Adherencia de Lactobacilos Vaginales Humanos a las células epiteliales vaginales y su interacción con los uropatógenos.

Tres muestras de lactobacilos, identificados como L acidophilus, L gasseri y L jensenii, se seleccionaron de entre 70 cepas de las vaginas de mujeres pre menopáusicas sanas por las propiedades relevantes a la colonización mucosa o antagonismo. Todas las 3 se auto agregaron y adhirieron a las células epiteliales vaginales, desplazando a los bien conocidos patógenos vaginales, como G. Vaginalis, e inhibiendo el crecimiento in vitro de E Coli y Streptococcus agalactiae. Los componentes de la superficie involucrados en la auto-agregación aparentan ser proteínas para L. gasseri y lipoproteínas para L. acidophilus y L. jensenii, como se juzga por la susceptibilidad al tratamiento con las enzimas degradantes apropiadas. Los factores responsables para la adherencia a las células epiteliales vaginales parecieron ser glicoproteínas (L. acidophilus y L. gasseri) y carbohidratos (L. jensenii). Los receptores de las células vaginales fueron los glicolípidos, que presumiblemente fueron los blancos de la competencia observada entre los lactobacilos y los microbios patogénicos.

El ecosistema vaginal alberga una microbiota que está crecientemente reconocida como protectora de este de patógenos invasores, incluyendo aquellos que causan infecciones del tracto urinario y enfermedades transmitidas sexualmente. Los lactobacilos son dominantes en este hábitat de 107 a 108 CFU/g de fluido vaginal en mujeres pre menopáusicas sanas. Entre ellos, aquellos que pertenecen al grupo de L acidophilus y L. fermentum son los más frecuentemente aislados, aunque otros, como L. plantarum, L. brevis, L. jensenii, L. casei, L. delbrueckii, y L. salivaris fueron también aislados.

Se cree que los lactobacilos interfieren con los patógenos por diferentes mecanismos. El primero es la exclusión competitiva de patógenos genitourinarios de los receptores presentes en la superficie del epitelio genitourinario. Segundo, los lactobacilos se coagregan con algunas bacterias uropatogénicas, un proceso que, cuando se liga a la producción de compuestos antimicrobianos, como ácido láctico, peróxido de hidrógeno, sustancias similares a la bacteriocina y posiblemente biosurfactantes, resultarían en la inhibición del crecimiento del patógeno.

La adherencia de las bacterias a las células epiteliales ha mostrado ser un factor importante en la colonización de las membranas mucosas. No obstante, poco se sabe acerca de los mecanismos por los cuales los lactobacilos de las vaginas de mujeres jóvenes sanas ase adhieren a las células epiteliales vaginales, aunque la variedad de estructuras en estas bacterias implican que puede existir un espectro de mecanismos de adherencia. Además, la auto-agregación puede incrementar substancialmente el potencial de colonización de lactobacilos en ambientes con tiempos de residencia cortos.

En este estudio, reportamos sobre los mecanismos de auto-agregación y adherencia a las células epiteliales vaginales de tres cepas de Lactobacilos vaginales. Además, analizamos como estas propiedades pueden interferir con la colonización patogénica, ya sea por competición a través de la superficie de la célula e inhibición del crecimiento.

Materiales y Métodos.

Muestras y condiciones del cultivo. Los lactobacilos fueron incubados en caldo de cultivo o agar LAPTg a 37°C. Los aislados iniciales de las muestras vaginales se hicieron bajo una atmósfera de

CO2 al 5%. Las cepas fueron incubadas subsecuentemente por aerobiosis. Gardnerella Vaginalis fue cultivada en caldo de cerebro-corazón (BIokar) bajo una atmósfera de CO2 al 5%, E Coli se propagó en azul eosina-metileno (pronadisa), y Streptococcus agalactiae y Candida albicans se cultivó en agar LAPTg a 37°C por aerobiosis. Todas las muestras fueron especímenes ambulatorios o clínicos obtenidas en el Hospital Monte Naranco.Pruebas de Agregación. La determinación de la habilidad de auto-agregación de los lactobacilos y los tratamientos bioquímicos de las células para determinar la naturaleza de los factores de agregación se realizaron como se describió previamente.Microscopía electrónica. Los lactobacilos de cultivos de una noche en caldo LAPTg se lavaron con agua destilada y resuspendidos en el líquido que quedó en el precipitado, y se permitió colocar alícuotas de 5 l en parrillas de cobre cubiertas con Formvar (Merck). El exceso de líquido se removió y se agregaron 5 l de 2% (wt/vol) de acetato de uranilo y se permitió reposar la mezcla por 2 min. Las células teñidas negativamente se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 2000 EXII a 120 kv.Determinación de Hidrofobicidad. La hidrofobicidad de la superficie de los lactobacilos se determinó midiendo la afinidad de las células cultivadas de un día a otro por xilol en un sistema de dos fases (agua-xilol).Cepas de Adherencia. Las células epiteliales vaginales fueron colectadas de mujeres premenopáusicas saluldables y tratadas como se describió previamente. Los cultivos de un día a otro de los lactobacilos a probar se suspendieron a 108 celulas/ml en medio esencial mínimo de Eagle (Laboratorios Flow). Se mezclaron volúmenes iguales de las suspensiones bacterianas y de las células vaginales y se incubaron a 37°C con agitación orbital (100 rpm/min) por 30 min. Posteriormente, las suspensiones pasaron a través de filtros Miliporo (8m de tamaño del poro) y lavadas con un volumen del medio de Eagle. Las células retenidas en el filtro se colocaron en laminillas recubiertas de albúmina, fijadas con etanol y teñidas con Gram. Las pruebas se iniciaron a una hora de la colección de las células epiteliales y cada determinación fue realizada por duplicado. Como control negativo para adherencia, se utilizó L. plantarum LL 441 aislado del suero del queso.La naturaleza de los factores bacterianos y eucarióticos involucrados en la adherencia se determinaron a través del tratamiento de las células con proteinasa K, lipasa, y metaperiodato de sodio como se describió antes. La sensibilidad de la adherencia a la temperatura fue probada calentando las suspensiones de lactobacilos a 100°C por 10 min en solución salina fosfatada. La reversibilidad de la adherencia se probó lavando repetidamente la mezcla de lactobacilos y células epiteliales con 20 mM de EDTA o EGTA.Cepas de interferencia. Los experimentos de interferencia se realizaron con G Vaginalis y C albicans, dado que son los únicos patógenos genitourinarios potenciales utilizados en este trabajo que mostraron una capacidad significativa para adherirse a las células vaginales (véase abajo). Se utilizaron los procedimientos descritos por Spencer y Chesson, con algunas modificaciones. Para las pruebas de exclusión, los lactobacilos y las células epiteliales vaginales se incubaron juntas por 30 min; posteriormente se añadieron células de C. albicans o G. Vaginalis y la incubación continuó por otros 30 min. Para las pruebas de competencia, se mezclaron los lactobacilos, cualquiera de los patógenos y las células epiteliales vaginales y se incubaron por 30 min. Para las pruebas de desplazamiento, C. albicans o G. vaginales y las células epiteliales vaginales se incubaron juntas por 30 min. Se añadieron lactobacilos y la incubación continuó por otros 30 min. Las suspensiones resultantes se filtraron y la observación celular se realizó como se indicó arriba.Cepas de coagregación. Las cepas de coagregación se diseñaron basadas en métodos previamente reportados. Las suspensiones de los microorganismos se ajustaron a un A600 de 0.6. Se mezclaron alícuotas de 500 l de los tres tipos de Lactobacilos con 500 l de cada uno de los cuatro patógenos

e incubados a 37°C en un agitador orbital a 100 rpm por 4 h. Las suspensiones fueron medidas macroscópicamente para coagregación, de acuerdo a una escala ya descrita. Además, se observaron a través de un microscopio de contraste de fases después de teñir con tinción de Gram.Análisis estadístico. Todas las medidas se hicieron con un mínimo de muestras duplicadas por variable para cada experimento. Los datos son expresados como una media desviación estándar ± para experimentos representativos. Las comparaciones fueron analizadas por la prueba t de Student.

ResultadosSelección de Lactobacilos adherentes. Los exudados vaginales fueron colocados mediante hisopo en medio selectivo para patógenos sexualmente transmisibles y en agar chocolate. La incubación se hizo por 72 h a 37°C bajo una atmósfera de 5 a 10% de CO2 con inspecciones de crecimiento diarias. De las primeras series de medios, se obtuvieron los patógenos genitourinarios potenciales indicados en la sección de Materiales y Métodos. De las charolas de agar chocolae, colonias plancas, consistentes de bacilos gram positivos incapaces de crecer bajo aerobiosis completa, se aislaron, se sembraron en el agar LAPTg, e incubaron bajo las mismas condiciones. De este modo se obtuvieron 70 cepas de lactobacilos vaginales. Tres de ellos se seleccionaron por su habilidad de auto-agregación y adherencia a las células epiteliales vaginales. Se clasificaron como L. acidophilus, L. gasseri y L. jensenii con el sistema API 50 CHL (BioMerieux).

Estudios de agregación. Las tres especies se auto-agregaron, produciendo gránulos macroscópicos; el efecto también fue observado bajo el microscopio óptico. La agregación se abolió mediante el tratamiento de las células con proteinasa K y, para L. acidophilus y L. jensenii, también después de la incubación con lipasa. Este resultado indica que le factor promotor de agregación es una proteína para L. gasseri y una lipoproteína para los otros organismos (o lípidos y proteínas separados, cuya presencia de ambos sería necesaria para que la agregación ocurra). Ya que no se vieron efectos después del tratamiento de las células por extracción de Fenol o metaperiodato de sodio, los ácidos lipoteicoicos o carbohidratos probablemente no están involucrados en la agregación de estas especies.Irrespectivamente de la naturaleza de los factores, las tres especies mostraron alta hidrofobia superficial con valores en excesos de 80% de las células que migran en la fase de xilol en la prueba de dos fases de Rosenberg; los lactobacilos no adherentes fueron mucho más hidrófilos,, mostrando valores de 40% o menos. Las moléculas promotoras de la agregación parecieron formar una capa continua alrededor de las células, como se observó por la tinción negativa antes y después de los tratamientos con proteinasa K o lipasa.

Adherencia a las células epiteliales vaginales. Las tres especies de lactobacilos humanos fueron adherentes, mientras que L. plantarum LL441, una especie aislada de productos diarios y usada como control negativo, no lo fue. La habilidad de adherencia se perdió tras el tratamiento de las células con metaperiodato de sodio y para L. acidophilus y para L. gasseri, con proteinasa K. No obstante, la lipasa no ejerció un efecto significativo en la adherencia. Finalmente, parece que los cationes eran necesarios para la adherencia de L. gasseri y L. jensenii, mientras que la adherencia de L. acidophilus era sensitiva al calor (Tabla 1). Estos datos indican que los receptores de L. acidophilus son glicoproteínas sensitivas al calor y aquellos de L. jensenii son carbohidratos que requieren cationes.

Los receptores de las células epiteliales vaginales para las tres especies de lactobacilos aparentan ser glicolípidos, como se dedujo por el largo decremento en la capacidad de adherencia resultante del tratamiento de las células vaginales con lipasa y metaperiodato (tabla 2).

Interferencia de Adhesión de los patógenos urogenitales. Las especies de cuatro patógenos genitourinarios potenciales se obtuvieron de los mismos exudados vaginales del que se tomaron los lactobacilos usados en este trabajo. De este modo, intentamos comparar el comportamiento de las especies que presumiblemente estaban compitiendo por el mismo biotopo. No se observó adhesión a las células epiteliales vaginales por E. coli y S. agalactiae. No obstante, C. albicans y G. Vaginalis fueron adherentes. Los experimentos de interferencia de adhesión estuvieron restringidos a cepas de estas dos especies, contra L. acidophilus como especie competente. Se observó una gran reducción en la adherencia a las células vaginales cuando las células de C. albicans fueron añadidas junto con L. acidophilus. Se encontró la misma situación con G. vaginales, la cual, en adición, fue desplazada por los lactobacilos cuando se unieron a las células vaginales.

Experimentos de coagregación.

Los cultivos mezclados de las tres especies de lactobacilos con cualquiera de los cuatro patógenos potenciales mostraron coagregación con E. coli, C. albicans y G. Vaginalis pero no con S. agalactiae. Como ejemplo, la figura 4A muestra la apariencia de los agregados formados entre C. albicans y L. acidophilus.