COLORACION

TM PATRICIA TOLEDO RODRIGUEZ

ACIDO PICRICO

MECANISMOS GENERALES DE COLORACION

• FISICO

• FISICO - QUIMICO

• HISTOQUIMICO

MECANISMO FISICO

1.- colorante es más soluble en el tejido que en el disolvente, ej tinciones de grasas.

2.-impregnaciones: una precipitación selectiva se forman agregados insolubles, quedando atrapado entre la malla de células y fibras que constituyen los tejidos.

IMPREGNACION

MECANISMO FISICO-QUIMICO

• formación de uniones intermoleculares por atracción electroestática (cargas contrarias) o por fuerzas de tensión superficial (debidas a las fuerzas de gravitación generadas al disponerse las moléculas muy próximas entre si)

MECANISMO HISTOQUIMICO

• están basados en el desarrollo de una reacción química entre el colorante (comúnmente un leucoderivado) y la estructura objeto de tinción de forma que al interaccionar ambos produce un nuevo cromógeno responsable del color obtenido.

• PROGRESIVA / REGRESIVA

• DIFERENCIACION

DIFERENCIACION

Es el proceso mediante el cual extraemos el exceso de colorante de una placa histológica posterior a la tinción de la misma. La diferenciación se puede realizar con agua, alcohol, ácidos, bases, soluciones metálicas y combinaciones de estas entre otras. Todo dependerá del colorante que se utilice.

¿COMO SE UNE EL COLORANTE AL

SUSTRATO?

PARTICIPAN

• RELACIONES ELECTROESTATICAS

• ENLACES COORDINADOS

• MORDIENTES

• QUELANTES

• PUENTES DE HIDROGENO

• INTERACCIONES HIDROFOBICAS

• IMPREGNACIONES

RELACIONES ELECTROESTATICAS

• En teoría se forma una sal insoluble entre el colorante y la molécula del tejido de carga opuesta; para hacer más permanente esta unión se usa una técnica complementaria denominada MORDENTACION.

• +++ - - -

•

ATRACCION ELECTROVALENTE

• Dye cationico

proteoglicanoproteina

H3N+

OSO3-

NH3+

SO3-

Dye anionico

TEJIDOS

• SULFATOS

– FOSFATOS

• CARBOXILOS

– FENOLES

FUERMENTE ACIDOS

MORDENTACION

• MORDIENTE = une un colorante a un sustrato

• MORDIENTE son iones metálicos capaces de unirse covalentemente a algunos colorantes para formar complejos (denominados complejos de coordinación)

MORDIENTE

• La molécula que se combina con el ion metálico se denomina LIGANDO. Un ligando tiene dos o más átomos posicionados para formar enlaces coordinados con el mismo ión metálico, se puede formar un complejo estable de tipo QUELATO.

MORDIENTE

• Aluminio - Hierro – Cromo -Molibdeno

• enlaces coordinados =complejos colorante+mordiente +sustrato.

MORDIENTE

• ANTES DURANTE

MORDIENTE

• MORDIENTE COLORANTE

MORDIENTE

• Diferenciación

• OH acido ss mordiente

MORDIENTE

• las coloraciones obtenidas son bastante resistentes a lavados de agua, alcoholes y ácidos débiles; como soluciones diferenciadoras suele utilizarse un ácido más fuerte (alcohol ácido 0,5%) o bien soluciones con mordiente aislado.

ENLACE COVALENTE

• En general el enlace covalente se forma entre el auxocromo y el sustrato (grupos OH o amino)

• COMPLEJO COLORANTE + MORDIENTE + SUSTRATO.

PUENTES DE HIDROGENO

colorante + sustrato

unión es bastante débil

Ss acuosas más débil

En soluciones no acuosas y en el caso de algunas coloraciones de fibras colágenas pueden tener una participación más importante.

FUERZAS DE VANDER WAALS

• Son atracciones electroestáticas entre los electrones de un átomo y el núcleo de otro.

• Se reconocen tres tipos de fuerzas:

• Keesom – Debye - London

• Son importantes para las tinciones de fibras elásticas (más detalle en la clase correspondiente).

Interacciones Hidrofobicas

• Colorante Tinción

• Hidrofóbico Hidrofóbico

• OH solvente

• “Disolución Diferencial”

INTERACCIONES HIDROFOBICAS

En histología se utilizan colorante hidrofóbicos para teñir sustratos hidrofóbicos, ej tinción de lípidos; los colorantes se disuelven en disolventes orgánicos moderadamente polares (alcohol 70%), el colorante Negro Sudan presenta una mayor capacidad de disolución en las grasas que en el disolvente moderadamente polar en el que se prepara, tiñen por “disolución diferencial”

IMPREGNACIONES

• en una impregnación se forman agregados metálicos insolubles que quedan retenidos en el tejido gracias a la malla molecular creada en el proceso de fijación.

Impregnación metálica

Colorantes

Núcleo

• Hematoxilinas

• Galocianinas

• Verde de Metilo

• Azul de Alizarina S

• Fucsina Básica

• Violeta de Cresilo

• Rojo Nuclear Extra

• Carmín

Citoplasma

• Eosina

• Cromotropo 2R

• Floxina

COLORANTES NUCLEARES

• Cel. Eucariontes: DNA + nucleoproteínas

• DNA: cromosomas, RNA y nucleólo

• Nucleoproteínas: histonas y protaminas

• Arginina y lisina básicas

HEMATOXILINAS

COLORANTE + SOLVENTE

OXIDANTE

GRUPOS AUXOCROMOS

SOLVENTE GENERAL

pH

COLORANTE

• HEMATOXILINA, CRISTALES ROSADO-AMARILLENTOS SOLUBLES EN AGUA Y ALCOHOL.

• HEMATOXILINA REQUIERE SER OXIDADA A HEMATEINA PARA SER COLORANTE.

• HEMATEINA ES DEBILMENTE ACIDA Y COLORACION ROJO VINOSA

OXIDACION HEMATOXILINA

OXIDANTES

• MADURACION DE LA HEMATOXILINA

• Agentes:

– Oxigeno ambiental (4 A 6 semanas)

– Oxido Rojo de Mercurio

– Yodato de Sodio/ Potasio

– Permanganato de Potasio minutos

– Dicromato de Potasio

– Clorato de Potasio

Maduración Inducida

• CRUCIAL TIEMPO DE ACCION Y CANTIDAD DE AGENTE OXIDANTE.

• GENERACION DE LEUCODERIVADO (exceso)

• COLORACION PARDA E INESPECIFICA (sobreoxidación)

Oxidación inducida

• Para 1 gr de Hematoxilina, se usa:

Oxido de mercurio 0,5 g

Yodato de sodio 0,05g

Permanganato de Potasio 0,177g

Dicromato de Potasio 0,28g

Clorato de potasio 0,11 g

SOBREOXIDACION

• OH HOOC O

OH O C

OH

O

Hematoxilina sobre oxidada

Hematoxilina sobreoxidada

ESTABILIDAD HEMATEINA

SOLVENTE ESTADO

ACUOSA NEUTRA SOBREOXIDACION

GLICERINA-ALCOHOL MAYOR DURACION

BASICAS ACELERAN OXIDACION

ACIDAS RETARDAN OXIDACION

AUXOCROMOS

• OH

• COOH

• NH2

• SH

• IONES METALICOS: Cr, Al, H, Mb, Pb,

Cu.

GRUPOS AUXOCROMOS

• INCREMENTAR CAPACIDAD TINTORIAL

• AFINIDAD POR NUCLEOS CELULARES

• CARÁCTER BASICO

• SALES METALICAS BI Y TRIVALENTES

AUXOCROMOS= ALUMBRES

ALUMBRE HEMATOXILINA

ALUMBRE POTASIO/AMONIACO

H. HARRIS

ALUMBRE POTASIO / AMINIACO

H. MAYER

ALUMBRE AMONIACAL H. DELAFIELD

ALUMBRE POTASIO / AMINIACO

H. EHRLICH

ALUMBRE ALUMINIO/POTASIO

• HEMALUMBRE

• pH -1 rojo

• Ph 1-5 amarilla

• pH +6 azul violácea

FORMACION LACA

Requiere de que en el colorante coexistan un grupo fenólico y carboxílico en posición orto, desplaza molécula de agua y forma la laca.

FORMACION LACA

• Existiría una atracción electroestática, pero los complejos lacados son estables formación de enlaces covalentes, que se genera entre el catión + aniones del tejido = laca/quelato

• Catión cromo y fierro mas estable que aluminio.

TINCION NUCLEAR

Lacas de hematoxilina ácidos fosfóricos (histonas)

Hemateína no lacada arginina ++

Después de tto. Con ácido se mantiene un grado de tinción nuclear.

SELECTIVIDAD DE TINCION

ACIDIFICANDO

HEMATOXILINA HARRIS

• HEMATOXILINA 1g + ETANOL ABS 10 ml, disolver calentando suavemente.

• ALUMBRE POTASICO 20 g + AGUA DESTILADA 200 ml, disolver en caliente, agregar Hematoxilina y llevar a ebullición. El hervir agregar OXIDO ROJO DE MERCURIO 0,5 g (exergónico), enfriar, filtrar. Antes de usar

• ACIDO ACETICO GLACIAL 10 ml(ss. Fría)

HEMATOXILINA DE MAYER

• Hematoxilina 1g+ agua destilada 1000 ml

• Disolver, agregar

• Yodato sódico 0,2 gr, disolver sin calentar.

• Alumbre potásico 50g + acido cítrico 1g + hidrato de cloral 50g

• Filtrar antes de usar.

HEMATOXILINA MAYER

• La laca de hematoxilina es muy selectiva para colorear la cromatina nuclear y, por tratarse de una tinción progresiva, no requiere de diferenciación posterior. Aprox. 10 minutos de tinción.

S 100/ H. Mayer

HEMATOXILINA ACIDA DE EHRLICH

• Esta solución tiene una baja concentración de alumbre, contiene glicerol para prevenir la sobre oxidación de la hemateína. Da una tinción nuclear algo menos intensa pero mas uniforme.

Hematoxilinas Alumínicas:

• Hemateína + iones Al = HEMALUMBRE.

• El Al +3 tiene afinidad por el DNA

• progresivos o regresivos

• diferenciación se realiza con soluciones ácidas

AZULAMIENTO

• hemalumbre es rojizo a partir de pH 6 , se debe alcalinizar el pH: abundante lavado en agua corriente o bien someter las láminas a una solución alcalina (bórax, carbonato de litio, etc), este proceso se denomina azulamiento o viraje.

HEMATOXILINA DE DELAFIELD

• Núcleos de azul suave, ideal para contrastes.

• hematoxilina 5 g + alcohol puro 25ml.

• solución acuosa saturada de alumbre de amonio 800 ml. Exponga la solución a la luz por dos días en una botella taponada con algodón. Filtre.Glicerina 100 ml. Alcohol metílico 100 ml Mezcle bien. Madurarción por dos meses.

• Sin diferenciación

• Sin azulamiento

• H de Mayer

• H de Delafield

HEMATOXILINA FERRICAS

• usan sales de Hierro, están la Hematoxilina de Weigert o Hendenhain, estás tienen un azul intenso a negro y son más resistentes a las soluciones ácidas, por lo que suelen utilizarse en las coloraciones tricromicas, las que requieren soluciones de ácidos para los colorantes posteriores. Pueden usarse en coloraciones progresivas y regresivas.

H. Ferrica de Weigert

• Coloración de 1 tiempo

• Cromógeno y mordiente se combinan y se vinculan con el tejido.

• SS de trabajo poco estable.

VG

H. ferrica

H. Ferrica de Heidenhaim

• Coloración de 2 tiempos

• 1° mordentación del tejido con alumbre ferrico y después se agrega la hemateína

CARMIN

• Colorante natural Cochinillas hembras

• Molécula compleja

• Tiñe como carmalumbre las mismas estructuras que las lacas de hemateína.

• Carmín 1% acuoso en alumbre amoniacal.

• Diferenciación con agua.

• Tiempos de tinción 1 a 24 horas.

FUCSINAS

• Uso en coloraciones tricrómicas

• Fucsina básica CI 42510 1% en agua destilada

SAFRANINAS

• De elección para coloración de cromosomas.

GALOCIANINAS Y AZUL DE CELESTINA B

• Colorantes básicos, derivados de oxacinas.

• Combinables con iones metálicos

• En ss actúan como anfóteros, tiñen estructuras ácidas / básicas según pH.

COLORANTES CITOPLASMATICOS

• Menos específicos

• Principalmente derivados Xanténicos

EOSINA

• Colorante ácido lo que le permite enlazarse con constituyentes celulares de carga positiva:

– Citoplasma

– Colágeno

– Fibras musculares

EOSINA

Aquellos componentes que se tiñen con eosina son conocidos como acidófilos o eosinófilos.

EOSINA

• La coloración resultante de la tinción con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el caso de los eritrocitos. Es fuertemente fluorescente, aunque esta característica es muy poco utilizada.

EOSINA

• Puede usarse en solución acuosa y alcoholica.

• Relacionado con diferenciación.

• HISTIDINA RESIDUOS

• LISINA BASICOS

• ARGININA + + + + +

XANTENICOS: EOSINA

EOSINA B EOSINA Y

Eosina Alcoholica

• STOCK

• Eosina Y 1 gr + Agua destilada 20 ml

• Disolver calentando lentamente, enfriar.

• Etanol 95% 80 ml

• SS TRABAJO

• 25 ml Stock + 75 etanol 80%

• Filtrar, antes de usar agregar 0,5 ml ácido acético glacial.

Eosina Acuosa

• STOCK

• Eosina Y CI 45380 5 g + Agua destilada 100 ml

• SS TRABAJO

• 1 parte Stock + 4 partes agua destilada

Eosina Precipitada

• Eosina Y 5 g+ agua destilada 1000 ml

• Disolver calentando suavemente. Enfriar. Agregar 8 ml HCl concentrado. Dejar pp por 24 hrs, lavar el pp 8 X 500 ml agua destilada. Secar el pp (37°c), disolver 800 ml etanol 95%.

• Tinción 30-60 seg.

I. Delgado eosina acidificada

I. Delgado

CROMOTROPO 2R

• Colorante azoico

• Coloración rojo brillante

• Uso 1% alcoholica.