tambieacuten las sustancias

quiacutemicas se utilizan con mucha frecuencia por ejemplo los quimioteraacutepicos son sustancias

con actividad antimicrobiana (microbicida o microbiostaacutetica) En estas sustancias se busca

que sea efectivo contra un amplio espectro de microorganismos Pero no existe (hasta estos

momentos) un solo agente capaz de inhibir a todos los microorganismos Por otro lado existen

quimioteraacutepicos de espectro estrecho pero muy selectivos contra ciertas bacterias que son

patoacutegenas importantes Muchos factores influyen en la eficacia de los desinfectantes hay que

considerar la cepa de microorganismos presentes la concentracioacuten y naturaleza del

desinfectante y la duracioacuten del tratamiento Asimismo es imprescindible que las superficies

sucias se limpien antes de aplicar un desinfectante El uso apropiado de los agentes quiacutemicos

es esencial para la seguridad en los laboratorios y hospitales estos mismos productos se

utilizan tambieacuten para evitar el crecimiento microbiano en los alimentos (Prescott et al 1999)

E Fagos

E1 Antecedentes

Los virus son agentes infecciosos submicroscoacutepicos que pueden replicarse

independientemente de los cromosomas de una ceacutelula pero no independientemente de ella

A fin de multiplicarse deben penetrar la ceacutelula donde puedan replicarse a la cual se le

denomina hueacutesped Presentan una forma infecciosa madura que es tiacutepicamente extracelular

Antecedentes

36

Pueden infectar a diferentes seres vivos por lo que existen virus de animales de plantas y

de forma particular los llamados virus bacterianos o fagos (Madigan y Martinko 2006)

Los bacterioacutefagos o fagos (del griego φαγετον paguumlento ldquoalimentoingestioacutenrdquo) son agentes

virales de las bacterias su descubrimiento se atribuye por un lado al bacterioacutelogo ingleacutes F

W Twort que en 1915 mencionoacute el aclaramiento de un cultivo soacutelido de Micrococcus

provocado por un agente desconocido Por otro lado en 1917 el francocanadiense F

dHerelle descubrioacute un grupo de entidades bioloacutegicas en medios de cultivo que se propagaban

a expensas de las bacterias a los cuales les denominoacute fagos y dentro de sus investigaciones

definioacute su potencial uso e importancia cliacutenica Esto se refuerza a partir de 1940 con el

desarrollo del microscopio electroacutenico con el que se demuestra la naturaleza viral de los fagos

y que la forma de estudiarlos es mediante procedimientos microbioloacutegicos convencionales

facilitando su manejo y estudio (Grabow 2001)

La uacuteltima variedad de fagos se descubrioacute durante la Primera Guerra Mundial los tipos ya

conocidos eran los virus que afectaban a vegetales y animales fue entonces que se pensoacute

en que su aplicacioacuten para eliminar bacterias podriacutea ser utilizada para la prevencioacuten y el

tratamiento de enfermedades bacterianas pero no resultoacute (Merril et al 1996) Sin embargo

los fagos resultaron tener otros beneficios especialmente como modelos o sustitutos de los

virus en humanos en la investigacioacuten geneacutetica baacutesica asiacute como en la evaluacioacuten de la calidad

del agua Ademaacutes demostraron ser una herramienta valiosa en la mayoriacutea de las

investigaciones sobre los virus ya que en comparacioacuten con los humanos animales vegetales

e incluso los insectos anfitriones de otros virus los fagos son faacutecil y raacutepidamente reproducibles

en el laboratorio y no son particularmente exigentes con respecto al espacio instalaciones y

equipos El trabajar con fagos requiere la separacioacuten y purificacioacuten y las dos principales tareas

para realizar esto es utilizar meacutetodos quiacutemicos en los cuales se utilizan solutos como buffer

glicerol bromuro de potasio cloruro de cesio y tartrato de potasio aunque el maacutes comuacuten es

la sacarosa ademaacutes involucra la precipitacioacuten con sulfato de amonio polietilenglicol o cloruro

de cesio y los meacutetodos fiacutesicos que implican la centrifugacioacuten a diferentes velocidades y

gradientes de densidad y con menor frecuencia la cromatografiacutea de particioacuten (Sambrook y

Russell 2001)

La investigacioacuten sobre las propiedades baacutesicas de los fagos se desarrolla en la biologiacutea

molecular que permitioacute avances sin precedentes en toda la biologiacutea y ciencias meacutedicas La

Antecedentes

37

concentracioacuten y purificacioacuten es un factor determinante para llevar a cabo la infeccioacuten

eficientemente sin embargo existe un periacuteodo de adaptacioacuten por parte de los fagos antes

que se desarrollen y se logren tiacutetulos apreciables en ceacutelulas cultivadas (Sambrook y Russell

2001 Breeuwer et al 2003)

E2 Caracteriacutesticas generales de los fagos

Los virus son paraacutesitos intracelulares obligados no tienen metabolismo intriacutenseco y

requieren la maquinaria metaboacutelica codificada por los cromosomas de ceacutelula que puedan

infectar y reproducirse en ella denominada hueacutesped Su tamantildeo oscila entre 20 y 200 nm y

consiste de un nuacutecleo de aacutecido nucleico (ARN o ADN de cadena simple o doble) rodeado por

una cubierta proteica (caacutepside) y en algunos casos una cubierta de liacutepidos Los microbioacutelogos

que investigan la presencia de virus en haacutebitats marinos y han detectado su presencia creen

que son diez veces maacutes numerosos que las bacterias marinas En la superficie de los mares

se encuentran entre 106 y 109 partiacuteculas viacutericas por mililitro y se estima que en la capa

superficial (1 mm) de los oceacuteanos se encuentran unas 3 x 1030 partiacuteculas viacutericas (Grabow

2001 Atterbury et al 2003)

E3 Clasificacioacuten de los fagos

Las variaciones en los fagos se presentan en forma estructural como apeacutendices en la

cabeza cuello y las fibras de la cola o espigas ademaacutes del genoma que variacutea en cada orden

En 1962 Andreacute Lwoff junto a otros investigadores propuso una clasificacioacuten basada en la

morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico Los nombraron de la siguiente manera los urovirales

que presentaban cola pronunciada los inoviridae eran los filamentosos y los microviridae los

tipo φX Posteriormente Bradley (1967) consideroacute la morfologiacutea y el tipo de aacutecido nucleico y

agrupoacute a los fagos en seis morfotipos baacutesicos denominados de la A a la F posteriormente se

clasifico en fagos baacutesicos los de cola los filamentosos y los icosaeacutedricos con ADN de cadena

sencilla o RNA de cadena simple Los fagos han sido investigados debido a su rol como

agentes de biocontrol para el desarrollo de la seguridad alimentaria En el presente varios

miles de fagos en contra de varios objetivos han sido aislados de varios entornos y alimentos

Aproximadamente el 96 de los fagos aislados eran con cola y del tipo liacuteticos en una de las

Antecedentes

38

tres familias Myoviridae (245) Siphoviridae (61) y Podoviridae (14) en el orden de los

caudovirales (Atterbury et al 2003 Oh y Park 2017)

En 1971 el Comiteacute Internacional de Taxonomiacutea de Virus (ICTV por sus siglas en ingleacutes)

clasificoacute en 6 geacuteneros de los cuales 5 corresponden a la clasificacioacuten propuesta por Bradley

los grupos T4 λ φX174 MS2 y fd Los fagos pueden tener cola larga y flexible no contraacutectil

(Siphoviridae) cola larga y contraacutectil (Myoviridae) o cola corta (Podoviridae) como se observa

en la tabla 4 Para la clasificacioacuten de los fagos se aplican propiedades como el rango de

hueacutespedes y las relaciones inmunoloacutegicas sin embargo las maacutes importantes son su

morfologiacutea y las caracteriacutesticas de su aacutecido nucleico el cual se adsorbe a componentes de la

superficie celular que actuacutean como receptores especiacuteficos La zona de adsorcioacuten del virus es

complementaria al receptor celular por lo tanto un determinado fago soacutelo puede infectar un

nuacutemero limitado de cepas celulares que contengan a un determinado receptor La naturaleza

de la zona de adsorcioacuten variacutea con el tipo de fago En el T4 se localiza en el extremo de la cola

en donde se encuentran la placa basal las espiacuteculas y las fibras de la cola Las formas maacutes

complejas corresponden a los fagos con colas contraacutectiles (Atterbury et al 2003)

Tabla 4 Morfotipos y caracteriacutesticas baacutesicas de las diferentes familias de fagos

(Ackermann 2003)

Antecedentes

39

E4 Multiplicacioacuten de los fagos ADN bicatenarios el ciclo liacutetico

La multiplicacioacuten de los fagos (figura 4) ADN produce la destruccioacuten de la ceacutelula hueacutesped

mediante lisis lo que provoca su liberacioacuten El ciclo vital de un fago que culmina con el

estallido de la ceacutelula hueacutesped y la liberacioacuten de viriones recibe el nombre de ciclo liacutetico Los

acontecimientos que tienen lugar durante el ciclo liacutetico se revisaraacuten en esta seccioacuten con

especial atencioacuten a los fagos T-par de E coli Estos son fagos de ADN bicatenario con colas

contraacutectiles complejas de la familia Myoviridae son algunos de los virus maacutes complejos

conocidos (Fernaacutendez 2008)

Figura 4 Adsorcioacuten del fago T4 e inyeccioacuten del ADN (Leverentz et al 2003)

Los fagos podriacutean infectar hasta un 70 de la poblacioacuten de procariotas marinos y ser

responsables de la tercera parte de la mortalidad bacteriana acuaacutetica Tambieacuten se han

detectado virus que infectan diatomeas y otras algas importantes del fitoplancton marino lo

cual es de gran transcendencia ecoloacutegica ya que la multiplicacioacuten de bacterias marinas

supera la capacidad de reproduccioacuten de los protozoos La lisis por virus de ceacutelulas procariotas

y de algas puede tambieacuten contribuir enormemente en los ciclos del carbono y nitroacutegeno en las

cadenas troacuteficas marinas incluso podriacutea reducir el nivel de productividad marina como la de

moluscos y peces (Muniesa et al 2005)

E5 Adsorcioacuten del fago a la ceacutelula hueacutesped y penetracioacuten

Los fagos no se unen al azar a la superficie de una ceacutelula hueacutesped por el contrario se fijan

a receptores especiacuteficos La naturaleza de estos receptores variacutea de acuerdo al fago pueden

Antecedentes

40

ser lipopolisacaacuteridos y proteiacutenas de la pared celular aacutecidos teicoicos flagelos y pili Los fagos

T-par de E coli en particular utilizan lipopolisacaacuteridos o proteiacutenas de la pared celular como

receptores Las variaciones en las propiedades del receptor son parcialmente responsables

de las preferencias del fagos por el hueacutesped (Muniesa et al 2005 Leeuw et al 2017)

La adsorcioacuten de fagos T-par estaacute relacionada con diversas estructuras del tallo La fijacioacuten

del fago comienza cuando una fibra del tallo establece contacto con los receptores adecuados

a medida que maacutes fibras contactan con los receptores la placa basal se asienta en la

superficie La unioacuten se debe probablemente a interacciones electrostaacuteticas y se ve influida por

el pH y por la presencia de iones como Mg+2 y Ca+2 Una vez que la placa basal estaacute

firmemente asentada en la superficie celular se producen cambios conformacionales en ella

y en la vaina del tallo Esta uacuteltima se reorganiza de tal forma que se contrae pasando de una

conformacioacuten en cilindro de 24 anillos a otra de 12 anillos de longitud maacutes corta y ancha es

entonces cuando el tubo central es empujado a traveacutes de la pared celular bacteriana

Finalmente el ADN es extruido de la cabeza pasa a traveacutes del tubo del tallo y penetra en la

ceacutelula hueacutesped Parece ser que el tubo interacciona con la membrana plasmaacutetica para formar

un poro a traveacutes del cual pasa el ADN los mecanismos de penetracioacuten de otros fagos difieren

a menudo de los fagos T-par aunque no se han estudiado en detalle (Leverentz et al 2003)

F Biofilm

Las bacterias existen en la naturaleza bajo dos formas o estados a) bacterias planctoacutenicas

de libre flotacioacuten y b) bacterias biofilm en colonias de microorganismos seacutesiles (Nazar 2007)

Un biofilm se define como una agrupacioacuten de comunidades seacutesiles microbianas que se fijan a

superficies las ceacutelulas estaacuten incrustadas en una matriz autoproducida que actuacutea como

proteccioacuten quiacutemica y mecaacutenica del entorno asiacute estas bacterias presentan mayor resistencia

a desinfectantes y el secado (Vestby et al 2009) Las bacterias pueden crear condiciones

para formar biofilms casi en cualquier ambiente liacutequido La interfase soacutelido-liacutequido entre una

superficie y un medio acuoso (vgr leche) proporciona un entorno ideal para la fijacioacuten y

crecimiento de microorganismos (Fakruddin et al 2014)

Antecedentes

41

G Microscopiacutea electroacutenica

Los microscopios electroacutenicos se usan habitualmente para el estudio detallado de

estructuras celulares (Bradley 1967) Para analizar las estructuras internas es esencial el

microscopio electroacutenico de transmisioacuten MET En el MET se utilizan electrones en lugar de rayo

de luz las lentes son electromagneacuteticas y se opera en todo momento a alto vaciacuteo

(Ackermann 2003) El poder de resolucioacuten del microscopio electroacutenico es mucho mayor que

el del microscopio oacuteptico incluso pueden observarse estructuras moleculares como proteiacutenas

y aacutecidos nucleicos Sin embargo los haces de electrones tienen escaso poder de penetracioacuten

y una ceacutelula aislada es demasiado gruesa para poder visualizarse directamente por este

motivo se emplean teacutecnicas especiales para la obtencioacuten de cortes ultrafinos a fin de poder

observar las muestras Una ceacutelula bacteriana por ejemplo se corta con una cuchilla especial

en varios cortes ultrafinos de 20-60 nm de espesor que son posteriormente examinados de

manera individual en el microscopio electroacutenico (Fuster-Valls et al 2008) Para obtener

suficiente contraste las preparaciones se tintildeen previamente mediante tratamiento con

compuestos como aacutecido oacutesmico permanganato sales de uranilo o de lantano o plomo Como

estas sustancias poseen aacutetomos pesados son capaces de desviar los electrones y aumentar

el contraste (Madigan y Martinko 2006)

La microscopiacutea electroacutenica es el mejor meacutetodo para estudiar la forma de las bacterias Los

virus bacterianos por tener un diaacutemetro menor de 1000 Aring estaacuten por debajo del liacutemite de

resolucioacuten del microscopio oacuteptico sin embargo es posible observarlos mediante el

microscopio electroacutenico porque eacuteste utiliza una radiacioacuten de longitud de onda maacutes corta que

permite aumentar 100 mil veces una resolucioacuten de 10 Aring (Kruger et al 2000 Ackermann

2003) Para observar detenidamente la morfologiacutea se requiere el microscopio electroacutenico con

especificaciones precisas como el de barrido lo cual es una herramienta indispensable en

biologia molecular (Guzmaacuten 2015)

Para la observacioacuten las partiacuteculas se suspenden en un medio volaacutetil por lo general una

solucioacuten de acetato de amonio y se colocan sobre una membrana sostenida por una rejilla

metaacutelica que praacutecticamente no absorbe electrones El problema teacutecnico maacutes frecuente es la

falta de contraste como la imagen obtenida es el resultado de la dispersioacuten de electrones por

los aacutetomos de la partiacutecula se necesita una diferencia apreciable de poder dispersivo entre las

partiacuteculas y el medio de soporte generalmente se emplean teacutecnicas tradicionales La maacutes

utilizada se conoce como tincioacuten negativa consiste en mezclar la suspensioacuten del fago con

Antecedentes

42

fosfovolframato de sodio o acetato de uranilo a pH neutro A este pH las sales no se combinan

con el fago al secarse forman una capa uniforme y opaca a los electrones en la cual los fagos

destacan como partiacuteculas maacutes claras Como las sales en solucioacuten penetran las irregularidades

en la superficie de la partiacutecula la micrografiacutea revela los detalles finos de los fagos (Fuster-

Valls et al 2008 Montantildeez et al 2012)

La forma del fago se establece de manera visual que es directa de la placa cuando las

UFP que se observan a simple vista como placas liacuteticas a contraluz (APHA 2005) Y para

estudiar la adhesioacuten y formacioacuten celular en diversas superficies se han desarrollado varias

teacutecnicas de microscopiacutea entre las cuales se distinguen la microscopiacutea electroacutenica de barrido

y de transmisioacuten asiacute como la microscopiacutea de epifluorescencia (Fuster-Valls et al 2008) la

cual se basa en los mismos principios de oacuteptica de la microscopiacutea comuacuten con diferencias en

el manejo y el disentildeo relacionadas con la generacioacuten y transmisioacuten de longitudes de onda

adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar ya sean propios de la muestra o de

la coloracioacuten utilizada (Franco 2005)

El fundamento de la teacutecnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o

compuestos fluorescentes denominados fluorocromos en fijarse a los anticuerpos mediante

un enlace quiacutemico estable que no puede romperse durante el curso de la reaccioacuten

inmunoloacutegica La espectroscopia de fluorescencia es la teacutecnica de deteccioacuten oacuteptica maacutes

sensible En el caso de la deteccioacuten en ceacutelulas se exponen a alta energiacutea utilizando laacutemparas

de xenon excitando por varios nanosegundos y asiacute emitiendo una longitud de onda de baja

energiacutea (Franz y Jendreizik 2015)

H Fagoterapia

Las enfermedades infecciosas estaacuten catalogadas entre las primeras causas de muerte en

el mundo y por lo tanto son consideradas un problema de salud puacuteblica Entre ellas las

infecciones bacterianas causan gran preocupacioacuten dado que las bacterias adquieren diacutea a

diacutea mayor resistencia a los antibioacuteticos esto ocurre por medio de diversos mecanismos

fisioloacutegicos y moleculares que les permiten a estos microorganismos adaptarse raacutepidamente

a condiciones adversas (Prada-Pentildearanda et al 2015)

El descubrimiento de los fagos por dacuteHerelle se desarrolloacute cuando eacuteste buscaba una

Antecedentes

43

vacuna que pudiera combatir la crisis de disenteriacutea hemorraacutegica que se presentoacute en 1915 en

las afueras de Francia dacuteHerelle observoacute que tras aislar lisados libres de bacterias de la

materia fecal de los enfermos las bacterias eran destruidas por un agente desconocido

invisible capaz de destruir cultivos de bacterias o producir pequentildeas aacutereas de color maacutes claro

cuando las bacterias eran crecidas en confluencia en placas de medio soacutelido y publicoacute sus

observaciones en el artiacuteculo titulado ldquoSobre un microbio invisible antagonista de los bacilos

de la disenteriacuteardquo (Szafranski et al 2017)

El uso de los fagos como agentes terapeacuteuticos comenzoacute hace maacutes de 80 antildeos Entre los

ejemplos maacutes destacados y recientes de la utilizacioacuten exitosa de la fagoterapia cabe citar el

uso de fagos especiacuteficos en el control bioloacutegico de E coli O157H7 productora de colitis

hemorraacutegica (en alimentos) Tambieacuten se ha estudiado el uso de fagos en el tratamiento de

infecciones peritoneales y otitis externa en la erradicacioacuten de P aeruginosa en pacientes con

fibrosis quiacutestica en el tratamiento de infecciones urinarias y osteomielitis por S aureus y en

la descolonizacioacuten intestinal para combatir las infecciones por Enterococcus faecium

resistente a vancomicina entre otros Los efectos favorables de la fagoterapia podriacutean

exceder incluso su actividad antibacteriana Hay datos sorprendentes acerca de la actividad

in vivo de los fagos el conocido fago T4 de E coli podriacutea inhibir la adsorcioacuten y la replicacioacuten

de adenovirus en sus ceacutelulas blanco y el fago Pf4 de P aeruginosa habriacutea sido capaz de

inhibir el desarrollo de cepas de Aspergillus por secuestro de hierro (Lopardo 2017)

El estudio y desarrollo de nuevos tratamientos alternativos es de particular intereacutes en la

lucha contra la resistencia bacteriana Los fagos presentan caracteriacutesticas que los hace una

excelente herramienta contra las bacterias patoacutegenas debido a su especificidad y seguridad

ecoloacutegica Los fagos no solo son atractivos desde un punto de vista cliacutenico Se han utilizaacutedo

como potenciales aplicaciones en otras aacutereas como la agricultura el control de alimentos o

la industria como a continuacioacuten se describe en la siguiente tabla 5 Los fagos son una

solucioacuten ecoloacutegica ubicua para desarrollar nuevos tratamientos contra las bacterias aunque

se deben realizar maacutes estudios para comprender mejor la relacioacuten entre ellos y las bacterias

antes de su aplicacioacuten (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Antecedentes

44

Tabla 5 Principales lugares donde se pueden encontrar fagos la naturaleza lugares

urbanizados y cuerpo humano (Domingo-Calap y Delgado-Martiacutenez 2018)

Fuente Sitio encontrado

Naturaleza

Suelo y superficie terrestre

Agua continental y oceaacutenica

Ambientes extremos hielo marino pared de

algas zonas hipersalinas etc

Lugares artificiales

Hospitales y zonas similares

Planta de tratamiento de aguas negras

Algunas zonas bajo el impacto humano

Cuerpo de animales

Tracto digestivo y vagina

Tracto respiratorio y oral

Piel y epitelio mucoso

Los productos comerciales para terapia faacutegica se distribuyen en diferentes presentaciones

Los fagos se pueden distribuir liofilizados y se disuelven antes de la administracioacuten por viacutea

intravenosa en un soporte adecuado como por ejemplo una solucioacuten acuosa o tampoacuten o

suspenderse en cualquier liacutequido adecuado coloidal o de la matriz de poliacutemeros para crear

bactericidas el principio activo se puede administrar de una manera conveniente como por

inyeccioacuten (subcutaacutenea intravenosa administracioacuten etc) por viacutea oral pulmonar (por ejemplo

aerosoles o por otros dispositivos a los pulmones) spray nasal intramuscular intraperitoneal

intrahecal intraviacutetrea vaginal rectal la puncioacuten lumbar y la aplicacioacuten directa Dependiendo

de la viacutea de administracioacuten el principio activo puede estar recubierto de un material que

preserve la sustancia de la accioacuten de enzimas aacutecidos y otras condiciones naturales que

pueden inactivar la sustancia (por ejemplo comprimidos recubiertos enteacutericos o pastillas)

Empresas dedicadas a la biotecnologiacutea se dedicaron a desarrollar productos utilizando fagos

especiacuteficos para eliminar las bacterias que causan ETA la Food and Drug Administration de

los EE UU (FDA) incluye a los fagos en la categoriacutea de aditivos alimentarios la FDA ha

publicado la aprobacioacuten de seis fagos para usar en alimentos listos para comer (ready to eat)

efectivos para L monocytogenes de la compantildeiacutea Intralytix La compantildeiacutea Omnilytics ofrece

productos de control bacterial para varias aacutereas como son agricultura agua y alimentos

industrias que se pueden observar en su paacutegina web (httpswwwomnilyticscom) y otras

empresas como Biophage Pharma Inc (Canada) Exponential Biotherapies (EE UU)

(Segundo 2010)

Antecedentes

45

Estas nuevas estrategias de intervencioacuten eco-amigable son requeridas como agente de

biocontrol en contra de Salmonella Los fagos han recibido mucha atencioacuten en los uacuteltimos

antildeos debido a sus caracteriacutesticas prometedoras como la de tomar un objetivo especiacutef ico sin

dantildear la micro-flora en la que coexiste baja toxicidad robustez a los ambientes duros

distribucioacuten de esparcimiento auto-replicacioacuten y produccioacuten relativamente barata y sencilla

algunos ejemplos de la aplicacioacuten de los fagos son los descritos en la siguiente tabla 6 (Oh y

Park 2017)

Tabla 6 Productos con fagos aprobados para aplicaciones de seguridad alimentaria (Oh y

Park 2017)

Compantildeiacutea Producto del fago Organismo hueacutesped

FINK TEC GmbH (Alemania) Secure Shield E1 E coli

Intralytix Inc

(EE UU)

Ecolicidereg (EcolicidePXtrade) E coli O157H7

EcoShieldtrade E coli O157H7

ListShieldtrade L monocytogenes

SalmoFreshtrade Salmonella spp

ShigaShieldtrade

(ShigActivetrade) Shigella spp

Micreos Food Safety

(Holanda)

PhageGuard Listextrade L monocytogenes

PhageGuard Strade Salmonella spp

E coli O157H7

Passport Food Safety Solutions

(EE UU) Finalysereg E coli O157H7

Phagelux (China)

AgriPhag

Xanthomonas campestris pv

vesicatoria Pseudomonas

syringae

pv tomato

SalmoProreg Salmonella spp

Salmonella spp

Antecedentes

46

47

III OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

48

Objetivos y plan de trabajo

49

A Objetivo general

El objetivo general de este estudio es aislar y caracterizar fagos frente Salmonella spp a

partir de diversas fuentes ambientales para su uso potencial en el control bioloacutegico

El control de Salmonella spp es de gran intereacutes para la industria alimentaria por lo que

encontrar alternativas para su eliminacioacuten es de gran impacto en la salud puacuteblica

B Objetivos especiacuteficos

1- Aislar fagos de Salmonella proveniente de muestras de aguas residuales de la ZMM y

muestras de lavado de carne pollo de un establecimiento donde se comercializa esta carne

2- Caracterizar parcialmente los fagos aislados en base a su morfologiacutea por TEM y el

anaacutelisis de sensibilidad frente a diversas cepas bacterianas

3- Estudiar el efecto de los fagos previamente aislados desarrollando un biofilm de

Salmonella spp sobre discos de acero inoxidable utilizando la DEM

C Plan de trabajo

Para alcanzar los objetivos establecidos se considera la ubicacioacuten de las fuentes para la

obtencioacuten de los fagos en este caso el medio seleccionado son riacuteos arroyos asiacute como un

establecimiento donde se procesan canales de pollo en la ZMM y las lagunas de oxidacioacuten

de aguas residuales en Mariacuten ambas localidades en Nuevo Leoacuten Meacutexico

Posteriormentese utilizaraacute la teacutecnica ADC y se verificaraacute en cual de estas muestras se

podriacutean encontrar fagos que sean liacuteticos para Salmonella enterica y posteriormente se

realizaraacuten pruebas de selectividad con la meta de caracterizar los fagos aislados frente a

diferentes hueacutesped (cepas de Salmonella spp y de E coli) y la observacioacuten de la morfologiacutea

se realizaraacute por el TEM

Salmonella spp presenta un periacuteodo de incubacioacuten por lo general entre 12 y 36 horas

tras el cual el derarrollo bacteriano en las superficies puede dar como resultado la formacioacuten

de un biofilm Para este estudio se desarrollaraacute un biofilm de Salmonella spp sobre discos

de acero inoxidable en condiciones de humedad esto es importante por la fase de eclipse

Objetivos y plan de trabajo

50

(momento en el cual atacan y se desarrollan los fagos) Se probaraacuten 3 concentraciones de

fago 6 7 y 8 UFPmL Se realizaraacuten recuentos durante un periacuteodo de incubacioacuten de 72 h

Con el fin de conseguir estos objetivos el presente trabajo se ha estructurado en tres

secciones las cuales se pueden observar en la figura 5 incluyendo las pruebas con DEM

en los discos de acero inoxidable

Figura 5 Diagrama general de trabajo

51

IV MATERIALES Y MEacuteTODOS

52

Materiales y meacutetodos

53

A Toma de muestras

Las muestras para obtencioacuten de fagos se recolectaron en diez sitios del aacuterea metropolitana

de Monterrey y del municipio de Mariacuten Nuevo Leoacuten (tabla 7) El meacutetodo que se utilizoacute para

aislar fagos de diversas fuentes medio ambientales y su posterior traslado al laboratorio fue

el descrito por Higgins et al (2005) Se obtuvieron las muestras provenientes de aguas

residuales y riacuteos se emplearon frascos de 450 mL previamente lavados y secos que

posteriormente se impregnaron con una solucioacuten de tiosulfato de sodio (Na2S2O3bull5H2O) al

10 (pv) (Sigma-Aldrich EE UU) y se esterilizaron en autoclave 121ordmC15min Al momento

de hacer la recoleccioacuten en campo los frascos fueron abiertos cuidadosamente y se llenaron

con el liacutequido se almacenaron en hieleras para su traslado al laboratorio el tiempo que

transcurrioacute desde la toma de la muestra hasta la llegada al laboratorio fue entre 1 y 3 h

posteriormente las muestras se centrifugaron el mismo diacutea y los sobrenadantes se

almacenaron 4oC hasta su uso (Vidales-Contreras et al 2006)

A cada una de las muestras obtenidas en el muestreo se le agregoacute 25 de cloroformo

(grado de reactivo 995 Sigma-Aldrich EE UU) para conservarlas en condiciones oacuteptimas

para su posterior llegar al laboratorio se mantuvieron a 4degC durante toda la noche para

permitir que el material grueso decante Mientras tanto en lo referente a las muestras

obtenidas de aguas provenientes de los establecimientos expendedores de pollos las

muestras se trataron igual pero como el sobrenadante contiene grasa se optoacute por filtrar y

posteriormente se realizoacute el mismo procedimiento antes descrito

Materiales y meacutetodos

54

Tabla 7 Sitios de muestreo para la obtencioacuten de fagos

B Obtencioacuten de fagos

Para aislar los fagos se utilizoacute la teacutecnica descrita por Sambrook y Russell (2001) la cual se

describe a continuacioacuten En un tubo de ensayo (16150 mm Fisherbrand EE UU)

conteniendo 45 mL de agar suave (AS) (Bioxon Meacutexico) mantenieacutendose a temperatura de

40C (en una cuba hidroneumaacutetica con agua) se colocaron 500 L de un cultivo de S

Enteritidis (provenientes del cepario del CINSP) en fase logariacutetmica y se agregaron 300 L

de las muestras recolectadas en las que se presume conteniacutean los fagos especiacuteficos para

esta cepa Se agitoacute el tubo de ensayo mezclando con movimientos circulares suaves para

evitar la formacioacuten de burbujas este procedimiento se realizoacute aproximadamente por 5

segundos El contenido se vertioacute uniformemente sobre una caja de Petri (10015 mm

Fisherbrand EE UU) conteniendo agar soya tripticasa (AST) (Bioxon Meacutexico) y se dejoacute a

temperatura ambiente hasta solidificar la ADC Se incuboacute a 37C por 24h Al momento de

observar el desarrollo de las placas de lisis (calvas) se procedioacute al aislamiento de los fagos

Su cuantificacioacuten se realizoacute de manera directa e inmediata ya que las calvas son visibles con

una iluminacioacuten de contraste (Breeuwer et al 2003) Posteriormente los fagos que si formaron

halos de inhibicioacuten fueron aislados de manera directa o siguiendo uno de los dos protocolos

(enriquecimiento y sin enriquecer) debido a que depende principalmente de la amplificacioacuten

del fago y las caracteriacutesticas de cada uno se describen a continuacioacuten

Municipio Sitio de la toma

Monterrey

Parque Fundidora

Riacuteo Santa Catarina

Establecimiento de comida

Av Conductores

Mariacuten Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

Riacuteo La Libertad

Guadalupe Alcantarillas de la colonia La Azteca

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

San Nicolaacutes de los Garza Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea

Materiales y meacutetodos

55

B1 Protocolo de enriquecimiento para el aislamiento de fagos

Con el protocolo de enriquecimiento se proporcionoacute las condiciones oacuteptimas de desarrollo

al cultivo de la bacteria hueacutesped y la muestra al inocular el cultivo en la muestra y de esta

manera amplificar los posibles fagos que presentes en la muestra de agua

Se realizoacute este protocolo de la siguiente manera primero se seleccionoacute la cepa bacteriana

que seraacute el hueacutesped esto se consiguioacute haciendo un cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y

se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por otra parte se prepararon

aliacutecuotas (10 mL cada una) de cada una de las muestras recolectadas (enriquecidas con

cultivo bacteriano) y se centrifugan a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a

4degC despueacutes el sobrenadante se pasoacute por jeringa y con filtros de 022 microm (Millex-GP

polyethersulfone 33 mm radio-sterilized) Estas dos entidades biloacutegicas se unieron en un

matraz de capacidad de 50 mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon

Meacutexico) a doble concentracioacuten (20) En este matraz se agregaron 300 microL de la muestra

previamente filtrada con fagos y 500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incuboacute a 37degC por

24 h posteriormente por medio de la teacutecnica de ADC se pudo observar la formacioacuten de halos

de lisis de los fagos (Vidales-Contreras et al 2006)

B2 Protocolo sin enriquecimiento para el aislamiento de fagos

El protocolo se emplea para adicionar directamente de la muestra una aliacutecuota y testarla

con la bacteria hueacutesped Se siguieron los pasos anteriormente descritos a este protocolo

primero se seleccionoacute la cepa bacteriana (hueacutesped) esto se realizoacute haciendo un cultivo fresco

(AST) (Bioxon Meacutexico) y se seleccionoacute una colonia definida de un cultivo ldquoovernightrdquo Por

otra parte se preparoacute aliacutecuotas (10 mL) de cada una de las muestras recolectadas y se

centrifugaron a 2700 g (centrifuga Eppendorf 5804R) durante 15 min a 4degC despueacutes el

sobrenadante se pasoacute por jeringa con filtros de 022 microm (Millex-GP polyethersulfone 33 mm

radio-sterilized) Estas dos entidades bioloacutegicas se unieron en un matraz de capacidad de 50

mL y se antildeadieron 20 mL de caldo soya tripticasa (TSB Bioxon Meacutexico) a doble

concentracioacuten (20) A este matraz se agregaron 300 microL de la muestra filtrada con fagos y

500 microL de cultivo bacteriano fresco y se incubaron a 37degC por 24h posteriormente por medio

de la teacutecnica de ADC se observaron la formacioacuten de halos de lisis de los fagos (Vidales-

Materiales y meacutetodos

56

Contreras et al 2006)

B3 Puesta a punto de las entidades bioloacutegicas

Despueacutes de que los cultivos bacterianos se reactivaron la preparacioacuten para trabajar con

ellos fue la siguiente se tomoacute una asada de una colonia bacteriana bien diferenciada y se

incuboacute en un tubo inclinado (punta de flauta) se dejoacute el cultivo toda la noche y posteriormente

se traspasoacute a un subcultivo en caldo con infusioacuten cerebro-corazoacuten (BHI Merck Alemania) e

incuboacute a 37degC durante 24 h posteriormente se subcultivoacute en BHI en las mismas condiciones

Una colonia aislada en tubo punta de flauta se inoculoacute en 9 mL de agua peptonada (3M

Meacutexico) y se incuboacute a 37degC durante 24 h luego se realizaron mezclas seriadas en diluyente

(1 gL triptona 85 gL NaCl pH 72) (Merck Alemania) y se implantaron en las superficies de

los discos de acero inoxidable tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm con

un volumen inferior a 50 microL Como control del inoacuteculo se prepararon 5 placas de TSA

En el caso del fago obtenido se amplificoacute realizando la infeccioacuten en repetidas ocasiones

hasta alcanzar una concentracioacuten de 1x107 UFPmL

B4 Activacioacuten y mantenimiento de cultivos

Para la realizacioacuten de este estudio se utilizaron cepas bacterianas de Salmonella enterica

y E coli provenientes de diversas colecciones de los laboratorios involucrados tambieacuten se

utilizoacute un fago de prueba (PRD1) para ser utilizado como control positivo en los aislamientos

En la tabla 8 se muestran las bacterias y el fago indicando su denominacioacuten y origen asiacute como

las condiciones de conservacioacuten

Materiales y meacutetodos

57

Tabla 8 Origen de las entidades bioloacutegicas y condiciones de conservacioacuten

Origen Cepa bacteriana fagos Clave Condiciones de conservacioacuten

FaSPyN

S Typhimurium ATCC 13311

Glicerol a -20degC S Paratyphi ATCC 9150

S Enteritidis ATCC 13076

FCB S Typhi ATCC 19430 BGA TSA 4degC

FAUANL

S Typhimurium TSA 4degC

Fago PRD1

Tampoacuten fosfato 4degC

E coli CECT 515

E coli K12

E coli ATCC 10536

E coli O157H7 CECT 4783

S bongori ATCC 43975

UAB

S enterica LT2

Vial liofilizado a -20degC

S enterica sub enterica CECT 4138

S enterica sub enterica CECT 4594

S enterica sub enterica CECT409

S enterica sub enterica CECT 698

S Typhimurium CCUG 29478

Para la reactivacioacuten de los cultivos que se almacenan a 4degC se dejaron a temperatura

ambiente igualmente para los congelados Posteriormente para sacarlos del estreacutes se

sembraron en medio de cultivo fresco (AST) (Bioxon Meacutexico) y se incubaron a 37degC por 24

horas tras estas condiciones ya se pudieron utilizar en los ensayos (McLaughlin et al 2006)

A continuacioacuten se describe la forma en que se reactivaron los cultivos en este estudio de

acuerdo a la forma en que estaban almacenados

a) Cultivos almacenados en glicerol

Se descongelaron los viales a temperatura ambiente

Materiales y meacutetodos

58

Se transfirieron 5 microL de cultivo en 20 mL de TSB (Becton Dickinson Co) y se incuboacute a

37degC toda la noche

Se sembroacute en tres campos en caja de Petri de 90 mm con TSA (Becton Dickinson Co)

Se incuboacute a 37degC por 24h

Se seleccionoacute una colonia aislada y bien diferenciada

El cultivo (colonia) se incuboacute en 20 mL de TSB a 37degC toda la noche

b) En caso de los cultivos liofilizados

En el vial se hidrataron los cultivos agregando 1 mL de TSB e incubando 1h a 37degC

Se vertioacute el cultivo en 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC toda la noche

Se realizoacute el mismo proceso anteriormente mencionado en a)

B5 Meacutetodo de agar doble capa (ADC)

La siembra o inoculacioacuten consistioacute en introducir artificialmente una porcioacuten de muestra

(inoacuteculo) en un medio adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano para su desarrollo

y multiplicacioacuten Una vez inoculado el medio se incuboacute a una temperatura adecuada para el

oacuteptimo crecimiento en promedio 37degC Los meacutetodos de conteo en placa como capa doble y

capa simple de agar se basan en la determinacioacuten de la concentracioacuten viral mediante el

conteo de UFP las cuales son zonas de aclaramiento circular o halo de inhibicioacuten de

crecimiento bacteriano que se producen en la capa o ceacutesped bacteriano debido a la lisis

producida por los fagos Inicialmente una partiacutecula de fago infecta a su bacteria hueacutesped se

replica y posteriormente se disemina generando una zona circular sin crecimiento de la

bacteria (Solano et al 2012) Por esta razoacuten en nuestro estudio se utilizoacute esta manera de

trabajar considerando las diferentes formas que se puede presentar los halos de inhibicioacuten

(forma tamantildeo densidad)

La teacutecnica se basoacute en mezclar el cultivo bacteriano en fase logariacutetmica y el fago en agar

suave (AS) tambieacuten llamado top agar cuando se aplica a la placa de Petri donde se realizoacute

el proceso de infeccioacuten El AS se preparoacute con TSB y agar bacterioloacutegico (15) para obtener

una consistencia semisoacutelida que permita el desarrollo de las calvas en el ceacutesped bacteriano

Se mantuvo a una temperatura adecuada para conservar el estado liacutequido y se agitoacute

cuidadosamente para dejar interactuar los cultivos fago-hueacutesped en el tubo de ensayo

Materiales y meacutetodos

59

posteriormente se dispersoacute de manera uniforme en placas de Petri de 90 mm de diaacutemetro con

15 mL de TSA La suspensioacuten (ceacutesped bacteriano en ADC) se dejoacute solidificar a temperatura

ambiente unos minutos y posteriormente se incuboacute 24h37degC (Vidales-Contreras et al 2006)

B6 Modelo de infeccioacuten

Las enzimas endolisinas de los fagos provocan la lisis debilitamiento y rompimiento de la

pared celular de las bacterias La lisis depende de la proporcioacuten de fagos y hueacutesped o

multiplicidad de infeccioacuten (Multiplicity of infection MOI) Cuando hay una MOI baja la relacioacuten

de fagos a bacterias no es superior a 21 Cuando la MOI es alta es decir muchos fagos frente

a pocas bacterias las ceacutelulas se lisan directamente (Dimmock et al 2007)

En ese sentido la Norma ISO 10705-11995 indica que durante el ensayo el fago en fase

de multiplicacioacuten experimenta varios ciclos de replicacioacuten lo que resulta en la muerte de la

ceacutelula hueacutesped que ha actuado como faacutebrica para la produccioacuten viral El modelo que se siguioacute

es para observar los halos de inhibicioacuten y contrastar los resultados En la figura 6 se presenta

el modelo de infeccioacuten utilizado con S Typhimurium y el fago PRD1 siguiendo el modelo de

Vidales-Contreras et al (2006) y la puesta a punto propuetas por Sambrook y Russell (2001)

Figura 6 Diagrama de flujo utilizado para realizar la infeccioacuten fago-hueacutesped

Materiales y meacutetodos

60

B7 Controles utilizados durante los ensayos

Se utilizoacute la cepa de S Typhimurium y el fago PRD1 como control positivo para observar

la formacioacuten de las calvas para el control negativo se utilizoacute agua esterilizada con esto se

asegurar que si existe infeccioacuten y evitar los falsos positivos que ocurren primordialmente por

contaminacioacuten

Para control negativo el ceacutesped bacteriano se obtuvo de la siguiente manera en un

tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de cultivo de S

Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de agua destilada esteacuteril la mezcla se vertioacute

en placa Petri con TSA

Como control positivo el ceacutesped bacteriano y las placas de lisis se obtuvieron como

sigue en un tubo de ensayo se depositaron 45 mL de AS y se le agregaron 500 microL de

cultivo de S Typhimurium en fase logariacutetmica maacutes 300 microL de fagos PRD1 la mezcla se

vertioacute en placa Petri con TSA

B8 Curva de crecimiento de Salmonella Typhimurium

Para realizar los ensayos microbioloacutegicos se requirioacute trabajar con la misma cantidad de

biomasa en una fase de crecimiento similar El conteo en placa es un meacutetodo de medicioacuten de

biomasa que permite el recuento de ceacutelulas viables y consiste en determinar el nuacutemero de

ceacutelulas capaces de reproducirse y generar colonias sobre un medio soacutelido (cada ceacutelula viable

da origen a una colonia) Para este estudio y ver el efecto de los fagos sobre las bacterias

primeramente se calculoacute la curva de crecimiento celular pues es imprescindible para realizar

la infeccioacuten que la bacteria hueacutesped y se encuentre en fase logariacutetmica Es decir para

determinar la biomasa bacteriana se mide la cineacutetica de crecimiento celular y se considera

que se ha alcanzado la fase de crecimiento exponencial cuando la concentracioacuten es de 10⁸

UFCmL (McLaughlin et al 2006)

Para el conteo bacteriano se utilizoacute el meacutetodo de filtracioacuten por membrana

Se transfirioacute 1 mL del cultivo bacteriano fresco a 20 mL de TSB y se incuboacute a 37degC

Cada 30 minutos se recolectaron 300 microL de cultivo

A cada aliacutecuota recogida se le realizaron diluciones seriadas con 27 mL de agua

Materiales y meacutetodos

61

destilada esteacuteril hasta obtener un factor de 1010

De cada una de estas diluciones se obtuvieron 100 microL que se filtraron por membrana

de celulosa 045 microm (Millipore Corporation Billerica Ma 47 mm esteacuteril Cat No

JMX000089 Millipore) montada en un embudo de filtracioacuten magneacutetico de 47 mm (Pall

GELMAN Laboratory con capacidad de 300 mL) y con bomba de vaciacuteo (GM motors amp

industrial systems Modelo 5kh36kna510x)

Las membranas se colocaron en caja de Petri con TSA y se incubaron 24h a 37degC

C Concentracioacuten y purificacioacuten de fagos

Con excepcioacuten de la microscopiacutea electroacutenica los meacutetodos empleados para determinar el

tamantildeo forma y composicioacuten quiacutemica de los fago requieren una alta pureza de las partiacuteculas

virales El material de partida en cualquier estudio de este tipo para la obtencioacuten del fago es

cuando se presenten los halos de inhibicioacuten en el ADC en general ademaacutes de los fagos

estas zonas claras pueden contener los restos celulares de las bacterias como trozos de

pared membranas ribosomas ADN ARN proteiacutenas y otros componentes de peso molecular

maacutes bajo El contenido de fago en un lisado es del orden de 001 mg mL por lo que para

obtener la cantidad apropiada para su caracterizacioacuten es necesario partir de varios litros

(Leverentz et al 2003 Maestro y Sanz 2016)

Para llevar a cabo la purificacioacuten de los fagos se debe de realizar con concentraciones

superiores a 1010 UFPmL Uno de los meacutetodos maacutes utilizados es la centrifugacioacuten a alta

velocidad y posterior resuspensioacuten de las partiacuteculas sedimentadas en un volumen menor

Cuando es posible esta teacutecnica se reemplaza por un sistema de dos fases basado en la

propiedad que tienen algunos poliacutemeros de alto peso molecular como el polietilenglicol el

dextrasulfato de sodio y el dextrano al separarse estas fases por diferencia de pesos

moleculares los fagos se dispersan en este tipo de medios considerando las concentraciones

empleadas y las condiciones oacuteptimas de pH fuerza ioacutenica y temperatura y al pasar por el

proceso de centrifugacioacuten se concentran en una columna Una vez concentrado el fago en la

columna se puede recuperar faacutecilmente de la interfase Los procesos maacutes comuacutenmente

utilizados para la purificacioacuten posterior se basan en separar las partiacuteculas de fago ya sea por

su tamantildeo o densidad (Sambrook y Russell 2001 Vidales-Contreras et al 2006)

En la figura 7 se presenta el procedimiento para la amplificacioacuten de fagos que nos asegura

Materiales y meacutetodos

62

cultivos puros uniformes y con tiacutetulos altos lo cual es imprescindible para conseguir una

buena imagen en el microscopio electroacutenico

Figura 7 Teacutecnica que se emplea para la amplificacioacuten de bacteriofagos aplicando la teacutecnica

de agar doble capa (ADC)

El meacutetodo utilizado para purificar los fagos que despueacutes de utilizaron para analizar su

morfologiacutea implicoacute el uso del kit Montage SEQ96 (Millipore Sequencing Reaction Cleanup Kit

Millipore Corporation EE UU)

En una placa de filtracioacuten (96 well SEQ plate by Millipore) se depositaron en cada

pocillo 15 microL de concentrado de fagos maacutes 5 microL de agua milli-Q (Injection Solution by

Millipore)

Materiales y meacutetodos

63

La separacioacuten se realizoacute por la exclusioacuten de lavados de la columna de gel aplicando

vaciacuteo por medio de una bomba (Millipore EE UU Vacuumpressure 220 V50 Hz 15 mm

Hg)

Posteriormente se resuspendioacute la muestra (Thermomixer comfort by Eppendorf) con

agitacioacuten durante 1 min a 500 rpm

Finalmente se agregoacute 10 microL de agua ultra pura Milli-Q para concentrar la muestra

(Injection Solution by Millipore)

Una de las modificaciones que se realizaron para obtener los fagos con elevada pureza y

concentracioacuten para ser utilizada en la microscopiacutea electroacutenica se realizoacute con el kit Montage

SEQ96 que se utiliza para la purificacioacuten de DNA y en este caso se utilizoacute para concentrar los

fagos (concentracioacuten 1012 UFPmL) El procedimiento se describe a continuacioacuten

Se antildeadieron 20 microL de buffer de inyeccioacuten a la placa donde se teniacutea la suspensioacuten de

fagos se resuspendioacute y transfirioacute todo el volumen a la placa azul de Millipore (kit Montage)

Se colocoacute la placa en la bomba del kit Montage de 2 a 3 min hasta que quedoacute seca

Es aconsejable no dejar maacutes tiempo del necesario para evitar un secado excesivo

Se limpioacute todo el exceso de liacutequido en la placa con papel filtro secando un par de

veces la placa sobre el papel Inmediatamente despueacutes se colocoacute la placa sobre el soporte

de la bomba evitando dejarla sobre el papel

Se antildeadieron 30 microL de buffer de inyeccioacuten

Se colocoacute la placa en la bomba unos 4-5 min hasta secarse

Con papel filtro se limpioacute todo el exceso de liacutequido que quedoacute en la placa y se colocoacute

en el soporte de la bomba

Se antildeadieron 30 microL maacutes de buffer de inyeccioacuten para resuspender

Se colocoacute la placa en agitacioacuten se centrifugoacute a 500 g por 10 min

Se traspasaron los 30 microL a un nuevo pocillo y se recolectoacute el sobrenadante

D Preparacioacuten de muestras para microscopiacutea electroacutenica

Con la concentracioacuten de fagos purificados se preparoacute la muestra para la observacioacuten al

microscopio electroacutenico y se procedioacute utilizando la teacutecnica de tincioacuten negativa tal como se

explica a continuacioacuten

Se depositaron 2 microL de suspensioacuten de fagos en un disco de capa fina de carbono y cobre

Materiales y meacutetodos

64

(200 Mesh Holes 100 microm square Ethene old 200 RU) despueacutes de 2 min de reposo a

temperatura ambiente se eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente Se antildeadieron 2

microL de agente de contraste solucioacuten tampoacuten 1 de acetato de uranilo (UO2middot (CH3COO)2middot2H2O)

(Merck Alemania) Se dejoacute actuar el colorante durante 2 min a temperatura ambiente y se

eliminoacute el exceso de liacutequido con papel absorbente y despueacutes se dejoacute el disco alrededor de 5

min a temperatura ambiente antes de observar en el microscopio

D1 Observacioacuten de fagos mediante microscopiacutea de epifluorescencia directa

(DEM)

La microscopiacutea oacuteptica es el meacutetodo adecuado para la investigacioacuten de procesos celulares

ya que es menos agresivo para el manejo de la muestra Existen teacutecnicas de microscopiacutea con

otras especificaciones donde se aplican para estudiar la adhesioacuten celular y formacioacuten de

biofilms en superficies tales como el espectrofotoacutemetro infrarrojo transformada de Fourier el

laacuteser confocal de barrido y la microscopiacutea de fuerza atoacutemica estos microscopios se

caracterizada por detectar las ceacutelulas viables de las dantildeadas por medio de cromoacuteforos

(Montantildeez et al 2012) La microscopiacutea que estamos trabajando esta basada en fluorescencia

la cual utiliza cromoacuteforos para detectar DNA de ceacutelulas vivas (coloracioacuten verde) y ceacutelulas

muertas (coloracioacuten roja) y ha tenido grandes avances en la observacioacuten de tejidos ceacutelulas

moleacuteculas individuales y por consiguiente algunos restos celulares todos estos con una

excelente resolucioacuten (Pellegrotti et al 2014)

Para la observacioacuten de ceacutelulas mediante el DEM se utilizoacute el kit comercial de viabilidad Bac

Light (LIVEDEAD Bacterial Viability Kit L-13152 Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE

UU) que estaacute compuesto por dos colorantes fluorescentes de aacutecidos nucleicos (SYTOreg9 y

PISYTOreg9) que penetran tanto en las membranas intactas como en las lesionadas lo que

permite evaluar la vitalidad de las ceacutelulas bacterianas basaacutendose en la deteccioacuten de la

actividad de las oxidasas y reductasas bacterianas Se observa una sentildeal fluorescente

mejorada en ceacutelulas bacterianas con procesos metaboacutelicos activos En contraste PISYTOreg9

se manifiesta soacutelo en las ceacutelulas que presentan membranas lesionadas y desplaza el colorante

SYTOreg9 por la transferencia de energiacutea de la resonancia fluorescente Cuando se aplican

estos dos colorantes en proporcioacuten adecuada las ceacutelulas viables con membranas intactas

presentaraacuten fluorescencia verde y en contraste las ceacutelulas muertas o lesionadas tendraacuten

Materiales y meacutetodos

65

coloracioacuten roja (Berney et al 2007)

A continuacioacuten se describe la preparacioacuten de las muestras para ser observadas por el DEM

Se colocaron 2 microL de la concentracioacuten suspensioacuten de la muestra con fagos en una

concentracioacuten de 1x1012 UFCmL sobre un disco de acero inoxidable (tipo 14301 (2 cm de

diaacutemetro y 1 mm de grosor) ligeramente convexos con una altura maacutexima en el centro

de 1 mm

Se dejoacute secar a temperatura ambiente por espacio de 10 min

Posteriormente se aplicaron 2 microL de la solucioacuten vital de fluorescencia (LIVEDEAD Bac

Light Thermo fisher scienfific Molecular Pribes EE UU) que reacciona y da la coloracioacuten

al material geneacutetico de las bacterias

Para la observacioacuten de los discos se utilizoacute el microscopio de fluorescencia Olympus

BX51BX52 (Tokio Japoacuten) con caacutemara digital incorporada (DP 50 Olympus) equipado con

laacutempara de mercurio de 100 W (USH-103 OL Olympus) con filtro de doble paso (U-M51004

FR V2 Olympus)

Para enumerar las ceacutelulas bacterianas en el biofilm que se formo en los discos de

acero inoxidable se trabajoacute con un objetivo de 20X y se ubicaban 10 campos

aleatoriamente y los resultados se expresaron por cm2 Las imaacutegenes se revisaron con el

sistema de anaacutelisis de imagen (anaacutelisis 32 soft Imaging System GMBH Alemania)

El biofilm bacteriano se desarrolloacute en la superficie de discos de acero inoxidable tipo

14301 Antes de usarse deben limpiarse bien por inmersioacuten en una solucioacuten acuosa de

detergente (DINO-dis-Dipol Espantildea) al 5 en agua durante 1 h despueacutes se realizoacute la

inmersioacuten en bantildeo con alcohol isopropiacutelico (2-propanol) (Merck Alemania) al 70 en agua

durante 15 min Una vez secos se esterilizaron en autoclave a 121degC por 15 min

D2 Formacioacuten del biofilm y observacioacuten al DEM

Se inocularon la superficie de los discos con 50 microL de cultivo de S enterica maacutes medio de

cultivo (TSB) para proporcionar en medio rico para que se forme el biofilm posteriormente se

colocaron en cajas de Petri esteacuteriles y se mantuvieron en condiciones de humedad a

temperatura ambiente durante periacuteodos de 24 48 y 72h realizaacutendoles el conteo

correspondiente para verificar el desarrollo del biofilm

Materiales y meacutetodos

66

Una vez formado el biofilm se inocularon los discos con 3 concentraciones diferentes de

fagos 6 7 y 8 logcm2 en un volumen inferior a 50 microL Las diluciones del fago se hicieron en

solucioacuten salina fisioloacutegica (SSF cloruro de sodio 080) (Merck Alemania) Se realizoacute la

infeccioacuten al inocular a los discos prueba y los discos de control con el mismo volumen de SSF

las condiciones de incubacioacuten se realizaron con humedad y a temperatura ambiente

Los discos de acero inoxidable que fueron inoculados con la infeccioacuten fago-bacteria se

analizaron en periacuteodos de 0 2 8 24 y 48 h Se utilizaron para la valoracioacuten de bacterias y

fagos y se distribuyeron los discos de la siguiente manera 2 para visualizacioacuten microscoacutepica

panoraacutemica 2 para recuento bacteriano por microscopiacutea y 2 para recuento bacteriano dando

un total de 6 discos por caja de Petri por duplicado y por cada concentracioacuten (3) por cada

ensayo (3) y por horarios (5) de dando un total de 540 discos

Para el conteo sobre cada disco se colocaron 20 microL del colorante (LIVEDEAD Pribes) y

se incubaron por 5 min a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad y se tomaron

fotografiacuteas a 10X 20X y 40X Para la microscopiacutea de conteo las fotografiacuteas se realizaron a

un aumento de 40X considerando 10 campos aleatorios

Cuando se formoacute el biofilm se requirioacute hacer los recuentos de bacterias y de fagos en ese

sentido para recuperar las bacterias los discos se colocaron en un frasco con 5 mL de TSB

con Tween 80 (TSBTW) (Merck Alemania) y 3 g de perlas de vidrio se homogeneizoacute la

muestra por 1 min en agitador voacutertex a maacutexima potencia para favorecer el desprendimiento

de los microorganismos y posteriormente se realizaron diluciones seriadas De este mismo

extracto se obtuvo el material necesario para hacer el conteo de fagos utilizando la teacutecnica de

ADC Y para el recuento de las bacterias viables se trabajoacute con cajas de Petri se sembroacute 1

mL en TSA con 06 de extracto de levadura (TSAYE Merck Alemania) y se incuboacute a 37degC

durante 24h (Fuster-Valls et al 2008)

67

V RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN

Resultados y discusioacuten

68

Resultados y discusioacuten

69

A Sitios de recoleccioacuten y nuacutemero de muestras

De los 10 sitios de recoleccioacuten se lograron obtener un total de 39 muestras en junio de

2007 En la tabla 9 se presentan los sitios y el nuacutemero de muestras recogidas en cada sitio

En el caso del Riacuteo Santa Catarina se abarcoacute una distancia de 95 km la cual presentaba

diferentes zonas de descarga de aguas residuales y de ahiacute se hicieron las tomas en un periacuteodo

de estiaje En el caso de las lagunas de oxidacioacuten del municipio de Mariacuten esta zona presenta

tres lagunas con un aacuterea total de 16700 m2 se realizoacute el muestreo de manera aleatoria En

cuanto a las muestras que se obtuvieron en el sitio de comercializar carne de pollo se les tratoacute

de igual manera para comprobar si existiacutean fagos

Los lugares elegidos para la recoleccioacuten de muestras son similares a los reportados en la

literatura regularmente para el aislamiento de fagos del ambiente se utilizan aguas residuales

y establecimientos de manipulacioacuten yo venta de alimentos (Leeuw et al 2017) En

investigaciones previas se realizan muestreos de diversos sitios como en la piel y heces de

animales manos de los cuidadores superficies quiruacutergicas e instrumentos o utensilios usados

en los establecimientos hoteles y restaurantes (Ejo et al 2016 Yergeau et al 2016) Los

muestreos de aguas tambieacuten se pueden realizar en sitios cercanos a las salidas de drenaje

de hospitales esto es de gran importancia ya que donde hay bacterias posiblemente esteacuten

sus respectivos fagos (Tomat et al 2014 Mattila et al 2015 McShan y Nguyen 2016)

Resultados y discusioacuten

70

Tabla 9 Sitios donde se obtuvieron las muestas de agua para obtener fagos

B Aislamiento de fagos de Salmonella Enteritidis

Para el aislamiento de los fagos especiacuteficos de Salmonella fue necesario la puesta a punto

de varios procedimientos la teacutecnica de agar doble capa (ADC) determinar la cineacutetica de

crecimiento de cultivos de Salmonella determinar la fase de eclipse en la relacioacuten fago-

bacteria (se utilizoacute como control la cepa S Typhimurium y el fago PRD1) y su puesta a punto

en el laboratorio de bioremediacioacuten de la Facultad de Agronomiacutea de la UANL

B1 Puesta a punto de la teacutecnica de agar doble capa (ADC) mediante S

Typhimurium

La accioacuten liacutetica de los fagos sobre Salmonella se analizoacute utilizando la teacutecnica ADC

En este procedimiento es necesario tener un ceacutesped bacteriano uniforme entre dos capas

de medio soacutelido que puede ser agar-agar o agar-agarosa (Sambrook y Rusell 2001)

Con el objetivo de abaratar los costes y mejorar los resultados en este trabajo se empleoacute

esta teacutecnica con algunas modificaciones que se describen a continuacioacuten Asiacute pues se decidioacute

que las capas fueran agar-agar donde la primera capa fue de agar al 15 en medio TS y la

Municipio Sitio de la toma N de muestras

Tipo de agua

Monterrey

Parque Fundidora 3 Estanque y corriente

Riacuteo Santa Catarina 10 Corriente

Establecimiento de comida 2 Lavado del pollo

Av Conductores 2 Corriente

Mariacuten

Lagunas de oxidacioacuten del sistema de desechos de agua municipal

10 Estanque y corriente

Riacuteo La Libertad 2 Corriente

Guadalupe

Alcantarillas de la colonia La Azteca

3 Corriente

Establecimientos de venta de carne de pollo y derivados

2 Lavado del pollo

San Nicolaacutes de los Garza

Alcantarillas de la colonia Anaacutehuac

2 Corriente

Pesqueriacutea Riacuteo Pesqueriacutea 3 Corriente

Resultados y discusioacuten

71

segunda con agar a una menor concentracioacuten para hacer la capa menos firme por lo que fue

necesario poner a punto la teacutecnica probando diferentes concentraciones de agar en ambos

casos a pH 72 Ademaacutes esta adecuacioacuten es importante por el ahorro que se generoacute al utilizar

un componente maacutes econoacutemico que la agarosa lo cual repercutioacute favorablemente en el coste

de la prueba

Otra variable para poner a punto en la teacutecnica de ADC es el volumen de cultivo bacteriano

a utilizar para generar el ceacutesped de Salmonella y lograr una adecuada interaccioacuten con el fago

Se probaron 3 voluacutemenes diferentes de cultivo de S Typhimurium incubados 24 horas a 37oC

para alcanzar una concentracioacuten de 16 x 108 UFCmL Dependiendo de la cantidad de inoacuteculo

las caracteriacutesticas del ceacutesped bacteriano tienen diferente contraste lo cual puede facilitar o

dificultar la observacioacuten de las placas liacuteticas Finalmente el mejor resultado se obtuvo al

utilizar el volumen de 500 L ya que se logroacute una mejor observacioacuten del aclaramiento del

ceacutesped bacteriano al formar las placas liacuteticas En la tabla 10 se muestran las caracteriacutesticas

de las capas en la caja Petri para un buen manejo y desarrollo de la zona liacutetica producida por

el fago al multiplicarse

Tabla 10 Caracteriacutesticas finales de la teacutecnica de ADC

Paraacutemetro Condiciones

Agar suave (con agar) () 08

Temperatura del agar suave (degC) 49

pH del medio de cultivo (soacutelido y liacutequido) 72

Cantidad de agar suave (mL) 45

Cultivo bacteriano (microL) 500

Muestra tratada con fagos (microL) 100

Resultados y discusioacuten

72

B2 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Salmonella Typhimurium

El cultivo hueacutesped debe de encontrarse creciendo en medio liacutequido TS en fase logariacutetmica

al momento de mezclarlo con el fago Para identificar la fase logariacutetmica se probaron

diferentes tiempos de crecimiento Con todo ello se observa que la fase logariacutetmica de S

Typhimurium se encuentra en el minuto 150 coincidiendo con los datos reportados por

Vidales-Contreras et al (2006) Y siguiendo con mi tesis la determinacioacuten de la concentracioacuten

se realizoacute mediante el promedio de la enumeracioacuten de las UFC por placas Petri preparadas

por duplicado multiplicado por el factor de dilucioacuten el cual es el reciacuteproco del producto del

volumen ensayado y la dilucioacuten usada para el anaacutelisis Al final se observa cuando se ha

llegado a la fase estacionaria del desarrollo bacteriano (tabla 11) Se utiliza un factor de

dilucioacuten el cual se obtiene como el reciacuteproco de la multiplicacioacuten de volumen de ensayo y la

dilucioacuten usada en el anaacutelisis

Tabla 11 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Typhimurium

Tiempo Minutos

(Acumulado) Dilucioacuten

UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten

(UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 9 plusmn 25 1 x 106 900 x 106

T1 30 1 x 10-5 13 plusmn 74 1 x 106 130 x 107

T2 60 1 x 10-5 24 plusmn 56 1 x 106 240 x 107

T3 90 1 x 10-5 51 plusmn 32 1 x 106 510 x 107

T4 123 1 x 10-5 211 plusmn 89 1 x 106 211 x 108

T5 150 1 x 10-6 215 plusmn 81 1 x 107 215 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B3 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de Enteritidis

Las consideraciones tomadas del modelo infectivo S Typhimurium y el fago PRD1 y

utilizando la teacutecnica ADC se replican para poner a punto a la bacteria que se quiere probar

que en este caso es S Typhi ATCC 19430 Los resultados de estos ensayos se pueden

observar en la tabla 12 en la que se puede observar que es ligeramente mayor la etapa donde

Resultados y discusioacuten

73

se puede realizar la infeccioacuten (fase de eclipse) de los fagos aislados y la bacteria hueacutesped

Tabla 12 Determinacioacuten de la fase logariacutetmica de S Enteritidis (108 UFCmL) (37 ordmC24h)

Tiempo Minutos (Acumulado)

Dilucioacuten UFCmL Promedio

F (Factor) Concentracioacuten (UFCmL)

T0 0 1 x 10-5 216 710 1 x 106 20 x 107

T1 60 1 x 10-5 260 608 1 x 106 20 x 107

T2 120 1 x 10-6 160 173 1 x 107 16 x 108

T3 180 1 x 10-6 244 208 1 x 107 24 x 108

T4 240 1 x 10-7 400 100 1 x 107 40 x 109

Promedio Desviacioacuten Standard (DS) N=3 Seguacuten ecuacioacuten de Vidales-Contreras et al (2006)

B4 Obtencioacuten de fagos de Salmonella Enteritidis

De los sitios muestreados se logro obtener 39 muestras y se obtuvo un total de 15 fagos

aislados a partir de dos fuentes de aguas residuales las del Riacuteo Santa Catarina y las lagunas

de oxidacioacuten de Mariacuten Los 15 fagos se nombraron consecutivamente como MRH 1-15 Los

15 fagos se probaron contra la cepa hueacutesped S Enteritidis (CINSP tabla 4) tras realizar de

3 a 4 amplificaciones la mayoriacutea (14 fagos) no presentoacute actividad liacutetica (formacioacuten de halos

de inhibicioacuten) de manera que fueron descartados para los siguientes estudios siendo

solamente uno proveniente de la muestra del Rio Santa Catarina el que produjo halos bien

definidos en el ceacutesped bacteriano y con eacuteste se continuoacute trabajando El fago que mantuvo la

actividad liacutetica fue el MRH6 Se propuso nombrarle como MRH considerando la M para

muestra la RH por el Rodrigo Hernaacutendez

B5 Diferenciacioacuten de los fagos por la formacioacuten de halo de inhibicioacuten

La principal caracteriacutestica de los fagos es cuando forman halos de inhibicioacuten (tambieacuten

llamadas zonas liacuteticas o calvas) y en nuestro estudio las muestras de agua recolectadas

fueron tratadas y analizadas mediante la teacutecnica ADC observando los halos de inhibicioacuten

claros y de diferentes diaacutemetros estas observaciones son similares a las observadas por

Ackermann (2003) Tanto la cantidad de UFP que se pueden desarrollar y observar hecha por

Resultados y discusioacuten

74

los fagos y la pureza en que encuentren los bacterioacutefagos de las muestras obtenidas del medio

ambiente estaacuten directamente relacionadas la especificidad contra la bacteria Al sembrar por

vaciado en placa estos lisados sobre la cepa indicadora se obtuvieron diferentes tamantildeos de

placas liacuteticas

En la figura 8 se muestran los halos de inhibicioacuten en ceacutesped de Salmonella al realizar la

infeccioacuten se pueden observar los diferentes tamantildeos y la forma se da por la capacidad de

raacutefaga (nuacutemero de copias al realizar el proceso liacutetico) de los fagos de la progenie los fagos

suelen tener una raacutefaga de maacutes de 100 partiacuteculas infectivas producidas en un lapso de tiempo

de 05 ndash 20 h Algunos halos formados por el fago fueron claros lo que indica que es liacutetico de

acuerdo con diversos autores (Sambrook y Rusell 2001 Vidales-Contreras et al 2006 Wong

et al 2014) En nuestro estudio se batalloacute en encontrar fagos a pesar de buscar sitios

sentildealados por autores antes mencionados

Al intentar obtener fagos puede suceder que se encuentren en concentraciones tan

pequentildeas que al probarlos contra alguna cepa hueacutesped no sirven para trabajar por lo que se

llevoacute a cabo repeticiones seriadas (amplificacioacuten) asegurando que al formar una placa de Petri

en ADC con tamantildeos de los halos de inhibicioacuten iguales lo que nos indica que pertenecen a

una sola especie de fago

Figura 8 Ceacutesped bacteriano de S Enteritidis infectado por fagos con halos de inihibicioacuten de

diferentes tamantildeos

Resultados y discusioacuten

75

C Sensibilidad de los fagos frente a diferentes cepas de Salmonella spp y de E coli

La clasificacioacuten de los fagos se puede establer en base a su morfologiacutea al aacutecido nucleico

al espectro de accioacuten y algunas consideraciones inmunoloacutegicas (Criscuolo et al 2017) Al

realizar la infeccioacuten de fago-bacteria y observar la presencia de halos liacuteticos en las placas de

ceacutesped bacteriano se considera que se ha producido una infeccioacuten exitosa pero previamente

es necesario poner a punto el cultivo puro de ambos cultivos y considerar la concentracioacuten de

cultivos a utilizar

Al seleccionar los fagos que presentaron uniformidad en cuanto a la inhibicioacuten y posterior

evaluacioacuten de los fagos se consideraron varios factores entre ellos el tiempo que tarda la

replicacioacuten viral (lo cual es variable) siendo que en algunos casos se pueden replicar en

cuestioacuten de minutos A simple vista se pueden observar la formacioacuten de halos de lisis en el

ceacutesped bacteriano en las cajas de Petri

Asiacute pues la teacutecnica ADC se repitioacute varias veces hasta obtener placas liacuteticas con ideacutentica

morfologiacutea y tamantildeo En la tabla 13 se observa que hay diferentes tamantildeos de halos En los

primeros ensayos soacutelo cuatro muestras de agua (15 21 26 y 33) dieron halos de inhibicioacuten

pudieacutendose distinguir bien la forma y el tamantildeo Al realizar posteriores siembras los fagos

fueron perdiendo capacidad de infeccioacuten (fagos atemperados) y soacutelo la muestra 21 de las

lagunas de oxidacioacuten provenientes de Mariacuten presentoacute fagos con actividad liacutetica y el resto de

fagos no desarrolloacute actividad constante

Tabla 13 Frecuencia de cada tamantildeo de halo de inhibicioacuten de S Enteritidis en ceacutesped

bacteriano

Diaacutemetro de halo grande ge 8mm mediano 8 lt X lt6mm pequentildeo le 5mm

Distribucioacuten de tamantildeos de halo

Muestra de agua Grande Mediano Pequentildeo

15 8 23 15

21 17 11 27

26 10 18 6

33 7 9 13

Diaacutemetro medio halo (mm) 1055 0671 0376

Resultados y discusioacuten

76

En la tabla 14 se presenta el listado de posibles hueacutespedes probados 12 cepas de

Salmonella y 4 de E coli que se probaron contra los 15 fagos aislados previamente Se puede

distinguir que afecta a algunas serovariedades de Salmonella y no tiene efecto en otras

serovariedades entericas No afecta nada a las cepas de E coli Se ve que la cepa maacutes

afectada por el fago es la S Typhi ATCC 19430 y otras cepas de Salmonella son afectadas

ligeramente

Resultados y discusioacuten

77

Tabla 14 Listado de hueacutespedes de los fagos aislados frente a serovariedades de Salmonella spp y de E coli

serovariedades Fagos

M

R

H

1

M

R

H

2

M

R

H

3

M

R

H

4

M

R

H

5

M

R

H

6

M

R

H

7

M

R

H

8

M

R

H

9

M

R

H

1

0

M

R

H

1

1

M

R

H

1

2

M

R

H

1

3

M

R

H

1

4

MR

H15

S Typhimurium ATCC 13311

-

-

t

- -

t

- - - - - - - - -

S Paratyphi ATCC 9150 - - - - - - - - - - - - - - -

S Enteritidis ATCC 13076 - - - - - - - - - - - - - - -

S Typhi ATCC 19430 + + + + + t

c

+ + + n

d

n

d

n

d

n

d

nd +

S Typhimurium - - - - - - - - - - - - - - -

S Bongori ATCC 43975 - - - - - - - - - - - - - - -

S enterica LT2 - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4138 - - - - + + + - - - - - - - -

S sub enterica CECT 4594

t

t

t

- + + + - - -

t

- - - -

S sub enterica CECT 409 - - - - n

d

- -

t

- - - - - - -

S sub enterica CECT 698 - - - - - t

c

- - - - - - - - -

S Typhimurium CCUG

29478

- - - + + - - - - - - - -

E coli CECT 515 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli K12 - - - - - - - - - - - - - - -

E coli ATCC 10536 - - - - - - - - - - - - - -

E coli O157H7 CECT 4783 - - - - - - - - - - - - - - -

+ crecimiento y desarrollo de halo indica desarrollo muy pequentildeo o difuso del halo t indica desarrollo pequentildeo y turbio del halo tc indica turbio o con centro opaco en el centro del halo - no crecimiento o desarrollo de halo nd aparente baja efectividad o halo difuso

Resultados y discusioacuten

78

Resultados y discusioacuten

79

El fago que siacute mostroacute actividad (MRH6) y que mantuvo la capacidad liacutetica durante las

diferentes amplificaciones se trabajoacute de manera continua hasta obtener halos uniformes en el

tamantildeo y asiacute ya se considera como una entidad pura de fago Los resultados obtenidos en

este trabajo son semejantes a los mostrados por Thung et al (2017) En la figura 9 se

presentan las imaacutegenes donde se muestra el desarrollo de halos liacuteticos previamente

mencionados donde se puede observar los halos uniformes contra A) S Enteritidis (CINSP)

y B) S Typhi ATCC 19430 (UAB)

Figura 9 Placas con desarrollo de halos liacuteticos generados por la infeccioacuten fago-bacteria A) S Enteritidis (CINSP) y B) S Typhi ATCC 19430

La especificidad de los fagos se encuentra generalmente a nivel de cepa y tambieacuten de

especie y maacutes raramente a nivel de geacutenero Es de intereacutes el garantizar una eficiente infeccioacuten

de la dupla fago-bacteria de esta manera se toman todas las medidas precautorias para

obtener resultados fiables en este sentido se requiere verificar todos los aspectos como son

los controles (positivo y negativo) En el caso del control negativo se verificoacute el desarrollo

solamente del ceacutesped bacteriano de la cepa hueacutesped con la teacutecnica ADC y como control

positivo se consideroacute el modelo del fago PRD 1 y S Typhimurium los fagos son altamente

especiacuteficos (no afecta a otros cultivos bacterianos) y no se puede descartar falsos positivos

por la presencia de restos celulares bacterianos (Segundo et al 2010 Szafranski et al 2017)

Resultados y discusioacuten

80

D Observacioacuten del fago MRH6 por TEM

El ICTV clasifica a los fagos en 1 orden13 familias y 31 geacuteneros De los cuales se

observa al orden de los Caudovirales el cual comprende a la mayor parte de los fagos (en

torno a un 95)y estos estaacuten constituidos por 3 familias con cola Myoviridae Podoviridae

y Siphoviridae Con estas caracteriacutesticas morfoloacutegicas observadas mediante el TEM en la

figura 10 se presentan las imaacutegenes del fago MRH6

El anaacutelisis de una suspensioacuten de fagos con una concentracioacuten de 1x1012 UFPmL mediante

microscopiacutea electroacutenica muestra una distintiva morfologiacutea de cabeza icosaeacutedrica estructura

alargada y cola no contraacutectil La caacutepside tiene un diaacutemetro de 55-60 nm y la cola puede

alcanzar los 570 nm Estas caracteriacutesticas se corresponden con la familia Siphoviridae Yang

et al (2017) comentan que esta familia de fagos se encuentra frecuentemente en

enterobacterias

Figura 10 Imagen por TEM del fago MRH6 (X100 000) la barra representa 100nm (Servicio de Microscopiacutea UAB)

Resultados y discusioacuten

81

D1 Evaluacioacuten de la formacioacuten de biofilms de S enterica en superficies de acero

inoxidable y comparacioacuten de meacutetodos de conteo mediante microscopiacutea de

epifluorescencia directa (DEM)

Para corroborar la potencial condicioacuten como agente de desinfeccioacuten del fago MRH6 es

necesario observar su efectividad a traveacutes de la DEM con la que se pueden observar

bacterias viables y no viables Tambieacuten la materia orgaacutenica puede dar falsos positivos y se

debe tener en cuenta al comparar con otros meacutetodos de conteo (Montantildeez et al 2012)

En este trabajo S Typhi ATCC 19430 desarrolloacute biofilms en las superficies de acero

inoxidable (discos tipo 14301 de 20 cm de diaacutemetro y un espesor de 12 mm) y consiguieron

niveles de 29 plusmn 02 UFCcm2 despueacutes de tener un maacuteximo de 72 h en incubacioacuten en

condiciones de humedad y temperatura ambiente tal como se puede observar en la figura 11

Estos biofilms tienen distinta intensidad seguacuten el tiempo de incubacioacuten siendo los periodos

evaluados de 24 48 y 72h respectivamente En estas condiciones se realizoacute el recuento en

tres zonas de cada disco para cada tiempo de incubacioacuten y los resultados se presentan en la

figura 12 Para tener fiabilidad de los resultados se realizaron los conteos por triplicado porque

el manejo de los discos es muy complejo y para evitar errores de manejo se consideroacute

necesario tener maacutes de una muestra otorgando ademaacutes la oportunidad de comparar

resultados y tener un margen de referencia en cuanto a los resultados obtenidos

Figura 11 Imaacutegenes obtenidas por DEM en biofilms de S Typhi ATCC 19430 en

diferentes tiempos de incubacioacuten (24 48 y 72h) a temperatura ambiente

Resultados y discusioacuten

82

Figura 12 Crecimiento de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable incubados a temperatura ambiente n = 3

En este estudio se compararon 2 meacutetodos de conteo de bacterias despueacutes de ser atacadas

por los fagos eacutestos fueron el recuento en placa de agar y por otro lado la observacioacuten por

microscopiacutea de epifluorescencia y la relacioacuten entre ambos meacutetodos Desafortunadamente se

han perdido los resultados por un problema irresoluble pero si se puede comentar que existe

una relacioacuten ligeramente inferior a 09 (R2 ) Esta observacioacuten ya ha sido presentada

anteriormente por otros autores (Fuster-Valls et al 2008 Engelhardt et al 2014)

El cultivo bacteriano se puede contabilizar por conteo en placa directo (TSA) este meacutetodo

es utilizado generalmente para cultivos de geacutermenes no exigentes o moderadamente

exigentes y cuando se quiere visualizar como afecta el ataque de los fagos las ceacutelulas

bacterianas se visualizan por DEM (cuya coloracioacuten cambia a verde cuando han sido atacadas

por los fagos) y una forma de visualizar este ataque es por medio de TSA con la teacutecnica de

ADC

0

5

10

15

20

25

0 10 20 30 40 50 60

Co

nte

o (

Lo

g U

FC

cm

2)

Tiempo (h)

Crecimiento bacteriano

Resultados y discusioacuten

83

D2 Conteo por DEM en placas de acero inoxidable

Se aplicoacute la DEM para evaluar la efectividad del fago MRH6 en el control de S Typhi ATCC

19430 sobre superficies de acero inoxidable en condiciones de humedad El fago MRH6 es

liacutetico capaz de disgregar los biofilms

El analizar la accioacuten liacutetica del fago sobre Salmonella por medio del DEM es muy importante

e innovador pero el material que se utiliza y la manera en que se comportan las diferentes

bacterias hacen que se deba ser muy precavido al considerar el uso de este meacutetodo como

adecuado para realizar conteos (Libuchi et al 2010) Por ejemplo se debe tener en cuenta

que existen bacterias que no forman un biofilm y presentan movimiento esto puede llegar a

complicar el visualizarlas si no estaacuten en el campo por lo que se podriacutea pensar que fueron

atacadas y eliminadas por los fagos o bien que por los diferentes lavados se barrieron

La DEM con la tincioacuten LIVEDEAD reveloacute la presencia de ceacutelulas viables con coloracioacuten

verde En la figura 13 se puede observar el efecto letal del fago MRH6 sobre la poblacioacuten de

S enteacuterica disminuyendo su cantidad considerablemente en base a el tiempo de incubacioacuten

en color verde Se observa que hay disminucioacuten de las ceacutelulas de S Typhi ATCC 19430 al ser

atacadas por el fago MRH6 Recordemos que la infeccioacuten con el MRH6 se realizoacute despueacutes de

formar un biofilm a temperatura ambiente y con humedad por espacio de 72h en 3

concentraciones 6 7 y 8 UFPmL Al paso del tiempo se aprecia que a las 48h hay pocas

ceacutelulas vivas al menos detectadas por la teacutecnica utilizada

Resultados y discusioacuten

84

a)

b)

c)

Figura 13 Secuencia de imaacutegenes de epifluorescencia que ilustran la destruccioacuten de S Typhi ATCC 19430 sobre discos de acero inoxidable causada por el fago MRH6 tras incubacioacuten de 0 8 24 y 48 h y con 3 concentraciones de fagos a) 6 b) 7 y c) 8 UFPmL respectivamente

La DEM es un meacutetodo altamente sensible que se caracteriza por la formacioacuten de imaacutegenes

amplificadas y es considerada una teacutecnica poderosa con altos niveles de sensibilidad y

resolucioacuten Tomando como referencia los resultados se considera que la DEM es una

herramienta eficaz para el conteo bacteriano pero hay que considerar la experiencia del

observador

Resultados y discusioacuten

85

En algunas ocasiones al observar las bacterias atacadas por los fago se pueden encontrar

muestras con material geneacutetico mezclado con restos celulares esta situacioacuten hace que

algunos investigadores recomienden extraer los fagos de la muestra antes de sembrar las

bacterias con el fin de determinar la reduccioacuten bacteriana uacutenicamente debida a la actividad

virulenta del fago sobre la muestra y no a la infeccioacuten por fagos libres presentes en el agar

(Sharma et al 2009) En ese sentido tal como reporta Fuster-Valls et al (2008) en su trabajo

observoacute que el limite de deteccioacuten de esta teacutecnica es de 279 log10 celulas por cm2 en cambio

en nuestro trabajo y tal como se observa en la figura 14 se pudo llegar a una sensibilidad

muy proacutexima a 2 y que coincide con las imaacutegenes de la figura 13 en las que a las 24 y 48

horas apenas se observan algunas manchas que corresponden al crecimiento bacteriano

Los fagos utilizan los recursos de la ceacutelula para hacer muchos fagos nuevos lo que causa

que la ceacutelula lise (estalle) y muera en el proceso La lisis en las uacuteltimas etapas del ciclo liacutetico

el fago expresa los genes para las proteiacutenas que hacen agujeros en la membrana plasmaacutetica

y la pared celular En la figura 14 se puede observar como el recuento de Salmonella Typhi

ATCC 19430 disminuye por el ataque del fago MRH6 El efecto del fago es muy fuerte y al

final los conteos son muy parecidos

Resultados y discusioacuten

86

Figura 14 Reduccioacuten de S Typhi ATCC 19430 en superficies de acero inoxidable por el fago MRH6 con diferentes concentraciones y hasta 48 h de incubacioacuten

En este trabajo se buscoacute crear condiciones de infeccioacuten fago-bacteria en el laboratorio

como las que se pudieran presentar en la industria Los resultados de esta relacioacuten del fago

MRH6 y S Typhi ATCC 19430 muestran que la aplicacioacuten del fago es efectiva pero hay que

considerar que funciona mejor a altos tiacutetulos (108 UFCmL) y que deberaacute de potenciarse

cuando se trate de un coctel de fagos

Nuestros resultados sugieren que los fagos pueden ser utilizados como un meacutetodo para

controlar un biofilm formado por un bacteria especiacutefica

Al realizar la buacutesqueda de informacioacuten en diferentes motores de buacutesqueda una de las

plataformas de libre acceso (Pubmed) se obtuvo una relacioacuten de 5 en publicaciones de

00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Salm

on

ella

Typ

hi

AT

CC

19430

(lo

g1

0ceacutelu

las cm

2)

Tiempo (h)

Fago MRH6 a 6 Logml Fago MRH6 a 7 Logml Fago MRH6 a 8 Logml Control sin fago

Resultados y discusioacuten

87

fagos contra diferentes serovariedades de Salmonella spp lo que se puede traducir en que

hay un aacuterea de oportunidad latente

Las consideraciones que se enviacutean como propuesta es que existen en estos momentos

muchos trabajos sobre fagos pero aquiacute en Meacutexico no hay trabajos reportados y los que

existen estaacuten apenas en fases iniciales

Existe un enorme potencial de trabajo en esta aacuterea con los fagos tal es el caso de la

fagoterapia en otros sitos y en otros tiempos estaacuten realizando experimentos para ser

explotada como alternativa para todos los aacutembitos desde hogares industria salud animales

vegetales etc Por lo menos en EE UU tienen grandes avances en estudios relacionados

con la aplicacioacuten en bacterias multiresistentes que por el uso de antibioacuteticos han mutado esto

en el sector salud donde se estaacute perdiendo la batalla

Una de las fortalezas de estudiar a los fagos es que antes de que los antibioacuteticos fueran

descubiertos habiacutea investigacioacuten considerable sobre los fagos como tratamiento para las

enfermedades bacterianas humanas por lo menos en parte de Europa La aplcacion de los

fagos es potencialmente son buenos candidatos para tratar enfermedades bacterianas en

seres humanos inocuidad aliemnaria bioremediacioacuten y cada regioacuten tiene fagos endeacutemicos y

este tabajo representa de los primeros en llevarse en Monterrey

Ciertas limitaciones de los resultados se debiooacute a las condiciones que se presentaron al

realizar el estudio (laboratorio equipo conocimiento del tema) solamente se pudo aislar un

fago y lo recomendable es que sean varios fagos dado que son muy especiacuteficos de especie

o hasta de cepa Se proboacute su accioacuten sobre superficies con un solo cultivo bacteriano y en la

realidad las superficies se contaminan con diferentes bacterias

Lo que se vizualiza para nuestro estudio es sugerir varias liacuteneas de accioacuten a futuro Por

ejemplo el fago aislado podriacutea probarse in vivo sobre carne de pollo o fagoterapia tambieacuten

podriacutea continuar los estudios para aislar maacutes fagos y hacer mezclas (coacutecteles) que tuvieran

un mayor rango de actividad y combatir a diversas especies de Salmonella Con respecto al

tratamiento de superficies podriacutean utilizarse coacutecteles de fagos para tratar biofilms bacterianos

formados por maacutes de dos especies o inclusive podriacutean probarse en biopeliacuteculas industriales

reales

Resultados y discusioacuten

88

89

VI CONCLUSIONES

90

Conclusiones

91

De las 39 muestras de agua analizadas se aislaron tentativamente15 fagos de los que soacutelo 4

mantuvieron en un primer momento su actividad liacutetica estos fagos se correspondieron con las

muestras de agua 15 21 26 y 33 Se siguioacute trabajando con ellos y finalmente solo uno de

ellos el MRH6 mantuvo su actividad liacutetica despueacutes de varias amplificaciones este fago se

aisloacute de las aguas residuales de Mariacuten

Se consiguioacute optimizar la teacutecnica ADC cambiando la agarosa que tiene un alto costo por

agar-agar maacutes econoacutemico sin alterar la fiabilidad de la teacutecnica ademaacutes con este cambio se

facilita el manejo

En relacioacuten con la especificidad de los 15 fagos aislados frente a las 16 cepas de

enterobacterias probadas (12 cepas de Salmonella spp y 4 de E coli) se observa ciertas

tendencias marcadas Ninguno de los fagos ataca a las cepas de E coli probadas En cuanto

a Salmonella se observa una fuerte especificidad frente a S Typhi (ATCC 19430) una ligera

actividad frente a varias cepas de S enterica y no hubo efecto contra las demaacutes cepas de

Salmonella ensayadas lo cual confirma la elevada especificidad fago-hueacutesped

Las imaacutegenes obtenidas mediante DEM muestran una morfologiacutea caracteriacutestica de cabeza

icosaeacutedrica estructura alargada y cola no contraacutectil que sugieren que el fago MRH6 se puede

clasificar en la familia Siphoviridae

Se observa un efecto liacutetico progresivo del fago MRH6 frente a biofilms de Salmonella en

discos de acero inoxidable llegando a valores miacutenimos inferiores a 102 a las 48 horas de

incubacioacuten para todas las concentraciones de fago utilizadas (6 a 8 UFPmL)

Se comprueba que la DEM es un buen meacutetodo para la cuantificacioacuten del crecimiento de S

Typhi (ATCC 19430) sobre discos de acero inoxidable con una gran sensibilidad y resolucioacuten

ya que se observaron claras diferencias en los diversos tiempos de incubacioacuten ensayados y

a diferentes concentraciones del fago MRH6 Esto confirma que la teacutecnica es una herramienta

eficaz para valorar el efecto liacutetico de los fagos sobre biofilms

Ya que en este trabajo solamente se obtuvo un fago liacutetico se sugiere reflexionar acerca de

los factores que han dificultado la obtencioacuten de un nuacutemero maacutes amplio de fagos

Conclusiones

92

Este trabajo refleja el gran intereacutes por iniciar o regresar a trabajar con fagos tal como esta

sucediendo en otras partes del mundo Hasta el momento hay muchas espectaivas sin

embargo todaviacutea se necesita investigacioacuten para saber queacute tan seguros son

93

VII BIBLIOGRAFIacuteA

94

Bibliografiacutea

95

Ackermann H W (2003) Bacteriophage observations and evolution Research in

Microbiology 154(4) 245-251

APHA (Asociacioacuten Americana de Salud Puacuteblica) (21 Ed) (2005) Standard Methods for the

Examination of Water and Wastewater Washington United Book Press

Atlas R y Bartha R (2002) Ecologiacutea y evolicioacuten Ecologiacutea microbiana desarrollo histoacuterico

Evolucioacuten microbiana y biodiversidad En R Altlas (4Ed) Ecologiacutea microbiana y

microbiologiacutea ambiental (pp 29-34) Meacutexico Pearson

Atterbury R J Connerton P L Dodd C E Rees C E y Connerton I F (2003)

Application of Host-Specific Bacteriophages to the Surface of Chicken Skin Leads to a

Reduction in Recovery of Campylobacter jejuni Applied and Environmental

Microbiology 69(10) 6302-6306

Benetti A D (2007) Preventing disease through healthy environments Towards an estimate

of the environmental burden of disease Engenharia Sanitaria E Ambiental 12(2) 115-

116

Bettini M Pariacutes E Repeto G y Riacuteos C J (2012) Intoxicacioacuten y toxiinfecciones

alimentarias En A M Cameaacuten Manejo cliacutenico de las intoxicaciones alimentarias

(pp 663-665) Espantildea Diacuteaz de Santos Toxicologiacutea alimentaria Obtenido de

httpsbooksgooglecommxbooksid=ZVMBF-

CJBFsCamppg=PA660amplpg=PA660ampdq=Rios+Paris+bettini+repotto+2012012ampsource

=blampots=_KiutELMWrampsig=ACfU3U0NrzTQNtUFAFilRV5KbyUWyl2Qjgamphl=esampsa=Xamp

ved=2ahUKEwiM1M2K-

IHgAhUKMawKHU9IBzkQ6AEwB3oECAgQAQv=onepageampq=Rios2 Consultado

el 23 de diciembre de 2015

Bradley DE (1967) Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins Bacteriological

Reviews 31(4) 230 -304

Breeuwer P Boissin-Delaporte C Joosten H y Lardeau A (2005) Isolated phages and

their use as disinfectant in food or for sanitation factory environment European patent

specification Patente Europea No EP1 533 369 B1 Munich

Brenner F Villar R Angulo F Tauxe R y Swaminathan B (2000) Salmonella