AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE

1

Universidad Mayor

Facultad de Medicina

Escuela de Salud Pública

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE

Escherichia coli PRODUCTOR DE SHIGATOXINA DESDE

CARNE DE VACUNO NACIONAL E IMPORTADA,

DISTRIBUIDA EN LOS PRINCIPALES SUPERMERCADOS

DE LA PROVINCIA DE SANTIAGO

TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE MAGÍSTER EN

SALUD PÚBLICA Y SISTEMAS DE SALUD

CAROLINA BEATRIZ BAEZA QUIROZ

Director de tesis: Dr. Roberto Vidal Álvarez

Codirectora de tesis: Dra. Verónica Solari Gallegos

Santiago, Chile

Septiembre, 2013

2

Dedicado a mi esposo Fernando, por su gran apoyo y confianza

puesta en mí y a mis adorables hijos Franco y Santiago.

3

AGRADECIMIENTOS

Deseo manifestar mi reconocimiento público a las personas que

mencionaré, por cuanto cada una de ellas contribuyó con su conocimiento,

tiempo, buena disposición y paciencia para el buen desarrollo de esta

investigación que tiene como objetivo principal ser un aporte a la Salud Pública

de nuestro país.

Mi gratitud, en forma especial, al Director de ésta tesis, Dr. Roberto Vidal

Álvarez, Doctor en Ciencias Biológicas e investigador de la Facultad de

Medicina de la Universidad de Chile, por su importante entrega de sus

conocimientos y experiencia.

De igual manera, agradecer a la Dra. Verónica Solari Gallegos, Médico

Veterinario del Subdepartamento de Epidemiología de la SEREMI de Salud

RM, por su permanente cooperación como Codirectora de ésta investigación.

También quiero agradecer a las siguientes personas que colaboraron en las

distintas etapas de la investigación para que ésta fuera posible:

A Claudio Badilla, del Subdepartamento de Alimentos de la SEREMI de

Salud RM.

A Augusto Palma, del Laboratorio de Salud Ambiental de la SEREMI de

Salud RM.

A Mirka Pardo y Paz Orellana, del Laboratorio de Enteropatógenos del

Programa de Microbiología y Micología de la Facultad de Medicina de la

Universidad de Chile.

A Claudia Musalem y Carolina Vidal de la Escuela de Salud Pública de la

Universidad Mayor.

Reitero mis agradecimientos a todas las personas nombradas y a aquellos

que, en forma indirecta, me animaron y ayudaron al desarrollo de esta

investigación.

4

TABLA DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN 1

1.1. Escherichia coli diarreogénicas 1

1.2. Factores de virulencia de STEC 2

1.3. Shigatoxinas y Patogénesis 3

1.4. Manifestaciones clínicas 4

1.5. Epidemiología de STEC 5

1.6. Epidemiología de STEC en Chile 6

1.7. Reservorios y vías de Transmisión 7

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 9

OBJETIVO GENERAL 9

OBJETIVOS ESPECÍFICOS 9

METODOLOGÍA 10

1. Diseño del estudio 10

1.1. Tamaño de la muestra 10

1.2. Diseño de la muestra 10

1.3. Criterios de Inclusión 10

1.4. Criterios de exclusión 11

1.5. Variables del estudio 11

2. Procedimientos 12

2.1. Procedimiento de toma de muestra 12

2.2. Identificación de la muestra 12

2.3. Transporte y envío de muestras 13

2.4. Cultivo Microbiológico 13

2.5. Detección genotípica de shigatoxina e intimina por PCR múltiple 13

2.6. Aislamiento de cepas STEC 17

5

2.7. Detección genotípica de las variantes de shigatoxina 17

2.8. Detección genotípica de Escherichia coli O157 19

2.9. Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA (ehxA), iha, lpf

y efa1 no-O157 19

2.10. Serotipificación de STEC 21

2.11. Electroforesis de campo pulsado (PFGE) 24

3. Plan de análisis de la información 25

RESULTADOS 26

DISCUSIÓN 37

CONCLUSIONES 44

RECOMENDACIONES 45

REFERENCIAS 46

LISTA DE ABREVIATURAS 56

ANEXO 1 58

ANEXO 2 59

ANEXO 3 63

ANEXO 4 64

ANEXO 5 66

6

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Determinación del antígeno O (Serogrupo) de STEC 23

Figura 2. Porcentaje de muestras de carne con presencia de STEC, según

país de origen 28

Figura 3. Muestras con presencia de STEC según tipo de corte 31

Figura 4. Dendrograma que muestra la relación clonal entre las diferentes

cepas STEC aisladas desde carne bovina 36

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para

shigatoxinas e intimina 15

Tabla 2. Cepas de E. coli utilizadas como controles positivos 16

Tabla 3. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para la

detección de las variantes de shigatoxinas 18

Tabla 4. Partidor y secuencia nucleotídica utilizada para la detección de

E. coli O157 19

Tabla 5. Partidores y secuencias nucleotídicas utilizadas para la detección

de genes de virulencia de STEC 20

Tabla 6. Grupo de sueros polivalentes para la identificación del antígeno

somático O de los aislados de STEC 22

Tabla 7. Distribución de las muestras de carne según procedencia 26

Tabla 8. Distribución de las muestras de carne según supermercado y

país de origen 27

Tabla 9. Presencia de STEC en carne bovina según procedencia 27

7

Tabla 10. Análisis de asociación entre la presencia de STEC en carne y el

país de origen mediante el cálculo de OR (país de referencia Chile) 29

Tabla 11. Distribución de las muestras de carne según corte 30

Tabla 12. Análisis de prueba de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow 31

Tabla 13. Detección de los genes stx1 y stx2 desde carne bovina 32

Tabla 14. Presencia de las variantes de Stx aisladas desde carne bovina 33

Tabla 15. Presencia de los factores de virulencia: hlyA, saa y iha en cepas

STEC aisladas desde carne bovina 34

Tabla 16. Determinación de los serogrupos de STEC en cepas aisladas

desde carne bovina 34

8

RESUMEN

A nivel mundial, Escherichia coli productor de shigatoxina (STEC) es un

patógeno zoonótico emergente de importancia en salud pública, el cual ha sido

asociado a brotes de infección transmitidos por alimentos (ETA). Clínicamente

STEC puede producir cuadros de diarrea aguda, colitis hemorrágica (CH) y

Síndrome hemolítico urémico (SHU), afectando principalmente a niños menores

de 5 años. El objetivo de éste estudio fue determinar la presencia de STEC en

carnes nacionales e importadas de origen bovino (principal reservorio de STEC),

selladas al vacío y distribuidas en supermercados de Santiago. Se estudiaron 304

muestras de carne (28,6% de origen nacional y 71,4% importada), obtenidas de 32

supermercados, entre los meses de mayo a diciembre de 2012. Mediante PCR

múltiple, se realizó la búsqueda de genes que codifican para las shigatoxinas (stx1

y stx2) e intimina (eae). Del total de muestras analizadas, 20/304 (6,6%) fueron

positivas para STEC, de ellas 17 (7,8%) correspondieron a carne importada y 3

(3,4%) a carne nacional, presentando distinto perfil toxigénico; stx1/stx2 (7/20),

stx1 (2/20), stx2 (11/20). A partir de estas muestras, se logró aislar 20 cepas,

identificando distintos genotipos de stx: stx1a, stx2a, stx2b, stx2c y stx2d y otros

factores de virulencia destacando la presencia de los genes iha, hlyA y saa.

Mediante aglutinación con antisueros específicos, se logró identificar los

serogrupos O113 (6/20), O174 (2/20), O141 (1/20) y O8 (1/20). Debido a que las

cepas de STEC aisladas en este estudio presentan serogrupos y genes de

virulencia descritos en casos clínicos de CH y SHU en humanos, se propone

evaluar y mejorar los procedimientos de las distintas etapas de la producción de

carne bovina y desarrollar campañas de educación relativas al consumo de carnes

bien cocidas, evitando la contaminación cruzada durante su manipulación para

asegurar un producto libre de riesgo para la salud de la población, influyendo con

estas medidas en la reducción de los casos de SHU.

9

INTRODUCCIÓN

1.1 Escherichia coli

Escherichia coli, es un bacilo Gramnegativo, anaerobio facultativo, que

forma parte de la microbiota del tracto intestinal del hombre y animales. La

mayoría de las cepas son comensales, sin embargo, existen cepas que han

adquirido factores de virulencia específicos codificados por genes transportados

en plásmidos, transposones, bacteriófagos e islas de patogenicidad que les

confiere la capacidad de infectar y producir enfermedades intestinales y

extraintestinales en el hombre. Las cepas que causan infecciones entéricas se

denominan Escherichia coli diarreogénicas (ECD) y se clasifican en seis

categorías: enteropatógena (EPEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva

(EIEC), enteroagregativa (EaggEC), de adherencia difusa (DAEC) y Escherichia

coli productor de shigatoxinas (STEC) (Teng et al, 2004; Fernandez et al, 2003;

Vidal et al, 2005). Todas ellas, se diferencian según sus propiedades de virulencia,

interacción con la mucosa intestinal, cuadro clínico y epidemiología.

De acuerdo a la clasificación de Kauffmann, las cepas de E. coli se pueden

agrupar, en diferentes serogrupos y serotipos (basado en el antígeno O más el

antígeno flagelar H (Nataro y Kaper, 1998; Kaper et al, 2004). Dentro del grupo

STEC, E. coli O157:H7 es el serotipo más frecuentemente aislado y la mayoría de

los estudios están orientados a su detección debido a que se le reconoce como el

principal agente causal de grandes brotes. También se le ha asociado con casos

esporádicos de colitis hemorrágica (CH) y Síndrome hemolítico urémico (SHU). A

pesar de ello, existen más de 150 serotipos distintos al O157:H7 que comparten el

mismo potencial patogénico (Villalobos et al, 2008; INEI-ANLIS y OPS, 2011).

10

1.2 Factores de virulencia de STEC

Shigatoxinas

El principal factor de virulencia que caracteriza a las cepas de STEC es la

producción de dos shigatoxinas (Stx1 y Stx2), codificadas por los genes stx1 y stx2,

respectivamente. Las cepas de STEC de origen humano, animal o de alimentos,

pueden expresar sólo Stx1, Stx2 o ambas (Friedrich et al, 2003). Actualmente para

Stx1, se describen las variantes Stx1a, Stx1b y Stx1c y para Stx2, se han descrito

numerosas variantes, entre ellas Stx2a, Stx2b, Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2g y

Stx2h (Leung et al, 2003; Schmidt et al, 2000; Friedrich et al, 2003; Vidal et al,

2010). La identificación del tipo de shigatoxina, es clínicamente relevante, pues

algunas están significativamente asociadas con una mayor virulencia de la

bacteria causando cuadros graves de colitis hemorrágica y SHU (Sheutz et al,

2012).

Factores de adherencia intestinales

La capacidad de STEC de adherirse en forma específica y estrecha al

enterocito y de responder a señales de quórum sensing de la microbiota intestinal,

permite a la bacteria secretar las toxinas eficientemente (Tarr et al, 2000). El

principal factor de adherencia intestinal de E. coli O157:H7, lo constituye la

proteína denominada intimina, codificada por el gen eae, localizado en la isla de

patogenicidad LEE (locus de borrado del enterocito) junto a otros genes que

facilitan la colonización (Vidal et al, 2002; Prescott et al, 2000; Blanco et al, 2004).

La intimina permite a la bacteria iniciar la colonización del epitelio intestinal por

medio del receptor traslocado de intimina (Tir), además de generar una serie de

cambios en el citoesqueleto celular, produciendo una lesión característica llamada

A/E (adhesión y borrado), caracterizada por una acumulación de actina en el sitio

de contacto con la célula huésped formando una estructura de pedestal (Nataro y

Kaper, 1998). El gen eae está presente en las cepas más virulentas, sin embargo,

la presencia de éste gen no es esencial para la patogénesis, dado que existe un

importante número de cepas STEC eae-negativas (E. coli O104: H21 y O113:

11

H21), que han causado enfermedad severa y ocasionalmente brotes (Paton et al,

1999; Tarr et al, 2000). Por lo tanto, se sugiere la presencia de otros factores de

adherencia intestinales distintos a intimina, que también estarían involucrados en

la patogénesis. Ejemplos de éstos factores de adherencia intestinales son las

adhesinas Iha (IrgA-homologue adhesin) (Tarr et al, 2000); Efa1 (EHEC factor for

adherence) (Nicholls et al, 2000); Lpf (long polar fimbria) (Torres et al, 2002) y Saa

(autoaggutinating adhesin). Este último se ha relacionado exclusivamente con

cepas de serogrupos no-O157 LEE negativas (Paton et al, 2001).

Enterohemolisina

La mayoría de las cepas de STEC O157:H7, contienen un plásmido

altamente conservado, denominado pO157. Este plásmido codifica una toxina

designada hemolisina enterohemorrágica o enterohemolisina (EHEC-HlyA),

codificada por el gen ehxA. Esta hemolisina permite extraer el hierro de los

eritrocitos para ser utilizado por la bacteria (Schmidt et al, 1995).

1.3 Shigatoxinas y Patogénesis

Las shigatoxinas (Stx), tienen la estructura de holotoxina, con una

subunidad central A y cinco unidades periféricas B. A través de la subunidad B, se

establece la unión de la Stx con el receptor celular específico

globotriaosilceramida (Gb3) presente en la superficie epitelial. Lo anterior, permite

la entrada de la subunidad A al citoplasma celular mediante endocitosis,

subunidad que finalmente interfiere con la función ribosomal, provocando una

alteración irreversible en la síntesis de proteínas y posterior muerte de las células

blanco por apoptosis (Prado y Cavagnaro, 2008).

En etapas posteriores, la Stx puede también ser traslocada desde la

membrana apical a la superficie basolateral, con inducción de interleuquina-8 (IL-

8), que contribuye a la acumulación de leucocitos en la pared intestinal. Como

consecuencia de ello, se produce daño en las células endoteliales de los vasos

sanguíneos provocando diarrea sanguinolenta (INEI-ANLIS y OPS, 2011). Stx

12

entra a circulación sanguínea y es transportada a distintos órganos blanco cuyas

células endoteliales poseen el receptor Gb3.

En el riñón existen altos niveles de Gb3, particularmente en la región

cortical, donde se observan las principales lesiones en los pacientes con SHU.

También se encuentran receptores Gb3 en la membrana celular de los eritrocitos,

células cerebrales y páncreas. (INEI-ANLIS y OPS, 2011; Prado y Cavagnaro,

2008).

1.4 Manifestaciones clínicas

La infección por STEC puede causar casos esporádicos o brotes de diarrea

aguda, colitis hemorrágica (CH) y síndrome hemolítico urémico (SHU) (Leotta et

al, 2005). El período de incubación generalmente es de 3 a 4 días y el cuadro

clínico incluye un amplio espectro de manifestaciones clínicas, que inician con

dolor abdominal severo, fiebre baja o ausente, con o sin vómitos, diarrea acuosa,

seguidos por diarrea sanguinolenta o colitis hemorrágica durante 4 a 6 días. En la

mayoría de los casos la diarrea por STEC es autolimitada, sin embargo alrededor

del 5 al 10% de los niños infectados evoluciona a SHU para el cual no existe

tratamiento específico sino de sostén (Prado y Cavagnaro, 2008; INEI-ANLIS y

OPS, 2011). El SHU está definido por la triada clásica: anemia hemolítica

microangiopática, trombocitopenia y falla renal aguda, precedidas habitualmente

por diarrea con sangre (Varela et al, 2008; Giugno et al, 2007). En 1983, Karmali

et al, describieron la asociación entre STEC y SHU, hecho que representó un

avance significativo en el conocimiento del agente causal, los mecanismos

patogénicos y permitió diferenciar al SHU de otras microangiopatías trombóticas.

Es importante considerar que en el SHU el riñón no es el único órgano afectado,

pues algunos pacientes presentan en el período agudo síntomas neurológicos

(letargia, cefaleas, convulsiones y coma), insuficiencia pancreática, hipertensión

arterial y/o complicaciones digestivas como, prolapso rectal o invaginación

intestinal (Prado y Cavagnaro, 2008; Fernandez-Brando, 2011).

13

Alrededor de 20% de los pacientes presentan secuelas graves, siendo las más

frecuentes la insuficiencia renal, hipertensión arterial, anemia y alteraciones

neurológicas.

El riesgo de desarrollar SHU en una persona que se infecta con STEC,

depende de complejas interacciones entre el ambiente, el huésped y el patógeno,

siendo la variante de Stx, intimina y factores de virulencia adicionales

característicos de algunos serotipos como el O157:H7, O26:H11, los que

determinan de manera importante el curso de la infección (Prado y Cavagnaro,

2008).

1.5 Epidemiología de STEC

Los primeros brotes de intoxicación alimentaria asociados a STEC se

describen en el año 1982 en los Estados de Oregon y Michigan, EE.UU.,

asociados al consumo de hamburguesas en diferentes locales de una cadena de

comida rápida. A partir de entonces se han descrito numerosos brotes de ETA

causadas por este agente a nivel mundial, siendo la carne y sus subproductos los

más importantes en su transmisión (Vidal et al, 2010; Burgos et al, 2003).

Entre los serotipos descritos de STEC, el O157:H7 es el más prevalente en

países como EEUU, Inglaterra, Canadá y Japón y las cepas no O157 son más

prevalentes en Latinoamérica, Europa y Australia (Prado, 2008; Vidal et al, 2010;

Nataro y Kaper, 1998). Los registros de vigilancia de STEC en el Sur de Australia,

indican tasas de notificación anuales que oscilan entre 0,2 a 0,6 casos por cada

100.000 habitantes, siendo la tasa de notificación más alta en la población infantil

con 0,9 casos en 100.000 niños menores de 5 años (Vally et al, 2012).

En Estados Unidos, las infecciones por E.coli O157:H7 continúan siendo un

problema importante de salud a pesar de la implementación de sistemas de

vigilancia de los patógenos asociados a las ETA y un estricto control de la

producción de alimentos. Si bien se han identificado nuevos vehículos de

transmisión como vegetales, jugos de manzana no pasteurizados, aguas de

consumo y recreacionales, los productos a base de carne molida como las

14

hamburguesas son la principal fuente de infección (INEI-ANLIS y OPS, 2011). En

un estudio realizado entre los años 2000 y 2006, en ocho centros de vigilancia de

ese país, se estimó una incidencia de 5,6 casos de STEC O157 en 100.000 niños

menores de 5 años (Gould et al, 2009). En Canadá, en el año 2007, la incidencia

de casos de éste serogrupo fue de 2,9 en 100.000 habitantes por año (Vally et al,

2012).

En Latinoamérica es un problema endémico, siendo Argentina, Uruguay y

Chile los países más afectados. En Uruguay, la tasa de incidencia es de 4 a 5 en

100.000 niños menores de 5 años. Argentina, es el país con las tasas más altas

de SHU en el mundo. Se describen aproximadamente, 400 casos nuevos por año

en niños menores de 5 años, (27 por cada 100.000/año en la provincia de Buenos

Aires) constituyendo la primera causa de insuficiencia renal aguda en la edad

pediátrica y la segunda de insuficiencia renal crónica (Rivas et al, 2006). En Brasil,

la incidencia de SHU no está bien documentada y el diagnóstico puede ser

subestimado. Datos desde el centro de vigilancia epidemiológica en el Estado de

Sao Paulo, muestran una incidencia de SHU entre el período1998 y 2007, que

varía de 0,01 a 0,05 en 100.000 niños (Souza et al, 2011).

1.6 Epidemiología de STEC en Chile

Un estudio retrospectivo realizado en la Región Metropolitana (RM) entre

1992 y 1994, reveló una incidencia anual de SHU de 3,2 casos por 100.000 niños

menores de 5 años de edad (Vizcaya et al, 1996).

Posteriormente, en el año 2000, se planificó un estudio prospectivo de

vigilancia por un período de tres años, con la participación de 14 centros

centinelas, incluyendo hospitales en el norte, en el centro y sur del país en donde

se registró semanalmente la ocurrencia de casos de SHU. Las tasas de incidencia

para cada centro, variaron entre 0,5 y 9,0 casos por 100.000 niños menores de 15

años de edad con una letalidad de 2,7%. Este estudio de vigilancia demostró que

Chile presenta una situación de endemia de infección por STEC y SHU, con casos

durante todo el año y en todo el territorio (Prado y Cavagnaro, 2008).

15

En dos estudios realizados en Santiago entre los años 2002 y 2005, se

analizaron muestras fecales de niños con diarrea aguda arrojando como resultado

una frecuencia de aislamiento de STEC entre 0.6 a 1.6%. Otro estudio que incluyó

90 aislamientos clínicos de STEC recolectados entre 1997 y 2005, determinó que

el 46.6% de los aislamientos estaban asociados a diarrea aguda leve, 23.3% a

Síndrome disentérico y el 30% a SHU, siendo el serotipo más frecuentemente

aislado de los tres cuadros clínicos el O157:H7 donde alcanzó el 100% de

aislamiento en los casos de SHU, 52.3% de pacientes con diarrea aguda y 62% en

pacientes con Síndrome disentérico (Vidal et al, 2010).

En Chile el Decreto Supremo 158/2004 en su Artículo 9º, establece que

STEC es objeto de vigilancia obligatoria de laboratorio, lo que implica que todos

los laboratorios clínicos, tanto públicos como privados, deben enviar los aislados

para confirmación microbiológica al Instituto de Salud Pública (ISP).

Durante el año 2012, según registros del ISP, se han notificado por

laboratorio 0,4 casos por cada 100.000 habitantes. Del total de cepas confirmadas,

el mayor número de casos se presentó en la Región Metropolitana, en un 67,1%

de los aislados, seguida por la región de La Araucanía con el 12% de las cepas

confirmadas y la región del Bío-Bío con el 9% de los aislados (Minsal, 2012). Esta

distribución refleja un subdiagnóstico importante en nuestro país porque muy

pocos laboratorios incluyen la búsqueda de STEC en el estudio de un coprocultivo

y los que lo hacen, sólo se enfocan en la búsqueda del serotipo O157. Además, no

todos los laboratorios tienen la capacidad de identificar STEC principalmente por

la falta de acceso a métodos de serotipificación y caracterización de genes de

virulencia (Prado y Cavagnaro, 2008).

1.7 Reservorios y vías de Transmisión

STEC se ha aislado desde el contenido intestinal de bovinos, ovinos,

caprinos, cerdos, perros, gatos y pollos, sin embargo, el principal reservorio de

STEC son los bovinos y cerdos. Las frecuencias de aislamiento han sido de 8 a

21% en bovinos y de 7,5% en suinos (Vidal et al, 2010).

16

Un estudio realizado en Argentina por Blanco et al (2004) en el que se

caracterizó un total de 153 STEC aisladas de las heces de ganado bovino, carne

picada y hamburguesas de vacuno, arrojó que el 84% pertenecieron a serotipos

previamente descritos de STEC en humanos, y el 56% a serotipos asociados a

STEC aislados de pacientes con SHU, lo que confirma que el bovino es un

importante reservorio de STEC para humanos. Estudios realizados en Francia,

Alemania y Estados Unidos, también encontraron que muchas cepas de STEC

aisladas de ganado vacuno pertenecieron a serotipos que se han asociado a

enfermedad en humanos (Blanco et al, 2004.)

La principal vía de transmisión de STEC son los alimentos contaminados,

como por ejemplo carne molida, productos cárnicos crudos, o insuficientemente

cocidos, hamburguesas, leche no pasteurizada, lechuga, agua, entre otros (Rivas

et al, 2006; Gyles, 2007). Un mecanismo de transmisión importante en niños

pequeños y lactantes es la contaminación cruzada durante la preparación de

alimentos y el contacto persona a persona por la ruta fecal-oral. Esta transmisión

directa, se facilita debido a la baja dosis requerida para causar infección, que va

desde 10 a 100 bacterias por gramo de alimento (Rivas et al, 2006; Vidal et al,

2011).

En atención a que el bovino es el reservorio más importante en la

transmisión de STEC, en importante considerar que el consumo de carne

bovina en Chile es alto y actualmente alcanza los 22,4 Kilogramos por

habitante al año. La disponibilidad de carne bovina en nuestro país, se ha

mantenido relativamente estable en los últimos diez años, con una tasa de

crecimiento promedio anual de 0,2%. Se estima que la producción nacional

cubre el 50% del consumo interno y el otro 50% está siendo cubierto por las

importaciones. Durante el año 2012, el volumen de compras de carne bovina

en el exterior creció 3,7%, siendo los países de origen Brasil, Argentina,

Australia, Uruguay y EEUU (Odepa, 2012).

Dada la importancia de STEC, como patógeno emergente transmitido por

los alimentos y en atención a que la forma más común de contraer el SHU es por

la ingesta de carne mal cocida en la población infantil, el interés de éste estudio

17

está orientado a determinar la presencia de STEC en carnes de origen bovino

chilenas e importadas que se distribuyen en los supermercados de la provincia de

Santiago. Lo anterior con el objeto de generar información actualizada en relación

a éste patógeno y su presencia en carnes, entregando con ello un aporte a la

salud pública que sin duda ayudará a determinar futuras estrategias de control y

prevención.

18

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN

¿Existe presencia de Escherichia coli productor de shigatoxina en la carne bovina

que se expende en los supermercados de Santiago?

OBJETIVO GENERAL

Determinar la presencia de Escherichia coli productor de shigatoxina

(STEC) en carne de vacuno nacional e importada, distribuida en los principales

supermercados de la provincia de Santiago.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Aislar cepas de E. coli productoras de shigatoxina desde carne de vacuno

nacional e importada, distribuida en los supermercados de la provincia de

Santiago.

2. Determinar la presencia de genes de virulencia de STEC presentes en los

aislados de STEC obtenidos desde carne de vacuno nacional e importada,

distribuida en los principales supermercados de la provincia de Santiago.

3. Determinar los serogrupos más frecuentes asociados con las cepas de

STEC/EHEC aisladas desde carne de vacuno nacional e importada, distribuida en

los supermercados de la provincia de Santiago.

19

METODOLOGÍA

1. Diseño del estudio

Estudio de tipo descriptivo transversal.

1.1. Tamaño de la muestra

Basándose en antecedentes de un estudio de Alexandre et al (1999) que

detectó 4,2% de shigatoxina stx1 y stx2 en productos cárnicos de origen nacional

y extranjero, se estimó un tamaño muestral de 304 productos cárnicos de origen

bovino, con un 95% de nivel de confianza y con un error de estimación de 2,5%.

1.2. Diseño de la muestra

El muestreo fue de tipo probabilístico o aleatorio estratificado. Se consideró

en el estudio 151 supermercados de Santiago, agrupándose en 5 cadenas

comerciales identificadas con las letras A, B, C, D y E. La selección de la muestra

aleatoria, se llevó a cabo independientemente en cada grupo por afijación

proporcional al volumen de carne que vende cada cadena de supermercado.

A cada supermercado se le asignó un número de identificación correlativo, del 1

al 151. Una vez identificados, se seleccionaron 32 aleatoriamente a través de

números randomizados usando el programa Microsoft Excel 2003.

Se tomaron 10 muestras totales de carne bovina, dependiendo del stock de

cada supermercado, pudiendo ser nacionales, extranjeras o ambas.

1.3. Criterios de Inclusión

Se incluyó en el estudio sólo carne bovina sellada al vacío mantenida a

temperatura de refrigeración (5 °C) que se expendía en los supermercados de

Santiago, durante el período mayo a diciembre del año 2012.

20

1.4. Criterios de exclusión

No se incluyó en el estudio la carne bovina que estaba próxima a vencer y

con una temperatura mayor a 5 °C al momento de la toma de muestra.

1.5. Variables del estudio

Variable nominal dependiente: STEC en carnes

Variable nominal independiente: Procedencia de la carne y tipo de corte.

a) Descripción de la variable dependiente

Presencia de STEC en muestras de carne bovina: Toda muestra de carne bovina

sellada al vacío, cuyos análisis por PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

determinen la presencia de los genes stx1 y stx2 que codifican para la producción

de shigatoxinas.

b) Descripción de las variables independientes

Procedencia de la carne: Carne bovina sellada al vació de origen nacional e

importada.

Tipo de corte: Trozo o pieza grande de carne proveniente de una canal bovina

(cuerpo del animal después de haber sido sacrificado y eviscerado).

Se analizaron 26 cortes de carne distintos y para el análisis estadístico, estos se

clasificaron formando dos grupos de acuerdo a su ubicación: 1) cortes del cuarto

anterior (porción craneal de la media res, que se obtiene de la sección transversal

de la columna vertebral a la altura de la 10° costilla), 2) cortes del cuarto posterior

(porción caudal de la media res, que se obtiene de la sección transversal de la

columna vertebral a la altura de la 10° costilla.

21

2. Procedimientos

2.1. Toma de muestra

Cada 2 semanas se recolectaron alrededor de 20 muestras en un mismo

día, 10 de cada supermercado. Este procedimiento se realizó en la sala de

proceso de carnes de cada supermercado, con la supervisión del personal técnico

de la Seremi de Salud RM.

Se asignó un área para la preparación y mantención de materiales de

muestreo y un mesón para realizar la toma de muestra. Una vez preparados los

materiales, el profesional a cargo de la toma de muestras procedió a colocarse

mascarilla, lavado de manos y desinfección del mesón con etanol.

Se seleccionaron cortes de carne envasada al vacío que se disponía en

cámaras de frío a una temperatura de 0 a 5°C. Se tomaron aproximadamente 200

gr. de carne bovina, utilizando guantes de látex y un cuchillo esterilizado (flameado

con etanol 95%) los que se depositaron en una bolsa de plástico esterilizada y

previamente rotulada. Las muestras se mantuvieron en una hielera a una

temperatura de 4 a 8 °C, desde su obtención hasta la recepción en laboratorio.

2.2. Identificación de la muestra

Cada muestra fue identificada y registrada con los siguientes datos:

Número de muestra

Número de identificación del supermercado muestreado

Número de Lote o Trazabilidad de la carne

Frigorífico

Condiciones de temperatura

Fecha de faena, envasado y vencimiento del producto cárnico

Procedencia de la carne (importada o nacional)

Tipo de corte

Fecha y hora de muestreo

Persona responsable del muestreo

22

Fecha y hora de inicio de los análisis de la muestra en el laboratorio.

Observaciones (situaciones presentadas durante la toma de muestras que

pudieran incidir en los resultados analíticos y en general toda observación

que se consideró relevante).

2.3. Transporte y envío de muestras

Concluida la toma de muestras, éstas se transportaron al Laboratorio de

Salud Ambiental de la Seremi de Salud RM para ser procesadas el mismo día que

fueron recolectadas. En todo momento se evitó su exposición al ambiente y

manipulación. Las muestras se enviaron al laboratorio el mismo día que fueron

recolectadas para ser analizadas al día siguiente y procesadas antes de las 24

horas desde la fecha de toma de muestra.

2.4. Cultivo Microbiológico

Se pesaron 25 grs. de cada muestra de carne y se homogenizaron en agua

peptonada tamponada (caldo APT) e incubaron a 37 ºC por 18h. Posteriormente,

se sembró una alícuota del cultivo en agar Mac Conkey por el método de reloj y se

incubó a 37 ºC por 18h. A partir de la zona confluente de crecimiento bacteriano,

se tomó un inóculo y se realizó PCR, para la búsqueda de genes que codifican

para las shigatoxinas (stx1 y stx2) e intimina (eae).

2.5. Detección genotípica de shigatoxinas e intimina por PCR múltiple

El PCR es una técnica de biología molecular mediante la cual un pequeño

fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) se duplica varias veces para

obtener múltiples copias. Es un método selectivo y sensible cuyos componentes

básicos son una o más moléculas de DNA, nucleótidos o bases (dNTPs), una fibra

corta de DNA copiado, que se llama cebador oligonucleotídico o partidor y DNA

polimerasa para copiar el DNA. Los cebadores o partidores pueden ser

combinados en una reacción única (PCR múltiple) que puede detectar varios

genes en una sola muestra (Paton y Paton, 1998). Esta reacción ha significado un

considerable avance sobre otros métodos de PCR para identificar STEC y la

23

mayoría de sus genes marcadores de virulencia incluyendo las variantes de

shigatoxinas (Cicuta et al, 2009). En el presente estudio, se utilizó el protocolo de

PCR establecido para trabajar con cepas de E. coli desarrollado en el Laboratorio

de Enteropatógenos del Programa de Microbiología y Micología, de la Facultad de

Medicina de la Universidad de Chile (Vidal et al, 2005).

a) Obtención de DNA bacteriano

Se tomó un inóculo de cultivo correspondiente a la zona de crecimiento

confluente de las placas de Mac Conkey, se resuspendió en 200 μl de buffer Tritón

X-100 al 0,5% y se hirvió por 5 minutos a 100°C dos veces, con un paso

intermedio de agitación por vórtex. Posteriormente se centrifugó a 8.000 rpm,

durante 8 minutos. El DNA obtenido (sobrenadante) se conservó a 4 °C para ser

utilizado en el PCR múltiple.

b) Preparación de la mezcla de PCR

Se rotuló microtubos de 0,2 ml con el número correspondiente a cada

muestra y se preparó la mezcla de reacción en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, con

los siguientes reactivos: Buffer PCR 5X, Cloruro de Magnesio 25 mM, dNTPs 10

mM, GoTaqR Flexi DNA polimerasa (Promega) 5 U/µL y partidores específicos

10uM, para los genes stx1, stx2 y eae (Tabla 1), en un volumen final de 25 µl. Para

cada reactivo, se calculó los volúmenes necesarios en la mezcla de reacción, de

acuerdo al número de determinaciones (Anexo 1).

24

Tabla 1. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para

shigatoxinas e intimina.

F: Partidor directo R: Partidor reverso

c) Programas de amplificación y PCR

Una vez resuspendida la mezcla, a cada microtubo se agregó 1,5 µl del

sobrenadante del lisado obtenido a partir de cada una de las muestras. Como

control positivo se utilizó una cepa de referencia, E. coli EDL933 (Tabla 2). Al

microtubo que se usó como control negativo, se agregó 1,5 µl de agua estéril

desionizada. Posteriormente, se colocó los microtubos en un termociclador ESCO

modelo Swift maxi y se ejecutó el programa de amplificación específico para los

genes stx1, stx2 y eae (Anexo 1).

Gen de

virulencia

Tamaño del

producto de

PCR (pb)

Secuencias

5’-3’ Referencias

stx1 348 F: CAGTTAATGTGGTGGCGAAGG

R: CACCAGACAATGTAACCGCTG

Cebula et al

(1995)

stx2 584 F: ATCCTATTCCCGGGAGTTTACG

R: GCGTCATCGTATACACAGGAGC

Cebula et al

(1995)

eae 482 F: TCAATGCAGTTCCGTTATCAGTT

R: GTAAAGTCCGTTACCCCAACCTG

Vidal et al

(2004)

25

Tabla 2. Cepas de E. coli utilizadas como controles positivos.

* Cepas obtenidas del Department of Microbiology & Infection Control

Unit of Foodborne Bacteria and Typing. STATENS SERUM INSTITUT

d) Electroforesis y lectura del PCR

Una vez terminadas las amplificaciones se tomaron 8 μL de muestra que

fueron sometidas a electroforesis en un gel de agarosa al 2% preparado en buffer

Tris-ácido acético-EDTA TAE O.5X (Sigma ®). Paralelamente se utilizó 3 µl de un

marcador de tamaño molecular de 100pb (Invitrogen®) como referencia. La corrida

electroforética se realizó a 100 volts por 40 minutos.

Se observó el resultado de la electroforesis mediante la tinción del gel con

bromuro de etidio 0,5 μg/ml por 20 minutos y la exposición del gel a la luz

ultravioleta. La visualización y el análisis de la imagen permitió, de acuerdo al peso

molecular, discriminar las E. coli positivas para la presencia de genes de

shigatoxinas e intimina.

Cepa E. coli control positivo* Gen de referencia

EDL933 (O157:H7) stx1,stx2, eae, stx1a,stx2a,lpf, iha y hlyA,

180-02 efa1 no-O157

112 efa1 / ent

EO26 y 472-1 saa

DE 131/3 stx1c

MHI 813 stx1d

EH250 stx2b

F35790 stx2c

1112R15035 stx2d

51191 stx2e

T497 stx2f

7V stx2g

26

2.6. Aislamiento de cepas STEC

De cada placa de agar McConkey donde el lisado bacteriano confluente dio

una señal positiva a la presencia de shigatoxinas por PCR, se seleccionó un

máximo de 10 colonias con fenotipo de E. coli. Estas colonias se sembraron

nuevamente en agar McConkey y se realizó PCR múltiple con el fin de identificar

y aislar la colonia positiva correspondiente. Cuando no se logró identificar la

colonia positiva, se realizó un nuevo aislamiento de colonias desde la zona de

cultivo confluente de la cual se obtuvo señal positiva.

Una vez aislada la colonia positiva a STEC, ésta se sembró en agar LB y

después de 18 horas de incubación a 37 °C, se almacenó en leche a -80 °C para

su posterior serotipificación y determinación de las variantes de shigatoxinas 1 y 2

y de otros factores de virulencia distintos a intimina como los genes efa1, ent, saa,

hlyA, iha. lpf y efa1 no- O157.

2.7. Detección genotípica de las variantes de shigatoxinas

Para cada cepa se determinó por PCR, la presencia o ausencia de las

variantes de Stx1: Stx1a, Stx1b, Stx1c y las variantes de Stx2: Stx2a, Stx2b,

Stx2c, Stx2d, Stx2f y Stx2g. La preparación de la mezcla y programa de PCR que

se utilizaron se basaron en un estudio de subtipificación de shigatoxinas,

desarrollado en el año 2012 por Scheutz et al. (Anexo 2). Las secuencias de los

partidores utilizados se indican en la tabla 3.

27

Tabla 3. Secuencia nucleotídica de los partidores específicos para la

detección de las variantes de shigatoxinas


Gen de

virulencia

Temperatura

de

alineamiento

(°C)

Tamaño del

producto de

PCR (pb)

Secuencias

5’-3’

stx1a

62 478 F1: CCTTTCCAGGTACAACAGCGGTT

R2:GGAAACTCATCAGATGCCATTCTGG

stx1c 62 252 F1: CCTTTCCTGGTACAACTGCGGTT

R1: CAAGTGTTGTACGAAATCCCCTCTGA

stx1d 62 203 F1: CAGTTAATGCGATTGCTAAGGAGTTTACC

R2: CTCTTCCTCTGGTTCTAACCCCATGATA

stx2a 68 349

347

F2: GCGATACTGRGBACTGTGGCC

R3: CCGKCAACCTTCACTGTAAATGTG

R2: GCCACCTTCACTGTGAATGTG

stx2b 65 251 F1: AAATATGAAGAAGATATTTGTAGCGGC

R1: CAGCAAATCCTGAACCTGACG

stx2c 65 177 F1: CGAAAGTCACAGTTTTTATATACAAGGGTA

R2: CCGGCCACYTTTACTGTGAATGTA

stx2d 68 179

235

280

F1: AAARTCACAGTCTTTATATACAACGGGTG

R1: TTYCCGGCCACTTTTACTGTG

O55 R: TCAACCGAGCACTTTGCAGTAG

R2: GCCTGATGCACAGGTACTGGAC

stx2e 68 411 F1: CGGAGTATCGGGGAGAGGC

R2: CTTCCTGACACCTTCACAGTAAAGGT

stx2f

68 424 F1: TGGGCGTCATTCACTGGTTG

R2:TAATGGCCGCCCTGTCTCC

stx2g 68 573 F1:CACCGGGTAGTTATATTTCTGTGGATATC

R1: GATGGCAATTCAGAATAACCGCT

28

2.8. Detección genotípica de E. coli O157

Mediante la misma técnica anteriormente descrita, se hizo la determinación

genotípica del serogrupo O157 a las cepas que resultaron positivas a la presencia

de shigatoxinas, utilizando secuencias de partidores específicos que amplifican el

gen wzx que codifica para proteínas asociadas con la ruta biosintética del antígeno

somático O del lipopolisacárido O157 (Tabla 4). La preparación de la mezcla y

programa de PCR utilizado, se indican en el anexo 3.

Tabla 4. Partidor y secuencia nucleotídica utilizada para la detección de

E. coli O157

Partidor Tamaño del producto

de PCR (pb)

Secuencias


O157 497 F: AAGATTGCGCTGAAGCCTTTG

R: CATTGGCATCGTGTCGACAG

Desmarchelier et

al, 1998.


2.9. Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA (ehxA), iha, lpf y efa1 no-

O157

Para la caracterización de genes de virulencia distintos de intimina, se

trabajó con DNA bacteriano purificado utilizando el kit de extracción Wizard

Genomic (Promega). La preparación de la mezcla y programa de PCR para

determinar la presencia de cada gen, se indican en el anexo 4. Las secuencias de

los partidores utilizados se indican en la tabla 5.

29

Tabla 5. Partidores y secuencias nucleotídicas utilizadas para la detección

de genes de virulencia de STEC.


Gen de

virulencia

Tamaño

del

producto

de PCR

(pb)

Temperatura

de

Alineamiento

(°C)

Secuencias


efa1 456 60 F: AACTATCCTGCCGCCTCAGA

R: GCCTGCGATAACAGCATCAA

Vidal et al

(2007)

lpf 276 58 F: CCTTGCGTACTGTCCGTTGA

R: AGCGACCAGGGTATTGCTGT

Vidal et al

(2007)

saa 119 60 F: CGTGATGAACAGGCTATTGC

R: ATGGACATGCCTGTGGCAAC

Paton y

Paton

(2002)

hlyA 569 58 F: AGCTGCAAGTGCGGGTCTG

R:TACGGGTTATGCCTGCAAGTTCAC

Vidal et al

(2007)

iha 792 58 F: TGGTACGGGTAAAACCGGAG

R: CTGCGTACAAGCTCACGACC

Vidal et al

(2007 )

ent 607 58 F: TCATCCCCTCAATTATTAAGCAA

R: AAAGCAACCCAGGAACATTATT

de Saint-

Pierre et al

(2006)

efa1 no-

157

827 60 F: ACGCTGCATACAAAAATCATCT

R: TCCCTATTTCTGTCTTCTGGAGT

de Saint-

Pierre et al

(2006)

30

2.10. Serotipificación de STEC

La caracterización serológica se llevó a cabo mediante la técnica de

aglutinación en microplacas con antisueros monovalentes elaborados por el

laboratorio de referencia de E. coli de la Universidad de Santiago de Compostela

(LREC-USC), dirigido por el Dr. Jorge Blanco, Lugo, España.

El método empleado para la determinación del antígeno “O”, está basado

en el originalmente descrito por Guinée et al. (1972 y 1981), y modificado por

Blanco et al (1996).

a) Preparación de las suspensiones bacterianas

Las cepas en estudio se cultivaron en agar triptona-soja (TSA) e incubaron

a 37 °C por 18 horas. Posteriormente, el cultivo bacteriano obtenido en TSA, se

suspendió en 2 ml de solución salina (0,85% NaCl, p/v) y se ajustó la

concentración bacteriana (1,8 x 109 bacterias/mL) por comparación con el tubo 6

de la escala McFarland.

Las suspensiones bacterianas se autoclavaron a 121°C, durante 2,5 horas,

para inactivar el antígeno “K” y desenmascarar el antígeno “O”. Una vez enfriadas

las suspensiones, se añadió a cada tubo, 2 mL de solución salina formalinizada

(0,5%, v/v) con violeta de genciana (0,005%, p/v).

b) Preparación de los antisueros O de E.coli

. Todas las diluciones, se prepararon con solución salina estéril (NaCl

0,85%). Se generaron 24 antisueros polivalentes identificados con letras de la A a

la X, con seis a siete antisueros específicos por grupo. Se usaron diluciones para

cada antisuero de 1/80, a excepción de los antisueros marcados con arterisco (*)

que fue de 1/40 (Tabla 6). Las cepas en estudio se enfrentaron en una primera

etapa con los antisueros polivalentes “A” hasta el “O”, ya que en ellos se incluyen

los antisueros que permiten detectar a las cepas de E. coli con los antígenos O

más frecuentes. Aquellas cepas que resultaron negativas frente a ellos, se

enfrentaron en una segunda etapa con los polivalentes restantes, del grupo P

hasta el X.

31

Tabla 6. Grupo de sueros polivalentes para la identificación del

antígeno somático O de los aislados de STEC.

A B C D E

O1 O8 O18 O26 O45

O2 O9 O20 O27 O48

O3 O11 O21 O28 O49

O4 O12 O22 O29 O50

O5 O14 O23 O32* O51

O6 O15 O24 O35 O54

O7 O16 O25 O44 O55

F G H I J

O59* O78 O101 O112 O121

O63 O80 O103 O113 O123

O64 O82 O104 O114 O124

O69 O83 O105 O115 O125

O73 O85* O109 O117 O126

O75 O86 O110 O118* O127

O76 O88 O111 O119 O128

K L M N O

O130 O141* O148 O162 O169

O131 O142 O149 O163 O170

O132 O143 O152 O164* O171

O134* O144 O153 O165 O172

O136 O145 O157* O166 O173

O138 O146 O158 O167 O174

O139 O147 O159 O168 O175

P Q R S T

O10 O36 O46 O61 O79

O13 O37 O52 O62* O81

O17* O39* O53 O66 O84

O19 O40 O56 O70 O87*

O30 O41 O57 O71 O89

O33 O42 O58 O74 O90

O34 O43 O60 O77

U V W X

O91 O100 O133 O161

O92 O102 O140 O176

O95 O107 O150 O177

O96 O108 O151 O178

O97 O116 O154 O179

O98 O120 O156 O180

O99 O129 O160* O181

32

c) Determinación del serogrupo O

Para la determinación del antígeno O se emplearon placas de micro

titulación de 96 pocillos de fondo “V”. En cada pocillo se agregó 50 μL de cada

antisuero y 50 μL de la suspensión bacteriana y se incubó a 37 °C durante 18

horas.

d) Interpretación de los resultados

La interpretación de los resultados se realizó estudiando las reacciones de

aglutinación. Cuando la cepa en estudio resultó reconocida por alguno de los

antisueros O (resultado positivo), se formó una película que impide la

sedimentación de las bacterias. En los pocillos donde no hubo reconocimiento

(negativos), las bacterias sedimentaron visualizándose en forma de botones

azulados (Figura 1). Si la cepa bacteriana aglutinó con uno o varios de los

antisueros polivalentes empleados, se realizó a continuación el mismo proceso

con los antisueros “O” monovalentes incluidos en el o los polivalentes

correspondientes. Si el ensayo resultó negativo con todos los antisueros

polivalentes se consideró no tipificable (NT).

Figura 1. Determinación del antígeno O (Serogrupo) de STEC

Resultado

negativo

Resultado

positivo

33

2.11. Electroforesis de campo pulsado (PFGE)

Para establecer la diversidad genética y la relación clonal entre las cepas

de STEC aisladas en nuestro estudio, se utilizó la técnica de PFGE. Esta es

considerada la técnica gold standard para la realización de estudios

epidemiológicos moleculares para determinar las relaciones clonales entre cepas

bacterianas.

Las cepas en estudio y la cepa control (Samonella Braenderup) fueron

incubadas a 37°C durante 18 horas en agar LB, se preparó una suspensión de las

cepas bacterianas en buffer CSB (Tris 100 mM, EDTA 100 mM, pH 8), ajustando

su densidad óptica a 0.8 (medida a 420 nm). Se tomaron 400 μl de cada

suspensión bacteriana los que fueron mezclados con 20 μl de proteinasa K (20

mg/ml) y 400 μl de agarosa Seakem Gold 1%: SDS al 1% en buffer TE (Tris

10mM: EDTA 1mM, pH 8). Esta mezcla se dispensó en moldes para preparar los

bloques de agarosa.

La lisis celular in situ fue realizada colocando los bloques de agarosa

solidificados en tubos que contenían 5 ml de buffer de lisis (Tris 50 mM: EDTA

50mM, Sarkosyl 1 %, pH 8) y 25 μl de proteinasa K (20 mg/ml) e incubados en

baño María con agitación a 55°C por 3 horas. A continuación los bloques fueron

lavados con agua miliQ (2 lavados) y buffer TE (3 lavados) por 20 minutos en

agitación a 50 °C, para eliminar los restos celulares y posteriormente ser tratados

con enzimas de restricción.

La digestión del ADN bacteriano presente en cada bloque de agarosa se

realizó utilizando 50 U de la enzima de restricción XbaI (Fermentas) durante 3

horas a 37°C, según describe el fabricante. Los fragmentos de ADN fueron

separados mediante electroforesis, utilizando un gel de agarosa al 1% preparado

con buffer TBE 0,5X. Las condiciones de la electroforesis fueron las siguientes:

tiempo inicial 2,16 segundos, tiempo final 54,17 segundos, temperatura de 14ºC,

voltaje 6 V/cm, con un tiempo total de corrida de 21 horas (equipo CHEF-DR III

System, Bio-Rad).

34

Los patrones de bandas obtenidos de PFGE, fueron analizados utilizando

el software GelCompar II (Applied Maths). Para visualizar la relación existente

entre las cepas aisladas de STEC desde carne bovina selladas al vació, se

construyó un dendrograma con un parámetro de optimización de 1,0 % y 1,0% de

tolerancia en la posición de las bandas. La cepa de Salmonella Braenderup fue

utilizada como referencia.

3. Plan de análisis de la información

a) Consolidación base de datos: La recolección de los datos, se registró

en Excel 2003 y fueron exportados al software estadístico SPSS 15.0.

b) Análisis descriptivo: Cálculo de porcentajes con intervalo de confianza

(IC) de 95%: Frecuencia de aislamiento de STEC en las muestras de

carne, los serogrupos presentes y la presencia de genes asociados con

virulencia en cepas de STEC.

c) Análisis de regresión logística: Calculo de Odds Ratio (OR) mediante

modelo de regresión logística binaria para analizar asociación entre la

presencia de STEC en carne con el país de origen (categoría de

referencia, Chile) y con el tipo de corte (categoría de referencia, cortes

del cuarto anterior).

d) Prueba estadística de Hosmer-Lemeshow: Este test es un contraste

de distribución, para determinar si el modelo de regresión logística

utilizado, se ajusta bien a los datos usados para estimarlo (H0: El

modelo se ajusta bien). Se consideró significancia estadística los

resultados con p valor < 0,05.

35

RESULTADOS

Distribución de las muestras de carne: Las muestras de carne bovina selladas

al vacío, recolectadas desde 5 cadenas de supermercados de la provincia de

Santiago, entre mayo y diciembre del año 2012, provenían de Argentina, Australia,

Brasil, Uruguay, EEUU y Chile. La mayor proporción, correspondió a carnes

brasileñas y a carnes nacionales con un 29,3 % y 28,6% respectivamente. En

segundo lugar a carnes de origen argentino y australiano y en menor proporción

de Uruguay y EEUU (Tabla 7).

Tabla 7. Distribución de las muestras de carne según procedencia

De acuerdo al volumen de carne que vende cada cadena de supermercado, la

mayor proporción de muestras recolectadas se obtuvo de los supermercados C y

A en un 33% (100/304) y 28% (86/304) respectivamente, seguida de los

establecimientos D, en un 20% (60/304). En general, en los supermercados

muestreados, se observó una mayor proporción de carne bovina sellada al vacío

de procedencia importada, disponible para la venta (tabla 8).

Procedencia de la carne N° muestras %

Brasil 89 29,3

Chile 87 28,6

Argentina 55 18,1

Australia 53 17,4

Uruguay 17 5,6

EEUU 3 1,0

Total 304 100,0

36

Tabla 8. Distribución de las muestras de carne según supermercado y país

de origen

Análisis Microbiológico: De un total de 304 muestras de carne bovina

analizadas por PCR, se identificó la presencia de STEC en un 6,6% (20/304), de

las cuales el 3,4% (3/87) correspondieron a carne bovina nacional y 7,8%

(17/217) a carne importada (Tabla 9).

Tabla 9. Presencia de STEC en carne bovina según procedencia

Supermercado

País de origen

A B C D E Total %

Brasil 30 3 23 17 16 89 29,3

Chile 30 1 40 16 0 87 28,6

Argentina 7 15 11 9 13 55 18,1

Australia 16 0 23 14 0 53 17,4

Uruguay 2 9 1 4 1 17 5,6

EEUU 1 0 2 0 0 3 1,0

TOTAL 86

(28%)

28

(9%)

100

(33%)

60

(20%)

30

(10%)

304

(100%)

100

Procedencia de la

carneN de muestras Presencia de STEC

Cantidad (n) % Cantidad (n) %

Nacional 87 28,6 3 3,4

Importada 217 71,4 17 7,8

Total 304 100,0 20 6,6

37

Al analizar la distribución de muestras de carne con presencia de STEC por país,

se observó una mayor prevalencia en la carne proveniente de Uruguay y

Argentina en un 24% (4/17) y 16% (9/55) respectivamente, mientras que en

Australia, Brasil y Chile la prevalencia no superó el 4%. Respecto a la carne

proveniente de EEUU, sólo se recolectaron 3 muestras y en ninguna se detectó

STEC (Figura 2).

Figura 2. Porcentaje de muestras de carne con presencia de STEC, según

país de origen

El análisis por regresión logística binaria (considerando a Chile como país de

referencia o control), mostró que los países asociados significativamente a la

presencia de STEC en carne fueron en primer lugar Uruguay (OR= 8,6; IC: 1,727 -

42,967; p = 0,009) y en segundo lugar Argentina (OR= 5,5; IC: 1,413 - 21,242; p =

0,014). Por el contrario, al analizar el OR de la carne proveniente de Australia,

Brasil y EEUU, no hubo una asociación significativa con la presencia de STEC

(Tabla 10).

38

Tabla 10. Análisis de asociación entre la presencia de STEC en carne y el

país de origen mediante el cálculo de OR (país de referencia Chile)

En relación a la distribución de las muestras de carne según tipo de corte,

cabe destacar que en ambos grupos se analizó un número similar de muestras. El

porcentaje de muestras asociadas a cada corte perteneciente al cuarto anterior,

varió de 0,6 a 17,2%, siendo más frecuentemente analizados, los cortes choclillo,

tapapecho y asado carnicero. En el caso de los cortes pertenecientes al cuarto

posterior, el porcentaje de muestras analizadas varió de 0,7 a 15,6 %, siendo los

cortes pollo ganso, abastero y punta picana, los más frecuentes (tabla 11). El

análisis por regresión logística binaria (considerando al grupo cuarto anterior como

referencia), mostró que los cortes del cuarto posterior están asociados

significativamente con la presencia de STEC en carne (OR= 6,7; IC: 1,924 –

23,416; p = 0,003), destacando los cortes ganso (29%, 4/14), abastero (18%, 4/22)

y pollo ganso (17%, 4/23) (Fig. 3).

País de origen OR 95% IC p

Argentina 5, 478 1,413 – 21,242 0,014

Australia 1,098 O,177- 6,795 0,920

Brasil 0,644 0,105 – 3,949 0,634

EEUU 0,000 0,000 0,999

Uruguay 8,615 1,727- 42,967 0,009

39

Tabla 11. Distribución de las muestras de carne según corte.

Tipo de corteN°

muestras%

Choclillo 27 17,2

Tapapecho 21 13,4

Asado carnicero 20 12,7

Punta paleta 19 12,1

Huachalomo 17 10,8

Posta paleta 16 10,2

Plateada 15 9,6

Sobrecostilla 13 8,3

Lomo vetado 6 3,8

Asado americano 1 0,6

Carnicero 1 0,6

Malaya 1 0,6

Total 157 100

Tipo de

corte

N°muestras

%

Pollo ganso 23 15,6

Abastero 22 14,9

Punta picana 16 10,9

Ganso 14 9,5

Asiento 13 8,8

Lomo liso 9 6,1

Palanca 9 6,1

Filete 8 5,4

Tapabarriga 7 4,8

Posta rosada 7 4,8

Posta negra 7 4,8

Entraña 6 4,1

Punta ganso 5 3,4

Asiento picana 1 0,7

Total 147 100

A. Cuarto anterior B. Cuarto posterior

40

Figura 3. Muestras con presencia de STEC según tipo de corte

Al ajustar por las dos variables independientes, mediante la prueba de

Hosmer-Lemeshow, persisten las diferencias encontradas en el modelo de

regresión logística binaria y éstas aumentan su riesgo (Tabla 12).

41

Tabla 12. Modelo de regresión logística para la presencia de STEC ajustado

por el tipo de corte y país de origen.

Prueba de bondad de ajuste Hosmer-Lemeshow (p=0,395)

Detección genotípica de shigatoxinas e intimina por PCR múltiple: Al realizar

el PCR desde la zona de confluente de crecimiento bacteriano, se observó que de

las 20 muestras de carne bovina con presencia de STEC, el 55% presentó sólo el

gen stx2, seguido por un 35% que presentó los genes stx1/stx2 y un 10% sólo el

gen stx1. Una vez aisladas las cepas, ninguna presentó el gen eae, que codifica

para la producción de la proteína intimina (Tabla 13).

Tabla 13. Detección de los genes stx1 y stx2 desde carne bovina

Gen N° de muestras con STEC

stx1 – stx2 7/20(35%)

stx1 2/20(10%)

stx2 11/20 (55%)

País de origen OR 95% IC p

Cuarto Posterior 7,738 2,291 -26,141 0,001

Argentina 7,628 1,885 -30,864 0,004

Australia 1,252 0,198 -7,899 0,811

Brasil 0,899 0,144 -5,633 0,910

EEUU 0,000 0,000 -0,000 0,999

Uruguay 18,245 3,117 -106,809 0,001

42

Caracterización genotípica de las cepas aisladas de STEC: A partir de las 20

muestras positivas a shigatoxina por PCR múltiple, se logró aislar 20 cepas de

STEC con distinto perfil toxigénico, a las cuales se les caracterizó

genotípicamente, de acuerdo a los factores de virulencia.

Detección genotípica de las variantes de shigatoxinas: Los genotipos de Stxs

detectados en las cepas aisladas de carne, fueron: Stx1a, Stx2a, Stx2b, Stx2c, y

Stx2d. Estas variantes se presentaron solas o en combinación de dos o más genes

(Tabla 14).

Tabla 14. Presencia de las variantes de Stx aisladas desde carne bovina

Detección genotípica de E. coli O157: Los resultados arrojados por el PCR

específico para el serogrupo O157 mostraron que el 100% de las cepas fueron

no-O157.

Variantes de Stx Cepas STEC aisladas de carne bovina

stx1a stx2a stx2c 1/20 (5%)

stx1 a stx2a 6/20 (30%)

stx1a stx2a stx2d 1/20 (5%)

stx1a stx2a stx2c stx2d 6/20 (30%)

stx1a stx2c stx2d 1/20 (5%)

stx1a stx2c 1/20 (5%)

stx2b stx2c 1/20 (5%)

stx2c 3/20 (15%)

43

Detección de los genes efa1, ent, saa, hlyA, iha, lpf y efa1 no-O157: Del total

de cepas aisladas, en el 65% se detectó por PCR los genes hlyA y saa, y en el

60% el gen iha. No hubo presencia del resto de los genes de virulencia (Tabla

15).

Tabla 15. Presencia de los factores de virulencia: hlya, saa y iha en cepas

STEC aisladas desde carne bovina

Determinación de serogrupos de STEC: El 50% de las cepas fueron

consideradas no tipificables (NT). De los serogrupos que se logró identificar, el

más prevalente fue el O113, correspondiendo al 30% del total de las cepas

aisladas. Con una frecuencia más baja fueron identificados los serogrupos O174,

O141 y O8 correspondiendo al 10 y 5% respectivamente. (Tabla 16).

Tabla 16. Determinación de los serogrupos de STEC en cepas aisladas desde

carne bovina

Factores de virulencia Cepas STEC aisladas de carne bovina

hlyA 13/20 (65%)

saa 13/20 (65%)

iha 12/20 (60%)

Serogrupo Número de cepas Porcentajes

O113 6/20 30%

O174 2/20 10%

O141 1/20 5%

O8 1/20 5%

NT 10/20 50%

44

Electroforesis de campo pulsado: El análisis de los productos de restricción

obtenidos al digerir el genoma de las cepas STEC aisladas desde carne bovina,

permitió identificar dieciocho patrones de bandas diferentes. El grado de

semejanza entre las cepas se representó gráficamente como un dendrograma de

homología (Fig. 4), donde se puede observar que las cepas con códigos 194-8 y

1-10, quedan separadas del resto (<40% de similitud). En los recuadros

destacados, se observa la presencia de 2 grupos mayoritarios (A y B) con bajo

porcentaje de similitud (alrededor de 50%). El grupo A contiene 3 subgrupos, que

tampoco tienen una relación muy estrecha (< 60% de similitud). Las cepas que

presentaron patrones con un alto porcentaje de similitud (> 90 %), fueron

aislados de la misma muestra de carne y del mismo país de oirigen.

El PFGE, permitió determinar que el grado de similitud genética que existe entre

las cepas de STEC aisladas desde carne bovina, es bajo, lo que sugiere que

presentan una alta diversidad genética y no es posible establecer asociaciones

entre ellas, con el país de origen, frigorífico y supermercado.

http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-10182009000100006#img01

45

Figura 4. Dendrograma que muestra la relación clonal entre las diferentes cepas STEC

aisladas desde carne bovina.

Las muestras de carne bovina, positivas para la detección por PCR de genes stx,

fueron tomadas en distintos establecimientos de comercialización en Santiago y

provenían de diversos frigoríficos, de variadas localidades y países de origen en

donde la carne se faena, se envasa al vació y se certifica.

Cabe destacar que de una muestra de carne fue posible aislar más de una cepa y

cada una de ellas con serogrupos y perfil toxigénico distintos (Anexo 5).

A

B

N°

cepa

Serogrupo

Perfil toxigénico

Local

Frig.

País de origen

46

DISCUSION

En el presente estudio se logró detectar STEC en muestras de carne bovina

selladas al vacío de procedencia nacional e importada que expenden las

principales cadenas de supermercados de Santiago de Chile. El porcentaje de

muestras de carne con presencia de STEC fue de 6,6% (20/304), lo que pone de

manifiesto que el consumo de carne en Chile es un potencial riesgo para la salud

de la población infantil. Otros resultados obtenidos a partir del análisis de muestras

de hamburguesas crudas y productos carnicos de origen bovino nacionales e

importados, describieron una frecuencia de aislamiento de 4,2% (9/213) de STEC

(Alexandre et al, 1999). Es importante destacar que a pesar de haber utilizado

técnicas diagnósticas distintas en ambos trabajos, mostraron resultados similares.

Alexandre et al detectó la presencia de shigatoxinas utilizando anticuerpos

monoclonales específicos para Stx1 y Stx2 mediante la técnica de ELISA y en

nuestro estudio, se detectaron los genes específicos de los factores de virulencia

stx1, stx2 y eae, mediante PCR múltiple.

Esta tesis tuvo como objetivo no sólo detectar y aislar STEC O157 si no también

determinar la presencia de STEC no-O157, evitando la utilización de inhibidores

del crecimiento tales como novobiocina, telurito y cefixime.

Diversos estudios, en distintos países, han aislado éste patógeno desde carne,

describiendo una prevalencia de STEC O157 que fluctúa entre 0,4 a 3,7% y de

STEC no-O157 que fluctúa entre 2,4 a 30% (Hussein, 2007). Lo anterior, difiere de

nuestros resultados, debido a que del total de muestras analizadas, sólo se logró

aislar e identificar cepas no-O157. Sin embargo, Vidal et al (2010) mostraron que

de un total de 385 muestras obtenidas de heces bovinas faenadas en la Región

Metropolitana, sólo una presentó O157:H7 en su contenido intestinal. En este

sentido, un mayor número de muestras analizadas por país, probablemente

permitirían detectar O157. A pesar de ello nuestros resultados pueden deberse

también al hecho de no haber utilizado la metodología epecífica para enriquecer

aislados de STEC O157, fundamentalmente en lo referido al uso de agar

MacConkey Sorbitol (SMAC) y el enriquecimiento del medio para lograr mayor

47

sensibilidad y especificidad en el aislamiento de éste serotipo (INEI-ANLIS y OPS,

2011). Sumado a lo anterior es importante considerar que el aislamiento de STEC

desde carne es complicado debido a que éstas bacterias se encuentran en bajo

número y compitiendo con otras bacterias de la microbiota de la carne (Brusa et al,

2013).

Al analizar las muestras de carne de Chile, se logró detectar 3,4% de STEC,

similar a lo descrito por Burgos et al en el año 2003, que detectaron la presencia

de genes de shigatoxinas en el 0,89% (2/226) de las muestras de canales bovinas

nacionales faenadas en la Región Metropolitana. El menor porcentaje de

aislamiento en carnes nacionales selladas al vació, se puede explicar por la baja

colonización de STEC en bovinos de nuestro país. Esto podría estar directamente

relacionado con mejoras en la producción animal, lo que se traduce también en un

buen manejo sanitario y por lo tanto, en una disminución en la presencia de esta

bacteria (Vidal et al, 2010). Además, la mayor parte de la carne bovina que se

produce en Chile se exporta y el mercado en el cual está enfocado Chile son

principalmente países desarrollados (UE, Japón, EEUU) que tienen altos

estándares de calidad, debido a lo cual los planteles nacionales deben cumplir con

estos requisitos. Sin embargo, a pesar de la baja prevalencia de STEC en las

carnes bovinas de nuestro país, es necesario la incorporación de medidas de

control más efectivas sobre todo en las etapas críticas de producción (sacrificio y

evisceración) para disminuir el riesgo de contaminación con STEC a lo largo de la

cadena agroalimentaria y de ésta manera poder asegurar la calidad e inocuidad de

la carne nacional.

En el caso de la carne de origen importada, los resultados de los análisis

estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se asociaron

significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al vacío (OR: 5,4;

OR: 8,6 respectivamente), siendo Chile el país de comparación o de referencia.

De lo anterior se puede inferir que la posibilidad de encontrar STEC en carne

importada desde Argentina es cinco veces más que en la carne de Chile, y a su

vez, la carne proveniente de Uruguay tendría 8 veces más posibilidades de

48

presentar STEC que la carne de nuestro país. Estos resultados se pueden asociar

con un estudio realizado en Argentina por Padola et al en el año 2004, donde se

describió una alta prevalencia de STEC (63%) en bovinos de ese país lo que

podría explicar el mayor porcentaje de STEC en carnes. Además, estudios

previos realizados en Argentina reportaron un alto nivel de contaminación con

STEC en carne molida (15,3%, 11/72) donde se aislaron cepas con perfiles

altamente virulentos (Miccio et al, 2011). Otro estudio realizado en Argentina,

donde se analizó por PCR 95 muestras de hamburguesas de carne bovina

congelada, también mostraron una prevalencia de STEC significativa (8,4%)

(Gómez et al, 2002). Lo anteriormente expuesto, es relevante debido a que en

Argentina el SHU ha sido descrito desde el año 1964, siendo actualmente el país

donde se registra la mayor incidencia mundial, con más de 400 casos nuevos por

año (Miccio et al, 2011; Masana et al, 2011). En relación a Uruguay, un estudio

realizado por Varela et al en el año 2008, describió una prevalencia de 1,8%

(4/220) de STEC del serotipo O157:H7 en muestras de carne picada.

Lamentablemente no existen referencias en Uruguay que describan la presencia

de STEC no-O157, a pesar de ello, nuestros resultados muestran una prevalencia

de STEC significativamente mayor (24%, 4/17, Fig. 1).

Un estudio reciente realizado en EE.UU. mostró que el 7,3% (300/4133) de las

muestras de carne molida fueron positivas para STEC no-O157 (Bosilevac y

Koohmaraie, 2011), mientras que en Australia la tasa de positivos fue del 16%

(46/285) (Barlow et al, 2006). Estos reportes indican prevalencias mucho más

altas que las encontradas en nuestro estudio donde las muestras de carne

provenientes de Australia presentaron una baja prevalencia de STEC (4%, 2/53).

En el caso de las muestras provenientes de EEUU, en ninguna de ellas se detectó

presencia de STEC, sin embargo éste resultado no es representativo debido a la

baja cantidad de muestras recolectadas (0/3).

Por otro lado, en Brasil se ha descrito una prevalencia de STEC de 3,5% (4/114)

en muestras de carne molida (Bergamini et al 2007), porcentaje similar a lo

obtenido en este estudio en carnes provenientes de ese país (2%, 2/89). La baja

prevalencia de STEC en carne bovina podría explicar la incidencia relativamente

49

baja de SHU en Brasil (Souza et al, 2011). Sin embargo, es muy difícil comparar

las tasas de infección por STEC en los distintos países debido a las diferencias en

los métodos de detección de STEC de cada estudio, en los procedimientos de

muestreo, en el número de muestras analizadas y la técnica de aislamiento de la

bacteria, pudiendo afectar los datos de prevalencia.

Varios autores señalan que el mayor riesgo de contaminación de las

canales bovinas ocurre durante el proceso de faena, cuando el contenido intestinal

o heces tienen contacto con la superficie de la carne (Arthur et al, 2010; Edwards y

Fung, 2006). Es así como se ha descrito que la contaminación con STEC en los

cuartos posteriores de la canal bovina es significativamente mayor que en los

cuartos anteriores (Etcheverría et al, 2010). Estos datos coinciden con los

resultados de nuestro estudio pues la mayor prevalencia de STEC se observó en

los cortes pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina como por ejemplo,

ganso (29%, 4/14), abastero (18%, 4/22) y pollo ganso (17%, 4/23), determinando

que estos tipos de cortes de carne, se asociacian significativamente con la

presencia de STEC (OR= 6,7).

Nuestro estudio, realizó la búsqueda de los genes stx1 y stx2 en las

muestras de carne, detectando en un 90% el gen stx2. Este antecedente es muy

importante, debido a que la proteína Stx2 codificada en éste gen, es el principal

responsable de la falla renal en el SHU y tiene una actividad citotóxica de 100 a

1000 veces superior a Stx1 (Paton y Paton, 2002; INEI-ANLIS y OPS, 2011). Por

lo tanto, la mayor prevalencia de stx2 en aislados de STEC en carne, podría

relacionarse a un mayor riesgo de incidencia de casos clínicos más graves de esta

patología. Si bien las Stx muestran similitud en su estructura y función, cada una

de las variantes (Stx1 y Stx2) presenta grandes diferencias en su toxicidad en

tejidos celulares y especies animales. Las cepas aisladas en este estudio,

presentaron distintos genotipos de stx, predominando los genes stx1a, stx2a, stx2c y

stx2d . Estos resultados son muy relevantes debido a que éstos genes se han

asociado a cuadros clínicos severos en humanos (Friedrich et al, 2003; Jelacic et

al, 2003). En relación al gen stx2b, sólo se detectó en una de las cepas y se ha

50

asociado principalmente a cuadros diarreicos no complicados (Friedrich et al,

2003).

Por otro lado, el gen eae, que codifica para la producción de la proteína

intimina, no se logró identificar en ninguna de las cepas analizadas . Aunque la

presencia de este gen está mayormente asociada con la capacidad de las cepas

de STEC para causar cuadros graves de SHU, la síntesis de intimina no es

esencial para la patogénesis, dado que existen cepas negativas para el gen eae

que se han aislado en pacientes con SHU (Paton et al 1999). Además de la

capacidad de producir Stx e intimina, STEC puede tener otros factores de

virulencia, codificados por distintos genes que les confiere la capacidad de

adherirse a las células del epitelio intestinal. Entre estos genes de virulencia, los

más estudiados y caracterizados son ent, efa1, hlyA, iha, saa y lpf (Vidal et al,

2007).

El gen saa, fue descrito por primera vez por Paton et al en el año 2001 y

detectado en cepas STEC que carecían del gen eae. Estas cepas negativas para

la presencia de intimina igual fueron capaces de generar cuadros de SHU,

pudiendo ser la fimbria Saa un importante mecanismo de adherencia ante la

ausencia de intimina. En esta tesis, el gen saa fue detectado en el 65% de las

cepas (13/20), las cuales no poseían el gen eae, concordando con lo descrito por

Paton (2001). Además, un estudio reciente describió que gran parte de las STEC

aisladas desde carne bovina picada presentaban el gen saa (73%) y estaba

presente sólo en ausencia del gen eae (Bosilevac y Koohmaraie, 2011), resultado

similar a lo obtenido en nuestro estudio. Por otra parte, estudios realizados en

Chile han descrito al gen saa como la adhesina más frecuentemente aislada

desde productos alimenticios (Vidal et al, 2007).

Respecto al gen hlyA, también se detectó con una alta frecuencia (65%). Esta

hemolisina estaría presente en la mayoría de las STEC, tanto eae positivas como

eae negativas, pero su patogenia en cuadros de SHU es aún incierta (Nataro y

Kaper, 1998). Recientemente, se ha descrito que hlyA, está presente en el 96%

de las cepas STEC aisladas de pacientes con diarrea aguda, síndrome disentérico

y SHU, lo que sugiere que la hemolisina codificada por éste gen tiene un rol

51

importante en las cepas STEC para producir infección en humanos (Vidal et al,

2010). Además, estudios llevados a cabo en Chile y Argentina demostraron que la

mayoría de los aislados de STEC desde heces de bovino presentaron éste gen

(67,3% y 46% respectivamente) (Blanco et al, 2004; Vidal et al, 2012).

En relación al gen iha, éste se detectó en un 60% de los aislados. Sin embargo, a

pesar de estar ampliamente distribuido entre las STEC (Tarr et al, 2000), aún no

existe claridad de su importancia en la virulencia de éste patógeno (Vidal et al,

2010).

Por otro lado, si bien el gen lpf junto a stx2 han sido los factores de virulencia con

mayor asociación a cuadros graves de SHU, (Torres et al, 2009) en nuestro

estudio, ninguna de las cepas aisladas fue positiva para su detección.

Respecto a los serogrupos obtenidos en este trabajo, el 100% correspondió a

cepas STEC no-O157. En orden de mayor a menor frecuencia se identificó los

serogrupos O113, O174, O141 y O8 representando el 50% del total de cepas

aisladas. El 50% restante correspondió a serogrupos O no tipificables (NT), lo que

sugiere que podrían ser otros serogrupos que no están incluidos dentro del

esquema de tipificación serológica utilizado. Informes publicados en los últimos

25 años, sobre contaminación de carne bovina con STEC revelan que existe

alrededor de 98 serogrupos O y más de 160 serotipos diferentes (O:H). De éstos,

se han descrito 40 serotipos aislados desde pacientes con SHU (Hussein, 2007),

incluyendo las STEC O113, O174, O141 y O8 caracterizadas en nuestro estudio.

Otros resultados indican que STEC O8 y O113 también han sido aislados desde

carne picada (Bosilevac y Koohmaraie, 2011) y son serotipos que se han asociado

a casos de SHU y colitis hemorrágica a nivel mundial (Brusa et al, 2013).

En base a los resultados obtenidos en este estudio y considerando que en nuestro

país STEC es endémico y su principal mecanismo de transmisión es el consumo

de carne bovina, es importante establecer programas de control que sean

frecuentes y periódicos para mejorar la bioseguridad a nivel de predio, de

matadero y en las distintas etapas de producción. Medidas como reducir la

densidad de animales durante el transporte y en el predio, podrían evitar la

52

transmisión de cepas entre animales y hacia el ambiente. Por otro lado, evitar la

contaminación cruzada en las plantas de faenamiento, sobre todo durante la etapa

de evisceración, debiera ser una preocupación constante. A su vez, es

fundamental, la aplicación de medidas educativas y preventivas relativas al

consumo de carne bien cocida, evitar la contaminación cruzada durante la

manipulación de los alimentos y promover el consumo de productos cárnicos

frescos y procesados, que involucren conceptos de calidad e inocuidad y con ello

influir en la reducción de los casos de SHU.

Los resultados de este estudio, se pueden extrapolar al resto de las regiones

del país, pues se analizó un adecuado número de muestras de carne bovina,

la técnica que se utilizó para la detección de STEC en carne es altamente

sensible y específica, las muestras se recolectaron desde los

supermercados de Santiago, que es donde se realiza la mayor parte de las

ventas de carne en Chile, debido a que geográficamente, el mercado

agroalimentario se encuentra concentrado en aquellas zonas donde habita la

mayor parte de la población chilena.

53

CONCLUSIONES

• Existe presencia de STEC en muestras de carnes bovinas selladas al

vacío (6,6 %) de procedencia nacional e importada que están a la venta en

los supermercados de Santiago.

• Las muestras de carne bovina chilena presentan un bajo porcentaje de

STEC.

• Los análisis estadísticos indicaron que tanto Argentina como Uruguay se

asociaron significativamente con presencia de STEC en carnes selladas al

vacío, independiente del tipo de corte (p< 0,05).

• Los cortes de carne pertenecientes al cuarto posterior de la canal bovina,

se asocian significativamente con la presencia de STEC, independiente del

país de origen (p<0,05).

• Las cepas aisladas en este estudio, presentan serogrupos y genes de

virulencia (toxinas y adhesinas) previamente descritos en cepas de STEC

aisladas de casos clínicos de CH y SHU en humanos.

• Los resultados obtenidos en este estudio, ponen de manifiesto que el

consumo de carne mal cocida es un potencial riesgo para la salud de la

población infantil y adulto mayor.

54

RECOMENDACIONES

Incluir STEC en el Reglamento Sanitario Chileno de Alimentos orientado a

la búsqueda de los genes de shigatoxinas.

Realizar controles a la carne bovina importada y nacional, para detectar la

presencia de STEC.

Se sugiere exigir, a los proveedores de carne bovina nacionales y

extranjeros, el muestreo y análisis de STEC durante la faena en los

establecimientos de origen.

Informar a personal de frigoríficos sobre los riesgos que implica la infección

por STEC.

Evitar la contaminación cruzada en las plantas de faenamiento, sobre todo

durante el proceso de desosado y evisceración

Fomentar campañas de prevención y educación en jardines infantiles,

colegios y consultas pediátricas, relativas al consumo de carne bien cocida,

evitar contaminación cruzada durante la manipulación de alimentos, con el

fin de disminuir el riesgo de SHU.

55

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66

LISTA DE ABREVIATURAS

APT: Agua Peptonada Tamponada

CSB: Cell Suspension Buffer

CH: Colitis hemorrágica

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato

DAEC: Escherichia coli de adherencia difusa

ECD: Escherichia coli diarreogénica

EaggEC : Escherichia coli enteroagregativa

EDTA: Acido etilendiaminotetraacético

EIEC: Escherichia coli enteroinvasiva

EPEC: Escherichia coli enteropatógena

ETEC: Escherichia coli entoretoxigénica

LB: Agar Luria-Bertani

mM: milimolar

mg: Miligramos

ml: Mililitro

nm: Nanomolar

NaCl: Cloruro de Sodio

pb: Pares de bases nucleotídicas

P/V: Peso/Volumen

67

PFGE: Pulsed field gel electrophoresis (Elecroforesis en gel de campo

pulsado)

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

rpm: Revoluciones por minuto

SHU: Síndrome hemolítico urémico

SDS: Sodium Lauryl Sulfate

STEC: Escherichia coli productor de shigatoixina

TBE: Tris Borato EDTA

TSA: Agar Triptona-Soja

U: Unidad

V/cm: Volts por centímetro

V/V: Volumen/Volumen

µM: Micromolar

µl: Microlitro

µg: Microgramo

68

ANEXO 1

Tabla 1. Mezcla de PCR múltiple para detección de los genes stx1/stx2/eae

Tabla 2. Programa de PCR múltiple stx1/stx2/eae

Reactivo Concentracion de

trabajo del reactivo

Volumen del reactivo por

reacción (µL)

Buffer para PCR 5x 5

MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor Stx1 R 10µM 0,4

Partidor Stx1 Fw 10µM 0,4

Partidor Stx2 Rw 10µM 0,2

Partidor Stx2 Fw 10µM 0,2

Partidor eae Rw 10µM 0,2

Partidor eae Fw 10µM 0,2

Taq polimerasa 5 U/µL 0,125

Agua sin nucleasa 13,275

DNA 1,5

Volumen final 25

Paso N° Etapa

Temperatura

°C Tiempo

Ir al paso

N°

N°de

ciclos

1 Denaturación inicial 94 3 min

2 Denaturación 94 1,30 seg

3 Alineamiento 58 1,15 seg

4 Extensión 72 1 min 2 35

5 Extensión final 72 7 min

6 Pausa 4

69

ANEXO 2

Tabla 1. Mezcla de PCR múltiple para la detección de las variantes de stx1

Reactivo Concentración de


Volumen del reactivo

por reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor Stx1a F1 5µM 1

Partidor Stx1a R2 5µM 1

Partidor Stx1c F1 5µM 0,5

Partidor Stx1c R1 5µM 0,5

Partidor Stx1d F1 5µM 0,25

Partidor Stx1d R2 5µM O,25



DNA 1

Volumen final 25

70

Tabla 2. Mezcla de PCR para la detección del gen stx2a

Tabla 3. Mezcla de PCR simple para la detección de las variantes stx2b, stx2c,

stx2e, stx2f y stx2g




reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor Stx2a F1 5µM 0,625

Partidor Stx2a R3 5µM 0,625

Partidor Stx2a R2 5µM 0,625



DNA 1

Volumen final 25




reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor F 5µM 0,625

Partidor R 5µM 0,625



DNA 1

Volumen final 25

71

Tabla 4. Mezcla de PCR para la detección del gen stx2d




reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor Stx2d F1 5µM 0,625

Partidor Stx2d R1 5µM 0,625

Partidor Stx2d R2 5µM 0,625

Partidor Stx2d 055-R 5µM 0,625



DNA 1

Volumen final 25

72

Tabla 5. Programa de PCR múltiple para la detección de las variantes

stx1a/stx1c/stx1d

Tabla 6. Programa de PCR múltiple para la detección de las variantes del

gen stx2

Paso

N° Etapa Temperatura °C Tiempo

Ir al paso

N°

N°de

ciclos

1

Denaturación

inicial 95 4 min

2 Denaturación 94 50 seg

3 Alineamiento 62 40 seg



6 Pausa 4

Paso

N° Etapa

Temperatura

°C Tiempo

Ir al paso

N°

N°de

ciclos

1

Denaturación

inicial 95 4 min


3 Alineamiento

Ver Tabla 3

Metodología 40 seg



6 Pausa 4

73

ANEXO 3

Tabla 1. Mezcla de PCR para detección de E. coli O157

Reactivo Concentracion de trabajo

del reactivo


reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5

Partidor O157 R 10µM 0,5

Partidor O157 F 10µM 0,5



DNA 1,5

Volumen final 25

Tabla 2. Programa de PCR para la detección de E. coli O157

Paso N° Etapa

Temperatura

°C Tiempo Ir al paso N°

N°de

ciclos

1 Denaturación inicial 95 5 min


3

Alineamiento o unión de

partidores 66 30 seg

4 Extensión 72 30 seg 2 35


6 Pausa 4

74

ANEXO 4

Tabla 1. Mezcla de PCR para la detección de los genes efa1 no-O157 y ent

Reactivo Concentración de trabajo

del reactivo


reacción (µL)


MgCl2 25 mM 3

dNTPs 10 mM 0,5





DNA 1

Volumen final 25

Tabla 2. Mezcla de PCR para la detección del gen saa


del reactivo


reacción (µL)


MgCl2 25 mM 1,5

dNTPs 10 mM 1

Partidor R 10µM 1

Partidor F 10µM 1



DNA 1

Volumen final 25

75

Tabla 3. Mezcla de PCR para la detección de los genes hlyA, iha, efa1 y lpf.


del reactivo


reacción (µL)


MgCl2 25 mM 1,5

dNTPs 10 mM 0,5





DNA 1

Volumen final 25

Tabla 4. Programa de PCR para la detección de los genes efa1, lpf, saa, hlyA,

iha, ent y efa1 no-O157.

Paso

N° Etapa

Temperatura

°C Tiempo

Ir al paso

N°

N°de

ciclos

1

Denaturación

inicial 94 3 min

2 Denaturación 94

1,30

seg

3 Alineamiento

Ver tabla 5

Metodología

1,15

seg



6 Pausa 4

76

ANEXO 5

Tabla 1. Trazabilidad de las muestras de carne bovina con precencia de

STEC

* Cepa no aislada NT: No tipificable

País de origen Frigorífico Supermercado Comuna Perfil toxigénico Serogrupo

Argentina F1 A Santiago stx1a, stx2a, saa, hlyA.

stx1a, stx2a, stx2c,

hlyA, iha

O174

NT

Argentina F1 B Santiago stx1a, stx2a, saa, hlyA,

iha.

O113

Chile F2 A Providencia stx1a, stx2a

stx1a, stx2a

NT

NT

Australia F3 A Providencia stx2 *

Uruguay F4 B Santiago stx2 *

Uruguay F4 B Santiago stx1a, stx2a, stx2c,

stx2d, saa, hlyA, iha

stx1a, stx2c, stx2d,

saa, iha

stx1a, stx2a,stx2c,

stx2d, saa

O174

O113

NT

Uruguay F5 B El Bosque stx2 *

Chile F6 A La Reina stx1a, stx2a,

stx2c,stx2d, saa, hlyA



NT

O113

Brasil F7 C Las Condes stx2 *

77

Continuación Tabla 1. Trazabilidad de las muestras de carne bovina con

presencia de STEC.

* Cepa no aislada NT: No tipificable

País de origen Frigorífico Supermercado Comuna Perfil toxigénico Serogrupo

Australia F8 C Las

Condes



stx1a, stx2c, saa,

hlyA, iha



O141

NT

O113

Argentina F9 D Las

Condes

stx2 *

Argentina F10 E Maipú stx2b, stx2c, iha NT

Argentina F10 E Maipú stx1 *

Brasil F7 E Las

Condes

stx2 *

Argentina F11 E Las

Condes

stx2 *

Argentina F12 D San

Miguel

stx2c, hlyA O113

Argentina F12 D San

Miguel

stx2c, iha NT

Uruguay F13 D San

Miguel

stx2c, iha NT

Chile F14 A La Pintana stx1 *

Argentina F1 C La Reina stx1a, stx2a, stx2d,

saa, hlyA

stx1a, stx2a, saa,

hlyA, iha

stx1a, stx2a, saa,

hlyA

O8

O113

NT

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE

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