ABLANDAMIENTO DE FRUTOS DE RIÑÓN (Annona squamosa L.) y SU RELACION CON ALGUNAS ENZIMAS HIDROLASAS

Ángel Guadarrama y Pedro Espinoza.

Universidad Central de Venezuela. Facultad de Agronomía, Instituto de Botánica Agrícola-Laboratorio de Fisiología Postcosecha. guadarramaa@agr.ucv.ve

RESUMEN

Los frutos de riñón son climatéricos y el ablandamiento ocurre a pocos días después de cosechados, debido principalmente a la acción de enzimas hidrolasas tales como la pectinmetilesterasa la poligalacturonasa y la celulasa. Por ser frutos muy perecederos se requiere un mejor conocimiento del ablandamiento para prolongar su vida postcosecha, estableciéndose como objetivo: establecer la relación entre la firmeza y la actividad de las enzimas antes mencionadas. Se utilizaron frutos en diferentes estados de madurez. Se determino la firmeza, el contenido de sólidos solubles y de pectinas. La pérdida de firmeza y el contenido de sólidos solubles se incrementaron a medida que los frutos maduraban, mientras que el contenido de pectinas disminuyó. Se observó actividad de las enzimas PME y PG durante todos los estados de maduración, presentándose la máxima actividad para ambas enzimas en el estado maduro. No se detectó actividad de la celulasa en ningún estado durante la maduración de estos frutos.

Palabras clave: firmeza, pectinas, pectinmetilesterasa, poligalacturonasa, celulasa.

SOFTENING OF Annona Squamosa L FRUITS AND ITS RELATION TO SOME HYDROLASE ENZYMES

ABSTRACT

Annona squamosa fruits are climacteric and softening occurs within days after harvest, mainly due to hydrolases enzymes such as pectinmethylesterase cellulase and polygalacturonase. Being highly perishable these fruit requires a better understanding of the softening to extend postharvest life and we established the following objective: determine some parameters associated with the firmness and its relation to the activity of enzymes mentioned above. Fruits were used at different stages of maturity. Firmness, solids soluble and pectins were determined. Firmness decreased and soluble solids content increased as the fruits ripen, while the pectin content decreased. Activity was observed for pectin methyl esterase and polygalacturonase enzymes during all stages of maturation. No cellulase activity was detected at any stage during the ripening of these fruits.

Keywords: firmness, pectin, pectin methyl esterase, polygalacturonase, cellulase.

INTRODUCCION

Como parte del proceso fisiológico de la maduración, el ablandamiento de los frutos es uno de los factores que limitan la vida útil postcosecha de los frutos y está asociado a los cambios de firmeza que ocurren como consecuencia de la hidrólisis de la pared celular modificándose la estructura y composición de sus constituyentes, principalmente por transformaciones de las protopectinas insolubles en pectinas solubles.

Durante el ablandamiento de los frutos, las protopectinas y la hemicelulosa sufren solubilización y depolimerizacióm, lo cual contribuye a la laxitud y desintegración de la pared celular (El-Zoghbi, 1994). La participación de enzimas hidrolasas de la pared celular

constituye elementos clave en el ablandamiento de los frutos, principalmente la pectinmetilesterasa, poligalacturonasa y celulasa La pectinmetilesterasa (EC 3.1.1.11) es una enzima péctica que cataliza la deesterificación de los grupos metílicos del acido poligalacturónico de los compuestos pécticos. (Markovic et al 2012), lo cual trae como consecuencia la generación de grupos carboxílicos libres en las pectinas, afectándose el pH y los equilibrios iónicos dentro de la pared celular así como la actividad de las enzimas hidrolasas asociadas y las interacciones entre los componentes estructurales de la pared celular. Anthon et al (2002) aseguran que la acción de la pectinmetilesterasa convierte a la pectina a ser susceptible a la degradación por parte de la PG, la cual actúa solamente en los segmentos de la cadena de pectina que han sido demetilados por la PME.

La poligalacturonasa (E.C. 3.2.1.15) es una enzima que cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos α-1,4 del acido poligalacturónico. Esta enzima se clasifica en endo y exo-poligalacturonasa, según actúe sobre la parte interna o terminal, respectivamente del ácido poligalacturónico. La endo-poligalacturonasa ataca al ácido poligalacturónico al azar en los enlaces glucosídicos internos de la cadena. Se señala que uno de los requerimientos de la poligalacturonasa para actuar sobre el ácido poligalacturónico es que este debe tener un cierto grado de demetilación, lo cual se atribuye a la acción previa de la pectinmetilesterasa (De Lorenzo et al,2011)

La celulasa (E.C. 3.2.1.4) es muy específica y actúa sobre los enlaces glucosídicos β- 1-4 de la celulosa de la pared celular y la convierte en fragmentos menores denominados celo-dextrinas y posteriormente en celobiosa. (Abeles y Takeda,1990). Las enzimas celulolíticas son un sistema complejo de enzimas compuesto de exo-β-1,4-glucanasas (EC 3.2.1.91), endo-β-1,4-glucanasas (EC 3.2.1.4) y β-glucosidasas (EC 3.2.1.21), que actúa sinérgicamente para degradar la celulosa y otros oligosacáridos a glucosa (Faria et al., 2008 , Brijwani et al., 2010).

En este contexto, el objetivo general del presente trabajo es estudiar la relación entre el ablandamiento de los frutos de riñón durante la maduración y la actividad de algunas enzimas hidrolasas de la pared celular, incluyendo la pectinmetilesterasa, poligalacturonasa y celulasa.

MATERIALES Y METODOS

Material vegetal

Los frutos fueron cosechados en San Francisco de Asís, Municipio Zamora del estado Aragua.

Se seleccionaron frutos en cada uno de los estados de madurez: verdes en madurez fisiológica (estado 1), pintones (estado 2), maduros (estado 3) y sobremaduros (estado 4), con base a criterios subjetivos de coloración de la corteza y firmeza al tacto. Al estado

verde le correspondió la mayor textura y un color verde claro brillante; los frutos sobremaduros con menor textura o firmeza presentaron un color verde oscuro opaco con ligeras coloraciones violáceas. Los frutos pintones y maduros tuvieron una coloración y firmeza intermedias entre los dos estados previamente mencionados.

ANALISIS FISICOS Y QUIMICOS

Determinación de la firmeza: En dos puntos de la zona ecuatorial de los frutos, mediante un penetrómetro ELE-400 (ELE International, California,USA), midiendo la distancia recorrida por la punta cónica y los resultados se expresaron en mm de penetración, como reflejo de la pérdida de firmeza.

Contenido de sólidos solubles: Mediante un refractómetro ATAGO N1 (Atago, Japón) y los resultados se expresaron en grados Brix, indicadores del % de sólidos solubles.

Pectinas: Mediante el método de la AOAC (1990) y utilizando una curva patrón de acido galacturónico en un rango entre 0 y 60 mg/ml de ácido galacturónico.

ANALISIS BIOQUIMICOS

Extracción de las enzimas: Para la extracción de las enzimas hidrolasas, se utilizaron 25 g de pulpa de frutos (en sus diferentes estados de maduración) en 50 mL de una solución extractora de NaCl al 10 % y se homogeneizó durante 1 min en frio (+/-50C ). El extracto se centrifugó a 15.000rpm durante 30 min a +/-50C en una centrífuga SORVALL RC-2B. El sobrenadante obtenido se filtró con lana de vidrio y se almacenó congelado a -10 0C hasta realizar los análisis de las actividades enzimáticas correspondientes.

Actividad de la pectinmetilesterasa (PME) : Se evaluó mediante el método espectrofotométrico de Hagerman y Austin (1986),. La mezcla de reacción consistió en 2,5 mL de una solución de pectina cítrica al 1 % (p/v) en agua destilada y de 0,75 mL de extracto enzimático y dos gotas de azul de bromofenol.La mezcla de reacción se incubó en un baño térmico durante una hora a 300C .La actividad de la PME se midió a través del cambio de absorbancia a 620 nm en un Spectronic 401-Milton Roy.La actividad se expresó como la variación de la absorbancia a 620 nm por hora (∆ Abs/hora).

Actividad de la poligalacturonasa (PG) : Utilizando el método de de Durbin y Lewis (1988) .Se utilizó una mezcla de reacción de 2.5 mL al 0,2 % (p/v) de ácido poligalacturónico mas 0,75 mL del extracto enzimático.La mezcla de reacción fue incubada a 300C en un baño térmico durante una hora. La actividad de la PG se expresó como el porcentaje de pérdida de viscosidad de la mezcla de reacción en un viscosímetro de Oswald y la actividad se expresó como el porcentaje de pérdida de viscosidad de la mezcla de reacción por hora.

Actividad de la celulasa (CE): Por el método de Durbin y Lewis (1988), en condiciones similares a la actividad de la PG, pero utilizando carboximetil-celulosa al 0,2 % como sustrato. La actividad se expresó como el porcentaje de pérdida de viscosidad por hora de la mezcla de reacción.

DISEÑO Y ANALISIS ESTADISTICO

El diseño fue totalmente al azar con tres repeticiones de tres frutos en cada ensayo. Se realizó análisis de varianza y prueba de media de Tukey para aquellas variables que presentaron diferencias estadísticas significativas

RESULTADOS Y DISCUSION

Establecimiento de los diferentes estados de maduración

Sobre la base de criterios subjetivos de pigmentación de la corteza y firmeza al tacto se determinaron 4 estados de maduración para los frutos de riñón (Cuadro 1 y Figura 1)

Cuadro 1 Pigmentación de la corteza y firmeza al tacto de frutos de riñón

Estados de maduración Coloración de la cáscara Firmeza al tacto

Estado 1 Verde claro con matices violeta en las escamas y entre ellas pigmentaciones amarillas

Mayor firmeza al tacto

Estado 2 Escamas amarillo- verdosas con coloraciones amarillas entre ellas

Firmeza intermedia al tacto

Estado 3 Escamas amarillas con rasgos violetas y coloraciones amarillas entre ellas

Firmeza intermedia al tacto

Estado 4 Escamas color violeta con menor coloración amarilla entre ellas

Menor firmeza al tacto

Figura 1 Diferentes estados de maduración de frutos de riñón (Annona squamosa L.)

Variaciones en la firmeza durante la maduración de los frutos

El ablandamiento expresado como pérdida de la firmeza y medida en mm de penetración, se va incrementando a medida que el fruto avanza en la maduración como se observa en el Cuadro 2, donde se presenta los valores promedios de firmeza para los diferentes estados de maduración, los cuales reflejaron diferencias estadísticas significativas al 5 %, formándose 4 grupos homogéneos.

Cuadro 2 Firmeza de frutos de riñón para los diferentes estados de maduración

Estados de maduración Firmeza (mm de penetración) Grupos homogéneos

Estado 1 1,33 c

Estado 2 5,30 b

Estado 3 9,78 ab

Estado 4 11,72 a

A medida que los frutos avanzan en su maduración, disminuye la firmeza de los mismos debido a cambios estructurales y composicionales en las paredes celulares, debido a la hidrólisis enzimática de sustancias celulósicas, pécticas y del ácido poligalacturónico.En frutos de lechosa, Paul et al (1999) determinaron el rango de masa molecular aparente de las diferentes fracciones extraíbles de la pectina y la hemicelulosa, encontrando que la masa molecular de la pectina disminuyó y su solubilidad aumentó durante la maduración de los frutos, mientras que el ácido urónico soluble en agua aumentó durante la maduración.

Variaciones en el contenido de pectinas durante la maduración de los frutos

En el Cuadro 3 se observa que el contenido de pectinas desciende a medida que los frutos pasan de una condición de mayor firmeza en los frutos verdes, pero en madurez fisiológica (Estado 1) a una de menor firmeza en los frutos sobremaduros (Estado 4).Este comportamiento se puede explicar debido a cambios estructurales y composicionales en las paredes celulares como se mencionó anteriormente. Se determinó que los frutos pintones (Estado 1) son los que tienen la mayor cantidad de pectinas presentándose diferencias estadísticas significativas al 5 % y se formaron tres grupos homogéneos (Cuadro 3)

Cuadro 3 Valores promedio obtenidos del contenido de pectina en frutos de riñón para los diferentes estados de maduración

Estados de maduración Contenido de pectinas ( g acido poligalacturónico/100g

pulpa)

Grupos homogéneos

Estado 1 0,1900 a

Estado 2 0,0933 ab

Estado 3 0,0800 ab

Estado 4 0,0667 b

Paul et al (1999) señalan que la pérdida de pectinas de masa molecular alta disminuye durante la maduración de frutos de lechosa, mientras que la tasa de demetilación fue mayor a principios de la maduración. Esos resultados sugieren que la hidrólisis de la pectina y la modificación de la hemicelulosa estuvieron involucradas en el ablandamiento de frutos de lechosa durante la maduración y la hidrólisis de la pectina parece ser más importante durante la última fase del ablandamiento.

Actividad de la PME durante el ablandamiento de los frutos

En el cuadro 4 se observa que los frutos maduros (Estado 3) y sobremaduros (Estado 4) son los que presentan la mayor actividad de la enzima pectinmetilesterasa, no encontrándose diferencias estadísticas significativas entre esos dos estados, pero si entre los frutos verdes y pintones.

Cuadro 4 Valores promedio de la actividad de la enzima pectinmetilesterasa en frutos de riñón para los diferentes estados de maduración

Estados de maduración

Actividad promedio de la pectinmetilesterasa (∆Abs/min)

Grupos homogéneos

Estado 1 0,490 b

Estado 2 0,653 ab

Estado 3 1,19 a

Estado 4 1,18 a

El ablandamiento excesivo es el principal factor que limita la vida útil postcosecha de los frutos durante el almacenamiento. Brummell y Harpster (2001) señalan que plantas transgénicas en las cuales se han modificado las enzimas hidrolasas y se ha encontrado que la actividad de la enzima pectinmetilesterasa es clave para demetilar la pectina, la cual puede ser sustrato adecuado para la posterior actividad de la poligalacturonasa, contribuyendo así ambas enzimas al ablandamiento de los frutos a través de los cambios estructurales y composicionales que se producen en las paredes celulares. Actividad de la PG durante el ablandamiento de los frutos

En el Cuadro 5 se observa el aumento progresivo de la actividad de la poligalacturonasa desde el estado 1 al estado 4, en el cual se obtuvo el máximo valor de actividad enzimática, con un valor de 3,78 % de pérdida de viscosidad/h para luego mostrar un leve descenso en los frutos sobremaduros (estado 4).En relación a la actividad de la enzima poligalacturonasa, el análisis estadístico no arrojó diferencias significativas al 5 % cuando se compararon los diferentes estados de maduración de los frutos (Cuadro 6), lo cual refleja que la actividad de la PG se puede considerar constante en todos los estados de maduración, aunque se tengan diferencias biológicas que afecten el ablandamiento de los frutos de riñón. En otras palabras, siempre encontraríamos actividad de la enzima PG durante la maduración de estos frutos, disponible para actuar sobre su sustrato, el ácido poligalacturónico, que es demetilado por la enzima PME.

Cuadro 5 Valores promedio de la actividad de la enzima poligalacturonasa en frutos de riñón para los diferentes estados de maduración

Estados de maduración

Actividad promedio de la poligalacturonasa (∆Abs/min)

Grupos homogéneos

Estado 1 2,01 a

Estado 2 3,43 a

Estado 3 3,78 a

Estado 4 3,43 a

Todos los cambios en la pared celular en los frutos están relacionados con la actividad de enzimas hidrolíticas. Las principales enzimas que se han señalado como involucradas en el metabolismo de la pared celular durante el ablandamiento de los frutos, son la poligalacturonasa, pectinmetilesterasa, celulasa, β-galactosidasa y xilanasa, pudiendo variar la importancia de cada una de estas hidrolasas dependiendo de la especie de fruto considerado. Por ejemplo, la actividad de la celulasa correlaciona bien con el ablandamiento de frutos de aguacate, mientras que la poligalacturonasa correlaciona adecuadamente con el ablandamiento de frutos de tomate. Además es probable que ninguna de las enzimas mencionadas anteriormente, sea responsable en forma exclusiva de este proceso fisiológico, sino que haya una participación conjunta y sinérgica de las diferentes enzimas hidrolíticas de la pared celular.

Actividad de la celulasa durante el ablandamiento de los frutos

Con la metodología utilizada en este trabajo, no hubo actividad detectable de la enzima celulasa en ninguno de los estados de maduración, lo cual sugiere que en los frutos de riñón, su participación no es tan determinante para el ablandamiento de estos frutos, como lo son la pectinmetilesterasa y la poligalacturonasa.

CONCLUSIONES

Se detectó actividad de la PME y PG en todos los estados de maduración, presentándose los valores máximos para ambas enzimas, en el estado maduro. Ambas enzimas están más relacionadas con el ablandamiento de los frutos de riñón, expresado a través de su pérdida de firmeza y a la degradación de las pectinas.

En los frutos de riñón, no se observó alguna actividad detectable de la enzima celulasa, para ninguno de los estados de maduración evaluados. Se puede inferir una ínfima o inexistente actividad de esta enzima.

La hidrólisis de las sustancia pécticas durante el ablandamiento de estos frutos, es probablemente una consecuencia de la acción de las enzimas hidrolasas como la pectinmetilesterasa y poligalacturonasa.

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