Mtodosdesecuenciacindecidosnucleicos.GonzaloGreif.UnidaddeBiologaMolecular.InstitutPasteurMontevideo.

1. Unpocodehistoria2. SecuenciacinpormtododeMaxxamyGilbert3. SecuenciacinpormtododeSanger

a. AvancesenelmtododeSanger(19861996)b. ProyectoGenomaHumano

4. AlgunosMtodosdesecuenciadomasivoa. Pirosecuenciacinb. Secuenciadoporhibridizacin(Illumina)c. Otromtodosd. Aplicaciones

1. Unpocodehistoria.

Pasaron15aosdesdeeldescubrimientode laestructuradedoblehlicedelADNen1953hastaladeterminacindelaprimerasecuenciadeADNdeformaexperimental.Algunasdelasrazonesqueprovocaronestademorafueron:

1. LaspropiedadesqumicassimilaresdelasdiferentesmolculasdeADNdificultabansuaislamiento.

2. EllargodelasmolculasdeADN,muchomayoresquelascadenaspolipeptdicasdelasprotenas,hacaninabordablelasecuenciacincompleta.

3. NoseconocanADNasasespecficas.Lasecuenciacindeprotenassebasabaenelusodeproteasasquecortabanendeterminadosaminocidos.

Sin embargo, algunas molculas de ARN no ofrecan estas dificultades, en particular lasmolculas de ARN de transferencia eran pequeas y se podan purificar individualmente.Adems se conocan ARNasas baseespecficas y se desarrollaron mtodos anlogos a losutilizadosparaprotenas.LaprimersecuenciadeuncidonucleicofueobtenidaporHolleyysuscolaboradoresen1965ycorrespondaalARNde transferenciadealaninadeEscherichiacoli.Un evento importante en el desarrollo de los mtodos de secuenciacin de ADN fue eldescubrimientode lasenzimasde restriccinde tipo IIen1970.Estsenzimas reconocenycortanelADNensecuenciasespecficas(engeneralentre4y6basesdelargo).Estasenzimasproporcionaronunmtodo generalpara fragmentar largasmolculasdeADN enpequeaspiezas para luego ser separadas por electroforesis en geles de agarosa. Amediados de ladcadadel70,FrederickSangerpublicaelmtodomsmenos (plusminusmethod)quepermita la secuenciacinde fragmentosdeADNutilizando laenzimaADNpolimerasadeE.coli. A fines de estamisma dcada,Maxxam y Gilbert publican unmtodo alternativo desecuenciacindeADN(mtodoqumico)yelmismoFrederickSangerpublicaelmtodoqueluegoseconvertiraenelmsutilizadodurante lossiguientes30aos (mtodoenzimtico),comoveremosenelpunto3.

2

El mfebrepubli

En eparadeuncadadesdepoliacdeesEl mpoliacADN.

2. Secuenci

todo de seero de 1977caraelmtoelartculodesecuenciarunADNmarcunade lasbe el extremcrilamidaysstamolculatodo propcrilamida,y

acinqumicecuenciacinen el Volu

ododesecueescribenelpunamolculcado radioacbases.Elcormo marcadoseparandod.puesto estabenesteprim

ca.n qumica pmen 74 (nenciacinenzrocedimientladeADN.Etivamenteerteparcialdo hasta laichosfragme

ba limitadomerartculo

Elqu(18dimestpHinteelproy thidtim

Endur(mo

FigupoIntUntenqueposcolsl

Mto

propuesto po2) de la re

zimticaquetodeestamElprocedimienunextremecadabasebase dndeentosporta

por la capmuestran la

mtodoutilimica produ8M hidracinametilsulfatoetratamientneutro, entensoparalascontrario, eovocaunpattenues dedracina)prodminas.laFigura1,rante la secuostradoene

ura 1. Se mliacrilamida cerpretacin:a banda intenueenlasegue lasituacinsicin. Una bumna en laopresenteen

odosdesecu

or Maxxamevista PNAS,everemosenmanera:Desentodetermmo,cortndoe,generaune fueron cmao,espo

pacidad deaposibilidad

izaba4reaccuce cortes ea, 2M NaClcortaenAdetoqumicostonces se osguaninasyel tratamientrninversoguaninas). Educeelclivaj

semuestraeuenciacindelartculode

muestran loscon cada unaLa secuenciaensa en la pundacorrespo inversacorrebanda que apmisma posicinlaltimacol

enciacinde

y Gilbert, f10meses a

nlasiguientearrollamosumina lasecueoloconagensetde fragmlivados. Utiosibledeterm

resolucinddesecuen

cionesqumiespecficame. Una reacceninasyGuaecalientalaobtiene un ptenuesparanto posterio(bandasinteEl ltimo tjetantoenc

elpatrndedeun fragm1977).

cuatro cara de las reacse lee de a

primera columondenaunaAespondeaunparece en lan indica unumnacorresp

ecidosnuclGonzalo

fue publicadantes que Seseccin.unanuevatencianucleontesqumicomentosmarlizando geleminarlasecu

de los geleciar100bas

icas.Unareaente en Citocin con 50aninas;siluereaccina9patrn de balasadeninar a un pHensasdeaderatamientocitosinascom

ebandasobtentode64

rriles del gecciones de clibajo hacia armna y una bAdenina,mienaGuaninaentercera y cua C. y una bpondeaunaT

leicos.oGreif

2

do enSanger

cnicaotdicaosenrcadoses deuencia

es desesde

accinosinas0 mMegode90Caandasas.Porcidoeninas(18Mmoen

tenidobases

l deivaje.rriba.andantrasnesauartaandaT.

Fred

Fuequeprot(195

En1dnResocomunaobtu(m

En1losc

En1Fuen

Lectu

3

Endicmtohabapartirdificusecuemto

As, esecueaspeccapila(finalpremlaapcidoprinclosse

derickSange

elaprimerap lasprotenastenas deber58).

1962,Sangercnde Francis Colvercomoomoestudiando tcnicaaplicuvo por ellotododesecue

1992,elWellccentrosdesec

1985seretirntes:http://www.

urasrecomendad

3. Secuenci

ciembrede1odoparadetan ya publicrdelcualhaultad en la iencia hicieroodosdesecuelmtodo penciacin dectostecnolar, etc.) perizado en el

mioNobelenaricindeloosnucleicos.ipiodenuclecuenciadore

er(1918)Frederick Saesperabaquedecidi realirealizandouncontinutrabel transcursoordenanlosa

personaenobseranmolcuan tenerun

comienzaatrrick, John Kebtenerlasecuoprimero la fcable luegoalsu segundoenciacinqu

comeTrustycuenciacind

ysededicap.dnaftb.org/23/b

das:NobelLectu

acinenzim1977sepubterminar lascado dos aabanlogradonterpretacion que Sangenciacindepropuesto pe cidos nucgicosymetormitieron, cao 2003)Qumicapo

ossecuenciaAunas,muetidos termesdeIllumin

nger naci eneFredsiguierizar una carrnPh.D.conAbajandoconCo de la inveaminocidose

btenerlasecuulasordenadaordeno secu

rabajarenellendrew y otrouenciadeADformadeseclADN (elmtpremio Nobmica)yPaulB

elMedicalRdndesellev

principalmente

io.html/http://wre(FrederickSan

tica.licaeltrabajsecuenciasdos antes, unoobtenerdon de los reger y sus coecidosnuclor Sanger ecleicos hastaodolgicos(aomo hito fupor estemrlainvencidores454sechasdelasnminadores,dna.

Mto

n Rendcomberasuspasos,sera en CiencAlbertNeuberC.Chibnallidestigacin, Saenlaprotena

enciadeaminasy,poranauencia. Por es

aboratoriodeos trabajabanNeralaextenuenciarARNtodode secuel tambin eBerg(ADNrec

esearchCounadelanteelp

ealcuidadodwww.sanger.ac.uk

ger,1980).

odeSanger,debasesennmtodo dossecuenciasultados y aolaboradoreeicos.en 1977 se ca la actualidautomatizacundamental,todo. En 19ndeestemediouncamnuevastecnodescritopor

odosdesecu

e, Inglaterra esinembargoecias. Continuger,enmetabentificandolosnger imagina.

nocidosdeuloga, losgenste trabajoo

eBiologaMon con problemnsinnatural(unamolculenciacinporen Qumica ccombinante).

ncilestablecieproyectoGeno

desujardn.k/about/people/

,NicklenyCounamolcude secuenciaasde70basealgunos erros siguieran

convirti endad. La incoin,mtodo, la secuenc980 Frederictodo(verrembioenlateologasdeseSanger,com

enciacinde

en 1918.DeenlaUniversi su formacibolismodeamsaminocidos las formas

unaprotena(nesyelADNbtuvo suprim

lecular,tambmas relacionadesutrabajolamspequerdideoxinuclecompartido co

eronelSangeromaHumano

biographies/fsan

oulsonquepladeADN. acin (mtodesdelbacteores que podtrabajando

elmtodorporacin dosdedetecciciacin delck Sangerobecuadro).Reecnologadeecuenciacinmoveremos

ecidosnuclGonzalo

padremdicdaddeCambn en Cambminocidos.Lsdelainsulinen las cule

(lainsulina).PquecodificamerpremioN

inenCambrados con el Aoanterior.Fueea) logrobtetidos).En1on Walter Gi

r Institute,un.

nger.html

proponeunnSangeryCodomsmenrifagoX1dan ocurrirpara mejora

ms utilizademejoras ein,electrofgenoma hubtuvo su segecinen2005secuenciacimasivautilimsadelan

leicos.oGreif

3

o, seridgeridgeLuegona,enes se

ProbestasNobel

ridge,ADN.eas,tener1980,ilbert

node

nuevooulsonnos) a74.Laen laar los

do deen losforesismanogundo5,conndezanelnteen

ElmcadendideoFiguADN(Figu

Enelreaccextendebepresetrifos

Figura2

Figura3naciente

todo enzimna de ADNoxinucletidoura2).Lainimpide quera3).

artculoejecin:Debidondindose,erahaberseencia de unasfato (uno

2.Estructurade

.Esquemademeluegodelainc

mtico de Saque est sios(esdecirncorporacine una nueva

emplifican,doaqueeldentonces la tincorporadoamezcla dede ellos m

unnucletido

mecanismodescorporacinde

anger, utilizaendo sintetnucletidosdeunabasea base pued

de forma cladTnocontieterminacin.Siuncebade ddTTP yarcado radi

(ej.dATP)yun

sntesisdeADNeundidoxinucle

Mto

a una ADN pizada en lugqueensucaeconestasca incorporas

ara,que sucenegrupo3ocurreespedoryunmoldTTP, as coiactivamente

dideoxinucle

N(1),y(2)impoetido.

odosdesecu

polimerasa egares especarbono3nocaractersticase y la snte

ede cundohidroxilo, lecficamenteldesonincubomo los otre con 32p),

tido(ddATP).

osibilidaddeco

enciacinde

e inhibidoreficos, particocontienenasenunmolesis de ADN

utilizandidacadenanoeen lasposbadosconAros tres deo, se obtien

ntinuarelongac

ecidosnuclGonzalo

s que finalizcularmenteelgrupohidlculanacienN es interrum

deoxiTiminaopuedecontsicionesdnDNpolimeraoxiribonucleoe un mezc

cindecadena

leicos.oGreif

4

zan lautilizadroxilontedempida

en latinuardedTasaenosidoscla de

a

fragmesframuesparamezcsecue

Lasse

Figuraprincip

mentostodosaccionadapostra ladistribcada uno d

claenparaleenciadebase

ecuenciasob

4.Esta imagenpiodelmtodo

sconelmismorelectroforbucindelode los cuatrloenelgel,es(Figura4

btenidascon

nseencuentradedideoxinucle

moextremoresisdesnatusresiduosTro nucletidseobtieneu

4y5).

estemtod

en laNobelLeetidostermin

Figura 5.Se tratamezclasimagensLas lectudeacuerdnucletid

Mto

5yconresuralizanteenTiminaenelos en reaccunpatrnde

oalcanzaban

ecturedeF.Saadores.

Estaimagencodeun autorad(una para cadeleenlassecuerasserealizandoalaaparicidodediferencia

odosdesecu

iduosddTenngelesdeacADNsintetizciones indepebandasap

nhasta200

angerde1980.

orrespondealadiografa dndeda dideoxinucleenciasdeADNdeabajo(frag

ndelasbandaaentamao.

enciacinde

nelextremocrilamidaelzado.Utilizanpendientes,partirdelcua

basesdelarg

En lamismas

asegundafigure semuestra laetido termina(enestecasougmentosmsps.Laresolucin

ecidosnuclGonzalo

o3.Siestampatrndebndoterminay corriendoalsepuedel

go.

seejemplificae

adelartculodamigracin deador utilizado).unfragmentodequeos)haciandelgel,permi

leicos.oGreif

5

mezclaandasadores cadaeerla

el

eSanger(PNASe las cuatrodif. A la derechelbacterifagoaarriba(msgitesepararban

S,1977).ferentesha de laoX174.grandes),dasde1

a

I.

En 19primecontmolenunLas snucle

II

LaemprimesecueUSA)secueEn 19secueConedesarestracopiaVentede43

a. Avancesy.Secuenciaci986 Hood yerreportedeerminadoresculafluorescnnicotubosecuencias oetidos.

I.SecuenciacmpresaAppler secuenciaenciadelpri.Laaparicienciacin.El992,Venterenciacincoestaplataforrrollodelaetegia consisa) y clonarlaerreporta33millonesde

a.

ymejorasenincontermy colaboradoeautomatizasfluorescentcentedifereo(Figura).Asobtenidas, co

cinautomtliedBiosysteador autommergenporndelossecprimerodefundael Inn30equiposrma instaladestrategiaESteenhaceras de forma37geneshuesecuencias

b.

nelmtodominadoresfluores, en colaacindelastescomovanteunidaasimismo,lason esta nue

tica.ems, fue laptico (ABI 37rCraigVenteuenciadoreseellosfueelstitute forGs.da,sedemueT(expressedcopiasdeAaleatoria p

umanosnoccorrespond

Fipadepasele

c.

Mto

deSanger(1uorescentes(aboracin csecuenciaciriantedelmcadadideoxsecuenciapueva variante

pionera y ld70A) aparecerysuscoleautomticoNIH,dndeGenomicRes

estraelpoddsequencetADN apartirara luego seonocidos.Lientesa130

gura6.Enestaaracadabase)elgel(cadacoloaraconvertiresecuenciadeADctura53.

odosdesecu

19771996).(dyeterminaon AppliedndeADN,q

mtododeSainucletido,uedeserlederan de un

deren instruce en 1987,egasdelNatospermitilaese instalarosearch (TIGR

erde lasectag)paraeldrdelARNmecuenciar. Eabasededa0organismo

afiguraseejem(a),secorrenorrepresentausassealesenDN (c). La flech

enciacinde

atorsequencBiosystems

queestableceanger.Estvaypermitere

daatravsdn largo de e

umentosdey con l seionalInstitutainstalacinon6secuencR) y expande

uenciacinadescubrimienmensajero ceEn 1991, conatosdeESTosdiferentes

mplificacomoetodas lasreacunabase)(b)yelectroferograha a la izquierd

ecidosnuclGonzalo

cing).(ABI) publicelasecuencarianteutilizealizarlareaeuncomputentre 500 y

secuenciaci logra conoteofHealthndefacilidadciadoresABIe la capacid

automticacntodegeneselular (ADNcn esta estracontieneho.

nlugarde4cacionesenunsedesarrollanaamasquereprda indica ladir

leicos.oGreif

6

can eliacinzaunaaccintador.1000

n.Elcer la(NIH,desdeI3700.ad de

conels.Estac=ADNategia,yms

rriles(unonicocarrilalgoritmosresentanlareccinde

Mtodosdesecuenciacindecidosnucleicos.GonzaloGreif

7

b. ProyectoGenomahumano:Lasecuenciacindelgenomahumanosevolviunobjetivorealizableunavezestablecidaslasmetodologas de secuenciacin de ADN. La discusin formal comenz en 1985 en EstadosUnidos.En1990,sepresentunproyectode5aosenelcongresodeEstadosUnidos(HumanGenomeProject).Seestimabaqueelproyectodurara15aosyelcosto rondara los3milmillones de dlares. El proyecto estableca el objetivo demapear y secuenciar diferentesorganismos modelo adems de humano. Entre ellos E. coli, S. cerevisiae, C. elegans, D.melanogaster y el ratn (Mus domesticus). El proyecto se convirti en un esfuerzo decolaboracininternacionalentrediversoscentrosdesecuenciacinenEstadosUnidos,EuropayJapn.Cadacentrosefocalizenregionesparticularesdelgenoma,quepermitieranobtenerunmapa.En1994sepublicunmapadetalladodelgenomahumanoqueincluaelmapeode5840lociconunamediadeespaciadode0,7cM(1centiMorgan=106bases).En1998,elproyectopblico,compitiendoahoracon laempresaCelera (propiedaddeCraigVenter)adoptalossecuenciadorescapilaresdeAppliedBiosystems(ABI3700). En1999elproyectoGenomahumanohaba secuenciadomsdemilmillonesdebasesysepubliclasecuenciacompletadeuncromosomahumano(elcromosoma22).Para el mismo tiempo, Celera, comenz asecuenciarelgenomahumanocon laestrategiade whole genome shotgun sequencingdesarrollada por C. Venter (explicada msadelante). La secuenciacin comenz ensetiembrede1999yenjuniode2000serealizun ensamblaje inicial de las secuenciasobtenidas. Los datos de Celera permitieron elensamblaje del genoma humano con unacobertura de 5X (ver Cobertura). Adems seaumentlacobertura3Xconlosdatospblicos.El 25 de junio de 2000, en la Casa Blanca, elpresidente Clinton junto a Francis Collins(responsabledelproyectopblico,NIH) yCraigVenter, anunciaron pblicamente la versinborrador del genoma humano realizada tantoporelesfuerzopblicocomoprivado(Figura7).Enfebrerode2001,sepublicaronlosborradoresdelconsorciopblicoydelprivadoenScienceyNature(Figura8).Finalmenteenelao2004sepubliclaversinfinaldelgenomahumano.

Cobertura(Coverage):La cobertura es elnmeropromediodesecuencias que representan a undeterminado nucletido en la secuenciatotalreconstruida.Puedesercalculadaapartirdellargooriginaldelgenoma(G),elnmero de secuencias (N) y el largopromediodelassecuencias(L)como:Cobertura=NxL/GEjemplo.Ungenomahipotticode2000bases,secuenciadocon24secuenciasde350 bases de promedio de largo tieneunacoberturade:24x(350/2000)=4,2X.Este valor significa que el genoma fuesecuenciado 4,2 veces. Cunto mayorcobertura, menor posibilidades deerroresenlasecuenciafinal.

Whol

Elmclonaobtensolapasin eminflue

En19mejor(Haemcolaboratn

En20JCVSFtrabaj

egenomeShotododeWhorloenplsminidas,lassecuan(Figura9).mbargo Ventenzae,1,8Mb)

95,Venterysrados de secmophilus influoradores, com).006se fundF,etc.).Setrajando.

ra9.Esquemaeradosalazar

otgunsequenleGenomeShidos y secuenuenciassealinElmtodofuer fue el primyproponerlo

sugrupodecidcuenciacinuenzae).EnTmenzaron en

el J.CraigVetadeunaorg

adesecuenciaryensamblaj

ncingyCraigVhotgunconsisnciarambashneanyensameutilizadopomero en utilocomoestrate

denutilizarnupara realizarIGRanalizarmtonces la sec

nter Instituteganizacinlde

acinconlaeedelasecuen

Mto

Figura7.Fohumanoe Figura8.Tlosborrad

Venter:steenlafragmhebras (elpasmblanparafororSangeren1izarlo para seegiaparasecu

uevasherramr la primermsde50 gecuenciacin d

e (JCVI)por laerengenmi

estrategiadeSnciautilizando

odosdesecu

otodelanzamnWashington

apasderevistdoresdelgeno

mentacinalasode clonadormarcontigsb1982paraensecuenciar unuenciarelgen

mientascompusecuencia deenomasmicrode genomas d

aunindevacaanivelmu

Shotgun.Secuoprocesamien

enciacinde

mientodeborrn(Clinton,Ven

tasNatureySomahumano.

azardelADNo luego fueebasndoseensamblarelfaggenoma deomahumano

utacionalesase un organisobianos.Ventdemayor tam

riasorganizacundialconm

uenciacindentoinformtic

ecidosnuclGonzalo

radordelgenonter,Collins).

Sciencede200

detodoelgeeliminado).Unlassecuenciagolambda(48mayor tama

o.

scomolosmsmo de vidater yalgunodmao (mosca

ciones (TIGR,sde400cien

fragmentosco.

leicos.oGreif

8

oma

01con

enoma,na vezasque8,5kb),o (H.

todosa librede sus, rata,

TCAG,ntficos

Mtodosdesecuenciacindecidosnucleicos.GonzaloGreif

9

4. AlgunosMtodosdesecuenciadomasivoPasaroncercade30aosdesde lapublicacindelmtododeSanger,hastaqueaparecierauna nueva tecnologa de secuenciacin de cidos nucleicos que no fuera el mtodo dedideoxinucleotidosterminadores.Laprincipalcaractersticadeestasnuevasmetodologasesla posibilidad de secuenciado masivo de forma paralela, esto significa que el nmero desecuenciasobtenidasduranteunacorridasuperamuchasveceselmximode96secuenciasporcorridaqueseobtienenconlossecuenciadorescapilaresdeltimageneracinqueutilizanelmtododesecuenciadodeSanger.

A partir del desarrollo del mtodo de pirosecuenciacin (primer mtodo de secuenciadomasivo utilizado, 2005), surgen nuevas alternativas de secuenciacin que utilizan elmismoprincipio de dideoxinucleotidos terminadores en sus protocolos, aunque con mejorasinnovadoras.

Estosnuevosmtodosdesecuenciadomasivonoofrecenlecturastanlargascomoelmtodoclsico de Sanger, aunque en pocos aos se hamejorado sustancialmente el largo de lassecuenciasobtenidasyenalgunoscasosalcanzanlongitudescomparablesaSanger.

a. Pirosecuenciacin:

Elprimermtododesecuenciadomasivoonextgenerationsequencing(NGS),fuepublicadoen2005enNature,y llevadoalmercadopor laempresa454 (luegoadquiridaporRoche).Elresumen de este artculo explica: Describimos un mtodo escalable, un sistema desecuenciacin altamenteparalelizable conun rendimiento significativamentemayorque losinstrumentosdeelectroforesiscapilar.Elaparatopermitesecuenciar25millonesdebases,con99% de precisin en una corrida de 4 horas (este rendimiento es 100 veces superior a lacantidaddebasessecuenciadasenesetiempoenunsecuenciadorde96capilares).

En el primer artculo, publican la secuenciacin de novo del genoma de Mycoplasmagenitaliumalcanzandocubrirel96%delgenomayconunaprecisinde99,96%enunacorrida.

Elmtodoconsisteen4pasos:1. FragmentacindelADN(oARN).2. Ligacindeoligonucletidos(adaptadores)encadaunodelosextremos.3. Amplificacinclonal(mediantePCRenemulsin).4. Secuenciadoporsntesisusandounprotocolodepirosecuenciacinoptimizadoenun

soporteslidoyenescaladepicolitros.Ms en detalle, luego de fragmentar elADN, se ligan oligonuclotidos adaptadores a cadaextremo del ADN. Estas secuencias adaptadoras comunes a todos los fragmentos sernutilizadas,tantoparaligarcadafragmentoalasesferas,comosecuenciasdondeseunirnloscebadores de la PCR y adems presenta la secuencia donde se unir el cebador desecuenciacin.Unavezligadoslosadaptadores,seliganalasbeads(esferasquecontienenelcomplementarioaunodelosadaptadoresensusuperficie),porunmtododedilucinlmite,demododeobtenerunnicofragmentounidoaunaesfera.Sebusca,entonces,obtenerencadabeadunnicofragmentodeADN,elmismoesamplificadomediantePCRenemulsin.

PCReLa Pindepesferobtenfragmmicelreactmicro

Figuracomplemulsframgecofactmilesfragme

Luegopreseplacaunbepodesecue

enemulsinCR en emupendientes.Uas que contner un nicmentodeADlas de aceitetivos necesaoreactoresd

a 10. Esquemaementariasauin (aguaaceitentoyencontrores).(3)Luegode reaccionesentounidoaun

o de finalizentaron ampa(picoTiterpead(Figura1mos decirenciadoresd

(emPCR):ulsin permUnavezobtetienen unoo fragmentoDN)esemulse independiarios para lndeselleva

de la PCR enunode losadate)de tal formramosademsoserealizaunaenparalelo. (4nabead.

ada esta replificacin. Lplate),tiene11).Encadaque tenem

de96capilare

ite realizarenidalalibrede los adapo por esferasionadaenuentes cadalevar adelaaadelantela

n emulsin. (1aptadoresquemaqueen cadatodos los reacaPCRconvenci4) Luegoden

eaccin, seLasmismas1,6millonespocillosuced

mos 1,6 miesaproximad

Mto

en un nieradefragmptadores prea. Luego launamezclada uno de ellonte la reacareaccinde

1) Se liga a caseencuentrana gotade aceitctivosnecesarioonal,peroencciclosde reacc

rompe la eson depositsdepocillos,derunareallones de sdamente.

odosdesecu

ico tubos mmentosquesesentes en lpoblacin ddeaguayacos con unaccin. El reePCRdeform

ada bead un fen la superficte encontremoospara llevaracadatuboderecin, seobtien

emulsin ytadas en layencadauaccindesecsecuenciado

enciacinde

miles de resernsecuenlos fragmende esferas (ceite,demonica esferaesultado finamaindepend

fragmento mediede lasmismosunanicabeadelante laPCReaccinserealie unaamplific

se recuperaplaca de seunodeelloscuencia,porres de 1 c

ecidosnuclGonzalo

acciones denciados,seutos, demodcada una codotaldeoba y con todoal, son milediente(Figur

diante las secumas. (2)Se realeadunida aunR (dNTPs,Polimizansimultneacacin clonald

an las beadsecuenciacinslopuedeelocualenlacapilar, o 1

leicos.oGreif

10

e PCRunenado deon unbteneros loses dera10).

uenciasizaunannicomerasa,amentede cada

s que. Estaentrarplaca16000

Figuradelos

ReaccEstetermdndvez,incornaciepirofomediemitibasedetecpirofo(FigucadaEn elhomolacanEjemEnelobserluzemobserlaba

a11.PicoTitrepocillosyejem

cindesecumtodo

inadores.Eneseofrece

secuenciaporacin deente de ADosfato liberante dos pdaencadapofrecida,

ccin luminoosfato durara).Unacmbase,encadl caso de hoopolimeroesntidaddebaplo:primerciclorvalaemisimitida).LuegrvanlospocseG,y luego

plate.Arriba:emplodecargade

enciacin:no utili

nestecaso,encadapocalmente.e una baseDN se liberarado se coprocesos enzpocillo,dndes monit

omtrica dente la reacmaraCCDcodacicloyenomopolimerosdeterminasesincorpor

oseofrecendeluz(degodeobtenillosqueincoo laCparat

squemadedepeunaplaca.

za nuclese realizancillounabasDuranteen unamola pirofosfatonvierte enzimticos. Ldeseincorpotoreada pola liberaci

ccin de snlectalosdatcadaposicios (tractos ddoapartirdrada).

labaseA,eependiendoidas las imorporanT.Sterminarelp

Mto

posicindeesfe

tidosciclosepor

laculato, eln luzLa luzorlaor lan delntesistosden.de secuenciade lacantida

n todos loslacantidaddgenes,sereevuelveaeprimerciclo.

Figura

odosdesecu

erasenlospoci

a con elmisaddepirofos

pocillos.EndeAincorpoemueve labaliminarlabaLuegode1

a12.Esquema

enciacinde

illos.Abajo:mic

smo nucletsfato liberad

aquellosquorada,serlase,yseofreasenoincorp00ciclosfin

dereaccinde

ecidosnuclGonzalo

crografaelectr

tido), el largdo(proporcio

uese incorpoaintensidadece labaseTporadayseoaliza lacorri

pirosecuenciac

leicos.oGreif

11

rnica

go delonala

oraseddelaTyseofreceida.El

cin

Mtodosdesecuenciacindecidosnucleicos.GonzaloGreif

12tamaopromediode cada lecturaesde400basesyenuna corrida seobtienen cercade1millndesecuencias(esdecir400millonesdebases/10horasdecorrida).

b. Illumina:Lasegundatecnologadesecuenciacinmasivaquesalialmercado (2006) fue ladeSolexa(luego adquirida por Illumina). En esta tecnologa, se utilizan nucletidos terminadoresmarcadosconmolculasfluorescentesaligualqueenlaSecuenciacindeSanger.Ademsdela paralelizacinmasiva (es decir la capacidad de realizarmillones de secuencias en cadacorrida),ladiferenciaconelmtodoconvencionaleslaposibilidaddeeliminarlafluorescenciaunavezobtenidalaimagen,ydesbloquearcarbono3demodoquepuedaaceptarunanuevabase para continuar la reaccin de secuenciacin, haciendo que la incorporacin de unnucletidoterminadorseareversible.Enestecaso,laslongitudesobtenidassonmenoresquelossecuenciadores454(enlaactualidadhasta150bases),sinembargolacapacidadderealizarsecuenciasenparaleloesmuchomayorqueen454(hasta250millonesdesecuencias).Comoresultadoesposibleobtenerhasta6x1012enunasolacorrida.Paradimensionarestenmero,elgenomahumanotieneaproximadamente3x109basesdelargo.Al igual que el mtodo de secuenciacin de Roche, los primeros pasos consisten en lafragmentacindelADNyligacindeadaptadores.Luegohayunpasodeamplificacin(enestecaso, laamplificacinesenunasuperficieslida:flowcell,dndetambinsedar luego lareaccindesecuenciacin).AmplificacinyReaccindesecuenciacin:En el primer paso, la librera se deposita en la flow cell por complementariedad con losadaptadores (1). Luego se produce la amplificacin en puente (2 y 3) en sucesivos ciclos(4,5,6,7,8)hastaobtenerunclusterconlaamplificacinclonaldelfragmentoinicial(8)(Figura13).Figura13.Amplificacinenpuente.Verdescripcineneltexto.

En la reaccin de secuenciacin, se bloquea uno de los adaptadores (1), y se comienza lareaccindesecuenciacindesdeelotroextremo (2)medianteuncebadorespecfico (Figura14).

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Figura14.ReaccindesecuenciacindeIllumina.Verdescripcineneltexto.

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Durante la reaccin, adiferenciade lapirosecuenciacin, seofrecen los cuatronucletidosterminadoresmarcadoscadaunoconunfluorocromodiferente(1),aligualqueelmtododeSanger.Luegodeunlavado(2),seobtienenlasimgenesyseobtienelaprimerabasedecadacluster(3).Luego,seeliminaelfluorocromoysedesbloqueaelCarbono3,permitiendoqueunnuevo nucletido pueda extender la cadena de ADN naciente (4). Otra vez los cuatronucletidosterminadoresmarcadossonofrecidosa losclusters,comenzandounnuevociclo(Figura15).

Figura 15. Reaccin de secuenciacin de Illumina. Primer ciclo de secuenciacin (1), incorporacin dedideoxinucletidosmarcados(2),adquisicindeimagen(3),ylavado,desbloqueo,yeliminacindemarcado(4).

Losltimosmodelosde Illuminapermiten secuenciar enparalelomsde 3000millonesdeclustersconlargosdesde35a150bases(www.illumina.com).

c. Otrosmtodos:Desde2005hastalafecha,otrastecnologasdesecuenciacinmasivahansidodesarrolladasyotras se encuentran en desarrollo y constituyen una nueva generacin de secuenciadores(Tabla1).Esimposibleenestecaptuloeldesarrolloenprofundidaddecadaunadeellas,porlotantoenlasiguientetablasemuestranotrastecnologasylasfuentesdndeobtenermayorinformacindecadaunadeellas.Algunasdeestastecnologas(SMRT,Helicos)proponenlasecuenciacinapartirdeunanicamolculadeADNentiemporeal.Unadeellas(PacificBiosciences)enteoranotienelmiteencuntoal largode lassecuenciasgeneradasyeventualmentepodrasecuenciarcromosomasenterosenunanicalectura(www.pacificbiosciences.com).Otras, como Oxford nanopore e Ion Torrent (recientemente lanzada al mercado) ofrecennovedosas soluciones y no requieren marcacin fluorescente ni cmaras registradoras deimgenes.Enparticular, IonTorrent (ver recuadro J.Rothberg),sebasaenel registrode loscambiosdepHproducidosdurante la incorporacindebasesdurante lasntesisdeADN.Setrata de micropHmetros que reducen notablemente los costos de secuenciacin(www.iontorrent.com)yprometenserherramientastilesenelreadediagnstico.

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Tabla

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GenomaHumanoySecuenciacinmasiva:Comoyavimosantes, lasecuenciadelgenomahumanasepublicen2004.Lasecuenciacindeestegenoma tuvo un costo aproximado de 3000millones de dlares y cerca de 20 aos de trabajo. Enoctubrede2007,sepublicaelprimergenomadeunnico individuo(J.CraigVenter),realizadoporelmtododeshotgunysecuenciacinSanger.Elcostodeestegenomafueaproximadamente70millonesdedlaresyunaduracinde4aos.Elprimergenomahumanosecuenciadocon latecnologa454fueeldelDr.JamesWatson,auncostode1millndedlaresyendosmeses(2008). Elcostohacontinuadobajandoysehanreportado lasecuenciacindeungenomahumanopormenosde100.000dlares.Variosproyectostienencomoobjetivo lasecuenciacindems individuos,entreelellosTheCancerGenomeAtlasy1000Genomeproject.Hacetansolo10aos,2dedoseransuficientesparacontarel nmerodegenomassecuenciados.En2009, alcanzaban los dedos de ambas manos. Hoy, es difcil de saberlo exactamente, pero unrelevamiento realizadopor la revistaNature, indicaque cercade30.000 genomashumanosestarnsecuenciadosparafinalesde2011.

d. Aplicaciones

La produccin de un gran nmero de lecturas a bajo costo permite la aplicacin de lasplataformas de secuenciadomasivo enmuchas aplicaciones, y es imposible describir todasellasaqu.Laprimeraaplicacinobviaeslasecuenciacindegenomas(verrecuadroGenomaHumano y Secuenciacin masiva) y la precisa anotacin de genes (sitios de splicing,poliadenliacin,secuencias5y3UTR,etc).Dentrodelasprimerasaplicacionesencontramosla secuenciacin de ARN (ej. descubrimiento de ARN pequeos, nuevas variantes gnicas,nuevos genes, etc.) y amplicones de PCR (secuenciado de ARNr16S y su aplicacin enmetagenmica como veremos en el siguiente prrafo). Asimismo, la posibilidad decuantificacindetranscriptosqueofreceestatecnologa(RNAseq),lavuelveunaalternativaalosexperimentosdemicroarreglos.Lasecuenciacinparaidentificarmarcadoresepigenticos,identificar interaccinADNprotena, determinarestructuradecromatina(ChIPSeq,Methylseq,DNaseseq)sonaplicacionescadavezmsutilizadas.LametagenmicaeselestudiogenmicodemicroorganismosporlaextraccindirectadeADNde una comunidadmicrobiana. La aparicin de la secuenciacinmasiva ha facilitado a losinvestigadores la tareade identificacinycaracterizacindediferentesmicroogranismos,endiferentesambientes.En la seccinde lecturas recomendadas seofrecen revisionesbibliogrficasde cadaunadeestasaplicacionesparaqueellectorprofundiceenellas.

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16Lecturasrecomendadas:1. Sanger F. Coulson R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed

synthesiswithDNApolymerase. J.Mol.Biol.,94,441448 (1975).MtodomsmenosdeSanger.

2. MaxamA.andGilbert.AnewmethodforsequencingDNA.PNAS,74(2),560564,(1977).Articulodndesedescribemtodoqumicodesecuenciacindecidosnucleicos.

3. Sanger,F.,Nicklen,S.andCoulson,A.R.DNAsequencingwithchainterminatinginhibitors4. PNAS, 74 (12), 54635467 (1977). Artculo de Sanger dnde describe el mtodo de

secuenciacinutilizandodideoxinucletidos.5. Sanger, F. Determination of nucleotide sequences inDNA.Nobel lecture, 8December

1980.6. Venter,C.etal.TheDiploidGenomeSequenceofan IndividualHuman.PLOSBiology,5

(10),(2007).PublicacindegenomadeCraigVenter.7. International Human Genome Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the

humangenome.Nature431,931945(2004).8. Margulies,M.etal.Genomesequencinginmicrofabricatedhighdensitypicolitrereactors.

Nature437,376380(2005).Losautoresdescribeneldesarrollodelaprimertecnologade secuenciadomasivo,y realizanelensamblajedenovodelgenomadeMycoplasmagenitualiumutilizandopirosecuenciacin.

9. Bentley,D.R.etal.Accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry. Nature 456, 5359 (2008). Artculo de los desarrolladores de Illumina,reportandoelusodeestatecnologaparalasecuenciacindeuncromosomahumano.

10. Wang, Z.,Gerstein,M.& Snyder,M. RNASeq: a revolutionary tool for transcriptomics.NatureRev.Genet.10,5763 (2009).Review sobreusode tecnologasde secuenciadomasivoparaanlisisdetranscriptomas(RNAseq).

11. Park, P. J. ChIPseq: advantages and challenges of amaturing technology.Nature Rev.Genet.10,669680(2009).RevisinsobreChIPseq.

12. Morozova, O.,Hirst, M., Marra, M. Applications of New Sequencing Technologies forTranscriptome Analysis. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 10,13551 (2009). RevisinNGS.

13. Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A. & Versalovic, J.Metagenomicpyrosequencingandmicrobial identification.Clin.Chem.55,856866 (2009).Setratadeunreviewsobremetagenmica.

14. Zhou,X.,Ren,L.,Meng,Q.,Li,Y.,Yu,Y.,Yu,J.Thenextgenerationsequencingtechnologyandapplication.ProteinCell,1(6),520536(2010).RevisinNGS.

15. Metzker,M.L.Sequencing technologies thenextgeneration.NatureReviewsGenetics11,3146(2010).RevisinNGS.

16. Human genome: Genomes by the thousand. Nature 467, 10261027 (2010). Revisinsecuenciadoresinstaladosygenomassecuenciados.

17. Zhanga,J.,Chiodinic,R.,Badra,A.,ZhangG.Theimpactofnextgenerationsequencingongenomics.Genet.Genomics.38(3),95109(2011).RevisinNGS.

Otrosrecursosinteresantes:1000GenomesProject:http://www.1000genomes.orgTheCancerGenomeAtlas:http://cancergenome.nih.govTheExomeProject:http://www.nhlbi.nih.gov/resources/exome.htmHumanMicrobiomeProject:http://nihroadmap.nih.gov/hmpPersonalGenomeProject:http://www.personalgenomes.orgCraigVenterInstitute:www.jcvi.org